CN107446035A - 新蛋白材料 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种新蛋白材料。所述蛋白材料包含2～15mg/100mg的量的血管生成素和/或血管生成素水解产物，以及与血管生成素和/或血管生成素水解产物的质量比为0.003～0.6的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白水解产物。

Description

新蛋白材料
本申请是申请日为2012年07月31日、进入中国的申请号为201280074973.9、发明名称为“新蛋白材料”的申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及新蛋白材料，和包含该蛋白材料的药物、饮食品或饲料，并用于预防和治疗骨疾病。该蛋白材料具有促进成骨细胞增殖，并抑制破骨细胞分化和破骨细胞的骨吸收的功能。因此，该蛋白材料用于预防和治疗各种骨疾病，如骨质疏松症、骨折、风湿病和关节炎。
背景技术
近年来，在全球范围内伴随着社会老龄化等，各种骨疾病，例如骨质疏松、骨折和腰疼增加，并且已变为严重的社会问题。这些疾病由钙摄入不足，钙吸收能力下降，闭经期后激素失衡等引起。据认为，从生命早期开始通过活化成骨细胞和骨形成尽可能地增加体内骨量，并且增加最大骨量和骨强度(骨密度+骨质)在预防各种骨疾病，例如骨质疏松、骨折和腰疼方面是有效的。注意术语“骨质”涉及骨显微结构、代谢更新(metabolicturnover)、微裂纹和钙化。据称各种骨疾病，例如骨质疏松、骨折和腰疼可通过抑制破骨细胞的骨吸收来预防。骨以平衡的方式反复吸收和形成(重塑)。然而，当由于闭经期后激素平衡变化等引起骨吸收超过骨形成时，可发生各种骨疾病，例如骨质疏松、骨折和腰疼。因此，通过抑制破骨细胞的骨吸收和维持骨强度在恒定水平可使骨得到强化。
考虑到上述情形，为了强化骨，已摄取了单独添加钙盐，例如碳酸钙、磷酸钙或乳酸钙的钙盐或者天然钙制品，例如乳清钙、牛骨粉或鸡蛋壳的药物、饮食品或饲料等。还使用包含此类钙制品以及具有钙吸收促进效果的物质，例如酪蛋白磷肽或寡聚多糖的药物、饮食品或饲料等来强化骨。然而，当摄取包含钙盐或天然钙制品的饮食品时钙吸收率为50％以下，并且摄取的大部分钙可能排出体外而没有被吸收。另外，即使钙被吸收入体内，由于对骨的亲和性可根据其形式或同时摄取的营养成分的类型而不同，也未必显示骨代谢改善效果或骨强化效果。作为用于治疗骨质疏松或强化骨的药物已知雌激素制品、活性维生素D3制品、维生素K2制品、双膦酸盐制品和降钙素制品等，并且还开发了新型药物例如抗RANKL抗体。然而，这些药物可具有副作用例如耳鸣、头痛或食欲不振。另外，从安全和成本等观点，目前上述物质处于不能将其添加到饮食品的状况。因此，已需要开发根据各种骨疾病例如骨质疏松、骨折和腰疼的性质，可长期经口摄取，通过促进骨形成和抑制骨吸收来增加骨强度，并且可期望具有预防或治疗各种骨疾病的效果的此类骨强化剂、饮食品或饲料。
存在几种意欲改善骨强度的食材，例如，已报道了源自乳的碱性蛋白质或其酶促水解产物的肽级分显示成骨细胞增殖活性、破骨细胞的骨吸收抑制活性，以及由此的骨强化作用(参见专利文献1)。还已报道了包含在源自乳的碱性蛋白级分的血管生成素和抑半胱氨酸蛋白酶蛋白独立地具有改善骨代谢的功能(参见专利文献2和3)。
现有技术文献
专利文献
[专利文献1]JP-A-H08-151331
[专利文献2]JP-A-H10-7585
[专利文献3]JP-A-2000-281587
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的为提供新蛋白材料，所述蛋白材料安全，且通过日常摄取促进成骨细胞增殖，同时抑制破骨细胞分化和破骨细胞的骨吸收，因而可强化骨。
本发明的另一目的为提供通过经口摄取用于预防和治疗各种骨疾病如骨质疏松症、骨折、风湿病和关节炎的骨强化药物、饮食品或饲料。
用于解决问题的方案
本发明人已发现，有效促进成骨细胞增殖以及抑制破骨细胞分化和破骨细胞的骨吸收的作用可通过摄取包含特定量血管生成素和/或血管生成素的水解产物，并相对于血管生成素和/或血管生成素的水解产物以特定的质量比进一步包含抑半胱氨酸蛋白酶蛋白(cystatin)和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物的蛋白材料来获得。该发现导致本发明的完成。
具体地，本发明包括以下方面：
