CN107412417A - 一种预防斑点叉尾鮰肠道败血症的复方中草药制剂及方法 - Google Patents

一种预防斑点叉尾鮰肠道败血症的复方中草药制剂及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种预防斑点叉尾鮰肠道败血症的复方中草药制剂及方法，属于水产养殖领域，按重量计，所述复方中草药制剂的组分包括：黄芪多糖50‑60份、五味子1‑3份、甘草2份、维生素C为1份、维生素K3为1份，在发病季节，将该复方中草药制剂添加到鱼常规饲料中，可有效预防斑点叉尾鮰肠道败血症，且可连续投喂而不需要休药期，不会产生耐药性。

Description

一种预防斑点叉尾鮰肠道败血症的复方中草药制剂及方法
技术领域
本发明涉及的是水产养殖的技术领域，尤其涉及的是一种预防斑点叉尾鮰肠道败血症的复方中草药制剂及方法。
背景技术
斑点叉尾鮰，又称沟鲶，属鲶形目、鮰科，1984年从美国引入中国养殖。斑点叉尾鮰具有肉质鲜嫩、营养丰富、无肌间刺等优点，深受广大消费者的喜爱。目前斑点叉尾鮰养殖已在湖南、湖北、安徽和广东等全国30多个省(市)有分布。由于养殖品种的种质退化，养殖环境日益恶化，斑点叉尾鮰在养殖过程中常遇到各种病害，死亡率通常很高，阻碍了其养殖业的进一步发展。
斑点叉尾鮰肠道败血症是斑点叉尾鮰养殖业危害最严重的传染病，每年给斑点叉尾鮰养殖业造成巨大的经济损失。在美国斑点叉尾鮰苗种一半以上死于肠道败血症。目前该病在我国许多斑点叉尾鮰养殖区也常有发生，已造成了较大的损失。该病流行有高度的季节性，各个生长阶段斑点叉尾鮰的均能感染，对鱼种的危害更大。发病流行高峰的水温22℃～28℃，每年的4～5月和9～10月是该病的主要流行季节，引起斑点叉尾鮰大量死亡。
斑点叉尾鮰肠道败血症的病原体是鮰鱼爱德华氏菌，其最适生长温度为25～30℃。爱德华氏菌体能抵抗补体介导的溶菌作用，菌体可在吞噬细胞中增殖，通过鱼体吞噬细胞的吞噬作用将菌体传递到全身。该菌为革兰氏阴性小直杆菌，大小约(0.8±0.2)微米×(2.5±0.5)微米，氧化酶阴性。该菌在普通培养基上生长缓慢，在25～30℃条件下培养，于BHI琼脂上需25～30小时，于TSA琼脂上需要48小时才形成针尖大小的菌落，在37℃时则生长不良。慢性型带病鱼体经粪便散播，引起鮰鱼肠道败血症的暴发。潜伏感染的斑点叉尾鮰和感染的斑点叉尾鮰的排泄物是重要的病原菌来源，当水温为25℃时，鮰爱德华氏菌能在池塘水中存活2个月，在底泥里存活3个月仍保持致病性，这也是造成池塘反复发作的一个重要原因。另外，养殖环境恶化、水温剧烈变化、不规范生产操作也可导致该病发生。
斑点叉尾鮰感染鮰鱼爱德华氏菌后的临床症状可分为急性型和慢性型。急性型病原经消化道感染，发病急，死亡率高。病鱼离群独游，反应迟钝，摄食减少。病原菌被吞入后经消化道侵入血液，并随血液循环移植到各内脏器官，引起部分组织器官的充血、出血、炎症、变性、坏死和溃疡形成。典型的症状为病鱼头朝上尾朝下，悬垂在水中，有时呈痉挛式的螺旋状游动，继而发生死亡，死亡鱼腹部膨大，鳍条基部、眼部和背部、体侧、腹部、额部和鳃盖上可见到细小的充血、出血斑，在深色皮肤区则出现淡白色斑点，有的病例头部皮肤和躯体皮肤发生腐烂，一侧或两侧眼球突出，鳃丝苍白而有出血点，肌肉有点状出血或斑状出血；腹腔内有大量含血的或清亮的液体，肝肿大，质脆，有出血点和灰白色的坏死斑点，脾、肾肿大和出血，胃膨大，肠道扩张、充血、发炎，肠腔内充满气体和淡黄色的水样液体，粘膜水肿、充血。慢性型发病的病程长，病原体经神经系统感染。最初病原菌通过鼻腔侵入嗅觉器官，再经嗅觉器官移行到脑，继之缓慢发展到脑组织形成肉芽肿性炎症，病鱼不规则游动，如旋转游动和在水面窜跳等，在后期可见典型的“头穿孔”症状。
