CN107427606B - 细胞培养支架 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及细胞培养支架，细胞培养支架作为使细胞粘附来培养的支架，其特征在于，包括：纤维网，由生物降解性高分子的纤维蓄积而成，具有多个气孔；以及多个微珠，形成于上述纤维，用于以确保使上述细胞向上述纤维网的内部渗透来生长的空间。

Description

细胞培养支架
技术领域
本发明涉及细胞培养支架，更详细地，涉及对细胞培养提供熟悉且适合的环境，来使细胞的生存率极大化，细胞在培养后可移植到体内，并使细胞在分化后分解来向体外排出的基于生物降解性高分子的细胞培养支架。
背景技术
最近，随着培养细胞的使用扩大至疾病的治疗，而对细胞培养的关注和研究也逐渐增加。
细胞培养为从生物体采取细胞，在生物体外进行培养的技术，所培养的细胞通过分化为皮肤、器官、神经等身体的多种组织，来用于治疗疾病。
像这样的细胞培养需要用于提供与体内相似的培养环境的培养支架。
在培养支架上培养的细胞以粘附的状态生长，可通过提高细胞对培养支架的粘附性，来提高细胞的生存率。
因此，目前不断研究及开发新培养支架，以提高细胞的粘附性，并使细胞的培养环境进一步优化。
韩国公开专利公报第2007-0053443号公开了通过对纤维纺丝原液进行电纺丝工序，来由三维结构的海绵形态的纤维形成的支架的制造方法，但支架的纤维具有规定直径的线形状，支架的气孔定义为在多个纤维之间存在的空间。
因此，由于细胞难以通过支架的微细气孔渗透到支架的内部来生长，因而仅允许细胞的二维生长，来使细胞以优选的形状和骨架生长受到限制。
发明内容
技术问题
本发明是鉴于上述情况而提出的，本发明的目的在于，提供如下的细胞培养支架，即，对细胞培养提供熟悉且适合的培养环境，从而可使细胞的生存率极大化。
本发明的另一目的在于，提供如下的基于生物降解性高分子的细胞培养支架，即，灵活地进行细胞培养，培养在细胞后移植到体内并帮助细胞的分化，其结束后，可分解来从体内排出到体外。
解决问题的方案
用于实现上述目的的本发明的一实施例的细胞培养支架的特征在于，包括：纤维网，由生物降解性高分子的纤维蓄积而成，具有多个气孔；以及多个微珠，形成于上述纤维，用于以确保使上述细胞向上述纤维网的内部渗透来生长的空间。
在根据本发明的一实施例的细胞培养支架中，上述生物降解性高分子可以为聚乳酸(PLA)、聚左旋乳酸(PLLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚己内酯(PCL)及对二氧环己酮(PDO)中的一种。
在根据本发明的一实施例的细胞培养支架中，在上述纤维及上述微珠可包含有亲水处理用添加剂。
在根据本发明的一实施例的细胞培养支架中，上述亲水处理用添加剂可以为聚山梨酯80(Tween80)、普朗尼克(Pluronic)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)中的一种。
在根据本发明的一实施例的细胞培养支架中，上述纤维网可以为利用混合上述生物降解性高分子及溶剂的纺丝溶液进行电纺丝而成的网，上述纺丝溶液的粘度可以为50～2000cps。
在根据本发明的一实施例的细胞培养支架中，上述纤维的直径可以为100nm～10μm。
在根据本发明的一实施例的细胞培养支架中，上述微珠的直径可大于上述纤维的直径。
用于实现本发明的另一目的的细胞培养支架的特征在于，包括：第一纤维网，由形成有微珠的第一纤维蓄积而成，第二纤维网，在上述第一纤维网上由形成有微珠的第二纤维蓄积而成，第三纤维网，在上述第二纤维网上由形成有微珠的第三纤维蓄积而成。
