KR20100084454A

KR20100084454A - 안지오제닌을 함유하는 뼈 재생용 조성물

Info

Publication number: KR20100084454A
Application number: KR1020090056367A
Authority: KR
Inventors: 이준; 윤동현; 황동현
Original assignee: 원광대학교산학협력단
Priority date: 2009-06-24
Filing date: 2009-06-24
Publication date: 2010-07-26

Abstract

본 발명은 안지오제닌을 함유하는 뼈 재생용 조성물 및 이 조성물을 포함하는 뼈 재생용 스캐폴드에 관한 것이다.

안지오제닌은 종래 뼈 재생 촉진인자로 사용되는 PRP(Platelet Rich Plasma)에 비해 우수한 초기 혈관신생 및 골형성을 나타내어 뼈 재생 속도를 촉진할 수 있다.

안지오제닌, 뼈 재생

Description

안지오제닌을 함유하는 뼈 재생용 조성물{Composition for Reproduction of Bone Containing Angiogenin}

치과 질환에서 골결손으로 인한 악안면 심미 재건은 중요한 도전 과제이다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여 많은 노력을 기울여 왔는데 골 이식재나 골유도 물질, 조직공학 등이 대표적인 예이다.

골이 만들어지기 위한 큰 틀에서의 세포, 스캐폴드, 싸이토카인들은 적절한 환경과 시간을 통하여 양질의 구조체를 만들게 된다. 기존의 연구는 주로 시장성이 있는 스캐폴드에 집중되어 왔고, 자가골, 동종골, 이종골, 합성골 등의 수많은 재료들이 개발되어 유통되고 있다. 그러나 자가골의 채취시 환자의 신체손상이나 채취 양에서 한계를 가지고 있기 때문에 대부분이 동종골, 합성골의 내부 성분의 조성을 개량하여 골전도에 유망한 재료를 만들어내고 있다. 근래에 들어서는 싸이토카인 종류인 혈소판 농축 혈장을 환자의 혈액에서 분리하여 기존의 골에 혼합하 는 방식으로 골유도를 이끌어 내는 연구를 활발하게 보고되고 있고, 실제 환자에 적용하여 좋은 결과를 얻고 있다. 그러나 이런 재료 또한 환자의 혈액을 채취하는데 비해 효과가 높지 않기 때문에 다른 재조합형태의 재료를 필요로 하게 되었다.

골이식 등의 골치유 과정은 다양한 조직과 세포의 이동, 분화, 활성등 복합적인 기전에 의해 발생한다. 그 중 혈관신생은 골 조직의 항상성과 재생에 중요한 역할을 하고 있다. 18세기와 20세기 초반에는 주로 골재생 연구에서 골모세포의 중요성에 대해 연구를 주로 해왔으나, 1963년도 Trueta가 골절 부위에서 방출되는 혈관 신생인자들이 있다는 것을 보고한 이래 현재 까지 골재생에서 혈관 신생은 중요한 연구 대상이 되고 있다(Trueta J. J. Bone Joint Surg. 45(B):402-418, 1963). 골기질을 생산해내야 하는 1 단계 골 형성 과정에서 중요한 역할을 하는 PDGF(Platelet derived growth factor), VEGF(Vascular endothelial growth factor), EGF(Epidermal growth factor), FGF(Fibroblast growth factor), 안지오제닌(angiogenin) 등 혈관 신생 단백질에 대한 보고가 있는 있다(Kanczler JM et al. European cells and Materials 15: 100-114, 2008). 현재 우리가 주로 사용하는 재료는 혈소판 농축 혈장은 가장 쉽게 환자에서 자가 채취 및 원심 분리를 통하여 PDGF 등을 추출하여 골이식에 가장 많이 사용하고 있다. 과거 연구에서 혈소판에 PDGF와 TGF-β가 풍부하다고 밝혀졌고, 이는 겔 형태로 다루기가 쉽고 성장 요소의 활성도를 보존하기 위해 신속하게 사용되어야 한다. 그러나 조직 공학의 대두로 기존의 방법 보다는 더욱 효과적인 혈관신생 물질이 필요하게 되었다.

본 발명자는 뼈 재생시 보다 효과적인 혈관신생 물질을 발굴하던 중 안지오제닌이 종래 사용되는 PRP(Platelet Rich Plasma)에 비해 우수한 초기 혈관신생 및 골형성을 나타내어 뼈 재생 속도를 촉진함을 확인하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서, 본 발명은 안지오제닌을 함유하는 뼈 재생용 조성물을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 뼈 재생용 스캐폴드를 제공하고자 한다.