除了病原因素外，养殖环境的恶化，甚至包括不科学的养殖方式与管理方式等，是导致斑点叉尾肠道败血症暴发的另一个重要原因。池塘老化、长期未进行池塘清淤消毒为病原菌的生存和繁殖提供了重要条件；不科学的施肥导致水体富营养化，溶解氧含量降低，水体中有害物质增加，导致鱼体免疫力下降，增加了鱼体感染机会。水温是斑点叉尾肠道败血症暴发的另一重要因素，22～28℃是肠道败血症的高发期，表现为急性感染，死亡率高；当水温低于22℃或高于30℃时，死亡率较低，表现为慢性型，并形成潜伏感染。当环境压力增大时，极易形成二次暴发。此外，许多养殖户为追求高效益，盲目加大养殖密度，投喂廉价饲料，也增加了斑点叉尾肠道败血症暴发的概率。缺乏针对性的预防措施和诊断方法，导致复方中草药制剂、抗生素的滥用，病原菌出现抗药性，也极大地增加了疾病的有效预防和治疗难度。
目前，美国食品药品管理局(FDA)已经批准两种抗生素可在斑点叉尾鮰肠道败血症防治中使用，一种是氧四环素类，另一种是罗米特(Romet)，磺胺类。四环素类在沉性饲料中添加，投喂10d，休药期为21d。罗米特在浮性饲料中添加，投喂5d，休药期为3d。但是，抗生素的长期大量使用，很容易导致生物体内菌群失调、免疫功能下降以及食品安全问题等。随着人们对安全、卫生、健康、生态和环境等问题的日益关注，追求无抗、安全无污染、无残留绿色意识已深入人心，在水产养殖领域，研发和生产安全无抗生素的药物成为当务之急。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种预防斑点叉尾鮰肠道败血症的复方中草药制剂及方法，以提供一种斑点叉尾鮰肠道败血症的有效预防手段。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一种预防斑点叉尾鮰肠道败血症的复方中草药制剂，按重量计，所述复方中草药制剂的组分包括：黄芪多糖50-60份、五味子1-3份、甘草2份、维生素C为1份、维生素K3为1份。
进一步地，所述复方中草药制剂的组分中还包括：蛋清10-20份。
本发明还提供了一种预防斑点叉尾鮰肠道败血症的方法，即，在发病季节，在斑点叉尾鮰的常规饲料中添加如权利要求1所述的复方中草药制剂进行预防，以增强健康鱼体对致病菌的抵抗力，具体包括以下步骤：
(1)按重量计，称取黄芪多糖5060份、五味子13份、甘草2份、维生素C和维生素K3各1份，加入10-20份蛋清中，搅拌混合成浆糊状，即获得所述复方中草药制剂；
(2)将步骤(1)的复方中草药制剂加入斑点叉尾鮰常规饲料，充分混合；
(3)在不超过60℃的条件下风干，获得复方中草药制剂饲料；
(4)在发病季节，利用含有步骤(3)的复方中草药制剂饲料直接饲喂。
进一步地，所述步骤(2)中，复方中草药制剂加入常规饲料中的剂量水平为100-200mg/kg.B.W。
进一步地，所述步骤(2)中，常规饲料为常规膨化饲料或常规饲料鱼。
进一步地，所述方法还包括：
