CN104206776A - 桦褐孔菌多糖作为鱼类饲料添加剂的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种桦褐孔菌多糖作为凡纳滨对虾饲料添加剂的应用，桦褐孔菌多糖在鱼类基础饲料中的添加量为1-20g/kg鱼类基础饲料。本发明采用桦褐孔菌多糖加入鱼类饲料中，以代替抗生素药物和疫苗的使用，不会产生抗药性且使用成本低，能有效提高养殖鱼类的生长性能、免疫力和抗氧化能力，拓宽了桦褐孔菌多糖的应用范围，为鱼类饲料的开发提供了新途径，促进了鱼类养殖业的可持续发展。

Description

桦褐孔菌多糖作为鱼类饲料添加剂的应用

技术领域

本发明涉及水产养殖领域，特别涉及一种桦褐孔菌多糖作为海水和淡水养殖鱼类饲料添加剂的应用。

背景技术

海洋鱼类如石斑鱼、大黄鱼、大菱鲆（商品名多宝鱼）为具有高经济价值的鱼类。它们的肉质细嫩，味道鲜美，营养丰富，售价较高，在国内外市场上久负盛名， 供不应求。近年来，随着鱼类的规模化和集约化养殖的迅速发展，细菌和病毒感染导致的养殖病害爆发越来越频繁，病害一直是海洋鱼类养殖业发展的制约因素，为控制疾病的发生，化学药物和抗生素等被大量使用，由此产生药物残留、水体正常微生物种群失调、耐药性微生物增加、养殖动物内脏机能损伤等一系列不良后果，而且有时抗生素处理失败，其原因可能是每条鱼的口服抗生素剂量不同以及耐药性导致的。疫苗虽然是有效的疾病预防替代物，但是疫苗价格昂贵，而且是病原生物特异性的。因此，寻求抗生素药物和疫苗的替代品就显得尤为重要。草鱼(Ctenopharyngodon idellus)是我国著名的“四大家鱼”之一，是中国重要的养殖经济鱼类。但是在养殖过程中容易感染疾病，而且病害日益严重，而目前还没有一个针对草鱼疾病的疫苗被批准使用，为了预防疾病发生，研发有助草鱼抗病的天然免疫增强剂迫在眉睫。

桦褐孔菌，又名白桦茸，学名Inonotus obliquus，Fuscoporia oblique，欧洲人称之为“chaga”，是一种多孔菌科褐卧孔菌属食药用真菌。桦褐孔菌主要生长于白桦、银桦、榆树、赤杨等活立木的树皮下或砍伐后树木的枯干上，形成不育的木腐菌，其菌核可以在砍伐后的枯干上生存达6年之久。它主要分布于俄罗斯北部、北欧、中国黑龙江、吉林长白山、日本北海道等北纬45-50°极寒地区。桦褐孔菌子实体一般呈瘤状，直径约25-40 cm，外表坚硬，有深的裂痕，较硬，干时脆，颜色呈黄褐色或更深。

从16世纪以来，桦褐孔菌在俄罗斯、北欧一些国家被广泛用于恶性肿瘤、糖尿病、心血管疾病、肝病和艾滋病等疾病的治疗。在俄罗斯，桦褐孔菌被广泛用作日常保健品。日本的研究人员则称桦褐孔菌为一种“万能药”。在日本，桦褐孔菌的粉末状冲剂经常作为保健茶来饮用。1955年莫斯科医科院(The Medical Academy of Science in Moscow)宣布将桦褐孔菌列为抗癌物质，政府批准桦褐孔菌可用于医药品开发。美国把桦褐孔菌列入“特殊的天然物质”。

桦褐孔菌多糖是桦褐孔菌的重要药理活性成分之一，桦褐孔菌多糖是一种新型的真菌多糖，具有免疫调节、抗氧化作用、抗炎症及抗病毒等优点，成为当前免疫增强剂的研究热点。目前，桦褐孔菌多糖多应用于体外及小鼠的抗氧化、免疫功能的研究中，作用效果显著。但桦褐孔菌多糖对于鱼类是否合适，是否可以成为抗生素药物和疫苗的替代品是个未知数。如果桦褐孔菌多糖能够提高鱼类的免疫力和抗氧化能力，那么它在水产饲料添加剂研究中具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种桦褐孔菌多糖作为鱼类饲料添加剂的应用，采用桦褐孔菌多糖加入鱼类饲料中，以代替抗生素药物和疫苗的使用，使用成本低，能有效提高养殖鱼类的生长性能、免疫力和抗氧化能力，拓宽了桦褐孔菌多糖的应用范围，为鱼类饲料的开发提供了新途径。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是： 