'안지오제닌(angiogenin)'은 신생혈관형성(angiogenesis)에 관여하는 폴리펩타이드이다. 본 발명에서, 포유동물, 바람직하게는 사람으로부터 유래된 것일 수 있다. 안지오제닌으로 처리될 개체와 동종의 개체로부터 유래된 것이 바람직하다. 일례로, 서열번호: 1에 나타낸 안지오제닌을 사용할 수 있다.

본 발명에서, 안지오제닌은 재조합 DNA 기술에 기초하여 생산하는 것이 바람직하다. 한 양태로서, (a) 안지오제닌을 코딩하는 DNA 서열을 이 DNA 서열에 작동가능하게 연결되어 그의 발현을 조절하는 하나 이상의 발현 조절 서열을 포함하는 벡터에 삽입시키고, (b) 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주를 형질전환시키 며, (c) 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 하기에 적절한 배지 및 조건하에서 배양하고, (d) 배양물로부터 안지오제닌을 분리하는 단계를 거쳐 생산할 수 있다.

상기 '벡터'로는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다.

상기 '조절서열'은 안지오제닌의 발현에 필수적이거나 이로운 핵산 서열들을 의미한다. 상기 조절서열에는 프로모터, 업스트림(upstream) 활성화 서열 또는 인핸서(enhancer), 폴리아데닐화 서열 및 전사 종결인자 등을 포함한다.

상기 '숙주세포'로는 대장균, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균, 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵 숙주들, 스포도프테라 프루기페르다와 같은 곤충 세포, CHO 및 마우스 세포와 같은 동물세포, 조직 배양된 인간 세포 및 식물 세포 등이 포함된다.

상기된 형질전환 또는 형질감염은 Davis et al. Basic Methods in Molecular Biology, 1986과 같은 기본적인 실험 지침서에 기술된 방법에 따라 수행될 수 있다. 바람직한 예로는 전기천공(electroporation), 형질도입(transduction), 칼슘 포스페이트 형질전환(calcium phosphate transfection), 양이온 지질-매개 형질전환(cationic lipid-mediated transfection) 등이 포함된다.

숙주세포들은 적절한 배지와 안지오제닌 단백질이 발현 및/또는 분리되는 것을 허용하는 조건하에서, 배양될 수 있다. 배양은 공지된 기술을 사용해서 탄소, 질소 공급원 및 무기염을 포함하는 적합한 영양배지에서 진행한다. 적합한 배지는 상업적적으로 입수 가능하고, 예를 들면 American Type Culture Collection 카탈로그 등에 기재된 성분 및 이들의 조성비에 따라 제조할 수도 있다.

배양물로부터 안지오제닌은 당업계에 공지된 방법에 의해 분리될 수 있다. 예를 들어, 안지오제닌은 이에 제한되는 것은 아니지만, 원심분리, 여과, 추출, 분무 건조, 증발 또는 침전을 포함하는 방법에 의해 배양물로부터 분리될 수 있다. 더 나아가 안지오제닌은 크로마토그래피 또는 전기영동을 포함하여 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해서 정제될 수 있다.

안지오제닌은 통상적인 방법에 따라 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 사용할 수 있다. 적합한 담체의 예로는, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 알지네이트, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀루로오스, 미정질 셀루로오스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 필요에 따라 상기 조성물에 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 개체에 투여된 후 유효 성분의 신속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 정제, 분말, 환제, 에멀전, 용액, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말 등의 형태일 수 있다. 상기 제형은 1회용 투약 형태가 편리할 것이다.

본 발명에 따른 안지오제닌을 함유하는 뼈 재생용 조성물은 골 이식재와는 별도로 이식하거나, 골 이식재에 포함된 형태로 골 이식재와 동시에 이식할 수도 있다. 이에, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 뼈 재생용 스캐폴드에 관한 것이다.

상기 뼈 재생용 스캐폴드는 당업계에 공지된 임의의 뼈 재생용 스캐폴드를 포함한다. 그러한 뼈 재생용 스캐폴드는 자가골, 동종골, 이종골 또는 합성골일 수 있다. 상기 합성골로는 HA(hydroxyapatite), 콜라겐, 세라믹 스캐폴드, 다공성 인산칼슘 등이 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

한 양태로서, 상기 뼈 재생용 스캐폴드는 피브린 글루에 골 분말이 혼합되고, 뼈 성장촉진을 위한 인자(안지오제닌)를 수용하기 위한 복수의 세공이 형성되며 굳은 상태 상태의, 소정의 형상을 가진 뼈 재생용 스캐폴드일 수 있다.