A、控制斑点叉尾鮰的放养密度为1000-1500尾/亩；对于斑点叉尾鮰肠型败血症的防治，可以通过加强饲养管理，改善水体环境条件，科学饲喂，减少应激来预防该病的发生；特别是控制放养密度，因为放养密度过高会增加肠道败血症发生的机会；改善养殖环境、保持水温稳定、避免剧烈操作、投喂优质饲料等可预防该病发生；
B、22-28℃为斑点叉尾鮰肠道败血症发病的窗口期，而硫酸铜的使用可导致鮰鱼体内的免疫抑制作用，降低鱼体对病原菌感染的抵抗力；因此，在环境平均温度为22-28℃的季节，避免使用硫酸铜去抑制斑点叉尾鮰养殖水体中的藻类和杀灭寄生虫；
本发明相比现有技术具有以下优点：本发明提供了一种预防斑点叉尾鮰肠道败血症的复方中草药制剂及方法，该复方中草药制剂可用于预防斑点叉尾鮰肠道败血症，并且，将该复方中草药制剂与常规饲料混合后可进行连续投喂而不需要休药期，不会产生耐药性，在发病期间使用，可提高斑点叉尾鮰的免疫力，有效预防斑点叉尾鮰肠道败血症的发生。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
1、材料
本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。
2、方法
2.1复方中草药制剂的制备
按重量计，称取黄芪多糖50-60份、五味子1-3份、甘草2份、维生素C和维生素K3各1份，加入10-20份蛋清中，搅拌混合成浆糊状，即获得所述复方中草药制剂；
设置无蛋清对照组，用普通的水产饲料粘合剂代替上述10-20份的蛋清，制备获得不含蛋清复方中草药制剂。
2.2复方中草药制剂饲料的制备
将上述含蛋清复方中草药制剂和不含蛋清复方中草药制剂分别按照100mg/kg.B.W的剂量添加到斑点叉尾鮰常规膨化饲料中，充分混合后，在不超过60℃的条件下风干，获得含有复方中草药制剂饲料备用。
2.3试验鱼种饲养与处理
供试鱼来自于安徽省皖江水产技术研究院有限责任公司养殖基地，选取1龄健康斑点叉尾鮰鱼150尾，平均体重为(76±4.6)g，无外伤，体质健壮。在长2.0M，宽2.0M，高2.0M的网箱中开展以下各项试验。
将供试鱼驯养15d适应试验环境，并确认无疾病症状，然后将供试鱼平均分为3个试验组，每组50尾(编号分别为I、II、III组)，其中：
第I组试验鱼：用不含蛋清的复方中草药制剂饲料进行饲喂；
第II组试验鱼：用含蛋清的复方中草药制剂饲料进行饲喂；
第III组试验鱼：用常规膨化饲料进行饲喂，作为空白对照组。
各组试验鱼开始投喂前称量总体重，并记录其平均初始体重。
2.4复方中草药制剂的促生长作用
试验期间，每天早晚各喂一次，连续投喂30d后称重，结果如下表1所示：
表1：斑点叉尾鮰的生长情况表
表注：以上数据为50尾供试鱼的平均值。
表1中可看出，试验组I、II增重量显著高于空白对照组III(t测验，P<0.05)，说明本发明的复方中草药制剂对斑点叉尾鮰的生长具有明显促进作用，且含蛋清的复方中草药制剂相比较不含蛋清的复方中草药制剂对鮰鱼的生长促进作用更明显。
2.5免疫指标的测定
2.5.1菌株培养
将鮰鱼爱德华氏菌菌株接种在脑心浸液肉汤(BHI)培养基中，在25～30℃条件下培养30h后，离心收集，用已灭菌的生理盐水将菌体浓度调至3.0×108cfu/mL，作为攻毒菌液使用。从其中取一半的菌液加入浓度0.5％的福尔马林，25℃条件下灭活24h，离心收集，用灭菌生理盐水清洗3次，再将其浓度调整至3.0×108cells/mL，制成经福尔马林灭活的爱德华氏菌。
