CN107446972A - 一种双酶法生产海藻糖的监控方法 - Google Patents

一种双酶法生产海藻糖的监控方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种双酶法生产海藻糖的监控方法，首先安装近红外实时监测与控制系统；采集淀粉液化液用斐林试剂法测定DE值，采集催化液用pH计测定pH值、用高效液相色谱法测定海藻糖含量，并与对应采集的近红外光谱进行关联，建立起生产过程中DE值、海藻糖含量及pH值变化的定量模型并校正；然后利用所建立模型对生产过程中DE值、海藻糖含量及pH值进行快速检测，利用控制系统稳定DE值为8‑20，稳定pH值在麦芽寡糖基海藻糖合成酶‑MTSase及麦芽寡糖基海藻糖水解酶‑MTHase活力最佳范围内。本方法不但可以对淀粉液DE值及反应液海藻糖含量进行实时监测，而且可自动控制pH值和海藻糖含量变化，结果准确可靠。

Description

一种双酶法生产海藻糖的监控方法
技术领域
本发明属于一种关于海藻糖的发明，更具体地讲，本发明涉及一种有关双酶法生产海藻糖的监测和控制的方法。
背景技术
海藻糖-Trehalose是由两分子葡萄糖以α，α-1，1-糖苷键相连而成的非还原性二糖，由于其具有对生物体优良的抗逆保护作用等优良性能而被誉为“生命之糖”和“二十一世纪的新型糖类”，其大规模制造方法受到广泛关注；海藻糖的生产方法有天然生物提取法、微生物发酵法、化学合成法、基因工程法和酶转化法；目前工业化生产基本采用酶转化法，主要又分单酶法和双酶法；在双酶法生产海藻糖生产过程中，麦芽寡糖基海藻糖合成酶-MTSase作用于底物还原端的C-OH，产生α-1，4-糖苷键到α，α-1，1-糖苷键的分子内转糖基作用，形成中间产物麦芽寡糖基海藻糖，麦芽寡糖基海藻糖水解酶-MTHase则专一地内切该中间产物中麦芽寡糖基与海藻糖相连的α-1，4糖苷键，使之分解产生海藻糖和减少2个葡萄糖单位的新麦芽寡糖，该新麦芽寡糖作为新底物进行下一轮反应，如此反复交替进行，就可以将淀粉液化后的麦芽寡糖或直链淀粉转化成海藻糖以及少量葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖产物；其中淀粉液化DE值、MTSase和MTHase的性质决定了淀粉对海藻糖的转化率，该转化率的高低直接关系到后续海藻糖的结晶率及终产品海藻糖的成本；海藻糖生产企业现用斐林试剂法测DE值，用高效液相色谱HPLC来检测海藻糖的组分，以控制反应时间和产物质量，费时费事，成本较高，而且难以实时测出工艺过程中的成分变化，更难精确控制生产工艺；因此，发展形成双酶法生产海藻糖的在线监控技术，对于海藻糖生产技术进步和产品质量升级具有重大现实意义。
近红外光谱near-infraredspectroscopy，NIRS分析技术是上世纪90年代发展起来的一项现代分析技术，它综合运用了计算机技术、光谱技术和化学计量等多个学科的最新研究成果，以其独特的高效、快速、成本低、环保等突出优点，在农业、食品、石油化工和制药工程等学科中得到了广泛应用；文献“酿酒酵母胞内海藻糖的提取纯化及近红外检测，骆莹，2011”首次报道了近红外快速检测酿酒酵母内海藻糖含量是可行的，但由酿酒酵母提取海藻糖属于生物提取法，在海藻糖实际生产中没有产业化价值；目前尚无利用近红外检测酶法生产海藻糖含量的报道，更无利用近红外监控海藻糖生产的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是将双酶法生产海藻糖过程中需人工频繁进行的DE值检测及海藻糖含量检测改为近红外自动检测并根据其变化自动控制加碱量以实现生产最优化自动调控的目的，即提供一种方法：应用近红外实时检测双酶法生产海藻糖过程中淀粉液化液的DE值，海藻糖含量，通过计算分析其含量变化与pH值变化之间的关系建立模型并校正，进而确定加碱时间及加碱量以稳定反应液的pH值使之处于MTSase和MTHase活力最高的最适pH范围内，从而达到生产最优化自动调控的目的。