본 발명의 스캐폴드는 고형의, 그리고 굳은(concrete) 상태임을 특징으로 한다. 이를 위해 피브린 글루와 골 분말을 혼합한 후 동결건조된 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 스캐폴드는 동결건조되기 전 소정의 형상을 가지도록 처리되거나, 소정의 형틀 내에서 동결건조된 것이 바람직하다. 한 양태로서, 상기 형상과 형틀은 환자의 턱뼈 또는 치아 결손부위에 대응하는 형상일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 형틀은 (a) 3차원 CT를 이용한 3차원 모형 제작 과정, (b) 상기 3차원 모 형에서 치과용 레진 등을 이용하여 결손부위에 적합한 스캐폴드 제작용 형틀을 만드는 과정으로 제조된 것일 수 있다.

본 발명에서 '골 분말(bone powder)'는 뼈의 분쇄물, 바람직하게는 뼈 세포가 제거된 뼈(무기물)의 분쇄물을 의미한다. 상기 골 분말은 자가골, 동종골, 이종골 및 합성골(예, hydroxyapatite)로 이루어진 그룹으로부터 1종 이상 선택된 뼈로부터 유래된 것일 수 있다. 본 발명에서 골 분말은 상업적으로도 입수 가능하며, 예를 들면, Dynagraft (오스템), Biocera (오스코텍), Bio-Oss (정산 Biomed), ICB (푸르고), MBCP (푸르고) 등이 있다.

본 발명에서 '피브린 글루(fibrin glue)'는 피브리노겐과 트롬빈을 주요성분으로 포함하는 생체적합성 및 생분해성을 갖는 생산물을 의미한다. 피브린 글루는 현재 다양한 용도로 사용되고 있는데, 유럽 등에서는 피브린의 조직 교착작용을 이용하여 피브리노겐, 트롬빈, 염화칼슘, 및 선용 효소의 저해제를 조직접착제로서 말초신경의 봉합, 미소 혈관의 봉합 등에 적용하여 봉합의 대용 또는 보강을 위한 임상응용이 실시되고 있다. 또한, 일본에서는 수술용 접착제로서 혈관 외과 영역을 비롯해 뇌신경 외과수술, 뼈의 접착 등 정형외과 수술, 열상 환자의 지혈 등에 이용되고 있다. 예를 들면, 상표명 Greenplast (녹십자), Beriplast-P (아벤티스), Tisseel (박스터) 등이 상업적으로 입수 가능하다.

본 발명의 피브린 글루는 피브리노겐과 트롬빈을 포함하는 것이 바람직하다. 상기 피브리노겐은 10 내지 1000mg/ml, 바람직하게는 10 내지 100mg/ml의 농도로 이용될 수 있다. 상기 트롬빈은 0.1 내지 1000IU/ml, 바람직하게는 1 내지 100IU/ml의 농도로 이용될 수 있다.

본 발명의 피브린 글루는 아프로티닌(aprotinin) 또는 염화칼슘을 추가로 포함할 수도 있다. 또한, 본 발명의 피브린 글루는 수용성 바인더를 추가로 포함할 수도 있다. 상기 수용성 바인더는 세포배양배지, 증류수 또는 혈액일 수 있다.

본 발명에서 골 분말과 피브린 글루를 혼합함에 있어서, 피브린 글루의 양이 많을수록 독성을 유발할 가능성이 높기 때문에 그 함량을 적절히 조절하는 것이 바람직하다. 또한, 스캐폴드의 크기가 클수록 강도 및 형태 유지를 위해 골 분말의 함량을 높이는 것이 바람직하다. 이러한 점을 고려할 때, 본 발명에서 피브린 글루와 골 분말은 1 대 1~10, 바람직하게는 1 대 1~5, 보다 바람직하게는 1 대 1~3의 비율로 혼합할 수 있다.

본 발명의 뼈 성장촉진을 위한 인자로는 안지오제닌 뿐만 아니라 공지된 다른 뼈 성장을 촉진하는 다양한 인자를 포함할 수도 있다. 예를 들어, 호르몬, 안지오제닌 이외의 사이토카인, 줄기세포 등을 포함한다.

본 발명의 스캐폴드는 동결건조 과정을 거치면서, 피브린글루와 뼈 분말 혼합체 내에 다수의 세공이 생성되므로 안지오제닌과 같은 뼈 성장촉진인자의 흡수와 유지가 향상된다. 동결건조 상태의 스캐폴드는 뼈 성장촉진인자를 포함하는 배지(또는 담체)를 용이하게 흡수하여 뼈 성장촉진인자가 세공 내에 들어가게 된다.

