CN107449834B - 一种氯维地平及其脂肪乳注射液中有关物质的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种氯维地平及其脂肪乳注射液中有关物质的检测方法。采用高效液相色谱法，选用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的反相色谱柱；采用紫外检测器检测，检测波长220～245nm；流速为0.5ml～1.5ml/min；柱温为20℃～40℃；流动相A为磷酸盐缓冲液，流动相B为乙腈，流动相C为甲醇，梯度洗脱，可同时检测氯维地平及其脂肪乳注射液中的各个有关物质，工艺简单、成本低廉，可全面、科学、有效、快捷地实现氯维地平药物的质量控制。

Description

一种氯维地平及其脂肪乳注射液中有关物质的检测方法
技术领域
本发明属于医药制备和药物分析领域，涉及一种氯维地平及其脂肪乳注射液中有关物质的检测方法。
背景技术
氯维地平(Clevidipine，CAS：167221-71-8)其化学结构式如下所示：
Figure BDA0001004703890000011
化学名为4-(2,3-二氯苯基)-1,4-二氢-2,6-二甲基-3,5-吡啶二甲酸甲基(1-丁酰氧基)甲酯，是一种短效二氢吡啶类钙通道阻滞剂。氯维地平脂肪乳注射液是由英国阿斯利康公司研制开发的超短效二氢吡啶类钙通道拮抗剂，是一种新型的静脉注射用抗高血压药物；美国The Medicines Company公司拥有其在除日本以外的全球市场的开发和商业化授权，并于2008年8月首次在美国上市，商品名Cleviprex，可用于不宜口服药物或口服药物无效的高血压患者的治疗，也可用于治疗外科手术后急性血压升高。研究表明，氯维地平在体内吸收、分布、代谢和消除均比较快；体内氯维地平大部分通过尿液和粪便排出，在尿液和粪便中未检出其母体化合物；二氢吡啶类钙通道拮抗剂作为抗高血压药物，临床上长期服用在体内基本无蓄积，所以基本无蓄积毒性，可以方便快捷的与其他降压药物进行转换。该药是10年来美国FDA批准的首个新型静脉注射用抗高血压药，目前尚未在中国上市。
据报道，氯维地平原料在合成过程中可能存在原料残余及副产物的产生，其制剂加工或储存过程中可能发生降解，从而影响原料和制剂的纯度，影响其临床疗效。
目前关于氯维地平及其脂肪乳注射液有关物质测定方法的文献报道很少。马海波等人在中国新药杂志2015年第24卷第16期：1890-1915中报道了采用反相高效液相色谱法测定氯维地平脂肪乳注射液的有关物质(3种未知杂质)，然而该方法采用“自动预处理装置”进行样品前处理，对设备要求高，不适用于工业化的需要。在现有的文献报道中未见其他有关氯维地平脂肪乳注射液的测定方法的报道。本发明在上述色谱条件下采用乙腈进行脂肪乳样品前处理，准确提取样品中的主成分及有关物质，方法操作方便，快捷，专属性、准确度、精密度及耐用性等均符合要求，可满足工业生产及科研单位分析氯维地平脂肪乳注射液有关物质的需要。
因此，开发一种简单、有效的检测和分离氯维地平原料及脂肪乳注射液中有关物质的方法尤为重要，从而提高原料和制剂的纯度，提高其临床疗效，降低其毒副作用。
发明内容
本发明是提供一种氯维地平及其脂肪乳注射液中有关物质的检测方法，该方法采用一种流动相梯度洗脱的高效液相条件能更有效、科学、便捷的控制氯维地平原料及其脂肪乳注射液的有关物质，为本药物有关物质的质量标准的提高提供一个有效的方法。
样品浓度选择：为了兼顾主成分与杂质含量的测定，必须选择一个合适的样品浓度，浓度太小不利于杂质出峰，太大会影响主峰超出峰线性范围，且需要考虑样品前处理遇到的相关问题。样品溶液选择0.1mg～0.2mg/ml时最终分析结果证实该浓度范围内检测结果符合要求。
样品前处理：(1)原料：取氯维地平约20mg，置100ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；(2)制剂：精密量取氯维地平脂肪乳注射液4ml，置10ml量瓶中，加乙腈5ml超声15分钟，放冷至室温，定容，制成每1ml中含氯维地平0.2mg的溶液；精密量取供试品溶液10μl，检测，记录色谱图，完成氯维地平及其脂肪乳注射液有关物质的分析。