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案包括三个步骤：步骤一，安装近红外监测和控制系统；步骤二，生产、采样、检测、建模、校正：依（a）淀粉乳制备、（b）淀粉液化反应、（c）灭酶、（d）pH值初调、（e）加普鲁兰酶切枝、（f）调pH、（g）双酶催化反应、（h）灭酶、（i）加糖化酶糖化、（j）灭酶、（k）过滤、（l）脱色、（m）阴-阳离子交换、（n）浓缩、（o）结晶、（p）干燥流程进行双酶法生产海藻糖，在（b）淀粉液化反应及（g）双酶催化反应过程中采样、建模、校正；步骤三，将所装近红外监测和控制系统及校正模型用于（b）淀粉液化反应及（g）双酶催化反应在线监控。
步骤一、安装近红外实时监测和控制系统，包括贮料罐（1）、节流阀（2）、喷射液化器（3）、蒸汽进汽管（4）、控制阀（5）、液化罐（6）、节流阀（7）、检测池(8)、光纤(9)、近红外光谱仪(10)、计算机(11)、控制阀（12）、反应罐（13）、节流阀（14）、检测池(15)、光纤(16)、近红外光谱仪(17)、计算机(18)、加碱池（19）、控制阀（20），其中贮料罐（1）通过节流阀（2）与喷射液化器（3）相连，喷射器上有蒸汽进汽管（4）与物料控制阀（5），淀粉液化后从液化罐（6）经控制阀（12）进反应罐（13），液化罐（6）经节流阀（7）与检测池（8）相连，检测池(8)两边连接光纤（9），光纤（9）与近红外光谱仪（10）连接，近红外光谱仪（10）与计算机（11）连接，计算机（11）同时与控制阀（12）连接，反应罐（13）经节流阀（14）与检测池（15）相连，检测池(15)两边连接光纤(16)，光纤(16)与近红外光谱仪(17)连接，近红外光谱仪(17)与计算机(18)连接，计算机（18）同时与加碱池（19）连接，加碱池（19）通过节流阀（20）与反应罐（13）相连。
步骤二，生产、采样、检测、建模、校正包括：（A）将淀粉与水在贮料罐（1）内按10-30：100的重量比调成淀粉乳，调pH到5.0-6.0，按酶：淀粉=1-3：5000重量比加入耐高温α-淀粉酶，输送到喷射液化器（3），通过进汽管（4）升温到85-95℃，在液化罐（6）中维持40-80分钟对淀粉进行液化，按每10分钟间隔分时取样，用斐林试剂法测定DE值并通过光纤（9）、近红外光谱仪（10）实时扫描采集各样本的近红外光谱信息，取平均光谱用于近红外建模；（B）取DE值在8-20的液化液在反应罐（13）内加酸调pH1.5-2.5灭酶10-20分钟后，调pH到5.5-5.7，按酶：淀粉=5-15：5000重量比加普鲁兰酶将其中支链淀粉糊精切枝成直链淀粉糊精；（C）根据所用MTSase及MTHase的性质，调好温度和pH值后加入合适比例的MTSase及MTHase进行催化反应；在催化反应过程中分时采样，并用pH计实时测定各样本pH值、用高效液相色谱法实时测定各样本的海藻糖含量，用光纤（16）和近红外光谱（17）实时扫描采集各样本的近红外光谱信息，取平均光谱用于近红外建模；（D）然后通过计算分析，建立起双酶法生产过程中DE值定量模型、海藻糖含量变化及其与pH值变化相关联的定量模型并校正；（E）催化反应结束后，对反应液按高温灭酶-加糖化酶糖化-灭酶-过滤-脱色-阴、阳离子交换-浓缩-结晶-干燥的流程进行后续加工，即得海藻糖产品。
步骤三、将所装近红外监测和控制系统及校正模型用于（b）淀粉液化反应及（g）双酶催化反应在线监控，具体包括：使淀粉液化液DE值控制在8-20；当海藻糖含量增速下降到设定值时，通过加碱池（19）经节流阀（20）加碱到反应罐（13）调节pH值稳定在MTSase及MTHase酶活力最高区间。