(1)一种蛋白材料，其包含2～15mg/100mg的量的血管生成素和/或血管生成素的水解产物，以及以与血管生成素和/或血管生成素的水解产物的质量比为0.003～0.6的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物。
(2)一种饮食品或饲料，其包含根据(1)所述的蛋白材料。
(3)一种骨强化剂，其包含根据(1)所述的蛋白材料作为活性成分。
(4)一种骨强化方法，其包括以5mg/天以上的量摄取根据(1)所述的蛋白材料。
(5)一种制备根据(1)所述的蛋白材料的方法，其包括下列步骤1)～3)：
1)制备血管生成素和/或血管生成素的水解产物；
2)制备抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物；和
3)混合根据上述2)所述的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物以及根据上述1)所述的血管生成素和/或血管生成素的水解产物，以使得抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物与血管生成素和/或血管生成素的水解产物的质量比为0.003～0.6。
(6)一种制造根据(1)所述的蛋白材料的方法，其包括从乳和/或源自乳的材料提取包含血管生成素和/或血管生成素的水解产物以及抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物的级分，以使得抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物与血管生成素和/或血管生成素的水解产物的质量比为0.003～0.6。
(7)根据(6)所述的方法，其进一步包括将包含于所述级分中的血管生成素和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白酶促水解的另外的步骤。
发明的效果
本发明的蛋白材料通过促进成骨细胞增殖以及抑制破骨细胞分化和破骨细胞的骨吸收而显示显著的骨强化作用。本发明的药物、饮食品或饲料强化骨，且用于预防和治疗各种骨疾病，如骨质疏松症、骨折、风湿病和关节炎。
具体实施方式
本发明的蛋白材料的特征在于，该蛋白材料包括特定量的血管生成素和/或血管生成素的水解产物，并且相对于血管生成素和/或血管生成素的水解产物以特定质量比进一步包含抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物。
本发明的蛋白材料可为通过以特定质量比混合包含血管生成素和/或血管生成素的水解产物的级分以及包含抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物的级分获得的混合物，或者通过从乳或源自乳的材料如脱脂乳或乳清等提取以特定质量比包含血管生成素和/或血管生成素的水解产物以及抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物的级分来制备的材料等。本发明的蛋白材料还可包括通过酶促水解血管生成素和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白制备的材料。
当通过混合包含血管生成素和/或血管生成素的水解产物的级分以及包含抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物的级分来制备本发明的蛋白材料时，由哺乳动物如人、奶牛、水牛、山羊或绵羊的乳制备的级分，通过基因工程生产的级分，或由血液或内脏器官纯化的级分等可用作包含血管生成素和/或血管生成素的水解产物的级分以及包含抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物的级分。也可使用商购可得的纯化的血管生成素或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白试剂。在该情况下，本发明的蛋白材料可通过调整抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物与血管生成素和/或血管生成素的水解产物的质量比来制备。