一种桦褐孔菌多糖作为鱼类饲料添加剂的应用，桦褐孔菌多糖在鱼类基础饲料中的添加量为1-20g/kg鱼类基础饲料。

本发明首次将桦褐孔菌多糖作为添加剂应用到鱼类饲料中，以代替抗生素药物和疫苗的使用，不会产生抗药性且使用成本低，发现能显著提高鱼类的增重率、特定生长率和成活率，显著降低饲料系数，并且显著提高鱼类血清溶菌酶、碱性磷酸酶和总抗氧化能力，降低血清丙二醛含量。拓宽了桦褐孔菌多糖的应用范围，为鱼类饲料的开发提供了新途径。本发明中，桦褐孔菌多糖的添加量低于1g/kg则无法明显起到提高鱼类的生长性能、免疫力和抗氧化能力的效果；桦褐孔菌多糖的添加量高于20g/kg，则成本过高，且更进一步提高鱼类的生长性能、免疫力和抗氧化能力的效果微弱，不利于应用。

本发明中的桦褐孔菌多糖可以是市售产品，优选本发明自己制备的桦褐孔菌多糖。

作为优选，桦褐孔菌多糖在鱼类基础饲料中的添加量为5-15g/kg鱼类基础饲料。控制桦褐孔菌多糖在鱼类基础饲料中的添加量为5-15g/kg鱼类基础饲料，这样应用的效果最佳。

 

作为优选，所述桦褐孔菌多糖由以下工艺制备获得：

（1）菌种活化：以桦褐孔菌为菌种，接种至斜面菌种培养基上培养，获得活化菌种。

（2）液体菌种培养：将活化菌种转入液体种子培养基中，摇床培养至对数期得液体菌种。

（3）液体深层发酵：将液体菌种接入液体深层发酵培养基中发酵培养，液体菌种与液体深层发酵培养基的体积比为1:8-10，所述液体深层发酵培养基的配方为：葡萄糖30-32g/L，木质纤维素32-38g/L，蛋白胨 2-5g/L，KH₂PO₄ 1-2g/L，ZnSO₄ ·2H₂O 0.01-0.02g/L， K₂HPO₄  0.3-0.5g/L，FeSO₄ ·7H₂O  0.03-0.07g/L，MgSO₄ ·7H₂O  0.3-0.6 g/L，CuSO₄ ·5H₂O  0.01-0.03 g/L，CoCl₂ 0.01 -0.02g/L，MnSO₄ ·H₂O 0.06-0.09 g/L，pH值6.0-6.5。

液体深层发酵培养基优化的配方为：葡萄糖30-32g/L，木质纤维素32-38g/L，蛋白胨 3g/L，KH₂PO₄ 1g/L，ZnSO₄ ·2H₂O 0.01g/L，K₂HPO₄  0.4g/L，FeSO₄ ·7H₂O  0.05 g/L， MgSO₄ ·7H₂O  0.5 g/L，CuSO₄ ·5H₂O  0.02 g/L，CoCl₂ 0.01 g/L，MnSO₄ ·H₂O 0.08 g/L，pH值6.0。

液体深层发酵的工艺参数为：发酵温度27-28℃，发酵罐空气流量0.5-1.0vvm，发酵罐内部压力0.1-0.25 kg/cm³，搅拌转速70-150转/分钟，发酵周期12-14天。

（4）桦褐孔菌多糖提取：从发酵产物中提取桦褐孔菌多糖。

作为优选，从发酵产物中提取桦褐孔菌多糖的具体步骤为：发酵产物过滤，得发酵液，发酵液浓缩至原体积的20%-30%，加入4-6倍体积的无水乙醇，搅拌均匀后在0-4℃下静置过夜，离心分离去上清液，沉淀冷冻干燥后即得桦褐孔菌多糖。

作为优选，从发酵产物中提取桦褐孔菌多糖的具体步骤为：

a、发酵产物过滤，得菌丝体和发酵液，发酵液浓缩至原体积的20%-30%，加入4-6倍体积的无水乙醇，搅拌均匀后在0-4℃下静置过夜，离心分离去上清液，沉淀冷冻干燥后得桦褐孔菌胞外多糖；

b、将菌丝体水洗后，菌丝体悬浮于蒸馏水（1g菌丝体20-30ml蒸馏水）中，超声破壁， 121±1℃加热1.5-2h，冷却后离心收集上清液，残渣悬浮于蒸馏水（1g残渣20-30ml蒸馏水）中，121±1℃加热3-4h，冷却后离心收集上清液，合并上清液，浓缩至原体积的20%-30%，加入4-6倍体积的95%-98%的乙醇，搅拌均匀后在0-4℃下静置过夜沉淀，所得沉淀依次用95%-98%的乙醇和丙酮洗涤后，冷冻干燥得桦褐孔菌胞内多糖；