本发明与现有技术相比，具有如下优点：双酶法生产海藻糖现有技术用斐林试剂法测定DE值、高效液相色谱法检测海藻糖含量，费时费力，本发明方法可以对双酶法生产海藻糖的淀粉液化液及反应液进行实时取样，利用近红外光谱仪实时监测淀粉液化液DE值和反应液中的海藻糖的含量，自动调控稳定反应液的pH值，结果准确可靠；与不调控pH相比，明显提高了海藻糖得率并缩短了反应时间，与人工调控pH及检测相比，省时省力，既方便快捷又节省了人工，降低了监控和生产成本。
附图说明
图1为双酶法生产海藻糖近红外实时监控系统。
图2为双酶法生产海藻糖淀粉液化液近红外原始光谱。
图3为双酶法生产海藻糖淀粉液化液经2D预处理的近红外光谱。
图4为PLS模型的校正集和预测集DE的预测值与真值的关系。
图5为双酶法生产海藻糖催化反应液近红外原始光谱。
图6为双酶法生产海藻糖催化反应液经1D预处理的近红外光谱曲线。
图7为PLS模型的校正集和预测集海藻糖的预测值与真值的关系。
具体实施方式
为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施例作进一步说明；应理解，这些实施例仅用于对本发明进一步说明，而不用于限制本发明的范围；此外应理解，在阅读了本发明所述的内容后，该领域的技术人员对本发明作出一些非本质的改动或调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1系统安装：安装近红外实时监测和控制系统，由贮料罐（1）、节流阀（2）、喷射液化器（3）、蒸汽进汽管（4）、控制阀（5）、液化罐（6）、节流阀（7）、检测池(8)、光纤(9)、近红外光谱仪(10)、计算机(11)、控制阀（12）、反应罐（13）、节流阀（14）、检测池(15)、光纤(16)、近红外光谱仪(17)、计算机(18)、加碱池（19）、控制阀（20）组成，其中贮料罐（1）通过节流阀（2）与喷射液化器（3）相连，喷射器上有蒸汽进汽管（4）与物料控制阀（5），淀粉液化后从液化罐（6）经控制阀（12）进反应罐（13），液化罐（6）经节流阀（7）与检测池（8）相连，检测池(8)两边连接光纤（9），光纤（9）与近红外光谱仪（10）连接，近红外光谱仪（10）与计算机（11）连接，计算机（11）同时与控制阀（12）连接，反应罐（13）经节流阀（14）与检测池（15）相连，检测池(15)两边连接光纤(16)，光纤(16)与近红外光谱仪(17)连接，近红外光谱仪(17)与计算机(18)连接，计算机（18）同时与加碱池（19）连接，加碱池（19）通过节流阀（20）与反应罐（13）相连。
实施例2淀粉液化及检测：将淀粉与水在贮料罐（1）内按20:100的重量比调成淀粉乳，调pH到5.5，按酶：淀粉=2：5000重量比加入耐高温α-淀粉酶，输送到喷射液化器（3），通过进汽管（4）升温到90℃，在液化罐（6）中维持60分钟对淀粉进行液化，按每10分钟间隔分时取样，用斐林试剂法测定DE值，并通过光纤（9）、近红外光谱仪（10）采集各样本对应的近红外光谱。
实施例3淀粉糊精切枝：取DE值在15的液化液在反应罐（13）内加HCI调pH到2保持15分钟灭酶后，调NaOH调pH到5.6，按酶：淀粉=2：1000重量比加普鲁兰酶将其中支链淀粉糊精切枝成直链淀粉糊精。
实施例4催化反应及检测：将实施例3中切枝后的液化液温度调到44-46℃，加酸或碱调pH到6，按MTSase：MTHase：淀粉糊精=4：8：1000的重量比加入来自根瘤菌（Rhizobium sp.）CCTCC AB207877的MTSase及MTHase酶液，分别对催化反应过程中不调pH及调pH的2个催化反应进行分时取样，用上海雷磁pH计实时测定各样本pH值；用高效液相色谱法实时测定对应各样本的海藻糖含量，结果见表2，高效液相色谱条件：氨基柱—Agela InnovalNH2，5 μm，4.6×250 mm；流动相：乙腈/水，体积比为80/20；流速：1.0 mL/min；检测器：视差折光检测器；进样量：10 μL；柱温：35 ℃；参照海藻糖国标GB/T 23529-2009对各样本海藻糖含量进行检测；用光纤（16）和近红外光谱（17）实时扫描采集各样本的近红外光谱信息。