使用一种以上的蛋白酶通过酶促水解上述包含血管生成素的级分、血管生成素试剂、包含抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的级分或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白试剂等获得的产物可用作血管生成素的水解产物或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物。
当通过从乳或源自乳的材料如脱脂乳或乳清直接提取包含特定质量比的血管生成素和/或血管生成素的水解产物以及抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物的级分来制备本发明的蛋白材料时，例如，乳或源自乳的材料可与阳离子交换树脂相接触，接着吸附于树脂上的乳源蛋白可在0.1～2.0M的盐浓度下洗脱，使用反渗透膜、电透析膜、超滤膜或微滤膜等脱盐和浓缩，之后任选地使用蛋白酶如胰蛋白酶、胰酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、激肽释放酶、组织蛋白酶、嗜热菌蛋白酶或V8蛋白酶进行有限的水解至8000以下的分子量。当使用蛋白酶进行有限水解时，优选分子量的下限为500以上。由此获得的蛋白材料可通过冷冻干燥或喷雾干燥等干燥。
当使本发明的蛋白材料进行LC/MS/MS分析时，在以常用方式使用消化酶于还原条件下进行修饰和有限水解，从而进行蛋白材料的蛋白质组分析，之后，证实蛋白材料包含至少一种蛋白质，例如αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白或κ-酪蛋白，以及除了血管生成素和/或血管生成素的水解产物以及抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物以外的其蛋白水解产物。
本发明的蛋白材料包含2～15mg/100mg的量的血管生成素和/或血管生成素的水解产物，并且相对于血管生成素和/或血管生成素的水解产物以0.003～0.6的质量比包含抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物。
如下述试验例所示，当抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物与血管生成素和/或血管生成素的水解产物的质量比为0.003～0.6时，骨强化作用可比单独摄取血管生成素和/或血管生成素的水解产物或者抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物的情况更有效地获得。
注意，仅供参考，在牛乳中血管生成素和/或血管生成素的水解产物的含量为约0.001％，且在牛乳中抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物与血管生成素和/或血管生成素的水解产物的质量比为约2。在乳清蛋白浓缩物(WPC)中血管生成素和/或血管生成素的水解产物的含量为约0.1％，且在乳清蛋白浓缩物中抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物与血管生成素和/或血管生成素的水解产物的质量比为约3。
本发明的蛋白材料可通过适当添加蛋白材料作为活性成分而制备为骨强化剂。本发明的蛋白材料可直接用作骨强化剂。当配制为骨强化剂时，可混合通常用于药物、饮食品和饲料的原料等，例如糖类、脂质、蛋白质、维生素、矿物质或风味剂，并且还可以常用方式配制成粉末状药物、颗粒剂、片剂、胶囊剂或可饮用的制剂等。本发明的蛋白材料可与也显示骨强化作用的其它成分如钙、维生素D、维生素K或异黄酮一起使用。
如下述动物实验所示，当以5mg以上/kg体重的量经口摄取时本发明的蛋白材料可强化骨。由于该实验动物的摄取量对应于以血药浓度计的成人的摄取量(参见MitsuyoshiNakajima(1993),“Yakkou Hyoka Vol.8”,Hirokawa-Shoten Ltd.,pp.2-18)，期望获得骨强化作用，特别是可通过成人一人一日摄取5mg以上本发明的蛋白材料来预防或治疗各种骨疾病如骨质疏松症、骨折、风湿病和关节炎。因此，当与骨强化剂等混合时，蛋白材料可加入其中以便摄入上述必要量。
本发明的蛋白材料可加入普通饮食品，例如酸奶、饮料、华夫饼(wafer)或甜点(dessert)中。在该情况下，本发明的蛋白材料优选根据饮食品的形式以0.25～1000mg/100g饮食品的量添加。期望骨强化作用可通过保持上述混合量来获得。本发明的蛋白材料还可加入饲料，如牲畜饲料或宠物食品，从而制备骨强化饲料。在该情况下，优选以0.25～1000mg/100g饲料的量添加本发明的蛋白材料。