안지오제닌은 종래 뼈 재생 촉진인자로 사용되는 PRP(Platelet Rich Plasma)에 비해 우수한 초기 혈관신생 및 골형성을 나타내어, 보다 신속한 뼈 재생을 달성할 수 있다.

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 실험 재료 및 방법

1-1. 실험 동물 및 재료

체중 30 kg의 수컷 미니피그(소형화 및 맞춤형 실험동물, PWGetics, Korea) 8 마리를 실험동물로 사용하였으며, 실온에서 인증된 사육시설에서 동물형 연질 사료와 물을 이용하여 일정기간 사육하였다.

가) 발치

세포 배양 기간 동안 미니피그의 좌우 하악에서 소구치에서 제 1 대구치까지 발거를 시행하였다. 발거 후 창상 봉합을 연속 봉합으로 시행하였다. 1 주일 후 발사를 시행하였고, 1 달 동안 치유를 지켜보았으며, 치유과정에 추가적인 매복치의 발거는 수술시 시행하였다.

나) 이식재 준비

* (1) 혈소판 농축 혈장

미니피그의 정맥혈 50 cc를 채취한 후 통법대로 2회 원심분리하여 혈소판 농축혈장을 얻었다(도 1).

(2) 재조합 안지오제닌의 분리 정제

pET11a-bovine angiogenin/E.coli을 LB 배지(Trypton : Yeast Extract : NaCl = 2 : 1 : 1)에 접종하여 37℃ 배양한 후 IPTG(isopropyl thio-β-D-galactopyranoside)를 0.1 mM 첨가하여 2~3시간 배양하였다. 그 후 대장균을 원심분리(6000rpm, 4℃, 15분)하여 -70℃에 방치하였다. 동결된 대장균을 완충용액(20 mM Tris-HCl, pH 7.6, 10% sucrose containing 2.5 mM PMSF, 100 ㎍/㎖ Lysozyme, 200 mM NaCl, 10 mM EDTA)에 재현탁하여 얼음속에서 45분 동안 방치하였다. 마지막으로 2.5 mM PMSF를 첨가하여 초음파 분쇄기나 프렌치 프레셔(French pressor)로 대장균을 용균시켰다. 대장균을 원심분리(17300g, 25분, 4℃)하고 SDS-PAGE를 실시하여 안지오제닌의 발현상태를 확인하였다. 그 결과 안지오제닌은 봉입체(inclusion body)로 발현되었다. 그 후 봉입체로 재폴딩(refolding)을 수행하였 다. 20 mM Tris-HCl, pH 7.6으로 봉입체를 세척하고 7 M guanidine-HCl, pH 7.5 ( Containing 100 mM potassium phosphate, 100 mM mercaptoethanol)로 용해화하였다. 용해된 안지오제닌을 100 mM NaCl이 포함된 50 mM Tris-HCl, pH 8.5 용액에 희석하였다. 그리고 이것을 4℃에서 24시간 방치하고 6~8시간 동안 교반하였다. 마지막으로 1 M NaCl을 서서히 첨가하였다. 그런 다음 이 시료를 농축하여 C18 역상 HPLC로 분리했다. 재조합 안지오제닌의 서열은 서열번호: 1에 나타낸 바와 같다.

1-2. 실험 방법

1) 마취 유도

미니피그 골이식술을 위해 동물용 진정 마취제 (럼푼^® 3 mg/ kg, 한국 바이엘화학)와 케타민을 각각 정맥 주사하여 전신마취를 유도하였다. 구강내 삽관술을 시행하여 N₂O + O₂를 통한 전신마취를 시행하였다. 수술시 시야 확보를 위하여 상악과 하악의 견치에 bandage를 묶어 최대한의 개구를 유도하였다. 구강내를 포타딘 용액으로 소독을 한 후 국소마취 유도와 지혈을 위해 1: 100,000 에피네프린을 함유한 2 % 리도카인 (유한양행, 한국)을 하악의 잔존 치조골에 주사하였다.

2) 치조골 노출

미니피그의 잔존 치조골에 수평 절개와 수직 절개를 가한 후 골막을 박리하 여 하악의 협측 및 설측 면을 최대한 노출시켰다.

3) 대조군, 실험군 형성

반경 3 mm의 micro wheel saw를 이용하여 깊이 8mm, 지름 10 mm 정도의 둥근 형태의 골 결손부를 형성하였다. 거친 부위는 수술용 round bur 혹은 chisel, mallet을 이용하여 주수하면서 모양을 형성하였다. 동일한 방법으로 좌우 각각 3개씩의 골 결손부 모형을 완성하였다. 실험에 필요한 자가골은 골 결손부를 형성할 때 얻어진 것을 사용하였고 bone rongeur와 bone mill을 사용하여 chip bone을 만들었다.