c、将a步的桦褐孔菌胞外多糖和b步的桦褐孔菌胞内多糖混合均匀后即为桦褐孔菌多糖。

本发明自己制备的桦褐孔菌多糖，可以是从发酵液中提取的桦褐孔菌胞外多糖作为桦褐孔菌多糖使用，更为优选是从发酵液中提取的桦褐孔菌胞外多糖和从菌丝体中提取的桦褐孔菌胞内多糖的混合物作为桦褐孔菌多糖使用。桦褐孔菌胞外多糖和桦褐孔菌胞内多糖的混合物组成的桦褐孔菌多糖，其中的杂多糖含量更丰富，活性物质更全面均衡，提高鱼类的生长性能、免疫力和抗氧化能力的效果更显著。

作为优选，所述木质纤维素选自农作物秸秆、木屑、花生壳、甘蔗渣中的一种。

作为优选，所述斜面菌种培养基的配方为：麦芽浸膏40 g/100mL，蛋白胨4 g/100mL，琼脂10 g/100mL，pH值为5.4-5.6；斜面菌种培养基上培养的参数为：温度27-28℃，培养200-250小时。

作为优选，所述液体种子培养基的配方为：葡萄糖 5g/100mL，蛋白胨 0.5g/100mL，酵母浸膏 0.1g/100mL，KH₂PO₄ 0.1 g/100mL，MgSO₄ 0.15 g/100mL，CaCl₂ 0.01 g/100mL；液体菌种培养的参数为：温度27-28℃，培养3.5-4.5d，摇床转速80-140转/分钟。

作为优选，所述鱼类具体为大黄鱼、石斑鱼、大菱鲆或草鱼。

作为优选，包括桦褐孔菌多糖和鱼类饲料基础饲料，桦褐孔菌多糖用量为每千克鱼类饲料基础饲料中添加5-15g。

本发明的有益效果是：采用桦褐孔菌多糖加入鱼类饲料中，以代替抗生素药物和疫苗的使用，不会产生抗药性且使用成本低，能有效提高养殖鱼类的生长性能、免疫力和抗氧化能力，拓宽了桦褐孔菌多糖的应用范围，为鱼类饲料的开发提供了新途径，促进了鱼类养殖业的可持续发展。

 

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。

本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

鱼类基础饲料为现有技术，可以是市售，也可以是现有文献中公开的配方。

 

实施例1：

称取大黄鱼(Poseudosciaena crocea)基础饲料（配方见张春晓等，饲料中添加肽聚糖对大黄鱼生长和非特异性免疫力的影响，水产学报，2008，32（3））100kg，加入100g桦褐孔菌多糖（市售，浙江方格药业有限公司）或本发明自己制备的桦褐孔菌多糖，混合均匀后，然后加水揉匀，用SLX-80型双螺杆挤压机制成直径为2.5mm×8.0mm的颗粒状饲料，并在40℃烘干至饲料水分含量为10％左右。

本发明自己制备的桦褐孔菌多糖的制备方法如下：

（1）菌种活化：以桦褐孔菌（市售，购自徐州师范大学）为菌种，划线接种至斜面菌种培养基上27℃，培养250小时，获得活化菌种；斜面菌种培养基的配方为：麦芽浸膏40 g/100mL，蛋白胨4 g/100mL，琼脂10 g/100mL，pH值为5.4-5.6。

（2）液体菌种培养：将活化菌种转入液体种子培养基27℃，摇床上培养4.5d至对数期得液体菌种，摇床转速80转/分钟。液体种子培养基的配方为：葡萄糖 5g/100mL，蛋白胨 0.5g/100mL，酵母浸膏 0.1g/100mL，KH₂PO₄ 0.1 g/100mL，MgSO₄ 0.15 g/100mL，CaCl₂ 0.01 g/100mL。

（3）液体深层发酵：将液体菌种接入装有液体深层发酵培养基的发酵罐中发酵培养，液体菌种与液体深层发酵培养基的体积比为1:8，液体深层发酵的工艺参数为：发酵温度27℃，发酵罐空气流量0.5vvm，发酵罐内部压力0.1 kg/cm³，搅拌转速70转/分钟，发酵周期14天；所述液体深层发酵培养基的配方为：葡萄糖30g/L，玉米秸秆32g/L，蛋白胨 2g/L，KH₂PO₄ 1g/L，ZnSO₄ ·2H₂O 0.01g/L， K₂HPO₄  0.3g/L，FeSO₄ ·7H₂O  0.03 g/L， MgSO₄ ·7H₂O  0.3 g/L，CuSO₄ ·5H₂O  0.01 g/L，CoCl₂ 0.01 g/L，MnSO₄ ·H₂O 0.06 g/L，pH值6.0；发酵终点确立的标准为还原糖含量低于2%，镜检发现菌丝体开始衰老。

