CN107441555B - 一种可控性释放药物的人工皮肤的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种可控性释放药物的人工皮肤的制备方法，所述制备方法包括：(1)制备三维多孔结构的生物材料支架；(2)将双极粘性分子涂覆于生物材料支架表面；(3)利用该双极粘性分子吸附药物；(4)将上述材料浸泡于可溶解该支架材料的溶剂中，则原来结合在一起的“支架材料‑粘性分子‑药物”结合体被洗脱，随即在支架表面原位生成合适直径的微球。该微球由“支架材料‑粘性分子‑药物”组成。通过调控微球的降解速率，可以调控药物的释放速率。

Description

一种可控性释放药物的人工皮肤的制备方法
技术领域
本发明属于人工皮肤和药物控释领域，具体涉及一种可控性释放药物的人工皮肤的制备方法。
背景技术
药物的可控性释放是药理学和药代动力学领域重要的研究方向。可控性释放药物不但可以使药物达到且维持有效药物浓度，发挥良好的药理学作用，而且避免了间歇性大剂量给药导致的毒副作用。因此，实现药物的可控性释放是药剂学和临床医学领域的重要课题。
对于人工皮肤领域而言，可控性释放杀菌剂、生长因子、维生素等药物的人工皮肤有望提高创面处理效果，改善愈合质量，进而接近天然皮肤的生理要求。在临床实践工作中，临床医师较难处理的创面多为糖尿病导致的足溃疡，或者存在骨质裸露的难愈合创面。以上所述的难愈合创面带来了巨大的经济、医疗、社会负担。深入机制研究发现，难愈合创面的病理学特点是难以生成足够的血管组织。人工皮肤以及促血管化药物的使用，可以显著增加血液循环，加快创面细胞新陈代谢和增殖，最终加快创面愈合速度。
但是，目前人工皮肤产品存在以下不足：
第一，人工皮肤产品中较少应用药物控释技术。目前人工皮肤产品功能较单一，较少应用药物控释技术。如果能使人工皮肤可控性释放促血管生长、抗感染的药物成分，那么该人工皮肤有望进一步提高创面愈合质量、促进愈合速度。为了解决上述问题，可以尝试利用可降解的生物基质包裹药物。随着生物基质的缓慢降解，药物也实现了缓慢释放。蛋白类、肽段类、分子类等药物，半衰期非常短，而且非常容易在体内因为氧化水解而失效。因此，对于上述药物制剂，可控性释放显得尤其重要。尽管我们可以外源性添加该类药物，但是该类药物很容易被体内的多种蛋白酶水解。为了实现上述目的，我们必须提前制备好包裹药物的微球，然后将这些微球转移到人体受药部位。然而，这些微球很难被很好的固定。
第二，人工皮肤产品的材料多数为疏水性，导致细胞难以粘附，进而影响创面愈合疗效。未经表面改性处理的生物材料大多是疏水性的。因为天然生物材料缺少可供细胞、蛋白、多肽等粘附的亲水性基团，所以细胞以及多种药物成分难以有效固定粘附在材料表面。为了解决上述问题，需要进行材料表面改性。文献报道的多种材料表面改性技术中，常用的方法为嫁接亲水性生物基团到三维多孔支架中，如利用功能性羧基或者氨基的进行化学固定，利用静电力进行分子成面的层层自组装，利用肝素等分子进行物理粘附，等等。然而，遗憾的是，上述材料改性技术往往价格昂贵、工艺复杂，且不能广泛适用于所有生物材料。
为了解决上述不足，本发明拟分别通过下述方法解决：
第一，通过制备包裹药物的可降解微球，使人工皮肤能够可控性释放多种不同药物成分。本发明实施例中，实现了人工皮肤可控性释放血管生长因子(具体见后)。
