CN107429216B - 用于检测分子和结合能的装置和方法 - Google Patents

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Abstract

本公开内容提供了用于分析带电分析物的存在和/或带电分析物与捕获探针之间的结合力的装置和方法。本公开内容的所述装置和方法能够以多路复用形制操作，以例如进行具有临床意义的各种测定。

Description

用于检测分子和结合能的装置和方法
交叉引用
本申请要求2015年2月10日提交的美国临时专利申请序列号62/114,474的权益，上述申请通过引用全文并入于此。
背景技术
各种类型的分子可以通过形成可能以特定空间定向结合的多种(数目和/或类型的)非共价键(例如，范德华力、氢键、库仑引力和疏水键)来识别其他分子。这些分子识别相互作用可以是可逆的，并且具有中度至高度特异性。此类分子相互作用的示例包括抗体-抗原相互作用和核酸杂交。此类相互作用对于生物学以及若干成熟和发展中的行业十分重要，仅举几例而言，这些行业例如有医疗诊断、治疗、生物技术、农业、燃料和化工生产、国防、环境监测、食品和食品安全等。
发明内容
本文认识到需要用于检测分子相互作用的存在和用于测量与分子相互作用相关联的力的新型改进的传感器和方法。本公开内容提供了这样的传感器和使用该传感器的方法。非限制性地，本公开内容的装置和方法在区分特异性(例如，强)和非特异性(例如，弱)分子相互作用方面具有优势，并且因此可以区分假阳性与真阳性信号。所述装置和方法可适合于多路复用(例如，并行地进行5个、10个、102个、103个、104个、105个、106个或更多个测量)，并且直接使用诸如生物流体(例如，血液)或环境样品等具有两种或更多种分析物的复杂混合物。在一些实施方式中，本文所述的装置和方法可以用于测量与分子相互作用相关联的力，所述力在强度方面跨越多个数量级(例如，介于约1皮牛顿(pN)与约400pN)之间。
在一个方面，一种用于检测标靶分析物的存在的方法包括：(a)激活包括位于两个或更多个电极之间的一个或多个表面的至少一个传感器，其中所述一个或多个表面包括两个或更多个固定化捕获探针(immobilized capture probe)；(b)在足以允许靶标分析物和非靶标分析物各自结合到所述两个或更多个固定化捕获探针之中给定的一个的条件下，使所述一个或多个表面与含有或怀疑含有所述标靶分析物和所述非标靶分析物的溶液接触；(c)跨所述两个或更多个电极施加足以从所述两个或更多个固定化捕获探针之中给定的一个释放所述非标靶分析物但不足以释放所述标靶分析物的电压；以及(d)检测指示出所述一个或多个表面上的所述标靶分析物的存在和/或结合能的信号。在一些实施方式中，所述标靶分析物和/或所述非标靶分析物是带电分析物。在一些实施方式中，所述电压足以对所述非标靶分析物施加至少约1皮牛顿(piconewton，pN)的施加力。在一些实施方式中，所述施加力为至少约10pN。在一些实施方式中，所述电压足以产生具有至少约103伏每米强度的电场。
在一些实施方式中，所述方法还包括跨所述两个或更多个电极施加附加电压，所述附加电压足以从所述两个或更多个固定化捕获探针之中给定的一个释放所述标靶分析物。在一些实施方式中，所述附加电压足以对所述标靶分析物施加至少约1pN的施加力。在一些实施方式中，所述施加力为至少约10pN。在一些实施方式中，所述方法还包括在施加所述附加电压之后检测所述一个或多个表面上的所述标靶分析物的存在。在一些实施方式中，所述电压小于所述附加电压。在一些实施方式中，所述电压和所述附加电压是单独电压，所述单独电压是随时间改变的连续施加电压。在一些实施方式中，在不洗涤所述一个或多个表面的情况下施加所述附加电压。
在一些实施方式中，所述施加电压足以产生具有小于约109伏每米(V/m)强度的电场，并且所述附加施加的电压足以产生具有小于约109V/m强度的附加电场。
在一些实施方式中，所述标靶分析物和所述非标靶分析物中的每一个非共价结合到所述两个或更多个固定化捕获探针之中给定的一个，以相应地形成固定在所述一个或多个表面上的标靶探针-分析物复合物和非标靶探针-分析物复合物。
在一些实施方式中，所述施加电压随时间从第一电压增加到第二电压。在一些实施方式中，所述施加电压以至少约1毫伏每秒的速率从所述第一电压增加到所述第二电压。在一些实施方式中，所述施加电压在大于约10微秒的时间段内从所述第一电压增加到所述第二电压。在一些实施方式中，所述施加电压在小于约1秒的时间段内从所述第一电压增加到所述第二电压。在一些实施方式中，所述施加电压是周期性电压波形。在一些实施方式中，所述周期性电压波形具有小于约1吉赫的频率。在一些实施方式中，所述周期性电压波形具有大于约1毫赫的频率。
在一些实施方式中，所述方法还包括当所述施加电压随时间变化时，监测指示出所述一个或多个表面上的所述标靶分析物的存在的信号。在一些实施方式中，所述方法还包括确定所述标靶分析物结合至所述两个或更多个固定化捕获探针之中给定的一个的结合力。
在一些实施方式中，所述施加力小于所述标靶分析物结合至所述两个或更多个固定化捕获探针之中给定的一个的结合力。
在一些实施方式中，所述溶液包含与所述标靶分析物和/或所述非标靶分析物结合的带电分子，以提供所述标靶分析物和/或所述非标靶分析物上的电荷变化。在一些实施方式中，所述带电分子是抗体。在一些实施方式中，在不洗涤所述一个或多个表面的情况下进行(c)和/或(d)。
在一些实施方式中，通过测量与所述标靶分析物相关联的信号来检测所述一个或多个表面上的所述标靶分析物的存在。在一些实施方式中，所述信号是电荷信号。在一些实施方式中，使用感测电极和参考电极来检测所述电荷信号。在一些实施方式中，所述电荷信号是电压。在一些实施方式中，通过测量与所述标靶分析物相关联的光学信号来检测指示出所述一个或多个表面上的所述标靶分析物的存在和/或结合能的所述信号。在一些实施方式中，所述光学信号是荧光信号。在一些实施方式中，所述荧光信号由共价或非共价附着至所述标靶分析物的荧光探针提供。在一些实施方式中，使用表面等离子体共振来检测指示出所述一个或多个表面上的所述标靶分析物的存在和/或结合能的所述信号。
在一些实施方式中，所述一个或多个表面是基本上平坦的。在一些实施方式中，所述一个或多个表面包括电绝缘层和导电层。在一些实施方式中，所述导电层与所述溶液连通。在一些实施方式中，所述导电层与所述溶液电隔离并且所述导电层是电偏压的。在一些实施方式中，所述导电层包含铂。在一些实施方式中，所述一个或多个表面包括厚度在约0.08纳米与1毫米之间的膜。在一些实施方式中，所述一个或多个表面包括将电场集中成至少约103伏每米强度的场约束特征。在一些实施方式中，所述场约束特征包括所述一个或多个表面中的孔口，所述一个或多个表面包括电绝缘层和导电层。
在一些实施方式中，所述两个或更多个固定化捕获探针是与所述标靶分析物杂交的核酸分子。在一些实施方式中，所述标靶分析物是核酸分子。在一些实施方式中，所述两个或更多个固定化捕获探针包括结合所述标靶分析物的抗体。在一些实施方式中，所述标靶分析物是蛋白质。
在一些实施方式中，所述一个或多个表面包括多个表面。在一些实施方式中，所述多个表面中的每一个包括所述两个或更多个固定化捕获探针的子集。
在一些实施方式中，所述电压是直流电压。在一些实施方式中，所述电压是交流电压。
在另一方面，一种用于检测标靶分析物的存在的系统包括：包括位于两个或更多个电极之间的一个或多个表面的至少一个传感器，其中所述一个或多个表面包括两个或更多个固定化捕获探针；与所述一个或多个表面流体连通的溶液腔室，其中所述溶液腔室被配置用于在足以允许靶标分析物和非靶标分析物各自结合到所述两个或更多个固定化捕获探针之中给定的一个的条件下保持含有或怀疑含有所述标靶分析物和所述非标靶分析物的溶液；以及可操作地耦合至所述两个或更多个电极的控制器，其中所述控制器被编程用于(i)跨所述两个或更多个电极施加足以从所述两个或更多个固定化捕获探针之中给定的一个释放所述非标靶分析物但不足以释放所述标靶分析物的电压；以及(ii)检测指示出所述一个或多个表面上的所述标靶分析物的存在和/或结合能的信号。在一些实施方式中，所述标靶分析物和/或所述非标靶分析物是带电分析物。在一些实施方式中，跨所述两个或更多个电极的所述电压足以对所述非标靶分析物施加至少1皮牛顿的施加力。
在一些实施方式中，所述至少一个传感器包括传感器阵列。在一些实施方式中，所述传感器阵列包括至少约10个传感器。在一些实施方式中，所述传感器阵列中的每个传感器是可独立寻址的。
在另一方面，一种用于检测分析物的存在的装置包括：适于容纳电解质的流体腔室；两个或更多个能够在所述流体腔室内产生电场的电极；至少一个表面，其包括能够结合所述分析物的固定化捕获探针，其中所述至少一个表面位于所述两个或更多个电极之间并且与所述流体腔室接触，并且其中所述至少一个表面包括导电层和电绝缘层；以及靠近所述至少一个表面的至少一个场约束特征，所述至少一个场约束特征能够将所述至少一个场约束特征周围的电场集中成至少约103伏每米(V/m)的强度。在一些实施方式中，所述分析物是带电分析物。在一些实施方式中，所述至少一个场约束特征能够将所述至少一个场约束特征周围的电场集中成小于约105V/m的强度。在一些实施方式中，所述装置还包括可操作地耦合至所述两个或更多个电极的控制器，其中所述控制器被编程用于跨所述两个或更多个电极施加足以对所述分析物产生施加力的电压。在一些实施方式中，所施加的电压足以对所述分析物产生至少约1皮牛顿(pN)的施加力。在一些实施方式中，所述电压足以对所述分析物产生至少约20pN的施加力。