当以药物、饮食品或饲料的形式制备并使用本发明的蛋白材料时，本发明的蛋白材料可通过悬浮或溶解于去离子水中并搅拌混合来使用。搅拌/混合条件不特别限定，只要蛋白材料均匀混合即可。还可使用超分散器或TK均质混合器等搅拌来混合。
蛋白材料的溶液可任选使用反渗透膜等脱盐或浓缩，或者冷冻干燥以使溶液可容易用于药物、饮食品或饲料。
尤其证实了本发明的蛋白材料，即使在蛋白材料进行在药物、饮食品或饲料生产中常用的灭菌处理时也维持骨强化活性。当蛋白材料用作粉末时，蛋白材料可进行干燥加热灭菌。本发明的蛋白材料可以以各种形式如液体、凝胶、粉末或颗粒用于药物、饮食品或饲料。
下面借助参考例、实施例和试验例进一步更加详细地描述本发明。注意，下列实施例仅意于说明目的，且不应理解为限定本发明。
参考例1
血管生成素级分的制备(1)
填充有30kg阳离子交换树脂的柱(磺化Chitopearl；由Fuji Spinning Co.,Ltd.制造)用去离子水充分洗涤，然后将1000升未灭菌的脱脂乳(pH6.7)置于柱中。用去离子水充分洗涤柱后，吸附的蛋白质用线性梯度的0.1～2.0M氯化钠洗脱。包含血管生成素的洗脱级分使用S-琼脂糖阳离子交换层析(由Amersham Bioscientific制造)分级，所得包含血管生成素的级分在90℃下加热处理10分钟，并离心除去沉淀。包含血管生成素的级分进一步继续凝胶过滤层析(柱：Superose 12)。所得洗脱物使用反渗透膜脱盐，并将脱盐的洗脱物冷冻干燥，从而获得16.5g的血管生成素级分，其血管生成素纯度为90％。这些连续操作重复30次。
参考例2
血管生成素级分的制备(2)
填充有10kg肝素琼脂糖的柱(由GE Healthcare制造)用去离子水充分洗涤，然后将500升未灭菌的脱脂乳(pH6.7)置于柱中。用0.5M氯化钠溶液洗涤柱后，吸附的蛋白质用1.5M氯化钠溶液洗脱。洗脱物使用反渗透膜脱盐，并将脱盐的洗脱物冷冻干燥，从而获得18g的血管生成素级分，其血管生成素纯度为5％。上述连续操作重复50次。
参考例3
抑半胱氨酸蛋白酶蛋白级分的制备
100,000升5％的乳清蛋白溶液在90℃下加热处理10分钟，并离心除去沉淀。柱填充有通过将羧甲基化木瓜蛋白酶与Tresyl-Toyopearl(由Tosoh Corporation制造)结合制备的载体。用0.5M氯化钠溶液平衡后，上述乳清蛋白溶液置于柱中。然后，将柱用0.5M氯化钠溶液和含吐温20(0.1％)的0.5M氯化钠溶液顺序洗涤。之后，包含抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的级分用20mM乙酸-0.5M氯化钠溶液洗脱。洗脱的级分立即用1M氢氧化钠溶液中和。洗脱物接着使用反渗透膜脱盐，脱盐的洗脱物冷冻干燥，从而获得9.6g的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白级分，具有抑半胱氨酸蛋白酶蛋白纯度90％。上述连续操作重复20次。
实施例1
混合五点三零毫克(5.30mg)参考例1中获得的血管生成素、84.67mg参考例2中获得的血管生成素级分，和0.03mg参考例3中获得的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白级分，从而制备蛋白材料(实施例制品1)，其中血管生成素和/或血管生成素的水解产物的含量为10mg/100mg，抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物与血管生成素和/或血管生成素的水解产物的质量比为0.003。
实施例2
混合五点三五毫克(5.35mg)参考例1中获得的血管生成素、83.65mg参考例2中获得的血管生成素级分，和1.00mg参考例3中获得的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白级分，从而制备蛋白材料(实施例制品2)，其中血管生成素和/或血管生成素的水解产物的含量为10mg/100mg，抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物与血管生成素和/或血管生成素的水解产物的质量比为0.1。
实施例3