2.5.2鼠抗F-Ed血清制备
将等量佛氏完全佐剂(Difco)与上述经福尔马林灭活的爱德华氏菌混匀，皮下多点注射昆明鼠，每只鼠注射0.2mL，共接种8只大白鼠。14d后以相同的方法对大白鼠加强免疫1次。加强免疫后第14d，再对每只受免疫的大白鼠以相同方式注射1次，于14d后，对受免疫的大白鼠断尾采血，制备鼠抗F-Ed血清，置-20℃冰箱保存备用。
2.5.3试验鱼种采血
从I-III组试验鱼中分别捞取14尾供试鱼，用75％乙醇棉球擦拭体表后，切断腹主动脉采血，使用5mL一次性无菌注射器进行尾静脉取血。将每组鱼的血液分为2份，其中1份血液首先在室温下静置1h待其凝固，再置于4℃的冰箱保持4h后，在4℃条件下以4000r/min离心10min，收集上层血清，保存在4℃冰箱中备用；再将另一份血液用肝素抗凝，制备成抗凝血，供以下试验检测白细胞的吞噬活性使用。
2.5.4凝集抗体效价的测定
按照血凝板法进行测定，反应抗原为经福尔马林灭活的爱德华氏菌。
2.5.5溶菌酶活性的测定
按照许国焕等人在“两种多聚糖对彭泽鲫生长影响及免疫促进作用的初步研究”中提供的溶菌酶活性测定方法(许国焕，吴月嫦，陶家发.两种多聚糖对彭泽鲫生长影响及免疫促进作用的初步研究[J].水利渔业，2002，22(4)：49-51.)测定I-III组试验鱼的溶菌酶活性。具体为：将溶壁微球菌用0.067mol/L的磷酸缓冲液(PBS，pH 6.4)调至0.2mg/mL的菌悬液。取3.0mL菌悬液，吸取供试鱼血清40μL加入到菌悬液中，在96孔板中混匀后，立刻使用570nm的波长在酶标仪上测定A0值。然后在28℃水浴中温育30min后，置于4℃冰浴中终止反应，在570nm波长下测定反应后的光密度值A，按公式(A0-A)/A0计算溶菌酶的活性。
2.5.6白细胞吞噬活性的测定
取100μL抗凝血，加入100μL经福尔马林灭活的爱德华氏菌菌液，摇匀，在28℃条件下孵育30min，孵育期间每隔10min摇晃1次。用甲醇固定10min，Giemsa染色1h，水洗晾干后镜检。吞噬细胞活力以吞噬指数(phagocytic in-dex，PI)和吞噬百分比(phago-cyticpercentage，PP)表示：吞噬指数(％)＝(吞噬细胞内的细菌总数/参与吞噬的吞噬细胞数)×100；吞噬百分比(％)＝(100个吞噬细胞中参与吞噬的细胞数/100)×100。
2.5.7供试鱼血清中总蛋白含量和谷丙转氨酶活性的测定
分别采用血清总蛋白试剂盒和谷丙转氨酶试剂盒测定。
2.5.8功毒试验
对I-III组试验鱼的鱼胸鳍基部注射0.2mL的攻毒菌液，正常饲养14d。对死亡的斑点叉尾鮰进行解剖，分离致病菌。以鼠抗血清与分离所得致病菌进行玻片凝集试验，判断是否由爱德华氏菌感染致死，并统计各组由爱德华氏菌感染致死的鱼体的死亡率。依下式计算相对免疫保护率(Relative percent survival，RPS)。
相对免疫保护率(％)＝(1一试验组死亡率/空白对照组死亡率)×100％
死亡率(％)＝[(试验初鱼体尾数-试验末鱼体尾数)/试验初鱼体尾数]×100％。
2.4.9结果处理及分析
试验结果数据用平均值±标准误表示，数据分析采用SPSS17.0软件包中的单因素方差分析(One-way ANOVA)处理，以P＜0.05作为差异显著性标准。