在一些实施方式中，所述固定化捕获探针能够结合至所述分析物以在所述至少一个表面上形成探针-分析物复合物。在一些实施方式中，所述固定化捕获探针能够通过一个或多个非共价相互作用结合至所述分析物。在一些实施方式中，所述一个或多个非共价相互作用能够通过在跨所述两个或更多个电极施加电压时产生的施加力而破坏。在一些实施方式中，所述固定化捕获探针靠近所述至少一个场约束特征。在一些实施方式中，所述至少一个场约束特征是多个场约束特征。
在一些实施方式中，所述固定化捕获探针是抗体。在一些实施方式中，所述分析物是抗原。在一些实施方式中，所述固定化捕获探针是核酸分子。在一些实施方式中，所述分析物是核酸分子。
在一些实施方式中，所述分析物具有小于约104e-的电荷。在一些实施方式中，所述分析物具有大于约10e-的电荷。在一些实施方式中，所述装置还包括可操作地耦合至所述两个或更多个电极的控制器，其中所述控制器被编程用于在所述两个或更多个电极之间施加小于约100伏(V)的电位差。
在一些实施方式中，所述至少一个表面提供所述流体腔室的壁，并且所述场约束特征是所述表面中的孔口。在一些实施方式中，所述场约束特征包括所述至少一个表面中的孔口。在一些实施方式中，所述流体腔室包括由所述至少一个表面分隔的顶部部分和底部部分，并且其中所述场约束特征是所述至少一个表面中的孔口。在一些实施方式中，所述孔口延伸穿过所述表面。在一些实施方式中，所述孔口是凹口、孔阱、孔隙、通道、间隙(gap)或狭缝(slit)。在一些实施方式中，所述至少一个场约束特征具有小于约50微米的直径。在一些实施方式中，所述至少一个场约束特征具有小于约50纳米的直径。在一些实施方式中，所述场约束特征具有至少约0.1的宽高比。在一些实施方式中，所述宽高比是所述场约束特征的最长尺寸与所述场约束特征的最短尺寸的比率。在一些实施方式中，所述宽高比是所述场约束特征的宽度与所述场约束特征的深度的比率。在一些实施方式中，所述场约束特征具有尖锐边缘。在一些实施方式中，所述场约束特征是所述至少一个表面的升高部分。
在一些实施方式中，所述导电层与所述电解质连通。在一些实施方式中，所述导电层与所述电解质电隔离，并且其中在使用期间所述导电层是电偏压的。在一些实施方式中，所述导电层包含铂。在一些实施方式中，所述装置还包括感测电极，所述感测电极被配置用于测量与所述分析物的存在相关联的电荷信号。
在一些实施方式中，所述感测电极靠近所述至少一个场约束特征。在一些实施方式中，所述装置还包括光源和检测器，所述检测器被配置用于检测与所述分析物的存在相关联的光学信号。在一些实施方式中，所述光学信号是荧光信号。在一些实施方式中，所述荧光信号由共价或非共价附着至所述分析物的荧光探针提供。在一些实施方式中，所述装置还包括被配置用于检测与所述分析物的存在相关联的表面等离子体共振信号的检测器。
在一些实施方式中，所述至少一个表面是基本上平坦的。
在一些实施方式中，所述至少一个表面是传感器阵列的一部分，其中所述阵列的每个传感器包括场约束特征和多个固定化捕获探针。在一些实施方式中，所述阵列的给定传感器的所述多个固定化捕获探针靠近所述阵列的所述给定传感器的所述场约束特征。在一些实施方式中，所述阵列的给定传感器的所述多个固定化捕获探针是克隆的。在一些实施方式中，所述阵列的给定传感器包括相对于所述阵列的另一传感器独特的多个固定化捕获探针。在一些实施方式中，所述阵列的给定传感器与最邻近传感器之间的距离为至少约50纳米(nm)。在一些实施方式中，所述阵列的给定传感器与最邻近传感器之间的距离为至少约150nm。在一些实施方式中，所述阵列的给定传感器与最邻近传感器之间的距离小于约50微米。在一些实施方式中，所述阵列包括至少约10个传感器。
在另一方面，一种用于分析标靶分析物与捕获探针之间的结合能的方法包括：(a)激活包括位于两个或更多个电极之间的一个或多个表面的至少一个传感器，其中所述一个或多个表面包括固定化捕获探针；(b)在足以允许靶标分析物结合至所述固定化捕获探针的条件下，使所述一个或多个表面与含有或怀疑含有所述标靶分析物的溶液接触；(c)跨所述两个或更多个电极施加足以对所述标靶分析物施加至少约1皮牛顿(pN)的施加力的电压，以从所述固定化捕获探针释放所述标靶分析物；以及(d)检测指示出所述标靶分析物与所述捕获探针之间的结合能的信号。在一些实施方式中，所述施加力为至少约10pN。在一些实施方式中，所述电压足以从所述一个或多个表面释放所述标靶分析物，但不足以释放非标靶分析物。在一些实施方式中，所述电压足以产生具有至少约103伏每米强度的电场。
本公开内容的另一方面提供了一种包含机器可执行代码的计算机可读介质，所述机器可执行代码在由一个或多个计算机处理器执行时实现上述或本文其他各处的方法中的任一方法。
本公开内容的另一方面提供了一种包括一个或多个计算机处理器和与其耦合的计算机存储器的计算机系统。所述计算机存储器包含机器可执行代码，所述机器可执行代码在由所述一个或多个计算机处理器执行时实现上述或本文其他各处的方法中的任一方法。
根据以下详细描述，本公开内容的附加方面和优点将对于本领域技术人员变得显而易见，其中仅示出和描述了本公开内容的说明性实施方式。应当认识到，本公开内容能够具有其他实施方式和不同实施方式，并且其若干细节能够具有在各个明显方面的修改，所有修改都不偏离本公开内容。因此，附图和描述在本质上应被认为是说明性的，而非限制性的。
援引并入
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同具体地且单独地指明每个单独的出版物、专利或专利申请均通过引用而并入。
附图说明
本发明的新颖特征在随附的权利要求书中进行阐述。通过参考对在其中利用到本发明原理的说明性实施方式加以阐述的以下详细描述以及附图，将会获得对本发明特征和优点的更好的理解，在附图(在本文中亦称为“图”)中：
图1A示出了本公开内容的装置的截面轮廓图的示例；图1B示出了本公开内容的装置的截面轮廓图的示例；
图2A示出了传感器阵列大小对电场强度影响的示例；图2B示出了宽高比对传感器间电场强度变化影响的示例；
图3示出了在无导电层情况下产生的电场的示例；
图4示出了在有导电层(例如，场终止平面)情况下产生的电场的示例；
图5示出了本公开内容的适用于带电分析物光学检测的装置的示例；
图6A示出了作为用于操作图5的装置的施加电压的函数的荧光信号幅度的示例；图6B示出了图5的装置在第一电压下的操作的示例；图6C示出了图5的装置在第二电压的操作的示例；图6D示出了图5的装置在第三电压下的操作的示例；图6E示出了图5的装置在第四电压下的操作的示例；
图7示出了本公开内容的适用于带电分析物电检测的装置的示例；
图8A示出了作为用于操作图7的装置的施加电压的函数的传感器电压幅度的示例；图8B示出了图7的装置在第一电压下的操作的示例；图8C示出了图7的装置在第二电压下的操作的示例；图8D示出了图7的装置在第三电压下的操作的示例；图8E示出了图7的装置在第四电压下的操作的示例；
图9示出了本公开内容的适用于带电分析物等离子体检测的装置的示例；
图10示出了本公开内容的用于感测核酸分子的存在和结合力的阵列的示例；
图11A示出了本公开内容的用于测量互补核酸分子的结合力的方法的示例；图11B接续图11A，并且示出了本公开内容的用于测量互补核酸分子的结合力的方法的示例；
图12A示出了本公开内容的用于测量具有与捕获探针的单一碱基对错配的核酸分子的结合力的方法的示例；图12B接续图12A，并且示出了本公开内容的用于测量具有与捕获探针的单一碱基对错配的核酸分子的结合力的方法的示例；
图13A示出了本公开内容的用于测量与捕获探针具有不同程度互补性的核酸分子混合物的结合力的方法的示例；图13B接续图13A，并且示出了本公开内容的用于测量与捕获探针具有不同程度互补性的核酸分子混合物的结合力的方法的示例；
图14示出了多重免疫测定的示例，其中第二抗体具有附着核酸以增加和控制与分析物相关联的电荷量；
图15示出了使用图14中所示装置执行本公开内容的方法的示例；
图16示出了将核酸分子附着到本公开内容的表面的示例；
图17示出了本公开内容的装置的示例；
图18示出了用于操作本公开内容的装置的计算机系统的示例。
具体实施方式
虽然本文已经示出和描述了本发明的各个实施方式，但对于本领域技术人员显而易见的是，这样的实施方式仅以实施例方式提供。本领域技术人员可以想到不背离本发明的许多变更、变化和替代。应当理解，可以采用本文描述的本发明的实施方式的各种替代方案。
水溶液中的外加电场可以对溶液中的带电粒子(例如，分子或分析物)施加力。带电粒子上的这样的力(F)根据等式F＝qE可以与所施加的电场(E)和粒子的净电荷(q)成比例。
使用这些参数之间的线性关系，本方法将所施加的力与输入参数(例如，施加的外部偏压)相关联。本文提供了可以利用这样的力来进行力谱和力分化测定的装置。该测定可以针对抗原-抗体键进行，或者用于核酸分析(例如，单核苷酸多态性(SNP)分析))。在一些情况下，分析物与捕获探针之间的结合力可以是约1皮牛顿(pN)至约400pN。
以电荷为100e-的带电粒子(例如，相当于具有100个碱基的核酸)为例，用以破坏某些感兴趣的键的外部电场强度如下表1中所示。