实施例5近红外光谱采集，分时采集上述各样本的近红外光谱图，仪器：美国Thermo Nicolet公司AntarisⅡ型傅立叶变换近红外光谱仪， TE-InGaAs检测器，光谱采集及信息处理软件为TQ analyst软件，光谱采集条件：扫描范围4000～10000cm-1，分辨率8cm-1，扫描次数32次，增益为2，扫描2次，图2、图4为波数在4000~10000cm-1的样本NIRS谱图，取平均光谱用于近红外建模。
实施例6光谱数据处理：运用平滑、一阶微分、二阶微分等预处理方法处理样品的光谱数据，以消除光谱测量中引入的噪声影响；经主成分回归分析及偏最小二乘法算法PLS分析，剔除异常样品，从而提高校正模型的预测能力和稳定性。
实施例7评估依据：对建立模型的预测性能采用相关性（R）、交叉验证均方根误差(RMSECV)和预测均方根误差(RMSEP)的评价方式，计算方法依（I）~（III）所示：
(I)
(II)
(III)
式中：
——校正样品的预测值，g/100mL
——对应的参考值，g/mL
——所有校正样品的均值，g/100mL
——预测样品总数
n ——校正样品的总数。
实施例8光谱预处理方法比较：
表1 不同预处理方法下淀粉液化液DE值的PLS建模
表1中比较了无预处理、一阶微分处理1D、二阶微分处理2D、SG平滑互相组合后的建模效果，发现经2D预处理后的RSMEC、RMSEP值最接近于0，训练集相关系数Rc、预测集相关系数Rp最接近于1，效果最优；图3为原光谱经2D预处理后的液化液NIRS谱图；图4为DE值模型的预测值与真实值散点图；图中，模型的Rc 0.999，Rp为0.999，
表2 不同预处理方法下双酶法生产海藻糖含量的PLS建模
表2中比较了无预处理、一阶微分处理1D、二阶微分处理2D、SG平滑互相组合后的建模效果，发现经1D预处理后的RSMEC、RMSEP值最接近于0，训练集相关系数Rc、预测集相关系数Rp最接近于1，效果最优；图6为原光谱经1D预处理后的反应液NIRS谱图；图7为海藻糖含量模型的预测值与真实值散点图；图中，模型的Rc 0.997，Rp为0.984。
实施例9模型应用及效果：将上述所得校正模型和数据用于所装近红外监测系统进行液化DE值监测和催化反应在线监控，在液化反应过程中，当近红外预测DE≥15时即停止液化反应；在催化反应过程中，设定10分钟为单位反应时间，在反应最初21小时内，当海藻糖含量增速下降到≤0.18g/100mL/10min时，加碱池通过节流阀（20）按50mmol/LNaOH自动加碱，使海藻糖含量增速>0.18g/100mL/10min，pH值稳定在海藻糖酶活力最高区间，由表3可以看出，自控调节pH的反应与不调pH反应相比，其海藻糖转化率提高（72.8-60.1）/60.1=21.1%，反应时间缩短(30-18)/30=40%，具有明显的改善效果，
表3 根据海藻糖含量变化调控pH及其对照结果
说明：TH为海藻糖含量高效液相色谱HPLC测定值g/100mL，TN为海藻糖含量近红外预测值g/100mL；pH为pH计实测值，ΔpH为单位时间内pH的增减值，ΔTN为单位时间内海藻糖近红外预测值的变化量，g/100mL/h，海藻糖转化率=最后两个分时样本海藻糖含量均值/初始淀粉含量。
实施例10-后续加工：催化反应结束后，对反应液按高温灭酶-加糖化酶糖化-灭酶-过滤-脱色-阴、阳离子交换-浓缩-结晶-干燥的流程进行后续加工，即得海藻糖产品。

Claims (3)

1.一种双酶法生产海藻糖的监控方法，包括以下步骤：依（a）淀粉乳制备、（b）淀粉液化反应、（c）灭酶、（d）pH值初调、（e）加普鲁兰酶切枝、（f）调pH、（g）双酶催化反应、（h）灭酶、（i）加糖化酶糖化、（j）灭酶、（k）过滤、（l）脱色、（m）阴-阳离子交换、（n）浓缩、（o）结晶、（p）干燥流程进行双酶法生产海藻糖，其特征在于，在（b）淀粉液化反应及（g）双酶催化反应过程中采样，利用近红外检测、建模、校正，将所装近红外监测和控制系统及校正模型用于（b）淀粉液化反应及（g）双酶催化反应在线监控；具体包括以下步骤：
