CN107405403B - 用于治疗纤维化和腹膜炎的塞尼克韦罗 - Google Patents

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Abstract

本公开包括赛尼克韦罗或其盐或溶剂合物和含有它的药物组合物在治疗炎症和结缔组织疾病和病症诸如纤维化、腹膜炎和肝损伤中的用途。

Description

用于治疗纤维化和腹膜炎的塞尼克韦罗
相关申请
本申请要求2015年2月10日提交的美国申请号62/114,304的权益，所述申请的内容以引用方式整体并入本文。
技术领域
本公开涉及塞尼克韦罗(cenicriviroc)、其盐或溶剂合物、含有它们的药物组合物、用于制备这些组合物的方法以及它们在治疗炎症和结缔组织疾病和病症，尤其是纤维化、腹膜炎和肝损伤方面的用途。
背景技术
塞尼克韦罗(也称为CVC)是(S,E)-8-(4-(2-丁氧基乙氧基)苯基)-1-(2-甲基丙基)-N-(4-(((1-丙基-1H-咪唑-5-基)甲基)亚磺酰基)苯基)-1,2,3,4-四氢苯并[b]吖锌因-5-甲酰胺的常用名。甲磺酸塞尼克韦罗的化学结构显现在图1中。塞尼克韦罗结合至C-C趋化因子受体类型 2(CCR2)受体和C-C趋化因子受体类型5(CCR5)受体并抑制这些受体的活性(24)。这些受体不仅在病毒诸如人免疫缺陷病毒(HIV)进入细胞中起作用，而且对于免疫细胞到损伤位点的募集也是重要的。此受体的活性的抑制可以具有抗炎作用。最近，已检查炎症在纤维化发展中所起到的作用[30]。已显示C-C趋化因子受体类型2(CCR2)和 CCR5可以在促成肝纤维化方面起作用[3,4,5,31 32]。
发明内容
在一个实施方案中，本发明提供一种治疗有需要的受试者的纤维化或纤维化疾病或病状的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的塞尼克韦罗或其盐或溶剂合物。在另一个实施方案中，纤维化或纤维化疾病或病状是肝纤维化或肾纤维化。在另一个实施方案中，肝纤维化与非酒精性脂肪肝炎(NASH)相关联。在另一个实施方案中，肝纤维化与非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)相关联。在另一个实施方案中，肝纤维化与新兴肝硬化相关联。在另一个实施方案中，肝纤维化包括非硬化性肝纤维化。在另一个实施方案中，受试者被人免疫缺陷病毒 (HIV)感染。在另一个实施方案中，塞尼克韦罗或其盐或溶剂合物被配制为包含塞尼克韦罗或其盐或溶剂合物和富马酸的药物组合物。在另一个实施方案中，受试者患有选自由以下组成的组的疾病或病状：酒精性肝病、HIV和HCV共同感染、HCV感染、2型糖尿病(T2DM)、代谢综合征(MS)及其组合。
在一个实施方案中，本发明提供一种治疗有需要的受试者的 NASH的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的塞尼克韦罗、或其盐或溶剂合物；其中NASH或与NASH相关联的肝纤维化与2型糖尿病(T2DM)相关联。
在一个实施方案中，本发明提供一种治疗有需要的受试者的 NASH的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的塞尼克韦罗、或其盐或溶剂合物；其中NASH或与NASH相关联的肝纤维化与代谢综合征(MS)相关联。
在一个实施方案中，本发明提供一种治疗有需要的受试者的 NASH的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的塞尼克韦罗、或其盐或溶剂合物；其中肝纤维化与HIV和HCV共同感染相关联。