表1：破坏感兴趣的键所需的电场(假设标记分子上的电荷为100e-)。
Figure BDA0001429086220000111
所需场强可能相对较大，这可能难以在开放结构中产生。因此，本装置采用使用(微米或纳米尺度)结构的(物理)约束来显著提高施加的电场强度。这些结构在本文中称为“场约束特征”，并且可以包括孔隙、通道、间隙和狭缝(例如，孔口)以及与感测表面相关联的凸起结构。纳米孔是这样一种类型的场约束特征：其可以物理地约束分子的易位，从而支持通过阻断纳米孔进行单分子检测。
在一些情况下，这样的物理约束的一个优点是随之而来的电约束。当使用孔口作为最小特征进行设计时，孔口可以支配整个系统的电特性。电位降(因而电场)可能主要发生在孔口附近，而在其他位置较少发生(甚至很少发生)。当孔口较小(例如，微米或纳米尺度)时，这样的约束能够以相对较低的施加偏压来产生较大电场。例如，位于100nm厚的SiNx膜上的合成纳米孔可以通过施加1V来产生约10,000,000V/m的电场。本公开内容包括任何大小、形状或布置的场约束特征(例如，孔口)，包括图1A和图1B中所示的实施方式在内。
通过预先制备一组识别分子(例如，捕获探针)，本方法可以通过观察分析物的数量以及分析物与捕获探针结合的力来寻找样本
中其相应靶分子(例如，分析物)的存在。分析这样的分子识别(例如，结合)事件的本方法可以称为结合测定。可以使用经标记试剂(或标记试剂)来检测这样的分子识别事件。非特异性结合可能在现有的结合测定中带来挑战。现有结合测定的其他限制包括不能进行多重测定，无法在微米或纳米尺度上(例如，密集地集成)进行测定，以及无法产生足够的力。
现有结合测定的示例包括但不限于：酶联免疫吸附测定(ELISA)；夹心ELISA；邻位连接测定(原位PLA)；力分化测定(如Juncker,D.,S.Bergeron等人(2014)“Cross-reactivity in antibody microarrays and multiplexed sandwich assays:sheddinglight on the dark side of multiplexing.”Current Opinion in Chemical Biology18:29-37中所述)；与光学显微术结合使用的微量移液器(如Evans,E.和K.Ritchie(1997)“Dynamic strength of molecular adhesion bonds.”Biophysical Journal 72(4):1541-1555中所述)；使用层流流动来对一定大小的珠子产生物理力(如美国专利第7,736,889号中所述)；用于搅拌结合分子的超声激发(如美国专利第6,086,821号中所述)；使用磁场来向分子间键传递力(如美国专利第5,445,970号；第5,445,971号和第6,180,418号中所述)；使用介电电泳(如美国专利申请第2014/0102901号中所述)；使用原子力显微术(如美国专利第5,363,697号；第5,992,226号；第5,992,226号；Florin,E.L.,V.T.Moy等人(1994)“Adhesion Forces between Individual Ligand-Receptor Pairs.”Science264(5157):415-417；Lee,G.U.,D.A.Kidwell等人(1994)“Sensing Discrete Streptavidin BiotinInteractions with Atomic-Force Microscopy.”Langmuir 10(2):354-357；Dammer,U.,M.Hegner等人(1996)“Specific antigen/antibody interactions measured by forcemicroscopy.”Biophysical Journal 70(5):2437-2441；Chilkoti,A.,T.Boland等人(1995)“The relationship between ligand-binding thermodynamics and protein-ligand interaction forces measured by atomic force microscopy.”BiophysicalJournal 69(5):2125-2130以及Allen,S.,X.Y.Chen等人(1997).“Detection of antigen-antibody binding events with the atomic force microscope.”Biochemistry 36(24):7457-7463中所述)；使用合成孔隙(如美国专利第8,810,787号和Tabard-Cossa,V.,M.Wiggin等人(2009)“Single-Molecule Bonds Characterized by Solid-StateNanopore Force Spectroscopy.”ACS Nano 3(10):3009-3014中所述)；以及使用生物孔隙(如Dudko,O.K.,J.Mathe等人(2007)“Extracting kinetics from single-moleculeforce spectroscopy:Nanopore unzipping of DNA hairpins.”Biophysical Journal 92(12):4188-4195以及Tropini,C.和A.Marziali(2007).“Multi-nanopore forceSpectroscopy for DNA analysis.”Biophysical Journal 92(5):1632-1637中所述)，上述每一(专利和/或研究论文)出版物均通过引用而全文并入于此用于所有目的。
在结合测定中可能发生各种类型的交叉反应性，图14示出了一些示例。考虑到多种标记物或检测探针，除了正确的标记物或检测探针之外，不正确的标记物或检测探针也可以结合至标靶，1410。不正确的标记物或检测探针可以结合至捕获探针，1413。不正确的标记物或检测探针可以结合至与正确靶标结合的正确标记物或检测探针，1411。不正确的标记物或检测探针-标靶化合物可以结合至正确的探针，1414。不正确的靶标可以结合至结合有正确的靶标和正确的标记物或检测探针的正确的捕获探针，1412。在没有任何探针的情况下，不正确的标记物或检测探针可以被重力或库仑力吸附到检测表面。这些事件中的每一个可以导致过量的标记物或探针保留在测定面上，从而导致假阳性结果。这样的假阳性结果可以通过本公开内容的装置和方法来减少，例如，通过向表面施加足以移除不期望的标记物或探针或标靶的力，和/或通过先验预期捕获探针-靶标-标记物/检测探针或探针-标靶复合物的结合力，并对应地测量与预期结合力相比打破复合物所需的力。
在一个方面，本公开内容描述了一种用于测量分子间相互作用的方法，所述分子间相互作用包括但不限于受体/配体、蛋白质/蛋白质、核酸/蛋白质和核酸/核酸相互作用。用于测量分子间相互作用的方法可以包括同时使用(1)用于检测溶液中的靶分子对与表面结合的其特异性互补或近互补捕获分子的附着(例如，溶液中的核酸与表面上的互补或近互补核酸捕获探针的杂交)的传感器和(2)使用电场对结合的分子复合物(例如，附着于捕获分子或与捕获分子结合的靶分子)施加电动力。当电动力超过结合的分子复合物的附着力时，靶分子可以脱离捕获分子。这可能是由于捕获分子对表面的附着力远远超过靶分子对捕获探针的附着力而发生。通过电场施加的电动力使得可以将分子从传感器拉离。可以通过对传感器和装置的表面上或溶液中或组合中的两个相对的电极施加电压来产生电场。该靶分子可能具有足够的电荷来产生足够高的电动力。在一些情况下，可以利用附加的电荷来修饰靶分子，以对靶分子产生更高的电动力。作为示例，可以使用包括聚阴离子聚合物的引物在聚合酶链反应(PCR)期间修饰标靶核酸分子。在免疫测定的情况下，可以用核酸或聚阴离子聚合物标记第二抗体或检测抗体，以使得在靶分子不具有充足电荷的情况下能够对抗体施加电动力。
本公开内容还提供了能够采用该方法的若干种装置，包括全电子平台。在一个方面，本公开内容提供了一种用于检测带电分析物的装置。该装置可以包括适于容纳电解质的流体腔室。该装置还可以包括能够在电解质内提供电场的两个或更多个电极，诸如第一电极和第二电极，以及位于第一电极与第二电极之间并且与流体腔室接触的表面。该表面可以包括导电层和电绝缘层。可以存在位于所述表面附近的场约束特征。该场约束特征可以将电场集中成在场约束特征附近具有至少约103伏每米(V/m)、至少约104V/m、至少约105V/m、至少约106V/m、至少约107V/m、至少约108V/m、至少约109V/m或更大的强度。
在另一方面，本公开内容提供了一种用于检测带电分析物的结合的方法。该方法可以包括提供具有诸如一对电极等两个或更多个电极和该对电极之间的表面的设备。该表面可以具有在感测位置处拴系至表面的捕获探针。该方法还可以包括使所述表面与带电分析物的混合物接触，其中混合物包含标靶带电分析物和非标靶带电分析物。带电分析物可以与捕获探针形成非共价键。该方法还可以包括跨该对电极施加第一电压，所述第一电压产生第一电场，该第一电场对与捕获探针结合的带电分析物施加至少1皮牛顿(pN)的第一施加力，从而打破捕获探针与非标靶带电分析物之间的非共价键。该方法继而可以包括在感测位置处检测标靶带电分析物的存在。在一些情况下，第一电场在感测位置附近具有至少约103伏每米(V/m)、至少约104V/m、至少约105V/m、至少约106V/m、至少约107V/m、至少约108V/m、至少约109V/m或更大的强度。