좌측의 결손부에 대조군으로 혈소판 농축 혈장 + 혈병, 혈소판 농축 혈장 + 자가골, 혈소판 농축혈장 + 합성골을 순서대로 삽입하였고, 우측에 실험군으로 recombinant angiogenin + 혈병, recombinant angiogenin + 자가골, recombinant angiogenin + 합성골을 삽입하였다. 각각은 도 2의 방식대로 주입하여 고정하였다(도 2).

창상을 releasing incision을 시행하여 장력을 완화시키고 4-0 nylon을 이용하여 연속 잠금 봉합하였다. 모든 실험동물은 술 후 감염예방을 위하여 3 일간 아목사실린 (티라목스^®, 삼진제약, 한국)과 디클로페낙 나트륨 (킨포인^®, 삼진제약, 한국)을 근육주사하였고, 1주일 동안 고단백 우유를 동반한 연식을 섭취시켰다. 소독을 1주일 동안 클로르 헥시딘( 헥사메딘^®, 부광약품, 한국)을 이용하여 시행하였다.

1-3. 육안적 검사

수술 후 미니 피그의 사료 섭식상태 소독을 지속적으로 시행하였고, 미니 피그의 상태를 건전한 상태로 유지하였다. 술 후 1, 2, 4, 8주에 희생하여 포르말린에 고정하기 전에 골 이식 부위의 치유양상과 염증 상태 및 창상 이개 등을 육안적으로 관찰하였다.

1-4. Micro CT 분석

실험 부위의 블럭편을 Microfocus X-ray Computed Tomography(μCT, Harmony 130-P3-5, DRGEM co. Korea)의 Focal spot size 5 ㎛, fiend of view 105 mm, reconstruction Image Size 2048 X 2048 pixel, Depth of Reconstruction image 16 bits, Detectability 5 ㎛로 촬영하였고, Cone-beam volumetric reconstruction algorithm으로 1024 x 1024 x 512 pixels로 3D 영상을 획득하였다. 영상을 이용한 Volume rendering, Slab rendering, 3D measurement를 이용하여 골 형성 차이를 정량, 정성 분석하였다.

정량 분석은 각각의 조직 부피(Tissue volume), 골 부피(Bone volume), 골 표면(Bone surface)을 계측하고 이를 이용하여 각 군 내에서 골이 차지하는 양을 골 부피 대 조직 부피의 백분율로 계산하여 골 부피 백분율(Percent Bone Volume: Bone volume/Tissue volume)로 산출하였고, 각 군에서 골 표면 대 부피의 비율(Bone surface/Volume Ratio, 1/mm)을 산출하여 그 변화를 관찰하였으며, 각각의 실험군과 대조군의 비율을 구하여 두 군 간의 차이를 조사하였다.

또한, 정성 분석을 위하여 골의 표면의 강도를 나타내는 골 표면 밀도(Bone Surface Density, 1/mm)로 피질골의 밀도를 분석하였고, 골소주 두께(Trabecular Thickness, mm)와 골소주 수(Trabecular Number, 1/mm)를 이용하여 해면골의 골질을 평가하고 그 변화를 관찰하고 각각의 실험군과 대조군의 비율을 구하여 두 군 간의 차이를 조사하였다.

1-5. 조직학적 검사

시상면 방향으로 조직괴를 만들어 2 일간 10% 중성 포르말린용액에 고정하고, 5% 질산으로 탈회한 후, 통상적인 방법에 의하여 탈수 및 파라핀 포매를 하였으며, 4-6 ㎛의 박절 표본을 poly-L-lysine을 도포한 슬라이드에 부착하여 표본을 제작하였다. 신생골과 주위조직의 변화를 알아보기 위해 H & E, Masson's trichrome (MT) 염색을 시행하여 검경하였다.

1-6. 조직계측학적 검사

염색된 박절편을 광학 현미경으로 100배 촬영된 소견에서 영상을 취득하여 골이식 후 4 주, 8 주가 경과하여 2 단계 골형성 과정이 진행되는 조직에서 3 부위를 선택하여 신생골 면적을 측정하고 골 침착율(%)을 계산하였다.

1-7. 통계 분석

각각의 분석 값을 가지고 그룹의 평균과 표준 편차를 산출하였다. 데이터는 p < 0.05 이하에서 유의성 검정을 하였으며 ANOVA Test를 시행하였다.