第二，通过涂覆双极粘性分子，促进细胞粘附，加快创面愈合。除此之外，双极粘性分子的使用，也使包裹药物的微球更好的被固定，防止流失。本发明实施例中，选用纤黏连蛋白作为双极粘性分子，对材料进行了表面改性(具体见后)。
发明内容
针对上述情况，本发明目的是针对目前医疗需求，充分利用材料生物学特性，提供一种可控性释放药物的人工皮肤的制备方法。
为达上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
(1)冷冻干燥技术制备聚己内酯三维多孔支架：
将聚己内酯溶解于在浓度为20％(重量)的二氯甲烷/二甲基甲酰胺溶液中，二氯甲烷/二甲基甲酰胺的体积比是5∶1，冷冻12小时，然后将冷冻后的材料，放入冻干机中，真空冻干24小时，交联固定，获得聚己内酯三维多孔支架；
其中，本发明中使用的是20％(重量)的二氯甲烷/二甲基甲酰胺溶液，二氯甲烷/二甲基甲酰胺的体积比是5∶1。该参数选取的依据为，该浓度的材料适用于后期处理，可根据实际情况进行调整。
(2)生物粘性分子纤黏连蛋白涂覆于聚己内酯三维多孔支架表面：
将步骤(1)制备的聚己内酯三维多孔支架浸入纤黏连蛋白溶液中、37℃恒温箱孵育24小时，纤黏连蛋白为5毫克/毫升，pH7.5”；
其中，把生物粘性分子纤黏连蛋白作为人工皮肤支架和功能性多肽的粘合剂，若纤黏连蛋白孵育温度低于37℃，则应适当延长孵育时间。
(3)将血小板内皮生长因子与纤黏连蛋白结合：
将步骤(2)中制得的材料用纯净水漂洗3次，再浸入血小板内皮生长因子(VEGF)溶液中、37℃恒温箱孵育12小时，血小板内皮生长因子(VEGF)为1毫克/毫升，pH7.5，随后，将该聚己内酯三维多孔支架用纯化水漂洗一次，再检测漂洗液中血小板内皮生长因子(VEGF)的含量，获得PCL-FN-VEGF材料；
其中，把血小板内皮生长因子(VEGF)作为促进创面愈合和血管再生的功能性多肽，若血小板内皮生长因子孵育温度低于37℃，则应适当延长孵育时间。
(4)丙酮处理，原位生成合适直径的微球：
将步骤(3)制得的PCL-FN-VEGF材料浸入丙酮中，室温下放置40-120min；浸泡后，采用高压液相色谱法(HPLC)，检测丙酮溶液中血小板内皮生长因子(VEGF)的量，测量粘附到支架上的血小板内皮生长因子，经过丙酮处理后，可在聚己内酯(PCL)支架内部原位生成含血小板内皮生长因子(VEGF)的微球。
其中，利用丙酮处理，可在纤维膜内部原位生成包含血小板内皮生长因子(VEGF)的微球。此处处理时间选取依据为：丙酮处理时间过短，难以形成微球；随着丙酮处理时间延长，微球直径逐渐减小，但结构不完整。目的：选取适当的丙酮处理时间，使形成的微球直径适中、大小均匀、结构完整。
进一步的，步骤(1)中设定的制作支架的生物材料，包括具有生物安全性、相容性、可部分或全部溶解于某溶剂的所有生物材料，包括但不限于羟基乙酸衍生物、乳酸衍生物以及其他的聚酯纤维衍生物等；步骤(1)中设定的材料加工技术，包括可将材料制备成三维多孔结构的所有技术，包括但不限于冷冻干燥法，气泡制孔法、相分离制孔法等。
进一步的，步骤(2)中设定的纤黏连蛋白(FN)可以换成具有生物粘性的其他非极性分子，盐酸左旋多巴。
进一步的，步骤(3)中设定的血小板内皮生长因子(VEGF)可以换成可促进血管再生的多肽、分子或药物，血小板源性生长因子(PDGF)。
进一步的，步骤(4)中设定的丙酮可以换成与纤黏连蛋白或血小板内皮生长因子发生化学反应的其他溶剂，丁酮。