在一些情况下，该方法还可以包括跨该对电极施加第二电压，所述第二电压产生第二电场，该第二电场对与捕获探针结合的带电分析物施加大于1pN的第二施加力，从而打破捕获探针与标靶带电分析物之间的非共价键。该方法可以包括在感测位置处检测标靶带电分析物的缺失。
现在转到附图，图1A示出了本公开内容的装置的截面轮廓图的示例。该装置可以包括适于容纳电解质101的流体腔室。第一电极102可以位于电解质中并与第二电极103形成电路，可以通过电压源104跨所述电极施加电压。在这种情况下，第二电极形成流体腔室的壁之一。在一些情况下(例如，参见图1B)，流体腔室被膜一分为二，并且第一电极和第二电极位于膜的相对侧上。在本实施方式中，在第二电极附近或之上放置表面。该表面可以包括电绝缘层105和导电层106。在一些情况下，导电层暴露于电解质101。所述表面可以具有靠近该表面的场约束特征107(例如，在该表面内部或之上)。场约束特征可以增加该场约束特征附近的施加电场的幅度。
该装置可以使用电场来将锚定的捕获探针及其附着的标靶吸入孔隙中，以使用辅助传感器检测总电荷。捕获分子在其非杂交状态(例如，未结合至标靶)和杂交状态(例如，结合至标靶)之间的电荷差异可以用于确定结合的分子的存在。这样的架构可以非常适合于探测分子对的结合能。当在电场影响下测量分子对的存在时，可以逐渐增加电场直到电动力超过所述分子对的结合能。一旦靶分子脱离，就可以检测到感测区域中的电荷变化，并且可以使用该变化来确定所述对的结合电压。
图1B示出了本公开内容的装置的截面轮廓图的示例，其中传感器表面将流体腔室一分为二。图1A和图1B的流体腔室可以是微流体室(例如，具有小于约1毫米的最小尺寸)。如图1A所示，该装置可以包括电解质101、第一电极102、第二电极103、电压源104、电绝缘层105、导电层106和场约束特征107。
各种因素可能影响约束特征(例如，孔口)的约束程度。约束特征的设计，诸如宽高比和特征密度，可能会影响约束程度。较高的宽高比可能有助于减少边缘场的作用。对于约束特征的致密堆积，边缘场中的重叠可以减少场约束的作用。在一些情况下，可以通过提供用于使场在重叠之前终止的区域，诸如在约束特征附近的导电表面，来减少特征之间边缘场的重叠。这样的表面可以有效地保持孔口附近的电位，以允许进一步增强电场，并且从而进一步增强所产生的电动力。本文示出了对这样的场终止位置的作用的模拟研究连同对特征宽高比的作用的调查。导电表面层的存在可以增强单一特征约束电场的能力，并且非常有效地抵消将约束特征集成到阵列中带来的降低。
如本文所述，场约束特征的大小、形状、布置和数目可以影响在场约束特征附近产生的电场的幅度和可以对带电分析物施加的力的量。图2A示出了传感器阵列大小对电场强度的影响的示例。如此处所见，导电层(也称为电位保持或场终止层/平面)可以有助于产生更强的电场，尤其是随着感测位置(例如，孔阱)数目增加而产生更强的电场。当使用导电层201时，这种情况下的电场可以相对恒定在约1.5×106V/m，而在不存在导电层202的情况下的电场的幅度可能较低，并且随着孔阱阵列大小的增加而降低。水平轴是正方形阵列(例如，单个位置、3X3阵列、5X5阵列和7X7阵列)的一侧的感测位置的数目。图2A、图2B、图3和图4中所描绘的电场通过直径为1μm并且间隔4μm的约束特征实现。
图2B示出了宽高比对传感器间电场强度变化的影响的示例。系统架构是如图1A中所示的孔阱阵列，其中宽高比定义为孔阱(例如，沿着表面)的宽度除以孔阱(例如，进入表面)的深度。如图所示，随着宽高比的增加，电场强度变化(以％计量)203增加。比较微孔底部的电场以确定变化。在该示例中，电场的变化在1:1的宽高比下接近0.0％(例如，所有感测位置具有相同的场)。在一些实施方式中，宽高比小于约5:1、小于约4:1、小于约3:1、小于约2:1、小于约1:1或者小于约1:2。
图3和图4中以图形方式示出了场终止层的作用。参考图3，系统包括绝缘层301、电解质302和第一电极303。可以在第一电极与第二电极(未示出)之间施加电压以产生集中在场约束特征(在这种情况下为孔阱)中的电场。图3示出了传感器阵列的一系列三个轮廓图。随着孔阱数目从单孔304增加到3X 3的9孔阵列305到7X 7的49孔阵列306，电场的幅度降低。
图4示出了类似于图3的系统，包括绝缘层301、电解质302和第一电极303。该系统还包括安设在绝缘层上的导电层400。与没有导电层的图3相比较，电场的幅度更强，并且不随着阵列大小的增加而减小。对于单个传感器401、3X3阵列402和7X7阵列403，电场的幅度以阴影示出(更暗代表更强)。
在一些实施方式中，对带电分析物施加的电动力的范围从0pN至5000pN。在一些情况下，可以使用电场约束特征(例如，孔口)和/或导电电位保持平面来增强电动力。在一些情况下，施加力足以将分析物从捕获探针(例如，受体/配体，蛋白质/蛋白质，核酸/蛋白质或核酸/核酸相互作用)顺序地分离(例如，以其结合强度的顺序)。该方法可以能够判断分子是否正确地(特异性地)或不正确地(非特异性地)与其预期标靶结合。
在一些实施方式中，本公开内容的装置和方法用于检测和探查单核苷酸多态性(SNP)的结合力或者分析免疫测定(例如，夹心免疫测定)。在一些情况下，可以将不止一个传感器集成在单个芯片中，以便允许自行或同时并行地分析SNP、免疫测定和夹心免疫测定。
本公开内容的方法可以涉及通过任何合适的方法，例如光学检测、电或静电检测或者等离子体检测等，来检测带电分析物。
图5示出了本公开内容的适于带电分析物光学检测的装置的示例(例如，使用基于荧光的经改造的DNA微阵列)。该装置可以包括顶部衬底501和底部衬底515(例如，其可以是光学透明材料)以及限定流体腔室的流体壁518。在一些情况下，腔室是微流体的(例如，具有微米尺寸)并且包含电解质502。电压源523可以通过电连接器520连接到第一电极522和第二电极506。电极可以被具有绝缘层516和导电层517的表面所覆盖。该表面可以被多个场约束特征中断，在该实施方式中，所述多个场约束特征聚集在第一感测位置507和第二感测位置514，所述感测位置是此处所示的光学检测系统中的像素。光学检测系统可以包括光源512、激发滤光器511、二向色镜509和发射滤光器508。光可以穿过这些组件以及光学模块513(例如，包含透镜)，所述光学模块513将激发波长的光引导至感测位置并且接收来自荧光标记物503的激发波长的光。可以使用成像系统510(例如，包含相机)对发射辐射进行成像。捕获探针(例如，抗体)可以拴系在感测位置附近。在这种情况下，第一抗体505拴系至第一感测位置507处的表面上(例如，在电极上)，并且第二抗体519拴系在第二感测位置514处。第一标靶抗原504结合至第一抗体505(例如，捕获探针)并且具有荧光探针503的第二抗体521可以结合至标靶抗原，以便将荧光信号集中在感测位置处。
底表面可以表现得像传统核酸微阵列的表面，并且在顶部封装有流体通道。可以改造微阵列的顶表面和流体通道的底表面以具有电极。一个或两个电极表面可以是透明导电材料，例如氧化铟锡(ITO)，以允许表面的同时成像和电场的施加。检测过程在图6A至6E中示出。为了清楚起见，可以假设仅表面上的事件导致荧光信号，并且本底很少。在实践中，这可以通过首先将微阵列载玻片上的标靶核酸进行杂交并在测试之前进行洗涤来实现。随着电压的增加，杂交核酸上的电动力可以增加，直至将核酸拉离。该拉离电压可以与标靶分析物对捕获探针的结合能相关，所述拉离电压被称为结合能电压(VBE)。这可以用于区分可能是正确互补匹配的靶标和具有单个或多个突变并且与捕获探针不完全互补的靶标。与捕获探针不完全互补的靶标可能仍然与探针杂交。本公开内容的方法可以用于鉴定与捕获探针不完全互补的标靶(例如，由于标靶在较低电压下脱离)之间的杂交。该方法可以用于在单个捕获位点上鉴定混合突变样品。
图6A示出了示出了作为用于操作图5的装置的施加电压的函数的荧光信号幅度的示例。施加电压可以随时间增加，并且可以监测在第一像素601和第二像素602处的荧光输出。信号在较低的施加电压下由于分析物特异性地和非特异性地结合而开始相对较高，并且随着电压升高提供将带电分析物从捕获探针拉离的力而根据图6A中所示的曲线减小。提供了一系列附图，阐明在各个施加电压下的分析物的结合；其中在位置603处的最低电压对应于图6B，在位置604处的第三最高电压对应于图6C，在位置605处的第二最高电压对应于图6D，并且在位置606处的最高电压对应于图6E。
图6B示出了图5的装置在第一电压下的操作的示例，在所述第一电压下发生初始结合。第一像素611具有拴系在其上的多个第一捕获抗体609，并且第二像素612具有拴系在其上的多个第二捕获抗体610。带电分析物608可以特异性地(例如，高强度地)与第一捕获抗体结合，并且可以非特异性地(例如，低强度地)与第二捕获抗体结合。如图6A中所示，可以在第一像素以及第二像素都检测到荧光信号，但是由于在第一电压下信号的幅度相似，因而在第一施加电压下不能容易地区分特异性与非特异性结合。因此，可以将施加电压增加到第二电压。