（4）桦褐孔菌多糖提取：发酵产物过滤，得发酵液，发酵液浓缩至原体积的20%，加入4倍体积的无水乙醇，搅拌均匀后在0℃下静置过夜，离心分离去上清液，沉淀冷冻干燥后即得桦褐孔菌多糖。

实验数据

以大黄鱼基础饲料为空白对照饲料，在每千克大黄鱼基础饲料中添加1g桦褐孔菌多糖作为试验组的饲料。

大黄鱼放于海水网箱中暂养，并以基础饲料饱食投喂，使之逐渐适应实验饲料。暂养2周后，选出体格健壮、规格一致(平均体质量150g的大黄鱼)进行分组实验，每组3个重复，每个重复25尾，每天投喂2次(05：00和l7：30)，达饱足。实验期间海水水温为23～27℃，盐度为29～33，溶解氧含量在7 mg/l 以上。养殖周期为8周。

饲养试验结束时，分别从每网箱随机抽取6尾试验鱼，以丁香酚麻醉，用无菌注射器从尾静脉取血，将其血液混合，置于灭菌的EP管中作为1个样品组。一部分抗凝全血处理后用于大黄鱼白细胞吞噬活力的分析；另一部分不加抗凝剂的全血置于4℃冰箱中静置4 h，待其凝血后于4℃离心，分离血清和血细胞，备用于后续免疫指标分析。结果见表1。

表1 桦褐孔菌多糖对大黄鱼血清抗菌活力和非特异性免疫活性的影响

指标	吞噬指数	抗菌活力（U/ml）	溶菌酶(U/ml)	超氧化物歧化酶(U/mg)
					对照组	1.17±0.05	0.46±0.03	0.43±0.05	407.2±53.4
试验组	1.67±0.05	0.62±0.05	0.91±0.07	482.8±59.8

注：两组差异显著（P<0.05）。

实施例2：

称取石斑鱼(Epinephelus drummondhayi)基础饲料（市售，广东越群海洋生物研究开发有限公司）100kg，加入2000g桦褐孔菌多糖（市售，浙江方格药业有限公司）或本发明自己制备的桦褐孔菌多糖，混合均匀后，然后加水揉匀，用SLX-80型双螺杆挤压机制成直径为2.5mm×8.0mm的颗粒状饲料，并在40℃烘干至饲料水分含量为10％左右。

本发明自己制备的桦褐孔菌多糖的制备方法如下：

（1）菌种活化：以桦褐孔菌为菌种，划线接种至斜面菌种培养基上28℃，培养200小时，获得活化菌种；斜面菌种培养基的配方为：麦芽浸膏40 g/100mL，蛋白胨4 g/100mL，琼脂10 g/100mL，pH值为5.4-5.6。

（2）液体菌种培养：将活化菌种转入液体种子培养基28℃，摇床上培养3.5d至对数期得液体菌种，摇床转速140转/分钟。液体种子培养基的配方为：葡萄糖 5g/100mL，蛋白胨 0.5g/100mL，酵母浸膏 0.1g/100mL，KH₂PO₄ 0.1 g/100mL，MgSO₄ 0.15 g/100mL，CaCl₂ 0.01 g/100mL。

（3）液体深层发酵：将液体菌种接入装有液体深层发酵培养基的发酵罐中发酵培养，液体菌种与液体深层发酵培养基的体积比为1: 10，液体深层发酵的工艺参数为：发酵温度28℃，发酵罐空气流量1.0vvm，发酵罐内部压力0.25 kg/cm³，搅拌转速150转/分钟，发酵周期12天；所述液体深层发酵培养基的配方为：葡萄糖32g/L，花生壳38g/L，蛋白胨 5g/L，KH₂PO₄ 2g/L，ZnSO₄ ·2H₂O 0.02g/L， K₂HPO₄  0.5g/L，FeSO₄ ·7H₂O  0.07 g/L， MgSO₄ ·7H₂O  0.6 g/L，CuSO₄ ·5H₂O  0.03 g/L，CoCl₂ 0.02 g/L，MnSO₄ ·H₂O 0.09 g/L，pH值6.5；发酵终点确立的标准为还原糖含量低于2%，镜检发现菌丝体开始衰老。

（4）桦褐孔菌多糖提取：发酵产物过滤，得发酵液，发酵液浓缩至原体积的30%，加入6倍体积的无水乙醇，搅拌均匀后在4℃下静置过夜，离心分离去上清液，沉淀冷冻干燥后即得桦褐孔菌多糖。