在一个实施方案中，本发明提供一种治疗有需要的受试者的 NASH的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的塞尼克韦罗、或其盐或溶剂合物；其中肝纤维化与HCV感染相关联。
在一个实施方案中，本发明提供一种治疗方法，其中塞尼克韦罗或其盐或溶剂合物被配制为口服组合物。
在一个实施方案中，本发明提供一种治疗方法，其中塞尼克韦罗或其盐或溶剂合物每天施用一次或每天施用两次。
在一个实施方案中，本发明提供一种治疗方法，其中塞尼克韦罗或其盐或溶剂合物与一种或多种另外的活性剂共同施用。在另一个实施方案中，所述一种或多种另外的活性剂是选自由以下组成的组的一种或多种抗逆转录病毒药剂：进入抑制剂、核苷逆转录酶抑制剂、核苷酸逆转录酶抑制剂、非核苷逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、整合酶链转移抑制剂、成熟抑制剂及其组合。在另一个实施方案中，所述一种或多种另外的抗逆转录病毒药剂选自由以下组成的组：拉米夫定、依法韦仑、雷特格韦、vivecon、贝韦立马、α干扰素、齐多呋定、阿巴卡韦、洛匹那韦、利托那韦、替诺福韦、替诺福韦地索普西 (tenofovirdisoproxil)、替诺福韦前药、恩曲他滨、埃替格韦、考比泰特、地瑞纳韦、阿扎那韦、利匹韦林、度鲁特韦及其组合。
在另一个实施方案中，所述一种或多种另外的活性剂是一种或多种免疫系统抑制剂。在另一个实施方案中，一种或多种另外的活性剂选自由以下组成的组：环孢霉素、他克莫司、泼尼松龙、氢化可的松、西罗莫司、依维莫司、咪唑硫嘌呤、霉酚酸、甲氨蝶呤、巴利昔单抗、达利珠单抗、利妥昔单抗、抗胸腺细胞球蛋白、抗淋巴细胞球蛋白及其组合。
在另一个实施方案中，一种或多种另外的活性剂是一种或多种抗纤维化药剂，包括但不限于诸如以下的药剂：N-乙酰基-L-半胱氨酸 (NAC)以及血管紧张肽转化酶(ACE)抑制剂、AT II拮抗剂、奥贝胆酸 (OCA)、GFT505、simtuzumab或其组合。
在一个实施方案中，本发明提供一种治疗方法，其包括检测针对纤维化或纤维化疾病或病状进行治疗的受试者中的一种或多种生物分子的水平，以及基于一种或多种生物分子的水平的增加或减少来确定治疗方案，其中所述生物分子选自由以下组成的组：脂多糖(LPS)、 LP-结合蛋白(LBP)、16S rDNA、sCD14、肠脂肪酸结合蛋白(I-FABP)、连蛋白-1、胶原蛋白1a1和3a1、TGF-β、纤连蛋白-1及其组合。
在一个实施方案中，本发明提供一种治疗方法，其包括检测针对纤维化或纤维化疾病或病状进行治疗的受试者中的一种或生物分子的水平，其中一种或多种生物分子的水平与预定标准水平相比的增加或减少预测对纤维化或纤维化疾病或病状的治疗功效，其中所述生物分子选自由以下组成的组：脂多糖(LPS)、LP-结合蛋白(LBP)、16S rDNA、sCD14、肠脂肪酸结合蛋白(I-FABP)、连蛋白-1、胶原蛋白1a1 和3a1、TGF-β、纤连蛋白-1及其组合。
在另一个实施方案中，一种或多种生物分子在来自针对纤维化或纤维化疾病或病状进行治疗的受试者的生物样本中测量。在另一个实施方案中，生物样本选择血液、皮肤、毛囊、唾液、口腔粘膜、阴道黏膜、汗液、泪液、上皮组织、尿液、精子、精液、精浆、前列腺液、射精前的分泌物(考珀液(Cowper's fluid))、排泄物、活检组织、腹水、脑脊髓液、淋巴、大脑以及组织提取物样本或活检样本。