(I)对照和试验组斑点叉尾鮰的血清凝集抗体效价、溶菌酶活性和白细胞吞噬活性的测定结果如表2所示：
表2：斑点叉尾鮰血清中凝集抗体效价、溶菌酶活性和白细胞吞噬活性结果
1)凝集抗体效价为鱼体的几何平均数。
表2中可看出，投喂复方中草药制剂的试验组斑点叉尾鮰的凝集抗体效价与空白对照组之间均没有出现显著差异，各试验组之间也未出现显著差异。投喂复方中草药制剂的试验组鱼体溶菌酶活性显著高于空白对照组(t测验，P<0.05)，且投喂含蛋清的复方中草药制剂的试验组鱼体溶菌酶活性高于不含蛋清的试验组。投喂复方中草药制剂的试验组鱼体血液中白细胞的吞噬率(PP)和吞噬指数(PI)均显著地高于空白对照组(t测验，P<0.05)，含蛋清试验组的PP和PI略高于不含蛋清的试验组。以上结果表明，本发明的复方中草药制剂可增强斑点叉尾鮰的免疫能力。
(II)供试鱼血清中总蛋白含量和谷丙转氨酶活性(SGPT)活性测定结果如表3所示：
表3试验斑点叉尾鮰血清总蛋白和谷丙转氨酶活性
从表3中可以看出，试验组鱼体的血清中总蛋白含量并未随着复方中草药制剂在饲料中添加量的增加而提高。对供试鱼血清中SGPT活性的测定结果表明，在饲料中添加复方中草药制剂可以明显地降低鱼体血清中SGPT的活性，改善肝脏功能。
(III)功毒试验的结果，如表4所示。
表4：活菌攻毒后斑点叉尾鮰的死亡率和相对免疫保护率
从表4可以看出，投喂复方中草药制剂的试验鱼均获得了比较高的RPS，即在饲料中添加复方中草药制剂的试验组鱼体死亡率明显的低于空白对照组，且含蛋清组的RPS和死亡率比其它组都低，说明本发明的复方中草药制剂可明显降低试验鱼感染肠道败血病的几率，降低死亡率。
3、结论
黄芪已有2000多年的药用历史，其主要药效成分黄芪多糖APS以其多方面的免疫调节作用成为一种良好的免疫佐剂。APS可通过调节免疫器官、免疫细胞、免疫因子以及某些信使物质等来发挥免疫调节作用，不仅对特异性免疫及非特异性免疫均有调节作用，而且对正常机体与异常机体均有免疫调节功能。
五味子能促进肝糖原的合成，使糖代谢加强，又能增加肝细胞蛋白质的合成。对淋巴细胞DNA合成有促进作用，使淋巴母细胞生成增多，并促进脾免疫功能，而五味子醇能增强肾上腺皮质激素的免疫抑制作用，能对抗同种异体组织移植排斥反应，五味子是否能够预防肠道败血症及其效果尚未报道。
甘草及其提取物来源广、成本低、残留少和毒副作用小，被广泛用于水产养殖。将其添加到水产饲料中具有诱食、促生长、增强免疫力等功效。但甘草是否可预防肠道败血症及其效果尚未报道。
蛋清是指包在蛋黄周围，由蛋白质组成的透明的胶状物质。蛋清的成分中，水分87％，固形物13％，固形物中大约90％是蛋白质，其中：卵白蛋白75％，卵类粘蛋白15％，卵粘蛋白7％，伴白蛋白3％。蛋清为一种常用食材，对皮肤具有一定的保养作用，药用价值方面，民间有利用蛋清入白酒防治疟疾，有利用蛋清治疗轻度烧伤、烫伤、及其它皮肤病，但在动物养殖领域，其药用价值并不显著。
本发明利用黄芪多糖、五味子、甘草、维生素为原料，制备获得了一种可预防斑点叉尾鮰肠道败血症的复方中草药制剂，经免疫试验发现，该复方中草药制剂对斑点叉尾鮰肠道败血症的致病菌爱德华氏菌具有明显的免疫效果，预防效果显著。其中黄芪多糖、五味子和甘草对动物机体具有一定的免疫调节作用。