步骤一，安装近红外实时监测和控制系统，包括贮料罐（1）、节流阀（2）、喷射液化器（3）、蒸汽进汽管（4）、控制阀（5）、液化罐（6）、节流阀（7）、检测池(8)、光纤(9)、近红外光谱仪(10)、计算机(11)、控制阀（12）、反应罐（13）、节流阀（14）、检测池(15)、光纤(16)、近红外光谱仪(17)、计算机(18)、加碱池（19）、控制阀（20），其中贮料罐（1）通过节流阀（2）与喷射液化器（3）相连，喷射器上有蒸汽进汽管（4）与物料控制阀（5），淀粉液化后从液化罐（6）经控制阀（12）进反应罐（13），液化罐（6）经节流阀（7）与检测池（8）相连，检测池(8)两边连接光纤（9），光纤（9）与近红外光谱仪（10）连接，近红外光谱仪（10）与计算机（11）连接，计算机（11）同时与控制阀（12）连接，反应罐（13）经节流阀（14）与检测池（15）相连，检测池(15)两边连接光纤(16)，光纤(16)与近红外光谱仪(17)连接，近红外光谱仪(17)与计算机(18)连接，计算机（18）同时与加碱池（19）连接，加碱池（19）通过节流阀（20）与反应罐（13）相连；
步骤二，生产、采样、检测、建模、校正，包括：（A）将淀粉与水在贮料罐（1）内按10-30：100的重量比调成淀粉乳，调pH到5.0-6.0，按酶：淀粉=1-3：5000重量比加入耐高温α-淀粉酶，输送到喷射液化器（3），通过进汽管（4）升温到85-95℃，在液化罐（6）中维持40-80分钟对淀粉进行液化，按每10分钟间隔分时取样，用斐林试剂法测定DE值并通过光纤（9）、近红外光谱仪（10）实时扫描采集各样本的近红外光谱信息，取平均光谱用于近红外建模；（B）取DE值在8-20的液化液在反应罐（13）内加酸调pH1.5-2.5灭酶10-20分钟后，调pH到5.5-5.7，按酶：淀粉=5-15：5000重量比加普鲁兰酶将其中支链淀粉糊精切枝成直链淀粉糊精；（C）根据所用MTSase及MTHase的性质，调好温度和pH值后加入合适比例的MTSase及MTHase进行催化反应；在催化反应过程中分时采样，并用pH计实时测定各样本pH值、用高效液相色谱法实时测定各样本的海藻糖含量，用光纤（16）和近红外光谱（17）实时扫描采集各样本的近红外光谱信息，取平均光谱用于近红外建模；（D）然后通过计算分析，建立起双酶法生产过程中DE值定量模型、海藻糖含量变化及其与pH值变化相关联的定量模型并校正；（E）催化反应结束后，对反应液按高温灭酶-加糖化酶糖化-灭酶-过滤-脱色-阴、阳离子交换-浓缩-结晶-干燥的流程进行后续加工，即得海藻糖产品；
步骤三、将所装近红外监测和控制系统及校正模型用于（b）淀粉液化反应及（g）双酶催化反应在线监控，具体包括：使淀粉液化液DE值控制在8-20；当海藻糖含量增速下降到设定值时，通过加碱池（19）经节流阀（20）加碱到反应罐（13）调节pH值稳定在MTSase及MTHase酶活力最高区间。
2.根据权利要求1所述的一种双酶法生产海藻糖的监控方法，其特征在于，所述步骤二中（g）双酶催化反应所加的酶为来自根瘤菌（Rhizobium sp.）CCTCC AB207877的MTSase及MTHase，其最适温度为40-46℃，最适pH范围为5.6-6.0。
3.根据权利要求1所述的一种双酶法生产海藻糖的监控方法，其特征在于，所述步骤二中样品近红外光谱采集条件为：扫描波数范围4000～10000cm-1，分辨率8cm-1，扫描次数32-96次，每个样品测定2-3次；所述高效液相色谱法测定海藻糖的色谱条件为：氨基柱-Agela Innoval NH2，5 μm，4.6×250 mm；流动相：乙腈/水，体积比为80/20；流速：1.0 mL/min；检测器：视差折光检测器；进样量：10 μL；柱温：35 ℃。
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