在一个实施方案中，本发明提供一种治疗有需要的受试者的腹膜炎的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的塞尼克韦罗或其盐或溶剂合物。在一个实施方案中，本发明提供用以治疗有需要的受试者的腹膜炎的塞尼克韦罗或其盐或溶剂合物。在一个实施方案中，本发明提供治疗有效量的塞尼克韦罗或其盐或溶剂合物用于制造用以治疗有需要的受试者的腹膜炎的药物中的用途。在另一个实施方案中，腹膜炎是感染性的或非感染性的。在另一个实施方案中，腹膜炎与胃肠道穿孔相关联。在另一个实施方案中，腹膜炎与流体到腹膜中的渗漏相关联。在另一个实施方案中，腹膜炎与外来物相关联。
在一个实施方案中，本发明提供一种治疗有需要的受试者的感染性腹膜炎的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的塞尼克韦罗或其盐或溶剂合物。
在一个实施方案中，塞尼克韦罗或其盐或溶剂合物连同一种或多种另外的腹膜炎治疗和/或药剂一起施用。在另一个实施方案中，另外的活性剂是一种或多种抗生素。在另一个实施方案中，一种或多种另外的抗生素选自由以下组成的组：青霉素类、头孢菌素类、大环内酯类、氟喹诺酮类、磺胺类、四环素类以及氨基糖苷类或其组合。
在一个实施方案中，本发明提供一种治疗有需要的受试者的肝损伤的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的塞尼克韦罗或其盐或溶剂合物。在一个实施方案中，本发明提供用以治疗有需要的受试者的急性肝损伤的塞尼克韦罗或其盐或溶剂合物。在一个实施方案中，本发明提供治疗有效量的塞尼克韦罗或其盐或溶剂合物的共同施用用于制造用以治疗有需要的受试者的急性肝损伤的药物的用途。在一个实施方案中，肝损害是对乙酰氨基酚诱导的急性肝损伤。在一个实施方案中，肝损害是药物诱导的肝损伤。在一个实施方案中，肝损害是酒精诱导的肝损伤。在一个实施方案中，肝损害是化学剂诱导的肝损伤。在一个实施方案中，肝损害是毒素诱导的肝损伤。在一个实施方案中，塞尼克韦罗或其盐或溶剂合物连同一种或多种另外用于肝损害的治疗和/或药剂一起施用。在另一个实施方案中，所述一种或多种另外的活性剂是n-乙酰半胱氨酸(乙酰半胱氨酸；NAC)。在一个实施方案中，NAC静脉内施用。在另一个实施方案中，NAC口服施用。在一个实施方案中，一种或多种另外的药剂是糖皮质激素。在一个实施方案中，一种或多种另外的药剂是磷酸二酯酶抑制剂。
附图简述
图1是甲磺酸塞尼克韦罗的化学式。
图2是将作为口服溶液配制的甲磺酸塞尼克韦罗在比格犬中的绝对生物利用度与通过湿法制粒制备并与各种酸增溶剂赋形剂混合的甲磺酸塞尼克韦罗的绝对生物利用度相比较的图。
图3是当用干燥剂包装时经受在40℃和75％相对湿度下进行的加速稳定试验的不同塞尼克韦罗制剂的总杂质和降解物含量的图。
图4是不同塞尼克韦罗制剂的动态蒸气吸收等温线。
图5示出在三种预处理状态下来自不同制剂的塞尼克韦罗在比格犬中的吸收。
图6示出组合片剂中的塞尼克韦罗和拉米夫定的比格犬绝对生物利用度。
图7A-图7B示出在研究202中在24周时参与者的PBMC中的细胞内HIV DNA水平。散点图描绘了在由治疗组分开的基线与24 周之间细胞内HIV DNA水平的倍数变化。线和误差条分别表示平均值和标准误差测量值。使用在HIV/GAPDH多重qPCR反应中的ΔΔCT 计算倍数变化，其中每位患者的基线样本作为校准物。A)全长HIV DNA(晚期逆转录物)，B)强终止HIV DNA(早期逆转录物)
图8A-图8B是CVC和MVC对培养物流体中的R5-嗜性 (R5-tropic)病毒RNA和p24的影响。A)在感染后4h在对照或用CVC 或MVC处理的细胞的培养物流体中的病毒负荷水平。误差条表示标准偏差。表示两次独立的实验。B)在感染后4h在对照或用CVC或 MVC处理的细胞的培养物流体中的平均p24抗原水平。误差条表示标准偏差。表示两次独立的实验。