图6C示出了图5的装置在第二电压下的操作的示例，在所述第二电压下非特异性组分脱离613。从第二捕获抗体的脱离可以是由于通过在约束特征附近的电场施加在带电分析物上的施加力。在这种情况下，一些非特异性结合的分析物614在第二电压下保持结合，该非特异性结合的分析物可以通过进一步增加施加电压而脱离。
图6D示出了图5的装置在第三电压下的操作的示例。剩余的非特异性结合物脱离614。在一些情况下，一些真阳性结合物615(例如，特异性结合的分析物)同样脱离。如图6E中所示，施加电压可以进一步增加到所有组分脱离的第四电压。第三和/或第四电压可以用于确定标靶抗原与捕获探针之间的结合力。
在一些情况下，可以电子地检测带电分析物。图7示出了本公开内容的适于带电分析物电检测的装置的示例。该装置可以包括由表面一分为二的流体腔室702(例如，微流体腔室)。该表面可以包括若干个层，所述若干个层包括衬底707、绝缘层704(例如，电介质膜)和场终止层712(例如，诸如铂、铜、铝或银等导电金属)。施加电压可以使用与第一电极701和第二电极706电连通的电压源708来施加。感测电极也可以位于所述表面附近。在这种情况下，第一感测电极705围绕第一场约束特征713，并且第二感测电极709围绕第二场约束特征714。感测电极可以是可单独寻址的。带电分析物在第一场约束特征附近的结合可以由第一电压输出703来监测。带电分析物在第二场约束特征附近的结合可以由第二电压输出710来监测。
图8A示出了作为用于操作图7的装置的施加电压的函数的电信号幅度的示例。施加电压可以随时间增加，并且可以监测第一约束特征801附近和第二约束特征802附近的电压输出。信号在较低的施加电压下开始相对较低，原因在于分析物特异性地和非特异性地结合并被拉入孔口(例如，场约束特征)中并最终脱离。提供了一系列附图，阐明在各个施加电压下的分析物的结合；其中在位置803处的最低电压对应于图8B，在位置804处的第三最高电压对应于图8C，在位置805处的第二最高电压对应于图8D，并且在位置806处的最高电压对应于图8E。
图8B示出了图7的装置的操作的示例。该装置具有第一孔口807和第二孔口808。第一捕获探针809拴系在第一孔口807附近，并且第二捕获探针器810拴系在第二孔口808附近。在这种情况下，分析物812本身不带电。其可以通过与电荷标记物811相联结而变得带电。电荷标记物可以共价地或非共价地附着至分析物，并且分析物因此可以成为带电分析物。电荷标记物可以附接至也与分析物结合的第二抗体。分析物可以在低(或零)施加电压803下结合至捕获探针和第二抗体。
如图8C中所示，施加电压可以增加到足以将带电分析物拉入孔口813中的第二电压。可以在第一孔口和第二孔口处检测到电信号，然而，由于在第二电压下的信号幅度类似，因此不能在第二施加电压下容易地区分特异性结合与非特异性结合。因此，可以将施加电压增加到第三电压。
图8D示出了图7的装置在第三电压下的操作的示例，在所述第三电压下非特异性组分脱离814。从第二捕获抗体的脱离可以是由于通过在约束特征附近的电场施加在带电分析物上的施加力。如图8A中所示，第一孔口与第二孔口之间的传感器电压信号存在差异，因此第三电压可以区分分析物在场约束特征附近的特异性与非特异性结合。
图8E示出了图7的装置在第四电压下的操作的示例。真阳性分析物(例如，特异性结合的分析物)可以脱离815。第三和/或第四电压可以用于确定标靶抗原与捕获探针之间的结合力。
在一些实施方式中，靶分子的检测是基于等离子体学。本文提供了使用表面等离子体共振成像设置(SPRI)的示例。可以将SPRI芯片的金膜用于一个电极，并且将流体盖的底部上的导电膜用作第二个电极。在一些情况下，该系统的电极可能是不透明的。
本文公开的方法可以用于在免疫测定中探测交叉反应性和非特异性结合事件。非特异性和交叉反应性抗体可能具有比特异性抗体低得多的结合能。通过施加电动力，可以确定分子对的近似结合能电压，并且可以鉴定和移除非特异性和交叉反应性基团，以便鉴定特异性抗体的存在。在一些实施方式中，捕获探针是拴系至诸如DNA等聚合物链的抗体。
在一些实施方式中，直接由传感器检测标靶分析物。在这样的情况下，当第二抗原结合到表面时，可以发生交叉反应性或非特异性结合。继而所施加的电动力可以作用于分析物本身，从而探测分析物与捕获探针之间的结合强度。随着电动力的增加，比标靶分析物更弱地与捕获探针结合的交叉反应性第二分析物能够在比标靶抗原更小的施加电动力下分离。
在一些情况下，使用感测或检测抗体来增强抗原的可检测性。可以修饰感测抗体以增强传感器的可检测性(例如，通过与核酸或蛋白质偶联)。在使用感测抗体的实施方式中，可能的反应包括但不限于：(a)正确的相互作用，其中捕获抗体附着至标靶抗原并且经修饰或未经修饰的正确的感测抗体与标靶抗原结合；(b)交叉反应，其中第二抗体与标靶抗原结合；(c)交叉反应，其中第二抗体与捕获抗体结合；(d)交叉反应，其中第二抗原与捕获抗体结合并且第二抗体与第二抗原结合；(e)第二抗体在不存在标靶抗原时与捕获抗体结合；以及(f)第二抗原与捕获抗体结合并且第二抗体与第二抗原结合。增加的电动力可以在诸如(a)中所述的正确的相互作用之前移除诸如(b)～(f)中所述的交叉反应性组分。
图9示出了本公开内容的适于带电分析物等离子体检测的装置的示例。该装置包括待检测的带电分析物901，在这种情况下，其为核酸分子。等离子体检测系统可以包括光源904、偏振器903、棱镜902、金属(例如，金)膜908、滤光器906和检测器905。带电分析物901可以悬浮在被约束于流体腔室909中的电解质中。带电分析物901可以与捕获探针907杂交，从而可以被等离子体系统检测到。
在本公开内容的一些实施方式中，靶分子的检测基于单孔或多孔结构的离子电流阻塞。本公开内容的一些实例包括这样的方法和装置：其中由厚度范围从约0.08纳米(nm)至约1毫米(mm)的膜的存在使得施加的电动力得到增强。这些装置还包括嵌入在膜内的一个或多个用于感测靶分子的存在或缺失的电极。在一些情况下，嵌入式电极可以用于控制捕获探针和/或靶分子的物理位置。这些装置还可以包括各个孔口，通过该孔口来集中电动力。这些孔口可以是膜中的任何开口，包括各种大小的孔隙、狭缝或门孔。通过这些孔口，可以将(产生电动力的)电场导向任何期望的方向。在一些情况下，该装置的表面涂覆有材料以改变其在溶液中的表面电荷，这样的材料包括但不限于二氧化硅(SiO2)、氮化硅(SiNx)、二氧化铪(HfO2)、二氧化锆ZrO2)、氧化铝(Al2O3)以及二氧化钛(TiO2)。
图10示出了本公开内容的用于感测核酸分子的存在和结合能的阵列的示例。该系统包括流体腔室1000，该流体腔室1000含有缓冲液1002并且由一对能够产生电场的透明电极1004相抵。在这种情况下，未示出场约束特征。带电抗原含有荧光标记物1006并且可以与捕获探针1008杂交。核酸通常带有负电荷，因此可以不需要第二电荷标记物。
图11A示出了本公开内容的用于测量互补核酸分子的结合力的方法的示例。该图形描绘了具有不同相对施加电压(虚线)和荧光信号(实线)的系统的一系列三个状态(从上到下)。标靶分析物最初不与捕获探针1100结合并且检测到基线信号1102。分析物1104与捕获探针的杂交增强了信号1106。线性增加的施加电压1108的施加产生电场1110和对带电分析物的施加力，但最初不会影响信号。图11B接续图11A，并且示出了继续增加施加电压的效果。当电动力达到接近分析物与捕获探针之间结合力的水平时，一些标靶分析物可以分离1112，并且信号可以开始下降1114。随着电压继续增加，最终所有的分析物都可以分离1116，并且信号可以返回至基线。结合能电压可以定义为将一半标靶分析物从表面释放的电压1118。
图12A和12B类似于图11A和图11B，但是在这种情况下示出了本公开内容的用于测量具有与捕获探针的单个碱基对错配(例如，单核苷酸多态性(SNP))的核酸分子的结合力的方法的示例。该图形描绘了具有不同相对施加电压(虚线)和荧光信号(实线)的系统的一系列三个状态(从上到下)。标靶分析物最初不与捕获探针1200结合并且检测到基线信号1202。分析物1204与捕获探针的杂交增大了信号1206。线性增加的施加电压1208的施加产生电场1210和对带电分析物的施加力，但最初不会影响信号。参考图12B，与完全互补分析物分离的电压相比，错配的分析物在相对较低的电压下从捕获探针1212分离(参见图11B中的1112)。此外，与不具有SNP的分析物相比，所有错配的分析物在相对较低的电压1214下分离，并且结合能电压1216相对较低。信号与施加电压行为在图11B与图12B之间的差异可以用于鉴定多态性的存在。应当注意，本文描述的实施方式能够使用单个捕获探针在单个感测位置处区分两个或更多个核酸分子。
本文所述的方法还可以用于鉴定混合物中的多种不同分析物。例如，图13A和图13B示出了本公开内容的用于测量与捕获探针具有不同程度互补性的核酸分子混合物的存在和/或结合力的方法。图形描绘了具有不同相对施加电压(虚线)和荧光信号(实线)的系统的一系列三个状态(从上到下)。标靶分析物最初不与捕获探针1300结合并且检测到基线信号1302。分析物1304与捕获探针的杂交增大了信号1306。线性增加的施加电压1308的施加产生电场1310和对带电分析物的施加力，但最初不会影响信号。将注意力转向图13B，电压信号展示出两个拐点和两个结合能电压1316和1318，分别对应于错配的核酸分析物1312从捕获探针1314的首先分离和完全互补的核酸分析物1314从捕获探针1314的分离。