进一步的，本发明用于治疗哺乳动物皮肤缺损的人工皮肤、创面覆盖物中的用途，其中，所述哺乳动物选自人、狗、猫、牛、马、兔、猪、小鼠或大鼠，并且优选是人。
进一步的，本发明利用“纤黏连蛋白-药物-丙酮”序贯处理流程，在生物支架内部原位产生含药物的微球的用途，进而实现药物缓释、控释的用途。
进一步的，本发明制备的人工皮肤经过如下测试：
(1)制备完成后，利用扫描电镜观察微球形态(制备方法效果检测)。
(2)接种细胞到人工皮肤，荧光显微镜观察细胞在人工皮肤中的形态、分布情况(生物安全性和相容性检测)。
(3)利用动物实验，检测该人工皮肤对小鼠创面愈合速度影响(在动物体水平，检测人工皮肤疗效)。
(4)利用Western Blotting方法检测血管内皮标志物(CD31)、新生血管内皮标志物(CD105)蛋白表达情况(在蛋白水平，检测人工皮肤疗效)。
(5)利用免疫组化方法检测血管内皮标志物CD31分布情况(在组织器官水平，检测人工皮肤疗效)。
(6)免疫组化方法检测新生血管内皮标志物CD105分布情况(在组织器官水平，检测人工皮肤疗效)。
本发明的优点：本发明方法利用“纤黏连蛋白-药物-丙酮”序贯处理流程，制备了可控性释放血小板内皮生长因子的聚己内酯三维多孔支架人工皮肤，本发明制备的人工皮肤，经材料学实验证实，可通过改变丙酮处理时间，调控血小板内皮生长因子的释放速率；经动物实验证实，可运用于皮肤缺损创面，且促进创面血管再生。本发明方法成功实现利用生物粘性分子纤黏连蛋白(FN)涂覆的方法，使原本是疏水性的聚己内酯，利于细胞、生长因子的黏附；把血小板内皮生长因子(VEGF)生长因子包裹到微球中，随着微球的缓慢降解，血管生长因子被缓慢的释放，提高其在体生物学效应，避免大量释放而被蛋白酶水解失效；在生物支架内部原位产生微球；通过控制微球的直径和降解速率，进而控制血小板内皮生长因子的释放速率。
附图说明
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细说明：
图1是人工皮肤扫描电镜图像。左侧：丙酮处理前(无微球)；右侧：丙酮处理后(微球出现)。
图2是荧光显微镜观察小鼠成纤维细胞分布情况。左侧：细胞核分布情况；右侧：细胞质蛋白分布情况。
图3是动物实验检测人工皮肤对小鼠创面愈合速率的影响。实验结果示，应用该人工皮肤可显著促进创面愈合速度。
图4是Western Blotting方法检测血管内皮标志物(CD31)、新生血管内皮标志物(CD105)蛋白表达情况。实验结果示，应用该人工皮肤可显著促进创面血管生成。
图5是免疫组化方法检测血管内皮标志物CD31分布情况。箭头为阳性细胞。
图6是免疫组化方法检测新生血管内皮标志物CD105分布情况。箭头为阳性细胞。
具体实施方式
下面给出的实施例拟对本发明作进一步说明，但不能理解为是对本发明保护范围的限制，本领域技术人员根据本发明内容对本发明的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1：制备人工皮肤，利用扫描电镜观察，确认微球形态(制备方法效果检测)。
用二氯甲烷/二甲基甲酰胺溶液，二氯甲烷/二甲基甲酰胺的体积比是5∶1，配置20％聚己内酯溶液，冷冻干燥法制备三维多孔材料，交联固定，烘干备用。首先，浸入纤黏连蛋白溶液中、37℃恒温箱孵育18小时，纯净水漂洗3次，纤黏连蛋白为5毫克/毫升，pH7.5。然后，浸入血小板内皮生长因子(VEGF)溶液，37℃，12h，纯净水漂洗1次，血小板内皮生长因子(VEGF)为1毫克/毫升，pH7.5。最后，浸入丙酮中5分钟。干燥后，用扫描电镜观察其结构(图1)。