在根据本发明的一实施例的细胞培养支架中，上述第二纤维的直径可小于上述第一纤维及第三纤维的直径。
在根据本发明的一实施例的细胞培养支架中，上述第一纤维网及第三纤维网的厚度可小于上述第二纤维网的厚度。
在根据本发明的一实施例的细胞培养支架中，上述纤维及上述微珠可由生物降解性高分子形成。
在根据本发明的一实施例的细胞培养支架中，在上述纤维及上述微珠可包含有亲水处理用添加剂。
发明的效果
根据本发明，通过由具有与人体的细胞外基质(ECM，Extra Cellular Matrix)最相似的结构的纤维网实现细胞培养支架，来对细胞培养提供熟悉且适合的培养环境，从而可使细胞的生存率极大化。
本发明具有可实现由基于生物降解性高分子的纤维支架形成的细胞培养支架的优点，在细胞培养后移植到体内并帮助细胞的分化，其结束后，可分解来从体内向体外排出。
根据本发明具有如下的优点，即，以由生物降解性高分子形成的纤维网来实现细胞培养支架，通过形成挂在纤维网的纤维上的多个微珠，来在微珠与纤维之间以及微珠与微珠之间提供扩大的空间，以使所培养的细胞向纤维网内部渗透来生长，从而使细胞以不变形形状及骨架的状态生长。
本发明可提供如下的支架，即，以三层层叠的纤维网结构来实现细胞培养支架，来使细胞容易地粘附，细胞可向层叠结构内部渗透来生长，防止向层叠结构内部渗透来生长的细胞从层叠结构的底面逸出，从而使细胞以不变形形状及骨架的状态生长。
附图说明
图1为用于说明本发明的细胞培养支架的立体图。
图2a及图2b为本发明的根据微珠是否存在的纤维网的光谱角填图(SAM，spectralangle mapper)照片。
图3为示意性示出本发明中向细胞培养支架的内侧生长的细胞所渗透的状态的图。
图4为用于说明制造本发明的细胞培养支架的电纺丝装置的示意图。
图5为本发明的层叠的细胞培养支架的剖视图。
图6为用于说明本发明的层叠结构的细胞培养支架的制造方法的示意性剖视图。
具体实施方式
以下，参照附图对用于实施本发明的具体内容进行说明。
本发明具有如下的结构特征，即，将利用电纺丝而得到的生物降解性高分子的纤维蓄积而成并具有多个气孔的纤维网用作用于培养细胞的支架，在纤维网的纤维上形成多个微珠(bead)，以形成所培养的细胞可向纤维网内部渗透来生长的空间。
像这样，本发明的基于生物降解性高分子的细胞培养支架为如下的支架，即，具有可使细胞易于粘附且有效地生长的三维结构，可无副作用地移植到体内，并且在移植到体内后，分化到所需功能的脏器或器官之后，可被分解。
即，参照图1，本发明的细胞培养支架100作为使细胞粘附来进行培养的支架，包括：纤维网110，由生物降解性高分子的纤维120蓄积而成，具有多个气孔125；以及多个微珠130，形成于上述纤维120，用于以确保使上述细胞向上述纤维网110的内部渗透来生长的空间。
在图1中观察纤维网110的A区域的扩大图，由生物降解性高分子形成的纤维120不均匀地蓄积来形成平板形状的纤维网110，在蓄积的纤维120之间形成有多个气孔125。
其中，优选地，纤维120的直径为100nm～10μm，在纤维120形成有多个微珠130。
而且，微珠130的直径大于纤维120的直径，微珠130可定义为由生物降解性高分子所凝聚的块。此时，在所有纤维120分别形成有至少一个微珠130，或在所有纤维120中的部分纤维120形成有至少一个微珠130。
在本发明中，混合生物降解性高分子及溶剂来制备纺丝溶液，利用该纺丝溶液在后述的纺丝装置的喷嘴进行电纺丝，形成挂有微珠130的纤维120，并通过蓄积该纤维120来制造用于细胞培养支架100的纤维网110。