洗脱方式：通过实验验证，正相色谱和等度反相色谱分析法无法实现氯维地平及其脂肪乳注射液中多个有关物质的有效分离，采用梯度洗脱能够有效地提高杂质间的分离度，节省分析时间。
检测吸收波长：分析方法选择的最初目的是为了同时检测主成分和可能存在的所有杂质。取氯维地平原料、脂肪乳注射液中可能存在的16个杂质进行紫外扫描，记录各组分紫外吸收特征，重叠图确定吸收波长在220～245nm范围内，各组分紫外吸收相近，优选239nm。
流动相选择：通过实验验证，普通的两相(磷酸盐缓冲液和甲醇或乙腈)等度或梯度洗脱均无法满足所有杂质的有效分离，水相的pH值对杂质分离也有一定影响；通过摸索优化发现，采用三相体系，且水相pH值在3.0～4.0范围内时，各杂质峰形理想且杂质与杂质之间、杂质与主峰之间的分离度均满足要求。
因此，本发明提供一种氯维地平及其脂肪乳注射液中有关物质的检测方法如下：
一种氯维地平及其脂肪乳注射液中有关物质的检测方法，其特征在于检测方法采用高效液相色谱法，色谱条件为：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的反相色谱柱；
检测器：紫外检测器，检测波长为220～245nm；
柱温：20℃～40℃；
流速：0.5ml～1.5ml/min；
流动相：流动相A为磷酸盐缓冲液，流动相B为乙腈，流动相C为甲醇；流动相采用以下方式进行梯度洗脱：
0～10min，流动相A为60-70％，流动相B为15-25％，流动相C为10-20％；
10～15min，流动相A为45-65％，流动相B为20-35％，流动相C为15-20％；
15～40min，流动相A为40-45％，流动相B为35-40％，流动相C为20％；
40～50min，流动相A为40-45％，流动相B为35-40％，流动相C为20％。
所述氯维地平及其脂肪乳注射液中有关物质分别为：
杂质1：(Z)-2,3-二氯亚苄基乙酰乙酸甲酯；
杂质2：4-(2,3-二氯苯基)-1,4-二氢-2,6-二甲基-3,5-吡啶二甲酸甲基(2-氰乙基)甲酯；
杂质3：4-(2,3-二氯苯基)-5-甲酯基-2,6-二甲基-1,4-二氢吡啶-3-羧酸钠；
杂质4：3-((丁酰氧基)甲基)-5-甲基-4-(2,3-二氯苯基)-2,6-二甲基吡啶-3,5-二羧酸二乙酯；
杂质5：4-(2,3-二氯苯基)-2,6-二甲基-1,4-二氢吡啶-3-羧酸甲酯；
杂质6：4-(2,3-二氯苯基)-2,6-二甲基-1,4-二氢吡啶-3,5-二甲酸(1-丁酰氧基)甲酯；
杂质7：4-(2,3-二氯苯基)-2,6-二甲基-1,4-二氢吡啶-3,5-二羧酸二甲酯；
杂质8：4-(2,3-二氯苯基)-2,6-二甲基-1,4-二氢吡啶-3,5-二羧酸乙基甲基酯；
杂质9：(E)-2,3-二氯亚苄基乙酰乙酸甲酯；
杂质10：3-(2-氰乙基)-5-甲基-4-(2,3-二氯苯基)-2,6-二甲基吡啶-3,5-二羧酸二乙酯；
杂质11：4-(2,3-二氯苯基)-2,6-二甲基-1,4-二氢吡啶-3,5-二羧酸；
杂质12：4-(2,3-二氯苯基)-5-甲酯基-2,6-二甲基吡啶-3-羧酸；
杂质13：4-(2,3-二氯苯基)-2,6-二甲基-吡啶-3-羧酸甲酯；
杂质14：(1S,6S)-6-(2,3,-二氯苯基)-2-甲基-4-羰基-2-环己烯酸甲酯；
杂质15：(1R,6S)-6-(2,3,-二氯苯基)-2-甲基-4-羰基-2-环己烯酸甲酯；
杂质16：(1S,6R)-6-(2,3,-二氯苯基)-4-甲基-2-羰基-3-环己烯酸甲酯。
进一步地，所述流动相A为20～50mmol/L磷酸二氢钠溶液，磷酸调pH值至3.0～4.0，优选50mmol/L磷酸二氢钠溶液，磷酸调pH值至3.5。
进一步地，所述检测波长238～240nm，优选239nm。
进一步地，所述流速为0.9～1.1ml/min。
进一步地，所述色谱柱温度25～30℃。
进一步地，可按下表进行梯度洗脱：
Figure BDA0001004703890000041
采用本发明所述色谱条件及检测方法可以同时检测和分离氯维地平脂肪乳注射液中主成分及其有关物质，所述有关物质(其中杂质14与15是对映异构体)均为氯维地平原料或制剂中涉及的工艺杂质、副产物或降解杂质，这些有关物质的含量直接影响氯维地平原料及其制剂的质量。氯维地平和各已知杂质极性差别较大，因此等度洗脱实现分离比较困难。本发明采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的反相色谱柱，在同一色谱条件下，采用梯度洗脱法实现氯维地平及其有关物质的分离；为原料药、制剂制备过程和产品的质量控制提供了一种可靠的方法。