实施例2：接种细胞到人工皮肤，荧光显微镜观察细胞在人工皮肤中的形态、分布情况(生物安全性和相容性检测)。
分离培养原代的小鼠真皮成纤维细胞，培养至第5代时，胰酶消化、稀释、吹打致悬，制备成纤维细胞悬液，浓度约为10×105/ml。将细胞悬液接种到消毒后的人工皮肤中，细胞箱内培养至第8天。首先，用10％多聚甲醛溶液固定，然后，分别用罗丹明标记的鬼笔环肽(R415，Molecular Probes)将细胞质内的纤维型肌动蛋白染成红色，用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)将细胞核染成蓝色，最后，用防荧光淬灭封片试剂封片，避光条件下保存。用荧光显微镜观察、拍照，以研究细胞形态，以及细胞在人工皮肤中的分布情况(图2)。
实施例3：利用动物实验，检测该人工皮肤对小鼠创面愈合速度影响(在动物体水平，检测人工皮肤疗效)。
第一步，麻醉实验小鼠。采用0.8％戊巴比妥，对实验小鼠进行腹腔注射，实施麻醉。麻醉剂按照0.02mg/g体重剂量使用。第二步，利用脱毛膏脱去小鼠背部毛发，酒精消毒；在小鼠背部制作全层皮肤缺损创面，保证每个小鼠创面大小和深度基本相同。第三步，将制备的人工皮肤移植覆盖到创面，进行创面拍照、计算创面愈合速率。人工皮肤后移植后第0、3、5、7、13天，以佳能数码相机垂直于创面。拍照的同时，在创面旁放置与最初创面大小相同的参照物，以利于计算创面愈合比例(图3)。
实施例4：利用Western Blotting方法检测血管内皮标志物(CD31)、新生血管内皮标志物(CD105)蛋白表达情况(在蛋白水平，检测人工皮肤疗效)。
在人工皮肤接种了第5天时(Day5)，取小鼠背部创面组织(包括新生上皮层和真皮层)。第一步，将上述组织放入液氮中冷冻，冰上研磨，随即放入蛋白裂解液(由磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、PMSF组成)。转入1.5mL预冷的离心管，1200rpm离心1min。吸出上清后，弃掉，再加入200μl冷裂解液，颠倒充分混匀。再次离心25min，收集上清。第二步，利用BCA法测定蛋白浓度(蛋白浓度测定试剂盒，美国Pierce公司)。第三步，利用SDS-PAGE凝胶进行电泳(100V，80min)。冰浴中恒压转膜(120伏，电流300mA，2小时)。第三步，将转膜完成后的膜片至于5％BSA封闭液，室温，摇床，3小时，以封闭非特异性抗体。第四部，抗体结合。用CD31一抗(浓度1∶800)，CD105一抗(浓度1∶1000)，GADPH内参一抗(1∶1500)，4摄氏度孵育过夜。利用辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶2000)孵育。TBST洗涤，5min×5次。第四步，利用增强化学发光底物显色，利用凝胶成像仪照相，手动分析条带灰度值，获得电泳条带图(图4)。
实施例5：利用免疫组化方法检测CD31(血管内皮标志物)分布情况(在组织器官水平，检测人工皮肤疗效)。