此时，本发明的特征在于，为了实现具有微珠的纤维，将混合生物降解性高分子及溶剂的纺丝溶液的粘度设为50～2000cps。
其中，当纺丝溶液的粘度小于50cps时，由于纺丝溶液的流动性高，因而从纺丝装置的喷嘴喷射液滴(droplet)，当纺丝溶液的粘度大于2000cps时，因纺丝溶液中的有机溶剂量减少，而具有低流动性，从而从纺丝装置的喷嘴仅纺丝纤维。
本发明的发明人通过实验确认了在从纺丝喷嘴电纺丝而成的纤维120形成微珠与纺丝溶液的粘度有密切的关联。
即，作为生物降解性高分子应用分子量为130000的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)，以使粘度成为2100cps的方式对聚乳酸-羟基乙酸共聚物和溶剂进行混合并进行电纺丝，其结果，如图2a所示，制造出仅由纤维形成纤维网，但也可以通过以使粘度成为260cps的方式对混合聚乳酸-羟基乙酸共聚物和溶剂的纺丝溶液进行电纺丝，来制造如图2b所示的具有微珠的纤维蓄积的纤维网。
因此，在本发明中，利用由生物降解性高分子形成的纤维网来实现细胞培养支架，并形成挂在纤维网的纤维上的多个微珠，来对微珠与纤维之间以及微珠与微珠之间提供扩大的空间(大气孔)，因而如图3所示，具有在纤维网110上培养的细胞150向纤维网110的内部渗透来进行三维生长的优点。
即，仅由纤维蓄积而成的纤维网在纤维之间形成微细气孔，但作为本发明的细胞培养支架来使用的纤维网则在微珠与纤维之间以及微珠与微珠之间形成气孔。因此，存在微珠的本发明的纤维网的气孔大于不存在微珠的纤维网的纤维之间形成的微细气孔，从而成为使生长的细胞150易于渗透的空间。
而且，生物降解性高分子可定义为由自然界中存在的细菌、藻类、霉菌等的微生物完全分解为水和二氧化碳或水和甲烷气体的高分子。可以说，是所谓的腐烂性塑料，其物理性、化学性结构由自然界中的细菌等的有机物质改变。
本发明用于实现细胞培养支架，上述细胞培养支架由可使所培养的细胞的生存率极大化，并且在培养细胞后，移植到体内并帮助细胞的分化，其结束后，可分解来从体内向体外排出的基于生物降解性高分子的纤维支架形成。
即，本发明的特征在于，实现可灵活地进行细胞培养，并且可移植到体内并被分解的细胞培养支架。
其中，由纤维蓄积而成的纤维网具有与人体的细胞外基质(ECM，Extra CellularMatrix)最相似的结构，因而由该纤维网形成的支架可对细胞培养提供熟悉且适合的培养环境，因此可使细胞的生存率极大化。
像这样的生物降解性高分子具有按照高分子的种类，其生物降速度大有变化的特性，可通过较快分解的高分子和缓慢分解的高分子的组成比率来调节分解速度，因此，本发明还存在如下的优点，即，将已培养细胞的细胞培养支架移植到体内后，可按照细胞的分化速度来控制细胞培养支架的分解速度。
本发明中，即，混合生物降解性高分子及溶剂来制备纺丝溶液，并且利用该纺丝溶液在后述的电纺丝装置进行电纺丝而制备超细纤维，使超细纤维蓄积而制备由生物降解性高分子形成的细胞培养支架。
生物降解性高分子可使用聚乳酸(PLA)、聚左旋乳酸(PLLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚己内酯(PCL)及对二氧环己酮(PDO)中的一种，溶剂可使用选自由二甲基乙酰胺(DMAc，N,N-Dimethyl acetoamide)、二甲基甲酰胺(DMF，N,N-Dimethylformamide)、甲基吡咯烷酮(NMP，N-methyl-2-pyrrolidinone)、二甲基亚砜(DMSO，dimethyl