图9示出CVC和MVC对R5-嗜性细胞内HIV DNA水平的影响。在4h后CVC或MVC-处理的细胞的细胞内强终止DNA水平与无药物对照相比的平均倍数变化。误差条表示标准偏差。使用在 HIV/GAPDH多重qPCR反应中的ΔΔCT计算倍数变化，其中在4h 的无药物对照作为校准物。表示两次独立的实验。
图10A-图10B示出CVC到CCR5的多种结合模式。由在结合袋 (binding pocket)内结合至马拉维诺(Maraviroc)的CCR5晶体结构生成 CCR5的坐标(PDB ID:4MBS)。在CVC对接之后检查CVC结合位点。 CVC的对接姿势被显示为彩色细线。七跨膜(7TM)a-螺旋由螺旋表示并且根据氨基酸序列的顺序编号(1-7)。(A)从具有三个圆圈标记的潜在结合位点(位点1(白色)、位点2(黑色)和位点3(浅粉色))的受体的细胞外侧观察的顶视图。(B)在CCR5跨膜腔中的侧视图。细胞外环2 (ECL2)被标记。二级结构被表示为动画结构。所有图像均使用PyMOL 软件处理。
图11示出CCR5/马拉维诺与CCR5/赛尼克韦罗之间的配体结合口袋的比较。CCR5的顶视图展示了CVC(左，彩色细线)和MVC(右，黄色条)在配体结合口袋中的对接姿态。CCR5在分子表面表示中示出。参与gp120结合的关键性残基：Tyr37、Trp86、Trp94、Leu104、Tyr108、Phe109、Phe112、Thr177、Ile198、Trp248、Tyr251、Leu255 以及Glu283位于口袋深处并以红色着色。
图12示出在肾纤维化小鼠UUO模型中评价CVC的研究示意图。 BID施用的媒介物对照和CVC；每天两次QD BID施用的抗-TGF-β1 抗体(化合物1D11，阳性对照)；CVC，赛尼克韦罗；ip，腹膜内；PBS，磷酸盐缓冲盐水；QD，每天一次；TGF，转化生长因子；UUO，单侧输尿管梗阻
图13示出在肾纤维化小鼠UUO模型中每个治疗组中的体重变化 (第5天)。
图14示出在肾纤维化小鼠UUO模型中每个治疗组中的胶原容积分数(CVF；面积％)评分。所呈现的数据排除了来自CVC 20mg/kg/ 天组的动物的单个异常值，所述异常值的CVF值>2个标准偏差，这高于所述组中的任何其他动物。
图15A-图15B示出来自假手术的肾皮层组织的mRNA表达
图16示出在用赛尼克韦罗(低剂量或高剂量)治疗的动物中直到第9周体重的变化。
图17A-图17C示出在用赛尼克韦罗(低剂量或高剂量)治疗的动物中直到第9周肝重和体重的变化。图A示出体重的变化，图B示出肝重的变化，并且图C示出肝重与体重比率的变化。
图18A-图18F示出用赛尼克韦罗(低剂量或高剂量)治疗的动物在第9周时的全血和生物化学。图A示出全血葡萄糖，图B示出
血浆ALT，图C示出血浆MCP-1，图D示出血浆MIP-1β，图E 示出肝甘油三酯，并且图F示出肝羟基脯氨酸。
图19示出用赛尼克韦罗(低剂量或高剂量)治疗的动物在第9周时的HE染色的肝切片。
图20示出用赛尼克韦罗(低剂量或高剂量)治疗的动物在第9周时的NAFLD活动评分。
图21示出用赛尼克韦罗(低剂量或高剂量)治疗的动物在第9周时的天狼星红染色的肝切片的代表性显微照片。
图22示出用赛尼克韦罗(低剂量或高剂量)治疗的动物在第9周时的F4/80-免疫染色的肝切片的代表性显微照片。
图23示出用赛尼克韦罗(低剂量或高剂量)治疗的动物在第9周时的炎症面积百分比。
图24示出用赛尼克韦罗(低剂量或高剂量)治疗的动物在第9周时的F4/80和CD206双免疫染色的肝切片的代表性显微照片。