实验数据

以石斑鱼基础饲料为空白对照饲料，在每千克石斑鱼基础饲料中添加20g桦褐孔菌多糖作为试验组的饲料。

点带石斑鱼放于海水网箱中暂养，并以基础饲料饱食投喂，使之逐渐适应实验饲料。暂养2周后，选出体格健壮、规格一致(平均体重150g的石斑鱼)进行分组实验，每组3个重复，每个重复25尾。每天喂食2次(08：00，16：00)，日投饵量约占鱼体重的1%，并随鱼的生长和摄食情况适当调节。水温23-26℃，盐度28-32，溶解氧>6 mg/l，pH7.8-8.6，养殖周期为4周。

饲养试验结束时，分别从每网箱随机抽取6尾试验鱼，以丁香酚麻醉，用无菌注射器从尾静脉取血，将其血液混合，置于灭菌的EP管中作为1个样品组。一部分抗凝全血处理后用于石斑鱼白细胞吞噬活力的分析；另一部分不加抗凝剂的全血置于4℃冰箱中静置4 h，待其凝血后于4℃离心，分离血清和血细胞，备用于后续免疫指标分析。结果见表2。

表2 桦褐孔菌多糖对石斑鱼血清抗菌活力和非特异性免疫活性的影响

指标	吞噬指数	抗菌活力（U/ml）	溶菌酶(U/ml)	超氧化物歧化酶(U/ml)
					对照组	1.51±0.07	0.36±0.07	52.8±0.8	27.2±3.4
试验组	2.28±0.10	0.75±0.09	126.7±1.7	86.8±5.8

注：两组差异显著（P<0.05）。

 

实施例3：

称取大菱鲆（多宝鱼)基础饲料（市售，厦门福银生物饲料有限公司）100kg，加入1500g桦褐孔菌多糖（市售，浙江方格药业有限公司）或本发明自己制备的桦褐孔菌多糖，混合均匀后，然后加水揉匀，用SLX-80型双螺杆挤压机制成直径为2.5mm×8.0mm的颗粒状饲料，并在40℃烘干至饲料水分含量为10％左右。

本发明自己制备的桦褐孔菌多糖的制备方法如下：

（1）菌种活化：以桦褐孔菌为菌种，划线接种至斜面菌种培养基上28℃，培养220小时，获得活化菌种；斜面菌种培养基的配方为：麦芽浸膏40 g/100mL，蛋白胨4 g/100mL，琼脂10 g/100mL，pH值为5.4-5.6。

（2）液体菌种培养：将活化菌种转入液体种子培养基28℃，摇床上培养4d至对数期得液体菌种，摇床转速100转/分钟。液体种子培养基的配方为：葡萄糖 5g/100mL，蛋白胨 0.5g/100mL，酵母浸膏 0.1g/100mL，KH₂PO₄ 0.1 g/100mL，MgSO₄ 0.15 g/100mL，CaCl₂ 0.01 g/100mL。

（3）液体深层发酵：将液体菌种接入装有液体深层发酵培养基的发酵罐中发酵培养，液体菌种与液体深层发酵培养基的体积比为1:9，液体深层发酵的工艺参数为：发酵温度28℃，发酵罐空气流量0.8vvm，发酵罐内部压力0.2 kg/cm³，搅拌转速100转/分钟，发酵周期13天；所述液体深层发酵培养基的配方为：葡萄糖31g/L，甘蔗渣35g/L，蛋白胨 3g/L，KH₂PO₄ 1g/L，ZnSO₄ ·2H₂O 0.01g/L， K₂HPO₄  0.4g/L，FeSO₄ ·7H₂O  0.05 g/L， MgSO₄ ·7H₂O  0.5 g/L，CuSO₄ ·5H₂O  0.02 g/L，CoCl₂ 0.01 g/L，MnSO₄ ·H₂O 0.08 g/L，pH值6.0，发酵终点确立的标准为还原糖含量低于2%，镜检发现菌丝体开始衰老。