sulfoxide)、四氢呋喃(THF，tetra-hydrofuran)、碳酸乙烯酯(EC，ethylene carbonate)、碳酸二乙酯(DEC，diethyl carbonate)、碳酸二甲酯(DMC，dimethylcarbonate)、碳酸甲乙酯(EMC，ethyl methyl carbonate)、碳酸丙烯酯(PC，propylenecarbonate)、水、醋酸(acetic acid)、蚁酸(formic acid)、三氯甲烷(Chloroform)、二氯甲烷(dichloromethane)、丙酮(acetone)及异丙醇(isopropylalchol)组成的组中的一种以上。
另一方面，在本发明中，为对形成细胞培养支架的纤维网的纤维及微珠赋予亲水性，通过混合生物降解性高分子、亲水处理用添加剂及溶剂来制备纺丝溶液，并利用该纺丝溶液进行电纺丝，且通过使形成有具有亲水性的微珠的纤维进行蓄积，来制造纤维网。
其中，亲水处理用添加剂可以为聚山梨酯80(Tween80)、普朗尼克(Pluronic)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)中的一种。
细胞培养支架浸渍于培养液，粘附于细胞培养支架的细胞从培养液吸收营养素来生长。由于细胞很好地粘附于亲水性优秀的支架来生长，因而在本发明中，通过在纤维及微珠包含有亲水处理用添加剂，来实现亲水性强的纤维网，从而具有使细胞容易地粘附的优点。
图4为用于说明制造本发明的细胞培养支架的电纺丝装置的示意图。
参照图4，在用于制造本发明的细胞培养支架的电纺丝装置中，用于供给搅拌的纺丝溶液的搅拌罐20与纺丝喷嘴40相连接，在与纺丝喷嘴40隔开的下部配置有按规定速度移动的输送机形态的接地收集器50，纺丝喷嘴40与高电压发生器相连接。
其中，利用由马达10驱动的搅拌器30对生物降解性高分子及溶剂进行混合来制备纺丝溶液。此时，可不在搅拌器30进行混合，而是在投入电纺丝装置之前使用预先混合的纺丝溶液。
之后，若对收集器50与纺丝喷嘴40之间施加静电力，则在纺丝喷嘴40将纺丝溶液制造成超细纤维210并向收集器50进行纺丝，在收集器50蓄积纤维210，从而形成细胞培养支架的纤维网200。
更具体地说，从纺丝喷嘴40排出的纺丝溶液一边通过借助高电压发生器带电的纺丝喷嘴40，一边向纤维210纺丝，来在按规定速度移动的输送机形态的接地收集器50的上部依次层叠纤维210，从而形成细胞培养支架的纤维网200。
另一方面，根据本发明的细胞培养支架100由生物降解性高分子的纤维蓄积而成，并且能够以多个纤维上形成多个微珠的纤维网110层叠的层叠结构实现。
作为一例，层叠结构的细胞培养支架100，如图5所示，包括：第一纤维网111，由形成有微珠的第一纤维蓄积而成，第二纤维网112，在第一纤维网111上由形成有微珠的第二纤维蓄积而成，第三纤维网113，在第二纤维网112上由形成有微珠的第三纤维蓄积而成。
在这种三层结构的细胞培养支架100中，优选地，第二纤维具有大于第一纤维及第三纤维的直径。
即，第三纤维网113层叠在第二纤维网112的上部，细胞粘附于第三纤维网113来培养。此时，使第三纤维网113的第三纤维的直径小于第二纤维网112的第二纤维的直径，来使细胞的粘附表面积变大，从而使细胞更好地粘附。
并且，在本发明中，优选地，第一纤维网111及第三纤维网113的厚度小于第二纤维网112的厚度。
而且，由于第二纤维网112的第二纤维的直径大于第三纤维网113的第三纤维的直径，因而与第三纤维网113的空间相比，第二纤维网112的空间更宽，从而向第二纤维网112生长的细胞灵活地进行渗透，由于第一纤维网111的第一纤维的直径小于第二纤维网112的第二纤维的直径，因而与第二纤维网112的空间相比，第一纤维网111的空间更窄，可防止向第二纤维网112渗透来生长的细胞向第一纤维网111渗透来在第一纤维网111的底面生长。