图25示出用赛尼克韦罗(低剂量或高剂量)治疗的动物在第9周时的F4/80阳性细胞中的F4/80和CD206双阳性细胞百分比。
图26示出用赛尼克韦罗(低剂量或高剂量)治疗的动物在第9周时的F4/80和CD16/32双免疫染色的肝切片的代表性显微照片。
图27示出用赛尼克韦罗(低剂量或高剂量)治疗的动物在第9周时的F4/80阳性细胞中的F4/80和CD16/32双阳性细胞百分比。
图28示出用赛尼克韦罗(低剂量或高剂量)治疗的动物在第9周时的M1/M2比率。
图29示出用赛尼克韦罗(低剂量或高剂量)治疗的动物在第9周时的油红染色的肝切片的代表性显微照片。
图30示出用赛尼克韦罗(低剂量或高剂量)治疗的动物在第9周时的脂肪沉积面积百分比。
图31示出用赛尼克韦罗(低剂量或高剂量)治疗的动物在第9周时在肝脏中的TUNEL-阳性细胞的代表性显微照片。
图32示出用赛尼克韦罗(低剂量或高剂量)治疗的动物在第9周时的TUNEL阳性细胞百分比。
图33A-图33D示出用赛尼克韦罗(低剂量或高剂量)治疗的动物在第9周时的定量RT-PCR。测量TNF-α、MCP-1、1型胶原蛋白以及TIMP-1的水平。
图34A-图34F示出用赛尼克韦罗(低剂量或高剂量)治疗的动物在第9周时的定量RT-PCR的原始数据。图A示出36B4的水平，图B 示出TNF-α的水平，图C示出TIMP-1的水平，图D示出1型胶原蛋白的水平，图E示出36B4的水平，并且图f示出MCP-1的水平。
图35示出用赛尼克韦罗(低剂量或高剂量)治疗的动物从6周至 18周的体重变化。
图36示出用赛尼克韦罗(低剂量或高剂量)治疗的动物从6周至 18周的存活曲线。
图37A-图37C示出用赛尼克韦罗(低剂量或高剂量)治疗的动物在第18周时的体重和肝重。图A示出体重，图B示出肝重，并且图 C示出肝重与体重的比率。
图38A-图38C示出用赛尼克韦罗(低剂量或高剂量)治疗的动物的肝脏在第18周时的肉眼可见外观。图A示出仅用媒介物治疗的动物的肝脏，图B示出用低剂量赛尼克韦罗治疗的动物的肝脏，并且图 C示出用高剂量赛尼克韦罗治疗的动物的肝脏。
图39示出用赛尼克韦罗(低剂量或高剂量)治疗的动物在第18周时的可见肿瘤结节的数目。
图40示出用赛尼克韦罗(低剂量或高剂量)治疗的动物在第18周时的可见肿瘤结节的最大直径。
图41示出用赛尼克韦罗(低剂量或高剂量)治疗的动物在第18周时的HE染色的肝切片的代表性显微照片。
图42示出用赛尼克韦罗(低剂量或高剂量)治疗的动物在第18周时的GS免疫染色的肝切片的代表性显微照片。
图43示出用赛尼克韦罗(低剂量或高剂量)治疗的动物在第18周时的CD31免疫染色的肝切片的代表性显微照片。
图44示出用赛尼克韦罗(低剂量或高剂量)治疗的动物在第18周时的CD31-阳性面积百分比。
图45示出群组和研究日(研究201)的HIV-1RNA水平与基线相比的中值变化。
图46具有HIV-1RNA<50个拷贝/mL的受试者随着多至第48周的时间的比例–快照算法–ITT–研究202。
图47示出sCD14水平(106pg/mL)随着多至第48周的时间与基线相比的LS平均变化–ITT。
图48示出在基线、第24周和第48周时根据APRI和FIB-4纤维化指数评分分组的CVC(合并数据)和EFV治疗的受试者。
图49示出与基线APRI相比的变化相对于于基线sCD14相比的变化的散布图-第48周(ITT)。
图50示出与基线FIB-4相比的变化相对于于基线sCD14相比的变化的散布图-第48周(ITT)。
图51示出肌酸磷酸激酶(CPK)随着多至第48周的时间与基线相比的平均变化–安全群体。