실시예 2: 실험 성적

2-1. 임상적 소견

모든 실험동물은 염증의 소견 및 심각한 출혈 등은 없었고, 결손부에 혈병으로 채운군(대조군)에서 초기에 창상 이개의 소견을 보인 경우가 있었다. 그 외에 특별한 소견은 보이지 않았다.

2-2. 방사선학적 소견

Microfocus X-ray Computed Tomography(μCT)영상에서의 정량 및 정성 분석

1) 정량 분석

① 조직내 골 부피 백분율 (Percent Bone Volume, Bone Volume/ Tissue Volume)

실험군, 대조군에서 시간에 따라 volume의 증가를 보였고 실험군이 대조군에 비하여 높은 수치를 보였다. 특히 실험군의 합성골과 자가골은 8 주에 각각 51.15, 72.10으로 높은 증가를 보였다. 실험군/ 대조군의 비는 혈병, 합성골, 자가골의 1 주에 1.36, 1.56, 1.67로 높은 수치를 보였고, 자가골 4 주, 8 주에 1.39, 1.36의 높은 수치를 보였다. 하지만 각각의 군은 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았다(도 3, 표 2).

실험군/대조군의 골 부피 백분율의 비

타입/주수	1	2	4	8
혈병	1.36	0.88	0.98	1.22
합성골	1.56	0.94	1.10	1.18
자가골	1.67	0.96	1.39	1.36

② 골 표면과 골 부피의 비율 (Bone Surface / Volume Ratio, 1/mm)

혈병은 두 군 모두 시간이 지날수록 4 주까지 증가소견을 보였다. 합성골에서는 대조군에 비해 1 주와 2 주 사이에는 감소했지만, 8 주까지 계속적인 증가 소견을 보였다(0.63, 0.65, 0.82). 실험군/ 대조군의 비는 혈병의 1 주, 자가골 2 주에 각각 2.24, 4.09로 유의한 차이를 보였다(p < 0.05)(도 4, 표 3).

실험군/대조군의 골 표면과 골 부피 백분율의 비

타입/주수	1	2	4	8
혈병	2.24*	1.57	1.09	0.95
합성골	1.03	0.43	0.58	0.86
자가골	0.67	4.09*	0.88	0.94

* 2) 정성 분석

① 골 표면 밀도 (Bone Surface Density, 1/mm)

실험군 합성골에서 1, 2 주에 0.30, 0.14로 감소하는 소견을 보였고, 자가골 2, 4 주에 각각 0.48, 0.29로 감소하는 소견을 보였다. 즉, 이 시기에 골 표면 밀도 증가가 높았다.

실험군과 대조군의 비는 골 표면 골 부피 비에서와 같이 혈병은 1 주와 자가골 2 주군에서 높은 수치를 보였다(도 5, 표 4).

실험군/대조군의 골 표면 밀도의 비

타입/주수	1	2	4	8
혈병	3.00*	1.45	1.10	1.17
합성골	1.58	0.40	0.66	1.02
자가골	1.15	4.00*	1.26	1.30

* ② 골소주 두께 (Trabecular Thickness, mm)

실험군에서 2, 4 주에 증가소견을 보였고, 4 주에 자가골에서 대조군, 실험군 각각 7.80, 7.42로 비슷한 증가를 보였다. 실험군/ 대조군 비는 대체로 비슷하였으나, 합성골의 1, 2, 4 주에서 비교적 높은 수치( 1.35, 1.56.1.45)를 보였으나 통계적 유의성은 없었다(도 6, 표 5).

실험군/대조군의 골 소주 두께의 비

타입/주수	1	2	4	8
혈병	0.65	0.74	1.01	1.01
합성골	1.35	1.56	1.45	0.96
자가골	0.87	0.43	0.95	0.86

③ 골소주 수 ( Trabecular number, 1/mm )

실험군과 대조군 모두 군에서 시간에 따라 증가 소견을 보였고, 특히 실험군 합성골 4 주에서 8 주 사이에 0.04에서 0.10으로 높은 증가를 보였고, 자가골 군의 1 주, 2 주 사이에 0.04에서 0.09로 높은 증가를 보였다. 실험군/ 대조군 비율은 1주 혈병, 자가골에서 각각 2.00, 2.00으로 높게 나왔고, 특히 자가골 2 주에 2.25로 높은 수치를 보였다(p< 0.05; 도 7, 표 6).