图14示出了多重免疫测定的示例，图中描绘了当试图用多种抗体测试多种分析物时交叉反应性的问题。测定的一些实例使用具有附着的核酸1402的第二抗体1400(例如，以增加和控制与分析物1404相关联的电荷量，该分析物1404可以与拴系至表面1408的捕获探针1406结合)。图14示出了六种不同类型的交叉反应性。从左至右，(A)分子可以正确地相互作用，(B)第二抗体可以与(例如，在第二表位中的)标靶分析物相互作用，(C)第二抗体可以与捕获探针相互作用，(D)第二抗体可以通过中间分子与捕获探针或其他实体相互作用，(E)第二抗体可以与不具有分析物的捕获探针相互作用，和(F)错误的分析物可以被捕获探针和/或第二抗体结合。这些是非限制性示例。本公开内容的方法使用施加的电动力来通过打破这样的非特异性相互作用来解决这样的问题。
图15示出了使用图14中所示的装置执行本公开内容的方法的示例。可以通过施加电场1502将各种类型的正确和非特异性相互作用的分子拉入感测孔口1500中。传感器输出与施加电压的标绘图示出了非特异性结合1504的脱离，随后是与破坏正确结合的标靶分析物的结合相关联的实际信号1506。
图16示出了将捕获探针(例如，核酸)共价附着至表面的过程的示例。可以将包含氢氧化物部分1601(和/或羟基化的)的SiO2表面1600硅烷化(例如，使用氨基硅烷1602)。硅烷化可以在气相中进行。可以使用交联剂(例如，PMPI 1603)来将硅烷上的胺基和5’硫醇改性引物的巯基1604相连接。本文所述的表面化学所产生的产物在1605处示出。
在实践中，可以使用化学气相沉积系统对传感器进行等离子体清洁，再水合并且用(3-氨基丙基)-三甲氧基硅烷(APTMS)官能化。随后，可以通过在氩气氛下在40℃下在无水甲苯中暴露于2.3mM的N-(p-马来酰亚胺基苯基)异氰酸酯(PMPI)溶液达2小时，将氨基官能化表面转化成硫醇反应性部分。随后可以用无水甲苯洗涤表面，并在氩气流中干燥，然后使用硫醇化寡核苷酸进行DNA固定。在固定之前，可以使用三(2-羧乙基)膦(TCEP)作为还原剂来还原硫醇化寡核苷酸，并使用旋转柱(MWCO＝3000)来脱盐。在1M的NaCl缓冲溶液中，在受控气氛下，可以将硫醇化寡核苷酸以10μM的浓度直接点到感测芯片上达6小时，随后进行大量洗涤。可以在各种表面改性步骤后进行X射线光电子能谱分析，并且预期的元素和峰值偏移的存在证实了感测表面的转化。固定化核酸的存在可以通过荧光显微术结合适当激发的SYBR Gold核酸染色剂进行验证。随后，通过引入与固定化核酸的互补链偶联的所需探针，可以将固定化寡核苷酸用于进一步增加可能的表面改性的库。关于本文所述的设备的制造或操作的附加细节可以参阅PCT专利申请序列号PCT/US2015/036800，所述申请全文并入于此用于所有目的。
图17示出了本公开内容的装置的示例，其包括：用于集中电场的孔阱阵列中的TAMRA(5-羧基四甲基罗丹明)标记的寡核苷酸的荧光显微镜图像1701；透明氧化铟锡电极1702；以及围绕孔阱阵列的场终止铂金属板1703。
图18示出了被编程或以其他方式配置用于调节本公开内容的装置的操作的计算机系统1801。计算机系统1801可以调节例如流速、温度、压力、机械操纵、施加的电压或其他电输入和/或输出等。
计算机系统1801包括中央处理器(CPU，在本文中也称为“处理器”和“计算机处理器”)1805，该中央处理器1805可以是单核处理器或多核处理器，或者用于并行处理的多个处理器。计算机系统1801还包括存储器或存储器位置1810(例如，随机存取存储器、只读存储器、闪速存储器)、电子存储单元1815(例如，硬盘)、用于与一个或多个其他系统通信的通信接口1820(例如，网络适配器)以及外围设备1825，诸如高速缓存、其他存储器、数据存储和/或电子显示适配器。存储器1810、存储单元1815、接口1820和外围设备1825通过诸如主板等通信总线与CPU 1805通信。存储单元1815可以是用于储存数据的数据存储单元(或数据储存库)。
CPU 1805可以执行一系列机器可读指令，所述机器可读指令可以体现为程序或软件。指令可以储存在诸如存储器1810等存储器位置中。由CPU 1805执行的操作的示例可以包括读取、解码、执行和回写。
存储单元1815可以储存文件，诸如驱动程序、库和保存的程序。存储单元1815可以储存由用户生成的程序和记录的会话，以及与程序相关联的一个或多个输出。存储单元1815可以储存用户数据，例如，用户偏好和用户程序。在一些情况下，计算机系统1801可以包括计算机系统1801外部的，诸如位于通过内联网或因特网与计算机系统1801通信的远程服务器上的一个或多个附加数据存储单元。
计算机系统1801可以与系统1830通信，该系统1830包括具有集成的流体元件和/或处理元件的设备。此类处理元件可以包括传感器、流量调节器(例如，阀)以及被配置用于引导流体的泵送系统。
如本文所述的方法可以通过机器(例如，计算机处理器)可执行代码的方式来实现，机器可执行代码储存在计算机系统1801的电子存储位置上，例如在存储器1810或电子存储单元1815上。机器可执行代码或机器可读代码能够以软件的形式提供。在使用期间，代码可以由处理器1805执行。在一些情况下，可以从存储单元1815检索代码并将其储存在存储器1810上，以供处理器1805随时访问。在一些情况下，可以排除电子存储单元1815，并且将机器可执行指令储存在存储器1810上。
代码可以被预编译并配置用于与具有适于执行代码的处理器的机器一起使用，或者可以在运行时期间编译。代码能够以可被选择以使代码能够以预编译或编译时(as-compiled)的方式执行的编程语言来提供。
本文提供的系统和方法的各方面，诸如计算机系统1801，可以在编程中具体化。该技术的各个方面可被认为是“产品”或“制品”，其一般为在一类机器可读介质上携带或具体化的机器(或处理器)可执行代码和/或关联数据的形式。机器可执行代码可以储存在诸如存储器(例如，只读存储器、随机存取存储器、闪速存储器)或硬盘等电子存储单元上。“存储”类介质可以包括任何或所有的计算机有形存储器、处理器等，或其相关联的模块，诸如各种半导体存储器、磁带驱动器、磁盘驱动器等，其可以在任何时间为软件编程提供非暂时性存储。整个软件或其部分有时可以通过因特网或各种其他电信网络进行通信。这样的通信例如可以使软件能够从一个计算机或处理器加载到另一计算机或处理器中，例如，从管理服务器或主机加载到应用服务器的计算机平台中。因此，可以承载软件元素的另一类介质包括诸如跨本地设备之间的物理接口、通过有线和光学陆线网络以及通过各种空中链路使用的光波、电波和电磁波。携带此类波的物理元件，诸如有线或无线链路、光学链路等，也可以被认为是承载软件的介质。如本文所用，除非限制于非暂时性有形“存储”介质，否则诸如计算机或机器“可读介质”等术语是指参与向处理器提供指令以供执行的任何介质。
因此，机器可读介质，诸如计算机可执行代码，可以采取多种形式，包括但不限于有形存储介质、载波介质或物理传输介质。非易失性存储介质例如包括光盘或磁盘，诸如任何一个或多个计算机中的任何存储设备等，如附图中所示的可以用于实现数据库的那些介质等。易失性存储介质包括动态存储器，诸如这样的计算机平台的主存储器。有形传输介质包括同轴电缆；铜线和光纤，包括构成计算机系统内的总线的导线。载波传输介质可以采取电信号或电磁信号或者声波或光波诸如射频(RF)和红外(IR)数据通信过程中产生的那些波的形式。因此，计算机可读介质的常见形式例如包括：软盘、柔性盘、硬盘、磁带、任何其他磁性介质、CD-ROM、DVD或DVD-ROM、任何其他光学介质、穿孔纸带、具有孔洞图案的任何其他物理存储介质、RAM、ROM、PROM和EPROM、FLASH-EPROM、任何其他存储器芯片或盒、传送数据或指令的载波、传送这样的载波的电缆或链路，或者计算机可以从中读取编程代码和/或数据的任何其他介质。这些计算机可读介质形式中的许多形式可以参与将一个或多个指令的一个或多个序列传送至处理器以供执行。
本公开内容的一个方面提供了一种用于检测分析物的存在的装置，包括：(a)适于容纳电解质的流体腔室；(b)两个或更多个能够在所述流体腔室内产生电场的电极；(c)至少一个表面，其包括能够结合所述分析物的固定化捕获探针，其中所述至少一个表面位于所述两个或更多个电极之间并且与所述流体腔室接触，并且其中所述至少一个表面包括导电层和电绝缘层；以及(d)位于所述至少一个表面附近的至少一个场约束特征，所述至少一个场约束特征能够将所述至少一个场约束特征周围的电场集中成至少约103伏每米(V/m)的强度。在一些情况下，分析物是带电分析物。分析物可以直接带电，或者通过与诸如带电抗体等带电分子结合而间接带电。所述装置还可以包括可操作地耦合至所述两个或更多个电极的控制器，其中所述控制器被编程用于跨所述两个或更多个电极施加足以对分析物产生施加力的电压。
至少一个场约束特征可以能够将所述至少一个场约束特征周围的电场集中成任何合适的强度。在一些实施方式中，场强为至少约103伏每米(V/m)、至少约104V/m、至少约105V/m、至少约106V/m或至少约107V/m。在一些情况下，场强为至多约103V/m、至多约105V/m、至多约107V/m或至多约109V/m。