混合五点六五毫克(5.65mg)参考例1中获得的血管生成素、78.35mg参考例2中获得的血管生成素级分，和6.00mg参考例3中获得的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白级分，从而制备蛋白材料(实施例制品3)，其中血管生成素和/或血管生成素的水解产物的含量为10mg/100mg，抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物与血管生成素和/或血管生成素的水解产物的质量比为0.6。
[比较例1]
混合五点三零毫克(5.30mg)参考例1中获得的血管生成素、84.68mg参考例2中获得的血管生成素级分，和0.02mg参考例3中获得的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白级分，从而制备蛋白材料(比较例制品1)，其中血管生成素和/或血管生成素的水解产物的含量为10mg/100mg，抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物与血管生成素和/或血管生成素的水解产物的质量比为0.002。
[比较例2]
混合五点六八毫克(5.68mg)参考例1中获得的血管生成素、77.82mg参考例2中获得的血管生成素级分，和6.50mg参考例3中获得的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白级分，从而制备蛋白材料(比较例制品2)，其中血管生成素和/或血管生成素的水解产物的含量为10mg/100mg，抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物与血管生成素和/或血管生成素的水解产物的质量比为0.65。
[试验例1]
确定实施例制品1～3和比较例制品1和2的成骨细胞增殖效果、破骨细胞的骨吸收的抑制效果和破骨细胞分化的抑制效果。
成骨细胞增殖效果如下所述确定。成骨细胞的细胞系(MC3T3-E1)以2×103细胞/孔的浓度接种于96孔细胞培养板上，并使用增补有10％胎牛血清(FBS)的α-MEM培养基(由GIBCO制造)培养24小时。培养基完全除去后，将90μl的无FBS的α-MEM培养基，和10μl的包含实施例制品1～3和比较例制品1和2任一种的溶液添加至各孔。细胞进一步培养24小时。在添加包含于细胞增殖试剂盒(Cell Proliferation Kit，由GE Healthcare制造)的溴脱氧尿苷(BrdU)之后，将细胞培养2小时，并与过氧化物酶标记的抗-BrdU抗体反应。在添加3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(底物)后，成骨细胞增殖活性通过借助测定450nm下的吸光度测定BrdU引入细胞的量来确定。当450nm下的吸光度显著高于其中实施例制品1～3和比较例制品1和2都不添加至培养基的组(对照)的450nm下的吸光度时，成骨细胞增殖活性确定为阳性。
破骨细胞的骨吸收的抑制效果如下所述确定。从兔(5日大)中取出胫骨和股骨。除去软组织后，将这些骨机械切碎并将包含破骨细胞的全骨髓细胞分散于增补有5％FBS的α-MEM培养基中，接着以1×106细胞/孔的浓度接种于结晶性磷酸钙板(由Corning制造)的孔上。在开始培养之后2小时完全除去培养基，并将180μl的增补有5％FBS的α-MEM培养基，和20μl的包含实施例制品1～3和比较例制品1和2任一种的溶液添加至各孔。细胞培养72小时。通过添加5％的次氯酸钠溶液除去细胞后，使用立体显微镜拍摄形成于磷酸钙板的孔上的吸收窝(pits)，并通过图像分析测定其面积，从而确定破骨细胞的骨吸收的抑制效果(Takeshi Seno等，“Manual of selected cultured cell lines for biosciencebiotechnology”,pp.199-200,1993)。当窝面积显著小于其中实施例制品1～3和比较例制品1和2都不添加至培养基的组(对照)的面积时，对破骨细胞的骨吸收的抑制活性确定为阳性。