실험군/대조군의 골소주 수의 비

타입/주수	1	2	4	8
혈병	2.00*	1.00	1.00	1.40
합성골	1.00	0.67	0.67	1.25
자가골	2.00*	2.25*	1.40	1.43

* 2-3. 조직학적 소견

1) 혈병 이식군

PRP 실험 1 주에서는 결손부 내부에 많은 출혈 및 육아조직이 관찰되었고 결손부에서 중등도의 혈관 신생이 나타났다. 골모 세포의 활성이나 신생골 형성은 미약하게 관찰되었으며 파골세포의 활성도 적었다(도 8의 좌측 1W). 2 주에서는 혈관 신생이 1 주에 비해 감소하였으나 여전히 진행 중이고, 조골 세포 활성도 관찰되었다(도 8의 좌측 2W). 4 주군에서는 1 주에 비하여 염증세포 침윤이 현저히 감소되었으며 파골세포의 출현도 없고 골 결손부 변연에 신생골 형성이 관찰되는 골 전도 (osteoconduction) 현상이 관찰되었으나(도 8의 좌측 4W), 결손부 내부에서 골 전도에 의한 신생골은 없었으며 염증 및 신생혈관은 거의 없는 성숙된 섬유조직으로 신생골을 둘러싸고 있었다. 8주에서는 결손부 주위에 염증 및 파골세포는 사라졌으며 결손부에 조골세포의 활성은 보였고, 층판골로의 대체가 보였다(도 8의 좌측 8W).

안지오제닌 혈병군 실험 1주 소견으로는 대조군보다 염증세포 침윤은 적었고 이식체 주위의 섬유성 결체조직의 성숙 및 섬유화가 많이 보였다 (도 8의 우측 1W). 또한 혈관 신생은 대조군에 비해 활발하였고, 대조군과는 다르게 골 손상부에서 신생골 형성이나 조골세포활성은 많이 관찰되었으며 파골세포도 많이 관찰되었다. 실험 2주와 4주에서는 이물반응 및 염증반응은 거의 없이 대조군에 비해 신생골 형성이 많았으며 손상부의 섬유조직이 유지되고 있었다(도 8의 우측 2W와 4W). 8주군에서도 4주군과 비교하여 이물반응이나 염증세포 침윤은 없었고, 신생골 형성은 거의 결손부를 채워 있으며 대조군에 비해 성숙골로 많이 대체되었다(도 8의 우측 8W).

2) 합성골 이식군

대조군 합성골 실험 1주에서는 결손부 내부에 혈병군에 비해 출혈 및 육아조직이 적었으며 골모세포의 활성이나 신생골 형성은 약간 높았다. 파골세포의 활성은 거의 없었다(도 9의 좌측 1W). 2 주 및 4 주군에서는 혈병군에 비해 염증세포 침윤 및 섬유조직 형성정도가 높았으며 신생골 형성은 활발하였다(도 9의 좌측 2W와 4W). 이식 8주에 합성골 이식부는 층판골로 완전 대치되지 않았으나 골성융합도가 4 주에 비해 높았다(도 9의 좌측 8W))

안지오제닌 처리군 실험 1주 소견으로는 대조군보다 염증세포 침윤은 적었고 파골 세포 활성은 대조군에 비해 높았다. 이식체 주위에 파골 세포 활성이 높았고, 섬유화와 신생골 형성이 우수하였다(도 9의 우측 1W). 실험 2 주와 4 주에서는 대조군과 유사하게 손상부의 신생골 및 섬유조직형성이 나타났고(도 9의 우측 2W와 4W), 8 주군에서도 거의 완전한 골성융합을 보였다(도 9의 우측 8W).

3) 자가골 이식군

대조군 1주의 자가골 이식부에서는 출혈 및 육아조직은 거의 없었으며 골 결손부 변연에서 숙주골과 이식골간의 융합도 관찰되었으며(도 10의 좌측 1W), 염증세포 침윤은 제일 적었으며, 신생골 형성과 조골세포활성이 합성골이나 혈병 처리 대조군과 비교해 가장 우수하였다. 2 주에는 혈관 신생과 신생골 형성이 활발하고, 4주 신생골 형성이 점점 많아지며(도 10의 좌측 2W와 4W), 8 주에는 이식부가 완전한 골성 융합을 보이고 층판골로 대치되었다(도 10의 좌측 8W).

1주 안지오제닌 처리군의 자가골 이식부에는 실험군 중 가장 많은 신생골 형성을 보였으며(도 10의 우측 1W)) 염증반응은 가장 적었다. 실험 2주 이후 (도 10의 우측 2W) 4주에 비해 8 주에서는 신생골 및 신생혈관형성, 섬유조직형성, 성숙골에서는 차이가 없었다(도 10의 우측 4W와 8W).