本发明中，应用了蛋清作为粘合剂，将复方中草药制剂与常规饲料粘合，粘合效果好。蛋清本身无免疫调节作用，但从试验数据中可以明显看出，其加入能够增强复方中草药制剂对爱德华氏菌的免疫效果，说明蛋清对复方中草药制剂各成分之间起到了一定的协同作用，从而增强了药效。
实施例2
以安徽省皖江水产技术研究院有限责任公司为试验基地，自2015年起，利用如下方法对基地的斑点叉尾鮰进行养殖管理，包括：
A、控制斑点叉尾鮰的放养密度为1000-1500尾/亩；
B、在环境平均温度为22-28℃的季节，避免使用硫酸铜去抑制养殖水体中的藻类和杀灭寄生虫；
C、将斑点叉尾鮰常规饲料鱼浸入如实施例1步骤2.1制备获得的浆糊状含蛋清复方中草药制剂中，捞起，常温下风干，获得表面沾有所述复方中草药制剂的饲料鱼。在发病季节，利用该饲料鱼进行饲喂，预防败血症。
根据安徽省某养殖公司历年资料统计，2015年前，在斑点叉尾鮰养殖期间，因肠道败血症带来的经济损失为79万元/年，自2015年开始，利用上述A-C的方法进行综合管理后，因肠道败血症带来的经济损失为12万元/年，经济损失大大降低，由于复方中草药制剂中的有效组分本身具有一定的非特异性免疫调节作用，试验期间，因其它疾病带来的经济损失也有所降低。
以上为本发明一种详细的实施方式和具体的操作过程，是以本发明技术方案为前提下进行实施，但本发明的保护范围不限于上述的实施例。

Claims (7)

1.一种预防斑点叉尾鮰肠道败血症的复方中草药制剂，其特征在于，按重量计，所述复方中草药制剂的组分包括：
2.根据权利要求1所述的一种预防斑点叉尾鮰肠道败血症的复方中草药制剂，其特征在于，所述复方中草药制剂的组分还包括：蛋清10-20份。
3.一种预防斑点叉尾鮰肠道败血症的方法，其特征在于，在发病季节，在斑点叉尾鮰的常规饲料中添加如权利要求1-2任一所述的复方中草药制剂进行预防。
4.根据权利要求3所述的一种预防斑点叉尾鮰肠道败血症的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)按重量计，称取黄芪多糖50-60份、五味子1-3份、甘草2份、维生素C和维生素K3各1份，加入10-20份蛋清中，搅拌混合成浆糊状，获得所述复方中草药制剂；
(2)将步骤(1)的复方中草药制剂加入斑点叉尾鮰常规饲料，充分混合；
(3)在不超过60℃的条件下风干，获得复方中草药制剂饲料；
(4)在发病季节，用含有步骤(3)的复方中草药制剂饲料直接饲喂斑点叉尾鮰。
5.根据权利要求4所述的一种预防斑点叉尾鮰肠道败血症的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，复方中草药制剂的加入剂量水平为100-200mg/kg.B.W。
6.根据权利要求4所述的一种预防斑点叉尾鮰肠道败血症的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，常规饲料为常规膨化饲料或常规饲料鱼。
7.根据权利要求3所述的一种预防斑点叉尾鮰肠道败血症的方法，其特征在于，所述方法还包括：
A、控制斑点叉尾鮰的放养密度为1000-1500尾/亩；
B、在环境平均温度为22-28℃的季节，避免使用硫酸铜去抑制斑点叉尾鮰养殖水体中的藻类和杀灭寄生虫。
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