所施加的电压足以对带电分析物产生任何合适的施加力。在一些情况下，分析物上的施加力为至少约1皮牛顿(pN)、至少约5pN、至少约10pN、至少约20pN、至少约50pN、至少约100pN、至少约500pN、至少约1000pN或至少约5000pN。在一些情况下，分析物上的施加力为至多约1皮牛顿(pN)、至多约5pN、至多约10pN、至多约20pN、至多约50pN、至多约100pN、至多约500pN、至多约1000pN或至多约5000pN。
固定化捕获探针可以能够结合至分析物以在至少一个表面上形成探针-分析物复合物。固定化捕获探针可以能够通过一个或多个非共价相互作用结合至分析物。所述一个或多个非共价相互作用可以通过在跨两个或更多个电极施加电压时产生的施加力而破坏。
在一些实施方式中，固定化捕获探针靠近至少一个场约束特征。例如，捕获探针可以固定在场约束特征的约10纳米(nm)、约20nm、约50nm、约100nm、约500nm或约1000nm之内。
至少一个场约束特征可以是多个场约束特征。例如，表面可以具有至少约5个、至少约10个、至少约50个、至少约100个、至少约500个、至少约1000个、至少约5000个、至少约10000个、至少约50000个、至少约106个或至少约107个场约束特征。
在一些情况下，固定化捕获探针是抗体。在一些情况下，分析物是抗原。在一些情况下，固定化捕获探针是核酸分子。在一些情况下，分析物是核酸分子。
应当注意，术语“固定化”的使用并不意味着捕获探针无法移动。例如，捕获探针可以拴系至表面上的一个或多个位置处，并且由于流体流动或其他力而在电解质内移动。
分析物可以具有任何合适的电荷(例如，以提供足够的施加力)。在一些实施方式中，分析物具有至少约1e-、至少约10e-、至少约102e-、至少约103e-、至少约104e-、至少约105e-或至少约106e-的电荷。在一些实施方式中，分析物具有至多约1e-、至多约10e-、至多约102e-，至多约103e-、至多约104e-、至多约105e-或至多约106e-的电荷。应当注意，分析物可以具有正电荷或负电荷。具有与本文所公开的类似的量级的正电荷也包括在本公开内容中。
所述装置还包括可操作地耦合至两个或更多个电极的控制器，其中所述控制器被编程用于在所述两个或更多个电极之间施加小于约100伏(V)的电位差。在一些情况下，所施加的电压小于约50V、小于约10V、小于约5V或小于约1V。在一些情况下，所施加的电压大于约50V、大于约10V、大于约5V或大于约1V。
至少一个表面可以提供流体腔室的壁(如图1A中所示)，并且场约束特征是该表面中的孔口。在一些情况下，场约束特征包括至少一个表面中的孔口。在一些情况下，流体腔室包括由至少一个表面分隔的顶部部分和底部部分，并且其中场约束特征是至少一个表面中的孔口(如图1B中所示)。在一些情况下，孔口延伸穿过表面。孔口可以是但不限于凹口、孔阱、孔隙、通道、间隙或狭缝。场约束特征可以是包括圆形、椭圆形、正方形、矩形或任何多边形在内的任何形状。
场约束特征可以具有任何合适的直径。在一些情况下，该直径小于约50微米、小于约10微米、小于约5微米、小于约1微米、小于约500纳米、小于约100纳米或小于约50纳米。在一些情况下，该直径大于约50微米、大于约10微米、大于约5微米、大于约1微米、大于约500纳米、大于约100纳米或大于约50纳米。
场约束特征可以具有任何合适的宽高比。在一些情况下，宽高比是场约束特征的最长尺寸与场约束特征的最短尺寸的比率。在一些情况下，宽高比是场约束特征的宽度与场约束特征的深度的比率。非限制性地，场约束特征可以具有至少约0.1、至少约0.5、至少约1、至少约2、至少约3、至少约5、至少约10、至少约约50、至少约100或更大的宽高比。场约束特征可以具有尖锐边缘(例如，具有至少约60度的角度)。场约束特征可以是至少一个表面的升高部分。
导电层可以与电解质连通，诸如物理接触或电连通。导电层可以与电解质电隔离，并且其中在使用期间导电层是电偏压的。导电层可以包含任何合适的金属，诸如铂、铜、金或银。
所述装置还可以包括感测电极，该感测电极被配置用于测量与分析物的存在相关联的电荷信号。感测电极可以靠近至少一个场约束特征(例如，在场约束特征的约10纳米(nm)之内、约20nm之内、约50nm之内、约100nm之内、约500nm之内或约1000nm之内)。
所述装置还可以包括光源和检测器，该检测器被配置用于检测与分析物的存在相关联的光学信号。光学信号可以是荧光信号。在一些情况下，荧光信号是荧光共振能量转移(FRET)信号。荧光信号可以通过共价或非共价附着至分析物的荧光探针提供。
所述装置还可以包括被配置用于检测与分析物的存在相关联的表面等离子体共振信号的检测器。
至少一个表面可以是基本平坦的。至少一个表面可以是传感器阵列的一部分(或包括传感器阵列)，其中所述阵列的每个传感器包括至少一个场约束特征和多个固定化捕获探针。阵列的给定传感器的多个固定化捕获探针可以靠近阵列的给定传感器的场约束特征。阵列的给定传感器的多个固定化捕获探针可以是克隆的。在一些情况下，阵列的给定传感器包括相对于阵列的另一传感器独特的多个固定化捕获探针。
阵列的给定传感器与最邻近传感器之间的距离可以是任何合适的距离。在一些情况下，该距离为至少约50纳米(nm)、至少约100nm、至少约150nm、至少约200nm、至少约250nm、至少约500nm、至少约1000nm、至少约5000nm或至少约10000nm。在一些情况下，该距离为至多约50纳米(nm)、至多约100nm、至多约150nm、至多约200nm、至多约250nm、至多约500nm、至多约1000nm、至多约5000nm或至多约10000nm。
阵列可以包括任何合适数目的传感器。在一些情况下，阵列包括至少约5个、至少约10个、至少约50个、至少约100个、至少约500个、至少约1000个、至少约5000个、至少约10000个、至少约50000个、至少约106个或至少约107个传感器。
在另一方面，本公开内容提供了一种用于检测标靶分析物的存在的方法，包括(a)激活包括位于两个或更多个电极之间的一个或多个表面的至少一个传感器，其中所述一个或多个表面包括两个或更多个固定化捕获探针；(b)在足以允许靶标分析物和非靶标分析物各自结合到所述两个或更多个固定化捕获探针之中给定的一个的条件下，使所述一个或多个表面与含有或怀疑含有所述标靶分析物和所述非标靶分析物的溶液接触；(c)跨所述两个或更多个电极施加足以从所述两个或更多个固定化捕获探针之中给定的一个释放所述非标靶分析物但不足以释放所述标靶分析物的电压；以及(d)检测所述一个或多个表面上的所述标靶分析物的存在。标靶分析物和/或非标靶分析物可以是带电分析物。电压可以足以对非标靶分析物施加至少约1皮牛顿(pN)的施加力。操作(c)和/或(d)可以在不洗涤一个或多个表面的情况下进行。
所述方法还可以包括跨两个或更多个电极施加附加电压，该附加电压足以从两个或更多个固定化捕获探针之中给定的一个释放标靶分析物。附加电压可以足以对标靶分析物施加至少约1皮牛顿(pN)的施加力。
在各个实施方式中，对标靶分析物或非标靶分析物施加的力为至少约1皮牛顿(pN)、至少约5pN、至少约10pN、至少约20pN、至少约50pN、至少约100pN、至少约500pN、至少约1000pN或至少约5000pN。在一些情况下，分析物上的施加力为至多约1皮牛顿(pN)、至多约5pN、至多约10pN、至多约20pN、至多约50pN、至多约100pN、至多约500pN、至多约1000pN或至多约5000pN。
所述方法还可以包括在施加附加电压之后检测一个或多个表面上的标靶分析物的存在。所述电压可以小于所述附加电压。
电压和附加电压是单独电压，该单独电压是随时间改变的连续施加电压，如图6A或图8A中所示。
可以在不洗涤一个或多个表面的情况下施加电压和/或附加电
压。例如，本公开内容的方法可以在诸如生物液体(例如，血液)或环境样品等复杂混合物中进行。
施加电压可以足以产生具有小于约109伏每米(V/m)强度的电场，并且附加施加的电压可以足以产生具有小于约109V/m、小于约108V/m、小于约107V/m、小于约106V/m、小于约105V/m、小于约104V/m、小于约103V/m或更低强度的附加电场。
在一些情况下，标靶分析物和非标靶分析物中的每一个非共价结合至两个或更多个固定化捕获探针之中给定的一个，以分别形成固定在一个或多个表面上的标靶探针-分析物复合物和非标靶探针-分析物复合物。
施加电压可以随时间从第一电压增加到第二电压。施加电压能够以至少约1毫伏每秒(mV/s)、至少约5mV/s、至少约10mV/s、至少约50mV/s、至少约100mV/s、至少约500mV/s、至少约1000mV/s、至少约5000mV/s或更高的速率从第一电压增加到第二电压。
在一些情况下，施加电压在大于约10微秒、大于约50微秒、大于约100微秒、大于约500微秒、大于约1000微秒、大于约5000微秒、大于约10000微秒或更长的时间段内从所述电压增加到所述附加电压。在一些情况下，施加电压在小于约1秒的时间段内从所述电压增加到所述附加电压。
施加电压可以是周期性电压波形。周期性电压波形可以具有任何合适的频率，例如小于约109赫兹(Hz)、小于约108Hz、小于约107Hz、小于约106Hz、小于约105Hz、小于约104Hz、小于约103Hz、小于约102Hz、小于约10Hz、小于约1Hz、小于约10-2Hz或小于约10-3Hz的频率。周期性电压波形可以具有大于约109赫兹(Hz)、大于约108Hz、大于约107Hz、大于约106Hz、大于约105Hz、大于约104Hz、大于约103Hz、大于约102Hz、大于约10Hz、大于约1Hz、大于约10-2Hz或大于约10-3Hz的频率。