在人工皮肤接种了第5天时(Day5)，取小鼠背部创面组织标本，固定，切片。第一步，脱蜡至水，PBS溶液洗5次，3min/次；利用3％H2O2，室温孵育8min；PBS溶液洗5次，3min/次；利用微波修复抗原，细胞致孔剂处理1分钟；10％山羊血清封闭抗原，室温，1小时。第二步，CD31(血管内皮标志物)一抗(浓度1∶800)，4摄氏度孵育过夜。第三步，PBS溶液洗5次，3min/次。加入IgG二抗(稀释度1∶1000)，室温孵育90min；PBS漂洗3次，3min/次。加入生物素标记的辣根过氧化物酶，室温孵育20min，DAB显色。最后，将切片放入显微镜下观察，终止显色；拍照(图5)。
实施例6：利用免疫组化方法检测CD105(新生血管内皮标志物)分布情况(在组织器官水平，检测人工皮肤疗效)。
在人工皮肤接种了第5天时(Day5)，取小鼠背部创面组织标本，固定，切片。第一步，脱蜡至水，PBS溶液洗5次，3min/次；利用3％H2O2，室温孵育8min；PBS溶液洗5次，3min/次；利用微波修复抗原，细胞致孔剂处理1分钟；10％山羊血清封闭抗原，室温，1小时。第二步，CD105(特异性标记新生的血管组织)一抗(浓度1∶1500)，4摄氏度孵育过夜。第三步，PBS溶液洗5次，3min/次。加入IgG二抗(稀释度1∶1000)，室温孵育90min；PBS漂洗3次，3min/次。加入生物素标记的辣根过氧化物酶，室温孵育20min，DAB显色。最后，将切片放入显微镜下观察，终止显色；拍照(图6)。

Claims (4)

1.一种可控性释放药物的人工皮肤的制备方法，其特征在于，采用如下方法制备：
(1)冷冻干燥技术制备聚己内酯三维多孔支架：将聚己内酯溶解于在浓度为20％(重量)的二氯甲烷/二甲基甲酰胺溶液中，二氯甲烷/二甲基甲酰胺的体积比是5∶1，冷冻12小时，然后将冷冻后的材料，放入冻干机中，真空冻干24小时，交联固定，获得聚己内酯三维多孔支架；(2)生物粘性分子纤黏连蛋白涂覆于聚己内酯三维多孔支架表面：将步骤(1)制备的聚己内酯三维多孔支架浸入纤黏连蛋白(FN)溶液中、37℃恒温箱孵育24小时，纤黏连蛋白(FN)溶液的浓度为5毫克/毫升，pH7.5；(3)将血小板内皮生长因子与纤黏连蛋白结合：将步骤(2)中制得的材料用纯净水漂洗3次，再浸入血小板内皮生长因子(VEGF)溶液中、37℃恒温箱孵育12小时，血小板内皮生长因子溶液的浓度为1毫克/毫升，pH7.5，随后，将该聚己内酯三维多孔支架用纯化水漂洗一次，再检测漂洗液中血小板内皮生长因子(VEGF)的含量，获得PCL-FN-VEGF材料；(4)丙酮处理，原位生成合适直径的微球：将步骤(3)制得的PCL-FN-VEGF材料浸入丙酮中，室温下放置40-120min；浸泡后，采用高压液相色谱法(HPLC)，检测丙酮溶液中血小板内皮生长因子(VEGF)的量，测量粘附到支架上的血小板内皮生长因子，经过丙酮处理后，可在聚己内酯(PCL)支架内部原位生成含血小板内皮生长因子(VEGF)的微球。
2.如权利要求1所述的一种可控性释放药物的人工皮肤的制备方法，其特征在于：步骤(2)中设定的纤黏连蛋白(FN)换成盐酸左旋多巴。
3.如权利要求1所述的一种可控性释放药物的人工皮肤的制备方法，其特征在于：步骤(3)中设定的血小板内皮生长因子(VEGF)换成血小板源性生长因子(PDGF)。
4.如权利要求1所述的一种可控性释放药物的人工皮肤的制备方法，其特征在于：步骤(4)中设定的丙酮换成丁酮。
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