（4）桦褐孔菌多糖提取：

a、发酵产物过滤，得菌丝体和发酵液，发酵液浓缩至原体积的25%，加入4倍体积的无水乙醇，搅拌均匀后在4℃下静置过夜，离心分离去上清液，沉淀冷冻干燥后得桦褐孔菌胞外多糖；

b、将菌丝体水洗后，菌丝体悬浮于蒸馏水（1g菌丝体20ml蒸馏水）中，超声破壁（超声共5 min，超声5s，间隔3s）， 121±1℃加热1.5h，冷却后离心收集上清液，残渣悬浮于蒸馏水（1g残渣20ml蒸馏水）中，121±1℃加热3h，冷却后离心收集上清液，合并上清液，浓缩至原体积的20%，加入4倍体积的95%的乙醇，搅拌均匀后在4℃下静置过夜沉淀，所得沉淀依次用95%的乙醇和丙酮洗涤后，冷冻干燥得桦褐孔菌胞内多糖；

c、将a步的桦褐孔菌胞外多糖和b步的桦褐孔菌胞内多糖混合均匀后即为桦褐孔菌多糖。

实验数据

以大菱鲆基础饲料为空白对照饲料，在每千克大菱鲆基础饲料中添加15g桦褐孔菌多糖作为试验组的饲料。

大菱鲆幼鱼，暂养2周后，选出平均体重30g的大菱鲆进行分组实验，每组3个重复，每个重复25尾。每天投喂2次。水温19-20℃，采用循环水系统，24 h连续充氧，自然光照，pH7.5-7.8，盐度24-27，溶解氧含量≥7mg/l。养殖周期为4周。

饲养试验结束时，每组各取6尾试验鱼，以丁香酚麻醉，用无菌注射器从尾静脉取血，将其血液混合，置于灭菌的EP管中作为1个样品组。一部分抗凝全血处理后用于大菱鲆白细胞吞噬活力的分析；另一部分不加抗凝剂的全血置于4℃冰箱中静置4 h，待其凝血后于4℃离心，分离血清和血细胞，备用于后续免疫指标分析。结果见表2。

表2 桦褐孔菌多糖对大菱鲆血清抗菌活力和非特异性免疫活性的影响

指标	吞噬指数	溶菌酶(U/ml)	碱性磷酸酶(U/100ml)	超氧化物歧化酶(U/ml)
					对照组	1.01±0.03	12.8±0.8	63.2±5.3	127.2±8.2
试验组	2.06±0.10	36.7±2.5	118.8±10.7	216.8±10.8

注：两组差异显著（P<0.05）。

实施例4：

称取草鱼基础饲料（通威集团有限公司的“通威152浮性饲料）100kg，加入500g桦褐孔菌多糖（市售，浙江方格药业有限公司）或本发明自制桦褐孔菌多糖，混合均匀后，然后加水揉匀，用SLX-80型双螺杆挤压机制成直径为2.5mm×8.0mm的颗粒状饲料，并在40℃烘干至饲料水分含量为10％左右。

本发明自制桦褐孔菌多糖的制备方法如下：

本实施例步骤（1）-（3）同实施例3，不同之处在于步骤（4）桦褐孔菌多糖提取：

a、发酵产物过滤，得菌丝体和发酵液，发酵液浓缩至原体积的25%，加入4倍体积的无水乙醇，搅拌均匀后在4℃下静置过夜，离心分离去上清液，沉淀冷冻干燥后得桦褐孔菌胞外多糖；

b、将菌丝体水洗后，菌丝体悬浮于蒸馏水中（1g菌丝体30ml蒸馏水），超声破壁（超声共5 min，超声5s，间隔3s）， 121±1℃加热2h，冷却后离心收集上清液，残渣悬浮于蒸馏水中（1g残渣30ml蒸馏水），121±1℃加热4h，冷却后离心收集上清液，合并上清液，浓缩至原体积的30%，加入6倍体积的98%的乙醇，搅拌均匀后在0℃下静置过夜沉淀，所得沉淀依次用98%的乙醇和丙酮洗涤后，冷冻干燥得桦褐孔菌胞内多糖；

c、将a步的桦褐孔菌胞外多糖和b步的桦褐孔菌胞内多糖混合均匀后即为桦褐孔菌多糖。

实验数据

 以草鱼基础饲料为空白对照饲料，在每千克草鱼基础饲料中添加5g 桦褐孔菌多糖作为试验组的饲料。

试验用草鱼初始体重为51.3±6.8g，试验开始前用基础饲料驯养草鱼1周，以适应环境和试验饲料，然后随机分为3组，每组3个重复，每个重复25尾，分别投喂对照饲料（基础饲料）和试验饲料。每天按体重4%分2次(8：30，16：30)投喂，并根据水温、摄食情况调整。养殖期间水温为22～24℃，pH值为7.6±0.5，溶解氧为6.7～7.4 mg／L。养殖周期为4周。

饲养试验结束时，每个池随机取5尾鱼，尾静脉处采血，分离血清，测定免疫指标，结果见表4。

表4 桦褐孔菌多糖对草鱼血清抗菌活力和非特异性免疫酶活性的影响

指标	抗菌活力（U/ml）	溶菌酶(U/ml)	碱性磷酸酶(U /100ml)	超氧化物歧化酶(U/ml)
					对照组	0.15±0.03	0.35±0.02	6.27±1.12	81.29±3.34
试验组	0.38±0.04	0.72±0.03	9.58±1.95	132.82±9.81