2-3. 조직 계측학적 소견

조직 계측학적 분석에서 실험군 혈병 2 주, 합성골 4 주, 자가골 2 주에 대조군에 비해 유의성 있게 골 형성이 우수하였으며 (p < 0.05), 골 형성부의 면적은 각 군 모두에서 시간 경과에 따라 증가하였으나, 골 형성량은 자가골 8 주에 숙주골과 골성융합을 보여 거의 완전한 골성숙을 보였다.

본 실시예에서는 미니피그의 하악의 결손부에 혈병, 합성골, 자가골을 이식시 대조군으로 PRP를 처치하였고, 실험군으로 안지오제닌을 처치하여 조직 접착제로 고정하였다. 그리하여 각각의 군들의 골 치유과정에서 어떠한 효과가 있는지 육안적, 방사선학적(μCT), 조직학적 및 조직 계측학적 분석을 통해 다음과 같은 결과를 얻었다.

미니피그의 안지오제닌을 처치한 군은 대조군에 비해

첫째, 육안적 검사에서 상피화가 빠르고, 염증이 적었다.

둘째, 마이크로 CT 검사에서 골량과 골밀도 골소주 양에서 혈병은 1 주, 자가골은 2주에서 높게 나타났다.

셋째, 조직학적 및 조직 형태학적 검사에서 초기 1 주에 신생혈관 증식이 많았고, 2 주, 4 주에 골생성이 많았으며, 골화가 빨랐다.

결론적으로, 골 이식시 안지오제닌을 처치하는 술식은 현재 사용되는 PRP에 비해 양호한 초기 혈관신생 및 골형성을 보였다.

도 1은 미니피그로부터 혈소판 농축 혈장을 추출하는 과정을 간략하게 나타낸 것이다.

도 2는 미니피그 치조 결손부내에 본 발명에 따른 골 이식재를 이식할 위치를 나타낸 것이다.

도 3은 실험군/대조군의 골 부피 백분율의 비를 나타낸 그래프이다.

도 4는 실험군/대조군의 골 표면과 골 부피 백분율의 비를 나타낸 그래프이다.

도 5는 실험군/대조군의 골 표면 밀도의 비를 나타낸 그래프이다.

도 6은 실험군/대조군의 골소주 두께의 비를 나타낸 그래프이다.

도 7은 실험군/대조군의 골소주 수의 비를 나타낸 그래프이다.

도 8은 혈병 이식군에서 시간 경과별로 실험군과 대조군에서의 조직학적 소견을 나타낸 것이다.

도 9는 합성골 이식군에서 시간 경과별로 실험군과 대조군에서의 조직학적 소견을 나타낸 것이다.

도 10은 자가골 이식군에서 시간 경과별로 실험군과 대조군에서의 조직학적 소견을 나타낸 것이다.

<110> Wonkwang University Center for Industry-Academy Cooperation <120> Composition for Reproduction of Bone Containing Angiogenin <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> angiogenin derived from bovine <400> 1 Ala Gln Asp Asp Tyr Arg Tyr Ile His Phe Leu Thr Gln His Tyr Asp 1 5 10 15 Ala Lys Pro Lys Gly Arg Asn Asp Glu Tyr Cys Phe Asn Met Met Lys 20 25 30 Asn Arg Arg Leu Thr Arg Pro Cys Lys Asp Arg Asn Thr Phe Ile His 35 40 45 Gly Asn Lys Asn Asp Ile Lys Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asn Gly Gln 50 55 60 Pro Tyr Arg Gly Asp Leu Arg Ile Ser Lys Ser Glu Phe Gln Ile Thr 65 70 75 80 Ile Cys Lys His Lys Gly Gly Ser Ser Arg Pro Pro Cys Arg Tyr Gly 85 90 95 Ala Thr Glu Asp Ser Arg Val Val Gly Cys Glu Asn Gly Leu Pro Tyr 100 105 110 His Phe Asp Glu Ser Phe Ile Thr Pro Arg His 115 120

Claims

안지오제닌을 함유하는 뼈 재생용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 안지오제닌은 (a) 안지오제닌을 코딩하는 DNA 서열을 이 DNA 서열에 작동가능하게 연결되어 그의 발현을 조절하는 하나 이상의 발현 조절 서열을 포함하는 벡터에 삽입시키고, (b) 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주를 형질전환시키며, (c) 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 하기에 적절한 배지 및 조건하에서 배양하고, (d) 배양물로부터 안지오제닌을 회수하는 단계를 거쳐 생산되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 안지오제닌은 서열번호: 1에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 조성물.