破骨细胞分化的抑制效果如下所述确定。从ddy小鼠(7或8周大，雄性)的股骨采集的骨髓细胞以4×104细胞/孔的浓度接种于96孔板上，并在37℃和5％CO2下在200μl增补有10％FBS和M-CSF(25ng/ml)的α-MEM培养基中培养。在开始培养之后2小时完全除去培养基，并将180μl的增补有10％FBS、RANKL(5ng/ml)和M-CSF(25ng/ml)的α-MEM培养基，和20μl的包含实施例制品1至3和比较例制品1和2任一的溶液添加至各孔，并在37℃和5％CO2的条件下培养细胞2天。在更换培养基后，细胞进一步培养1天。在培养完成后，除去培养液，用PBS洗涤，并用丙酮-乙醇(1:1)溶液处理1分钟以固定细胞。之后，添加1.5mg/ml的对硝基苯基磷酸二钠盐-20mM酒石酸钠-50mM柠檬酸缓冲液(pH 4.5)(100μl/孔)，并室温下反应30分钟，接着加入1M氢氧化钠溶液(50μl/孔)终止反应。测定405nm下的吸光度，当做破骨细胞分化/突变的指标。当添加实施例制品1至3或比较例制品1或2的组的405nm下的吸光度显著低于其中实施例制品1至3和比较例制品1和2都不添加至培养基的组(对照)的405nm下的吸光度时，对破骨细胞分化的抑制活性确定为阳性。
结果示于表1。
表1
如表1所示，对应于本发明蛋白材料的实施例制品1至3在所有细胞测定中显示阳性活性。比较例制品1和2还在某些细胞测定中显示阳性活性，但有一个细胞测定显示阴性活性。
实施例4
填充有400g阳离子交换树脂(磺化Chitopearl，由Fuji Spinning Co.,Ltd.制造)的柱(直径：4cm，高度：30cm)用去离子水充分洗涤，并将40升未灭菌的脱脂乳(pH 6.7)以25ml/min的流量置于柱中。用去离子水充分洗涤后，吸附于树脂上的蛋白使用含有0.78M氯化钠的0.02M碳酸盐缓冲液(pH 7.0)洗脱。洗脱物使用反渗透膜脱盐，并将脱盐的洗脱物冷冻干燥，从而获得18g粉末状蛋白材料(实施例制品4)。蛋白材料包含量为2mg/100mg的血管生成素和/或血管生成素的水解产物，抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物与血管生成素和/或血管生成素的水解产物的质量比为0.5。蛋白材料可直接用作骨强化剂或骨强化剂的活性成分。作为蛋白质组分析的结果，发现蛋白材料包含β-酪蛋白的水解产物和κ-酪蛋白的水解产物。
实施例5
填充有30kg阳离子交换树脂(SP Toyopearl；由Tosoh Corporation制造)的柱(直径：20cm，高度：100cm)用去离子水充分洗涤，并将于75℃下加热灭菌15分钟的3t乳清(pH6.2)以10l/min的流速置于柱中。用去离子水充分洗涤后，吸附于树脂上的蛋白质使用含0.68M氯化钠的0.1M柠檬酸缓冲液(pH 5.7)洗脱。洗脱物使用反渗透膜脱盐，并将脱盐的洗脱物冷冻干燥。上述连续操作重复20次，从而获得3.3kg粉末状蛋白材料(实施例制品5)。蛋白材料包含量为15mg/100mg的血管生成素和/或血管生成素的水解产物，抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物与血管生成素和/或血管生成素的水解产物的质量比为0.01。蛋白材料可直接用作骨强化剂或骨强化剂的活性成分。作为蛋白质组分析的结果，发现蛋白材料包含αs1-酪蛋白和κ-酪蛋白的水解产物。
实施例6
四克(4g)实施例制品4的蛋白材料溶于800ml水中。以0.02wt％的终浓度添加胰酶(由Sigma制造)(其为蛋白酶)后，接着将混合物于37℃进行酶促处理8小时。通过90℃热处理5分钟使酶蛋白失活后，将混合物冷冻干燥，从而获得3.2g的蛋白材料(实施例制品6)。由此获得的蛋白材料包含量为2.0mg/100mg的血管生成素的水解产物，蛋白酶抑制剂水解产物与血管生成素的水解产物的质量比为0.45，蛋白材料的分子量为8000以下。因此，蛋白材料可直接用作骨强化剂或骨强化剂的活性成分。作为蛋白质组分析的结果，发现蛋白材料包含β-酪蛋白和κ-酪蛋白的水解产物。
实施例7
四克(4g)实施例制品5的蛋白材料溶于800ml水中。添加胰蛋白酶(由Sigma制造)(其为蛋白酶)以获得0.03wt％的终浓度之后，将混合物于37℃进行酶促处理8小时。通过90℃热处理5分钟使酶蛋白失活后，将混合物冷冻干燥，从而获得3.0g的蛋白材料(实施例制品7)。由此获得的蛋白材料包含量为14mg/100mg的血管生成素的水解产物，蛋白材料中蛋白酶抑制剂水解产物与血管生成素的水解产物的质量比为0.015，蛋白材料的分子量为8000以下。因此，蛋白材料可直接用作骨强化剂或骨强化剂的活性成分。作为蛋白质组分析的结果，发现蛋白材料包含αs1-酪蛋白和κ-酪蛋白的水解产物。
[比较例3]