图52示出由严重度分级的CPK升高相对于cavg(ng/mL)的点密度展示–第48周。
图53示出由严重度分级的ALT升高相对于cavg(ng/mL)的点密度展示–第48周。
图54示出由严重度分级的AST升高相对于cavg(ng/mL)的点密度展示–第48周。
图55示出由严重度分级的胆红素升高相对于cavg(ng/mL)的点密度展示–第48周。
图56A-图56B示出空腹总胆固醇、计算的LDL胆固醇、HDL 胆固醇和甘油三酯(mg/dL)随着多至第48周的时间与基线相比的平均变化。
图57A、图57B和图57C示出硫乙醇酸盐(thiolycollate)诱导的腹膜炎模型小鼠在用CVC或地塞米松治疗之后的个体体重数据。图A 示出体重，图B示出腹膜炎细胞计数(cells/μL)，并且图C示出外周血细胞计数。
图58是示出在小鼠硫乙醇酸盐(thioglycollate)诱导的腹膜炎模型中CVC对巨噬细胞/单核细胞募集的影响的图；对于所有组N＝6，除了组2(其中N＝8)。
图59是示出在硫乙醇酸盐诱导的小鼠腹膜炎模型中CVC对总白细胞募集的影响的图；对于所有组N＝6，除了组2(其中N＝8)。
图60是示出在硫乙醇酸盐诱导的小鼠腹膜炎模型中CVC对总白细胞和巨噬细胞/单核细胞募集的影响的图；对于所有组N＝6，除了组2(其中N＝8)。
图61示出在硫乙醇酸盐诱导的小鼠腹膜炎模型中对于所有剂量组的CVC血浆水平的个别值。
图62A和图62B是显示如通过ALT(A)和组织学(B)测定的对乙酰氨基酚诱导的肝损伤在ccr2-/-小鼠中与WT小鼠相比显著减少的图。
图63A和图63B显示如通过ALT(图A)和组织学(图B)测定的对乙酰氨基酚诱导的肝损伤在CCR2-/-小鼠中与野生型小鼠相比显著降低。
具体实施方式
应当理解，为了方便起见，单数形式诸如“一个/种(a/an)”和“所述 (the)”在整个本申请中使用，然而，除了上下文或明确陈述另外指示的情况之外，单数形式旨在包括复述。另外，应理解，本文所提及的每篇杂志文章、专利、专利申请、公布等均以引用的方式以其整体并出于所有目的并入本文。所有的数值范围应理解为包括所述数值范围内的各个和每个数值点，并且应解释为单独地陈述各个和每个数值点。关于相同组分或特性的所有范围的端点均包括在内，并且旨在是可独立地组合的。
定义：
除了下文所讨论的术语之外，本申请中所使用的所有术语均旨在具有本领域技术人员在本发明的时间下将赋予它们的含义。
“约”包括具有基本上相同的作用或者提供基本上相同的结果的所有值，作为参考值。因此，由术语“约”所涵盖的范围将根据其中使用所述术语的上下文而变化，例如与参考值相关联的参数。因此，根据上下文，“约”可以意指例如±15％、±10％、±5％、±4％、±3％、±2％、±1％或者±小于1％。重要的是，前面带有术语“约”的参考值的所有叙述均旨在也是单独的参考值的叙述。尽管有前述内容，在本申请中术语“约”具有关于药代动力学参数的特殊含义，这些参数诸如曲线下面积(包括AUC、AUCt和AUC∞)Cmax、Tmax等。当相对于药代动力学参数的值使用时，术语“约”意指参考参数的80％至125％。
“赛尼克韦罗”是指化学化合物(S)-8-[4-(2-丁氧基乙氧基)苯基]-1- 异丁基-N-(4-{[(1-丙基-1H-咪唑-5-基)甲基]亚磺酰基}苯基)-1,2,3,4-四氢-1-苯并吖锌因-5-甲酰胺(以下所示结构)。赛尼克韦罗的物质构成的详情公开于美国专利申请公布号2012/0232028，所述专利申请公布以引用的方式以其整体、出于所有目的并入本文。相关制剂的详情公开于美国申请号61/823,766，所述申请以引用的方式以其整体、出于所有目的并入本文。
Figure GDA0002945251210000131