本发明的有益效果是可同时检测的潜在杂质种类多，简单快捷，灵敏度高，可用于氯维地平及其脂肪乳注射液的质量控制。
附图说明
图1为本发明实施例1中氯维地平原料及其有关物质的高相液相色谱图。
图2为本发明实施例1中氯维地平脂肪乳注射液及其有关物质的高相液相色谱图。
具体实施方式
下面以实例和附图对本发明作进一步描述，本发明的保护范围并不限于这些实例。相关技术人员应理解，对本发明的技术特征所作的等同替换，或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。
实施例1氯维地平及其脂肪乳注射液有关物质检测
1.供试品配制
(1)氯维地平原料供试品配制：取氯维地平适量，加乙腈溶解并稀释制成每1ml中约含0.2mg的溶液，备用。
自身对照溶液的配制：精密量取供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀，备用。
(2)氯维地平脂肪乳注射液供试品溶液的配制：精密量取氯维地平脂肪乳注射液4ml(样品1-3)，分别置10ml量瓶中，加乙腈5ml超声15分钟，放冷至室温，定容，制成每1ml中含氯维地平0.2mg的溶液，离心15分钟，取上清液备用。
自身对照溶液的配制：精密量取上清液1ml，置100ml量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀，备用。
2.色谱条件：
高效液相色谱仪：Ultimate 3000；
色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(100×4.6mm，3.5μm)；
流速：1.0ml/min；
柱温：30℃；
检测器：紫外检测器，检测波长为239nm；
流动相：流动相A为磷酸盐缓冲液(50mmol/L磷酸二氢钠溶液，磷酸调pH值至3.5)；流动相B为乙腈；流动相C为甲醇，按下表进行梯度洗脱：
Figure BDA0001004703890000051
分别取氯维地平及其脂肪乳注射液的供试品溶液，分别注入液相色谱仪，按上述色谱条件分析，记录色谱图，并考察分离度，结果显示：各杂质之间以及杂质与主峰之间的分离度均符合要求，具体结果见表1：
表1实施例1氯维地平及其脂肪乳注射液有关物质的分离度
Figure BDA0001004703890000052
Figure BDA0001004703890000061
“-”：未检出；
实施例2氯维地平及其脂肪乳注射液中有关物质检测
1.氯维地平原料及其脂肪乳注射液供试品及自身对照溶液的配制同实施例1。
2.色谱条件：
高效液相色谱仪：Ultimate 3000；
色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(100×4.6mm，3.5μm)；
流速：0.9ml/min；
柱温：25℃；
检测器：紫外检测器，检测波长为238nm；
流动相：流动相A为(20mmol/L磷酸二氢钠溶液，磷酸调pH值至3.0)；流动相B为乙腈；流动相C为甲醇，按下表进行梯度洗脱：
Figure BDA0001004703890000062
分别取氯维地平及其脂肪乳注射液的供试品溶液，分别注入液相色谱仪，按上述色谱条件分析，记录色谱图，并考察分离度，结果显示：各杂质之间以及杂质与主峰之间的分离度均符合要求，具体结果见表2。
表2实施例2氯维地平及其脂肪乳注射液有关物质的分离度
Figure BDA0001004703890000063
Figure BDA0001004703890000071
“-”：未检出；
实施例3氯维地平及其脂肪乳注射液中有关物质检测
1.氯维地平原料及其脂肪乳注射液供试品及自身对照溶液的配制同实施例1。
2.色谱条件：
高效液相色谱仪：Ultimate 3000；
色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(100×4.6mm，3.5μm)；
流速：1.1ml/min；