因此，由于根据本发明的细胞培养支架100由层叠三层纤维网的结构实现，因而存在如下的优点，即，使细胞容易地粘附，并使细胞向层叠结构内部渗透来生长，防止向层叠结构内部渗透来生长的细胞从层叠结构的底面逸出，防止生长的细胞的形状及骨架歪曲，使细胞具有优选的形状及骨架。
图6为用于说明本发明的层叠结构的细胞培养支架的制造方法的示意性剖视图。
层叠结构的细胞培养支架由具有从第一纺丝喷嘴41、第二纺丝喷嘴42及第三纺丝喷嘴43排出的微珠的纤维蓄积而成。
混合生物降解性高分子及溶剂的纺丝溶液供给至第一纺丝喷嘴41、第二纺丝喷嘴42及第三纺丝喷嘴43，来排出具有微珠的纤维，第一纺丝喷嘴41、第二纺丝喷嘴42及第三纺丝喷嘴43依次配置于上述电纺丝装置的按规定速度移动的收集器50的上部。
首先，从第一纺丝喷嘴41排出形成有微珠的第一纤维来形成第一纤维网111后，当第一纤维网111移动到第二纺丝喷嘴42的下部时，从第二纺丝喷嘴42向第一纤维网111的上部排出形成有微珠的第二纤维，来层叠第二纤维网112。
之后，当第二纤维网112移动到第三纺丝喷嘴43的下部时，从第三纺丝喷嘴43向第二纤维网112的上部排出形成有微珠的第三纤维，来层叠第三纤维网113。
在上述记载中，虽然参照本发明的优选实施例来说明了本发明，但本发明并不局限于上述的实施例，本发明所属技术领域的普通技术人员可在不脱离本发明的精神的范围内，对本发明进行多种变更及修正。
产业上的可利用性
本发明适用于对细胞培养提供熟悉且适合的培养环境，来使细胞的生存率极大化，细胞在培养后可移植到体内，并使细胞在分化后分解来向体外排出的基于生物降解性高分子的细胞培养支架。

Claims (4)

1.一种细胞培养支架，其特征在于，
包括：
第一纤维网，由第一蓄积静电纺丝纤维形成，在上述第一蓄积静电纺丝纤维形成有第一气孔和第一微珠，上述第一微珠确保上述第一气孔的空间，
第二纤维网，层叠在上述第一纤维网上，由第二蓄积静电纺丝纤维形成，在上述第二蓄积静电纺丝纤维形成有第二气孔和第二微珠，上述第二微珠确保上述第二气孔的空间，
第三纤维网，层叠在上述第二纤维网上，由第三蓄积静电纺丝纤维形成，在上述第三蓄积静电纺丝纤维形成有第三气孔和第三微珠，上述第三微珠确保上述第三气孔的空间，
上述第三纤维网被配置为培养粘附于上述第三蓄积静电纺丝纤维的细胞，上述第二纤维网被配置为使向上述第二气孔的空间渗透的细胞生长，
上述第三蓄积静电纺丝纤维的直径小于上述第二蓄积静电纺丝纤维的直径，来使细胞的粘附表面积变大，
上述第一蓄积静电纺丝纤维的直径小于上述第二蓄积静电纺丝纤维的直径，以防止向上述第二纤维网渗透来生长的细胞向第一纤维网渗透来在上述第一纤维网的底面生长，
上述第一蓄积静电纺丝纤维、上述第二蓄积静电纺丝纤维、上述第三蓄积静电纺丝纤维是利用粘度为50～2000cps的纺丝溶液进行电纺丝而成的。
2.根据权利要求1所述的细胞培养支架，其特征在于，上述第一纤维网及第三纤维网的厚度小于上述第二纤维网的厚度。
3.根据权利要求1所述的细胞培养支架，其特征在于，上述第一纤维网、上述第三纤维网、上述第三纤维网由生物降解性高分子形成。
4.根据权利要求1所述的细胞培养支架，其特征在于，上述第一纤维网、上述第三纤维网、上述第三纤维网包含亲水处理用添加剂。
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