将十毫克(10mg)参考例3中获得的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白级分和100mg实施例制品4的蛋白材料混合，从而制备蛋白材料(比较例制品3)，其中血管生成素和/或血管生成素的水解产物的含量为1.8mg/100mg，抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物与血管生成素和/或血管生成素的水解产物的质量比为5。
[比较例4]
一克(1g)参考例1中获得的血管生成素级分和2g实施例制品5的蛋白材料混合并溶解于800ml水中。以0.02wt％的终浓度添加胰蛋白酶(由Sigma制造)(其为蛋白酶)之后，将混合物于37℃进行酶促处理12小时。通过90℃热处理5分钟使酶蛋白失活后，将混合物冷冻干燥，从而获得2.8g的蛋白材料(比较例制品4)。由此获得的蛋白材料包含量为39mg/100mg的血管生成素的水解产物，抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物与血管生成素的水解产物的质量比为0.0025。
比较例5
填充有100g阳离子交换树脂(CM Sepharose FF；由GE Healthcare制造)的柱(直径：5cm，高度：5cm)用去离子水充分洗涤，并将40升未灭菌的脱脂乳(pH 6.7)以40ml/min的流量置于柱中。用去离子水充分洗涤后，吸附于树脂上的蛋白质使用含0.98M氯化钠的0.2M碳酸盐缓冲液(pH6.8)洗脱。洗脱物使用反渗透膜脱盐，并将脱盐的洗脱物冷冻干燥。上述连续操作重复20次，从而获得20g粉末状蛋白材料(比较例制品5)。蛋白材料包含量为1.5mg/100mg的血管生成素和/或血管生成素的水解产物，抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物与血管生成素和/或血管生成素的水解产物的质量比为0.001。
试验例2
实施例制品4和5以及比较例制品3和5的各骨强化作用通过动物实验确定。C3H/HeJ小鼠(5周大，雄性)用于动物实验。1周适应环境后，将小鼠分成五组(6只小鼠/组)。小鼠使用试管以每1kg体重5mg的量经口投予实施例制品4或5或者比较例制品3或5，每日一次，共4周。对照组不投予任何实施例制品4和5，也不投予比较例制品3和5。在完成投予后(第四周)，使用微CT(由Rigaku Corporation制造)测定各小鼠的右腔骨的骨密度。结果示于表2。
表2
骨密度(mg/cm3)
对照组 1299±10
实施例制品4 1328±11
实施例制品5 1331±12
比较例制品3 1302±10
比较例制品5 1303±9
如表2所示，经口投予为本发明蛋白材料的实施例制品4或5的组，与对照组和经口投予比较例制品3或5的组相比，显示显著增加的骨密度。
试验例3
实施例制品6和7以及比较例制品4和5的各骨强化作用由动物实验确定。四十八只SD大鼠(51周大，雌性)用于动物实验。
将大鼠分成六组(8只大鼠/组)。五组进行卵巢切除术，并将剩余一组进行假手术(sham surgery)。在4周恢复期后，进行卵巢切除术的大鼠使用管以每1kg大鼠体重5mg的量经口投予实施例制品6或7或者比较例制品4或5，每天一次，共16周。对照组不服用实施例制品6和7以及比较例制品4和5的任一种。4周恢复期后，进行假手术的大鼠以与对照组相同的方式喂食16周。在完成给药后(第16周)，使用微-CT(由Rigaku Corporation制造)测定各大鼠的右腔骨的骨密度。结果示于表3。
表3
骨密度(mg/cm3)
对照组 550±10
假手术组 600±9
实施例制品6 597±11
实施例制品7 595±12
比较例制品4 556±13
比较例制品5 554±11
如表3所示，经口投予为本发明蛋白材料的实施例制品6或7的组，与对照组和经口投予比较例制品4或5的组相比，显示显著增加的骨密度。此外，骨密度接近假手术组的骨密度。
实施例8
骨强化液态营养增补剂的制备
五克(5g)实施例制品4的蛋白材料溶于4995g去离子水中。使用TK-均质混合器(TKROBO MICS；由Tokushu Kika Kogyo co.,ltd.制造)在6000rpm下搅拌溶液30分钟，从而获得包含100mg/100g的实施例制品4的溶液。接着，向5.0kg溶液添加4.0kg酪蛋白、5.0kg大豆蛋白、1.0kg鱼油、3.0kg紫苏子油、18.0kg糊精、6.0kg矿物质混合物、1.95kg维生素混合物、2.0kg乳化剂、4.0kg稳定化剂和0.05kg香精。将混合物装入蒸煮袋(retort pouch)(200ml)中并使用灭菌釜(retort sterilizer)(1类压力容器，RCS-4CRTGN；由Hisaka Works,Ltd.制造)在121℃下灭菌20分钟，从而生产50kg的骨强化液态营养增补剂。观察任意沉淀，并且在由此获得的骨强化液态营养组合物中没有感觉到异常风味。