柱温：30℃；
检测器：紫外检测器，检测波长为240nm；
流动相：流动相A为(50mmol/L磷酸二氢钠溶液，磷酸调pH值至4.0)；流动相B为乙腈；流动相C为甲醇，按下表进行梯度洗脱：
Figure BDA0001004703890000072
分别取氯维地平及其脂肪乳注射液的供试品溶液，分别注入液相色谱仪，按上述色谱条件分析，记录色谱图，并考察分离度，结果显示：各杂质之间以及杂质与主峰之间的分离度均符合要求，具体结果见表3。
表3实施例3氯维地平及其脂肪乳注射液有关物质的分离度
Figure BDA0001004703890000073
Figure BDA0001004703890000081
“-”：未检出；
实施例4氯维地平及其脂肪乳注射液破坏性试验有关物质检测
1.供试品配制：
(1)氯维地平原料供试品溶液
酸破坏：取氯维地平约20mg，精密称定，置100ml量瓶中，加2ml乙腈溶解，加1ml2mol/L盐酸溶液，摇匀后置70℃水浴中加热20分钟，放冷，加等体积2mol/L氢氧化钠溶液中和，然后加乙腈稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；同时做酸破坏空白溶液，分别依法测定。
碱破坏：取氯维地平约20mg，精密称定，置100ml量瓶中，加2ml乙腈溶解，加0.1ml0.1mol/L氢氧化钠溶液，摇匀，置暗处放置10min，加等体积0.1M盐酸溶液中和，然后加乙腈稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；同时做碱破坏空白溶液，分别依法测定。
氧化破坏：取氯维地平约20mg，精密称定，置100ml量瓶中，加2ml乙腈溶解，加1ml30％双氧水溶液，置70℃水浴中加热30分钟，放冷，加乙腈稀释至刻度，作为供试品溶液；同时做氧化破坏空白溶液，分别依法测定。
高温破坏：取氯维地平约20mg，精密称定，置坩埚中，于150℃马弗炉中加热2小时，取出放冷后，加乙腈溶解，完全转移至100ml量瓶中，并加乙腈稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，依法测定。
光照破坏：取氯维地平适量于表面皿中，放入光照箱(4500lx±500lx)中光照10天，取出后，精密称取20mg，置100ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，依法测定。
(2)氯维地平脂肪乳注射液供试品溶液
酸破坏：取氯维地平脂肪乳注射液4ml，置10ml量瓶中，加乙腈3ml，超声15分钟，加0.5ml盐酸溶液(1mol/L)，静置10分钟，加0.5ml氢氧化钠溶液(1mol/L)中和，然后加乙腈稀释至刻度，摇匀，离心取上清液，作为供试品溶液；同法制备酸破坏空白和空白乳酸破坏空白。
碱破坏：取氯维地平脂肪乳注射液4ml，置10ml量瓶中，加乙腈3ml，超声15分钟，加0.5ml氢氧化钠溶液(0.05mol/L)，静置10分钟，加0.5ml盐酸溶液(0.05mol/L)中和，然后加乙腈稀释至刻度，摇匀，离心取上清液，作为供试品溶液；同法制备碱破坏空白和空白乳碱破坏空白。
氧化破坏：取氯维地平脂肪乳注射液4ml，置10ml量瓶中，加乙腈3ml，超声15分钟，加1ml 30％过氧化氢溶液，静置10分钟，然后加乙腈稀释至刻度，摇匀、离心取上清液，作为供试品溶液；同时做氧化破坏空白和空白乳氧化破坏空白。
高温破坏：取40℃10天氯维地平脂肪乳注射液样品4ml，置10ml量瓶中，加乙腈5ml，超声15分钟，放冷，用乙腈稀释至刻度，摇匀，离心取上清液，作为供试品溶液。同法制备空白乳高温破坏空白。
光照破坏：取4500lx±500lx照射10天氯维地平脂肪乳注射液4ml，置10ml量瓶中，加乙腈约5ml，超声15分钟，放冷，用乙腈稀释至刻度，摇匀，离心取上清液，作为供试品溶液。同法制备空白乳光照破坏空白。
2.色谱条件：
高效液相色谱仪：Ultimate 3000；
色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(100×4.6mm，3.5μm)；
流速：1.0ml/min；
柱温：30℃；
检测器：紫外(DAD)检测器；