所述方法还可以包括当施加电压随时间变化时，监测指示出一个或多个表面上的标靶分析物的存在的信号。
所述方法还可以包括确定与两个或更多个固定化捕获探针之中给定的一个结合的标靶分析物的结合力(例如，将分析物从结合探针分离所需的力)。
施加力可以小于标靶分析物结合至两个或更多个固定化捕获探针之中给定的一个的结合力。
电解质(溶液)可以包含与标靶分析物和/或非标靶分析物结合的带电分子，以提供标靶分析物和/或非标靶分析物上的电荷变化。带电分子可以是抗体。
可以通过测量与标靶分析物相关联的信号来检测一个或多个表面上的标靶分析物的存在。所述信号可以是电荷信号。可以使用感测电极和参考电极来检测电荷信号。电荷信号可以是电压。
可以通过测量与标靶分析物相关联的光学信号来检测一个或多个表面上的标靶分析物的存在。所述光学信号可以是荧光信号。荧光信号可以通过共价或非共价附着至标靶分析物的荧光探针提供。
可以使用表面等离子体共振来检测一个或多个表面上的标靶分析物的存在。
一个或多个表面可以包括厚度在约0.08纳米与1毫米之间的膜。一个或多个表面可以包括多个表面。多个表面中的每一个可以包括两个或更多个固定化捕获探针的子集。
电压可以是直流电压或交流电压。
在另一方面，本公开内容提供了一种用于检测标靶分析物的存在的系统，包括：(a)包括位于两个或更多个电极之间的一个或多个表面的至少一个传感器，其中所述一个或多个表面包括两个或更多个固定化捕获探针；(b)与所述一个或多个表面流体连通的溶液腔室，其中所述溶液腔室被配置用于在足以允许靶标分析物和非靶标分析物各自结合到所述两个或更多个固定化捕获探针之中给定的一个的条件下保持含有或怀疑含有所述标靶分析物和所述非标靶分析物的溶液；以及(c)可操作地耦合至所述两个或更多个电极的控制器，其中所述控制器被编程用于(i)跨所述两个或更多个电极施加足以从所述两个或更多个固定化捕获探针之中给定的一个释放所述非标靶分析物但不足以释放所述标靶分析物的电压；以及(ii)检测所述一个或多个表面上的所述标靶分析物的存在。
标靶分析物和/或非标靶分析物可以是带电分析物。在一些情况下，标靶分析物和/或非标靶分析物可以具有第一电荷(例如，零电荷)并且可以在与带电分子耦合时获得第二电荷(例如，+2、-2)。
跨两个或更多个电极的电压可以足以对非标靶分析物施加至少约1皮牛顿的施加力。至少一个传感器可以包括传感器阵列。传感器阵列的每个传感器可以是可独立寻址的(例如，从其获得测量值)。
由前文所述应当理解，尽管已经图示和描述了特定的实现方式，但本文中设想到并且可以对此作出各种修改。例如，本文描述的实施方式可以结合或修改，以产生本发明的更多实施方式。本文也并不旨在通过说明书中提供的特定示例来限制本发明。尽管已经参考前述说明书描述了本发明，但本文的优选实施方式的描述和图示不应以限制性的意义来解释。此外，应当理解，本发明的所有方面并不限于本文阐述的特定描绘、配置或相对比例，而是取决于多种条件和变量。本发明的实施方式在形式和细节方面的各种修改对于本领域技术人员将会是显而易见的。因此设想到本发明还应当覆盖任何这样的修改、改变和等同物。本文旨在由下列权利要求限定本发明的范围并且从而覆盖这些权利要求及其等同项的范围内的方法和结构。

Claims (47)

1.一种用于检测分析物的存在的装置，包括：
适于容纳电解质的流体腔室；
能够在所述流体腔室内产生电场的两个或更多个电极；
至少一个表面，所述至少一个表面包括能够结合所述分析物的固定化捕获探针，其中所述至少一个表面位于所述两个或更多个电极之间并且与所述流体腔室接触，并且其中所述至少一个表面包括导电层和电绝缘层；
靠近所述至少一个表面的至少一个场约束特征；以及
靠近所述至少一个表面的感测电极，其中，所述感测电极能够测量电荷信号，以基于所述电荷信号检测捕获探针和所述分析物之间的分子相互作用的存在，并且响应于所述电荷信号的改变基于施加到所述两个或更多个电极的电压来测量与所述分子相互作用相关联的力。
2.根据权利要求1所述的装置，其中所述分析物是带电分析物。
3.根据权利要求1所述的装置，其中所述至少一个场约束特征能够将所述至少一个场约束特征周围的电场集中成小于105V/m的强度。
4.根据权利要求1所述的装置，还包括可操作地耦合至所述两个或更多个电极的控制器，其中所述控制器被编程用于跨所述两个或更多个电极施加足以对所述分析物产生施加力的电压。
5.根据权利要求4所述的装置，其中所施加的电压足以对所述分析物产生至少1皮牛顿(pN)的施加力。
6.根据权利要求5所述的装置，其中所述电压足以对所述分析物产生至少20pN的施加力。
7.根据权利要求1所述的装置，其中所述固定化捕获探针能够结合至所述分析物以在所述至少一个表面上形成探针-分析物复合物。
8.根据权利要求7所述的装置，其中所述固定化捕获探针能够通过一个或多个非共价相互作用结合至所述分析物。
9.根据权利要求8所述的装置，其中所述一个或多个非共价相互作用能够通过在跨所述两个或更多个电极施加电压时产生的施加力而破坏。
10.根据权利要求7所述的装置，其中所述固定化捕获探针靠近所述至少一个场约束特征。
11.根据权利要求1所述的装置，其中所述至少一个场约束特征是多个场约束特征。
12.根据权利要求1所述的装置，其中所述固定化捕获探针是抗体。
13.根据权利要求12所述的装置，其中所述分析物是抗原。
14.根据权利要求1所述的装置，其中所述固定化捕获探针是核酸分子。
15.根据权利要求14所述的装置，其中所述分析物是核酸分子。
16.根据权利要求1所述的装置，其中所述分析物具有小于104e-的电荷。
17.根据权利要求1所述的装置，其中所述分析物具有大于10e-的电荷。
18.根据权利要求1所述的装置，还包括可操作地耦合至所述两个或更多个电极的控制器，其中所述控制器被编程用于在所述两个或更多个电极之间施加小于100伏(V)的电位差。
19.根据权利要求1所述的装置，其中所述至少一个表面提供所述流体腔室的壁，并且所述场约束特征是所述表面中的孔口。
20.根据权利要求1所述的装置，其中所述场约束特征包括所述至少一个表面中的孔口。
21.根据权利要求1所述的装置，其中所述流体腔室包括由所述至少一个表面分隔的顶部部分和底部部分，并且其中所述场约束特征是所述至少一个表面中的孔口。
22.根据权利要求21所述的装置，其中所述孔口延伸穿过所述表面。
23.根据权利要求20所述的装置，其中所述孔口是凹口、孔阱、孔隙、通道、间隙或狭缝。
24.根据权利要求1所述的装置，其中所述至少一个场约束特征具有小于50微米的直径。
25.根据权利要求24所述的装置，其中所述至少一个场约束特征具有小于50纳米的直径。
26.根据权利要求1所述的装置，其中所述场约束特征具有至少0.1的宽高比。
27.根据权利要求26所述的装置，其中所述宽高比是所述场约束特征的最长尺寸与所述场约束特征的最短尺寸的比率。
28.根据权利要求27所述的装置，其中所述宽高比是所述场约束特征的宽度与所述场约束特征的深度的比率。
29.根据权利要求1所述的装置，其中所述场约束特征具有尖锐边缘。
30.根据权利要求1所述的装置，其中所述场约束特征是所述至少一个表面的升高部分。
31.根据权利要求1所述的装置，其中所述导电层与所述电解质连通。
32.根据权利要求1所述的装置，其中所述导电层与所述电解质电隔离，并且其中在使用期间所述导电层是电偏压的。
33.根据权利要求1所述的装置，其中所述导电层包含铂。
34.根据权利要求1所述的装置，其中所述感测电极靠近所述至少一个场约束特征。
35.根据权利要求1所述的装置，还包括光源和检测器，所述检测器被配置用于检测与所述分析物的存在相关联的光学信号。
36.根据权利要求35所述的装置，其中所述光学信号是荧光信号。
37.根据权利要求36所述的装置，其中所述荧光信号由共价或非共价附着至所述分析物的荧光探针提供。
38.根据权利要求1所述的装置，还包括被配置用于检测与所述分析物的存在相关联的表面等离子体共振信号的检测器。
39.根据权利要求1所述的装置，其中所述至少一个表面是基本上平坦的。
40.根据权利要求1所述的装置，其中所述至少一个表面是传感器阵列的一部分，其中所述阵列的每个传感器包括场约束特征和多个固定化捕获探针。
41.根据权利要求40所述的装置，其中所述阵列的给定传感器的所述多个固定化捕获探针靠近所述阵列的所述给定传感器的所述场约束特征。
42.根据权利要求40所述的装置，其中所述阵列的给定传感器的所述多个固定化捕获探针是克隆的。
43.根据权利要求40所述的装置，其中所述阵列的给定传感器包括相对于所述阵列的另一传感器独特的多个固定化捕获探针。
44.根据权利要求40所述的装置，其中所述阵列的给定传感器与最邻近传感器之间的距离为至少50纳米(nm)。
45.根据权利要求44所述的装置，其中所述阵列的给定传感器与最邻近传感器之间的距离为至少150nm。
46.根据权利要求40所述的装置，其中所述阵列的给定传感器与最邻近传感器之间的距离小于50微米。
47.根据权利要求40所述的装置，其中所述阵列包括至少10个传感器。
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