实施例9
骨强化凝胶样食品的制备
两克(2g)实施例制品5的蛋白材料溶于708g去离子水中。使用超分散器(ULTRA-TURRAX T-25；由IKA Japan制造)在9500rpm下搅拌溶液30分钟。40g山梨糖醇、2g酸味剂、2g香精、5g果胶、5g乳清蛋白浓缩物、1g乳酸钙和235g去离子水加入溶液中。搅拌并混合后，将混合物装入200ml铝箔包装中，并在85℃下灭菌20分钟，将包装密封，从而获得五包(200g)骨强化凝胶样食品。观察任意沉淀，并且在由此获得的骨强化凝胶样食品中没有感觉到异常风味。
实施例10
骨强化饮品的制备
两克(2g)酸化剂溶于706g去离子水中，并将4g实施例制品6的蛋白材料溶于溶液中。使用超分散器(ULTRA-TURRAX T-25；由IKA Japan制造)在9500rpm下搅拌混合溶液30分钟。在添加100g麦芽糖醇、20g还原淀粉糖浆、2g香精和166g去离子水之后，将混合物装入100ml玻璃瓶中。95℃下灭菌15秒后，将瓶紧密密封，从而获得十瓶(100ml)骨强化饮品。观察任意沉淀，并且在由此获得的骨强化饮品中没有感觉到异常风味。
实施例11
骨强化饲料的制备
两克(2kg)实施例制品7的蛋白材料溶于95kg去离子水中。使用TK-均质混合器(MARK II 160；由PRIMIX Corporation制造)在3600rpm下搅拌混合溶液40分钟，从而获得包含2g/100g的实施例制品7的溶液。接着，将12kg大豆粉、14kg粉末状脱脂乳、4kg大豆油、2kg玉米油、23.2kg棕榈油、14kg玉米淀粉、9kg面粉、2kg米糠、5kg维生素混合物、2.8kg纤维素和2kg矿物质混合物加入10kg溶液中。将混合物120℃下灭菌4分钟，从而获得100kg骨强化狗粮。
实施例12
骨强化剂(片剂)的制备
将原料以表4所示的比例混合。然后，以常规方式成形并制锭1g混合物，从而制备骨强化剂。
表4
含水结晶葡萄糖 92.5％(wt％)
蛋白材料(实施例制品1) 1.0％
矿物质混合物 5.0％
糖酯 1.0％
香精 0.5％

Claims (7)

1.一种蛋白材料，其包含2～15mg/100mg的量的血管生成素和/或血管生成素水解产物和与血管生成素和/或血管生成素水解产物的质量比为0.003～0.6的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白水解产物，所述血管生成素水解产物和所述抑半胱氨酸蛋白酶蛋白水解产物的分子量为500-8000。
2.一种饮食品或饲料，其包含根据权利要求1所述的蛋白材料。
3.一种骨强化剂，其包含根据权利要求1所述的蛋白材料作为活性成分。
4.根据权利要求1所述的蛋白材料在制备通过骨强化方法来强化骨的药剂中的用途，所述骨强化方法包括以5mg/天以上的量摄取根据权利要求1所述的蛋白材料。
5.一种制备根据权利要求1所述的蛋白材料的方法，其包括下列步骤1)～3)：
1)制备血管生成素和/或血管生成素水解产物；
2)制备抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白水解产物；和
3)混合根据上述2)所述的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白水解产物和根据上述1)所述的血管生成素和/或血管生成素水解产物，以使得与血管生成素和/或血管生成素水解产物的质量比为0.003～0.6。
6.一种制造根据权利要求1所述的蛋白材料的方法，其包括从乳和/或源自乳的材料中提取包含血管生成素和/或血管生成素水解产物以及抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白水解产物的级分，以使得与血管生成素和/或血管生成素水解产物的质量比为0.003～0.6的步骤。
7.根据权利要求6所述的方法，其进一步包括将包含于所述级分中的血管生成素和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白酶促分解的另外的步骤。
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