流动相：流动相A为磷酸盐缓冲液(50mmol/L磷酸二氢钠溶液，磷酸调pH值至3.5)；流动相B为乙腈；流动相C为甲醇，按下表进行梯度洗脱：
Figure BDA0001004703890000091
分别取氯维地平及其脂肪乳注射液的供试品溶液，分别注入液相色谱仪，按上述色谱条件分析，并考察分离度。结果显示：原料中未破坏样品中主要杂质为3、4、5、6、8和12；酸破坏主要增加杂质3；碱破坏主要增加杂质3、7；氧化破坏主要增加杂质12和4；高温破坏主要增加杂质4；光照破坏主要增加杂质3和4。制剂中未破坏样品中主要杂质为11、3、13、5和4；酸破坏主要增加杂质3、14/15、13；碱破坏主要增加杂质3、7；氧化破坏主要增加杂质12和4；高温破坏主要增加杂质3、14/15、13、16和4；光照破坏主要增加杂质3和4。该色谱系统可将酸、碱、氧化、热和光破坏条件下的各降解产物较好的分离，空白辅料没有干扰，在上述各图中，氯维地平与相邻峰的分离度均大于1.5，峰纯度均在980以上，表明本法的专属性良好。
实施例5市售氯维地平脂肪乳注射液有关物质的测定
1.供试品的配制
市售氯维地平脂肪乳注射液来源于阿斯利康制药有限公司，规格为50ml:25mg。
氯维地平脂肪乳注射液供试品及自身对照溶液的配制同实施例1。
2.色谱条件
高效液相色谱仪：Ultimate 3000；
色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(100×4.6mm，3.5μm)；
流速：1.0ml/min；
柱温：30℃；
检测器：紫外检测器，检测波长为239nm；
流动相：流动相A为(50mmol/L磷酸二氢钠溶液，磷酸调pH值至3.5)；流动相B为乙腈；流动相C为甲醇，按下表进行梯度洗脱：
Figure BDA0001004703890000101
取供试品溶液和自身对照溶液分别进样，结果表明，图中保留时间28.512min的色谱峰为氯维地平，除杂质3、4和5均小于0.5％外，其他单一杂质均小于0.2％，总杂含量低于1.5％，各杂质间及杂质与氯维地平间的分离度均符合要求，符合氯维地平脂肪乳注射液制剂要求。
对比实施例：
实施例6氯维地平及其脂肪乳注射液中有关物质检测
1.氯维地平原料及其脂肪乳注射液供试品及自身对照溶液的配制同实施例1。
2.色谱条件：
高效液相色谱仪：Ultimate 3000；
色谱柱：用PVA硅胶为填充剂(150×4.6mm，5μm)；
流速：1.0ml/min；
柱温：30℃；
检测器：紫外检测器；
流动相：庚烷-异丙醇(90:10)
分别取氯维地平及其脂肪乳注射液的供试品溶液，分别注入液相色谱仪，按上述色谱条件分析，记录色谱图，并考察分离度，结果显示：杂质1、9、10、11、12等均无法有效分离，制剂中辅料干扰严重。
实施例7氯维地平及其脂肪乳注射液中有关物质检测
1.供试品及自身对照溶液的配制同实施例1。
2.色谱条件：
高效液相色谱仪：Ultimate 3000；
色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(100×4.6mm，3.5μm)；
流速：1.0ml/min；
柱温：30℃；
检测器：紫外检测器；
流动相：流动相A为(20mmol/L磷酸二氢钠溶液，磷酸调pH值至3.5)；流动相B为乙腈，按下表进行梯度洗脱：
Figure BDA0001004703890000111
分别取氯维地平及其脂肪乳注射液的供试品溶液，分别注入液相色谱仪，按上述色谱条件分析，记录色谱图，并考察分离度，结果显示：杂质3与杂质11、12以及杂质13与杂质16均无法有效分离。
实施例8氯维地平及其脂肪乳注射液中有关物质检测
1.氯维地平原料及其脂肪乳注射液供试品及自身对照溶液的配制同实施例1。
2.色谱条件：
高效液相色谱仪：Ultimate 3000；
色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(100×4.6mm，3.5μm)；
流速：1.0ml/min；
柱温：30℃；
检测器：紫外检测器；
流动相：流动相A为(20mmol/L磷酸二氢钠溶液，磷酸调pH值至3.5)；流动相B为甲醇，按下表进行梯度洗脱：
Figure BDA0001004703890000121