注：两组差异显著（P<0.05）。

指标检测方法如下：

1、鱼类白细胞吞噬活性检测

在EP管中加入2ml51％Percoll细胞分离液(包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒混悬液GE Healthcare，17-5445-02)，轻轻滴入1ml含抗凝剂的血样，4℃、320 g离心30 min。然后吸取Percoll液面上的白细胞层，以HBSS缓冲液离心洗涤3次，并将所得白细胞以HBSS稀释至2×10⁷个/ml。然后使用台盼蓝检测活细胞数目的百分比，确保活细胞数在90％以上。取100??l浓度为1×10⁷个/ml白细胞悬液滴片，放入湿盒中，于25℃下静置20min，滴加100??l浓度约为1×10⁸个/ml的酵母细胞悬液(浓度约为白细胞浓度的10倍)，置于25℃湿盒中孵育。45min后取出玻片用灭菌生理盐水冲洗后自然风干，用甲醇固定5 min，待甲醇全部挥发后用Gimsa染液染色l5～20min，再用灭菌生理盐水反复冲洗，风干后置于光镜下观察，记录吞噬细胞率及吞噬指数。

吞噬细胞率=参与吞噬的细胞数／计数细胞总数×100％

吞噬指数=平均每个细胞吞噬的细菌数

2、鱼类血清抗菌活力测定

0.1mol/l磷酸钾盐缓冲液(pH6.4)制备大肠杆菌菌悬液，取3 ml该悬液(OD₅₇₀=0.3~0.5)于试管内冰浴，分别加入50??l草鱼抗凝血清混匀，测其在570 nm处的OD值(A₀)．然后将试液移入37℃温育30 min，取出后立刻放人冰箱(4℃)10 min，终止反应，测其在570 nm处的OD值(A)，重复测量10次。

抗菌活力按下式计算：U_a=√(A₀-A)/A

3、鱼类血清溶菌酶（LZM）活性的测定

溶菌酶是一种有效的抗菌剂，全称为 1，4-β-N-溶菌酶，又称作粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶或胞壁质酶。溶菌酶的杀菌机理是其作用于细菌细胞壁的粘肽层，粘肽是细菌的细胞壁主要成分。由于细菌细胞壁的重要功能之一是保护细菌，即抗低渗，故细菌失去细胞壁的保护作用后，在低渗环境中可发生溶解。溶菌酶的主要作用对象是革兰氏阳性菌。

测定原理：溶菌酶能使革兰氏阳性菌细胞壁溶解，尤其是对腐生菌，如溶壁微球菌最为敏感，故常以溶解溶壁微球菌为指标，对溶菌酶的活性值进行测定。

以溶壁微球菌冻干粉为底物，用0.1mol/L PH值为6.4的磷酸钾盐缓冲溶液配成底物悬液（OD570=0.3）。取3ml该悬液于试管内，置冰浴中，再加入50ul血清混匀，于570nm处测其初始光密度值A0值，然后将试液移入37℃水浴中保温30min，取出后立刻置于冰浴中10min终止反应，测其A值。溶菌酶活力（LZM）按下式计算：U=(A0-A)/A。

4、鱼类血清碱性磷酸酶（AKP）活性的测定

碱性磷酸酶是一种专一性较广的磷酸酯水解酶，可以催化所有的磷酸酶的水解反应和磷酸集团的转移反应，在生物体内具有非常重要的生理功能，它直接参与磷代谢，并与DNA，RNA蛋白质脂质等代谢有关。能催化磷酸单脂的水解和磷酸基团的转移反应，在生物体内具有重要的生理功能，且它是一种非特异性磷酸水解酶，能催化磷酸单脂的水解及磷酸基团的转移反应，对动物的生存具有重要的意义。

 测定原理：AKP分解磷酸苯二钠，产生游离酚和磷酸，酚在碱性溶液中与4-氨基安替吡啉作用经铁氰化钾氧化生成红色醌衍生物，根据红色深浅可以测定酶活力的高低。

本试验所采用碱性磷酸酶（AKP）测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所（名称：碱性磷酸酶（AKP）测试盒(50管/48样) 货号：A059），测定步骤按说明书进行。

5、鱼类血清超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定

超氧化物歧化酶（SOD）对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，其可以清除超氧阴离子自由基，保护细胞免受伤害。