分别取氯维地平及其脂肪乳注射液的供试品溶液，分别注入液相色谱仪，按上述色谱条件分析，记录色谱图，并考察分离度，结果显示：杂质5与氯维地平以及杂质13与杂质14/15均无法有效分离。

Claims (8)

1.一种氯维地平及其脂肪乳注射液中有关物质的检测方法，其特征在于检测方法采用高效液相色谱法，色谱条件为：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的反相色谱柱；
检测器：紫外检测器，检测波长为220～245nm；
柱温：20℃～40℃；
流速：0.5ml～1.5ml/min；
流动相：流动相A为磷酸盐缓冲液，流动相B为乙腈，流动相C为甲醇；
流动相采用以下方式进行梯度洗脱：
0～10min，流动相A为60-70％，流动相B为15-25％，流动相C为10-20％；
10～15min，流动相A为45-65％，流动相B为20-35％，流动相C为15-20％；
15～40min，流动相A为40-45％，流动相B为35-40％，流动相C为20％；
40～50min，流动相A为40-45％，流动相B为35-40％，流动相C为20％；
所述氯维地平及其脂肪乳注射液中有关物质为：
杂质1：(Z)-2,3-二氯亚苄基乙酰乙酸甲酯；
杂质2：4-(2,3-二氯苯基)-1,4-二氢-2,6-二甲基-3,5-吡啶二甲酸甲基(2-氰乙基)甲酯；
杂质3：4-(2,3-二氯苯基)-5-甲酯基-2,6-二甲基-1,4-二氢吡啶-3-羧酸钠；
杂质4：3-((丁酰氧基)甲基)-5-甲基-4-(2,3-二氯苯基)-2,6-二甲基吡啶-3,5-二羧酸二乙酯；
杂质5：4-(2,3-二氯苯基)-2,6-二甲基-1,4-二氢吡啶-3-羧酸甲酯；
杂质6：4-(2,3-二氯苯基)-2,6-二甲基-1,4-二氢吡啶-3,5-二甲酸(1-丁酰氧基)甲酯；
杂质7：4-(2,3-二氯苯基)-2,6-二甲基-1,4-二氢吡啶-3,5-二羧酸二甲酯；
杂质8：4-(2,3-二氯苯基)-2,6-二甲基-1,4-二氢吡啶-3,5-二羧酸乙基甲基酯；
杂质9：(E)-2,3-二氯亚苄基乙酰乙酸甲酯；
杂质10：3-(2-氰乙基)-5-甲基-4-(2,3-二氯苯基)-2,6-二甲基吡啶-3,5-二羧酸二乙酯；
杂质11：4-(2,3-二氯苯基)-2,6-二甲基-1,4-二氢吡啶-3,5-二羧酸；
杂质12：4-(2,3-二氯苯基)-5-甲酯基-2,6-二甲基吡啶-3-羧酸；
杂质13：4-(2,3-二氯苯基)-2,6-二甲基-吡啶-3-羧酸甲酯；
杂质14：(1S,6S)-6-(2,3,-二氯苯基)-2-甲基-4-羰基-2-环己烯酸甲酯；
杂质15：(1R,6S)-6-(2,3,-二氯苯基)-2-甲基-4-羰基-2-环己烯酸甲酯；
杂质16：(1S,6R)-6-(2,3,-二氯苯基)-4-甲基-2-羰基-3-环己烯酸甲酯。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述流动相A为20～50mmol/L磷酸二氢钠溶液，磷酸调pH值至3.0～4.0。
3.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于所述流动相A为50mmol/L磷酸二氢钠溶液，磷酸调pH值至3.5。
4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述检测波长238～240nm。
5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述检测波长239nm。
6.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述流速为0.9～1.1ml/min。
7.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述色谱柱温度25～30℃。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的检测方法，其特征在于按下表进行梯度洗脱：
Figure FDA0002372134320000021
。
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