测定原理：通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基，后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫红色，用可见光分光光度计测其吸光度。当被测样品中含SOD时，则对超氧阴离子自由基有专一性的抑制作用，使形成的亚硝酸盐减少，比色时测定管的吸光度值低于对照管的吸光度值，通过公式计算可求出被测样品中的SOD活力。

本试验所用超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所（名称：超氧化物歧化酶（SOD）测试盒（酶标法）(96T) 货号：A001-3），测定步骤按说明书进行。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

Claims (10)

1.一种桦褐孔菌多糖作为鱼类饲料添加剂的应用，其特征在于：桦褐孔菌多糖在鱼类基础饲料中的添加量为1-20g/kg鱼类基础饲料。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：桦褐孔菌多糖在鱼类基础饲料中的添加量为5-15g/kg鱼类基础饲料。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述桦褐孔菌多糖由以下工艺制备获得：

（1）菌种活化：以桦褐孔菌为菌种，接种至斜面菌种培养基上培养，获得活化菌种；

（2）液体菌种培养：将活化菌种转入液体种子培养基中，摇床培养至对数期得液体菌种；

（3）液体深层发酵：将液体菌种接入液体深层发酵培养基中发酵培养，液体菌种与液体深层发酵培养基的体积比为1:8-10，所述液体深层发酵培养基的配方为：葡萄糖30-32g/L，木质纤维素32-38g/L，蛋白胨 2-5g/L，KH₂PO₄ 1-2g/L，ZnSO₄ ·2H₂O 0.01-0.02g/L， K₂HPO₄  0.3-0.5g/L，FeSO₄ ·7H₂O  0.03-0.07g/L，MgSO₄ ·7H₂O  0.3-0.6 g/L，CuSO₄ ·5H₂O  0.01-0.03 g/L，CoCl₂ 0.01 -0.02g/L，MnSO₄ ·H₂O 0.06-0.09 g/L，pH值6.0-6.5；

液体深层发酵的工艺参数为：发酵温度27-28℃，发酵罐空气流量0.5-1.0vvm，发酵罐内部压力0.1-0.25 kg/cm³，搅拌转速70-150转/分钟，发酵周期12-14天；

（4）桦褐孔菌多糖提取：从发酵产物中提取桦褐孔菌多糖。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：从发酵产物中提取桦褐孔菌多糖的具体步骤为：发酵产物过滤，得发酵液，发酵液浓缩至原体积的20%-30%，加入4-6倍体积的无水乙醇，搅拌均匀后在0-4℃下静置过夜，离心分离去上清液，沉淀冷冻干燥后即得桦褐孔菌多糖。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：从发酵产物中提取桦褐孔菌多糖的具体步骤为：

a、发酵产物过滤，得菌丝体和发酵液，发酵液浓缩至原体积的20%-30%，加入4-6倍体积的无水乙醇，搅拌均匀后在0-4℃下静置过夜，离心分离去上清液，沉淀冷冻干燥后得桦褐孔菌胞外多糖；

b、将菌丝体水洗后，菌丝体悬浮于蒸馏水中，超声破壁， 121±1℃加热1.5-2h，冷却后离心收集上清液，残渣悬浮于蒸馏水中，121±1℃加热3-4h，冷却后离心收集上清液，合并上清液，浓缩至原体积的20%-30%，加入4-6倍体积的95%-98%的乙醇，搅拌均匀后在0-4℃下静置过夜沉淀，所得沉淀依次用95%-98%的乙醇和丙酮洗涤后，冷冻干燥得桦褐孔菌胞内多糖；

c、将a步的桦褐孔菌胞外多糖和b步的桦褐孔菌胞内多糖混合均匀后即为桦褐孔菌多糖。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述木质纤维素选自农作物秸秆、木屑、花生壳、甘蔗渣中的一种。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述斜面菌种培养基的配方为：麦芽浸膏40 g/100mL，蛋白胨4 g/100mL，琼脂10 g/100mL，pH值为5.4-5.6；斜面菌种培养基上培养的参数为：温度27-28℃，培养200-250小时。

8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述液体种子培养基的配方为：葡萄糖 5g/100mL，蛋白胨 0.5g/100mL，酵母浸膏 0.1g/100mL，KH₂PO₄ 0.1 g/100mL，MgSO₄ 0.15 g/100mL，CaCl₂ 0.01 g/100mL；液体菌种培养的参数为：温度27-28℃，培养3.5-4.5d，摇床转速80-140转/分钟。

9. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述鱼类具体为大黄鱼、石斑鱼、大菱鲆或草鱼。

10.一种添加有桦褐孔菌多糖的鱼类饲料，其特征在于：包括桦褐孔菌多糖和鱼类饲料基础饲料，桦褐孔菌多糖用量为每千克鱼类饲料基础饲料中添加5-15g。