“本发明的化合物”或“本发明化合物”是指赛尼克韦罗或其盐或溶剂合物。
“基本上类似的”意指在很大程度上在组合物或制剂的特征 (identity)和量两方面类似参考组合物或制剂的组合物或制剂。
“药学上可接受的”是指可以用于医学或药学的材料或方法，包括用于兽医目的，例如施用于受试者。
“盐”和“药学上可接受的盐”包括酸加成盐和碱加成盐。“酸加成盐”是指保留游离碱的生物效力和特性的那些盐，它们并非生物学上或其他方面不希望并且是与无机酸和有机酸形成的。“碱加成盐”是指保留游离酸的生物效力和特性的那些盐，它们并非生物学上或其他方面不希望并且通过向游离酸中添加无机碱或有机碱来制备。药学上可接受的盐的实例包括但不限于碱性残基诸如胺的无机或有机酸加成盐；酸性残基的碱性或有机加成盐；等，或包括一种或多种前述盐的组合。药学上可接受的盐包括活性剂的盐和季铵盐。例如，酸盐包括衍生自无机酸诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等的那些盐；其他可接受的无机盐包括金属盐，诸如钠盐、钾盐、铯盐等；以及碱土金属盐，诸如钙盐、镁盐等，或者包括一种或多种前述盐的组合。药学上可接受的有机盐包括由有机酸制备的盐，这些有机酸诸如乙酸、丙酸、琥珀酸、乙二醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、双羟萘酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、磺胺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、甲烷磺酸、乙基二磺酸、草酸、羟基乙磺酸、HOOC-(CH2)n-COOH(其中n是0-4)等；有机胺盐，诸如三乙胺盐、吡啶盐、甲基吡啶盐、乙醇胺盐、三乙醇胺盐、二环己胺盐、 N,N’-二苯甲基乙二胺盐等；以及氨基酸盐，诸如精氨酸盐、天冬酰胺盐、谷氨酸盐等；或包括一种或多种前述盐的组合。
在一个实施方案中，赛尼克韦罗的酸加成盐是甲磺酸赛尼克韦罗，例如(S)-8-[4-(2-丁氧基乙氧基)苯基]-1-异丁基-N-(4-{[(1-丙基-1H- 咪唑-5-基)甲基]亚磺酰基}苯基)-1,2,3,4-四氢-1-苯并吖锌因-5-甲酰胺单甲磺酸酯。在一个实施方案中，甲磺酸赛尼克韦罗是结晶物质，诸如淡绿色-黄色结晶粉末。在一个实施方案中，甲磺酸赛尼克韦罗易溶于冰醋酸、甲醇、苯甲醇、二甲亚砜以及N,N-二甲基甲酰胺；可溶于吡啶和乙酸酐中；并且难溶于99.5％乙醇中；微溶于乙腈、1-辛醇和四氢呋喃中；并且几乎不溶于乙酸乙酯和乙醚中。在一个实施方案中，甲磺酸赛尼克韦罗易溶于pH 1至2的水溶液中；在pH 3下难溶并且从pH 4至13几乎不溶并且几乎不溶于水。
“溶剂合物”意指通过溶剂化(溶剂分子与本发明的活性剂的分子或离子的组合)形成的复合物，或由溶质离子或分子(本发明的活性剂) 与一个或多个溶剂分子组成的聚集体。在本发明中，优选的溶剂合物是水合物。
“药物组合物”是指本公开的化合物和本领域通常接受的用于将生物活性化合物递送至哺乳动物例如人的介质的制剂。此介质包括所有药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
“治疗”包括减轻、缓解并减少疾病或病状的情况或者疾病或病状的症状。
“施用”包括任何施用模式，诸如口服、皮下、舌下、经粘膜、肠胃外、静脉内、动脉内、经颊、舌下、局部、阴道、直肠、经眼、经耳、经鼻、经吸入以及经皮。“施用”还可以包括开出或配出包含特定化合物的剂型的处方。“施用”还可以包括提供执行涉及特定化合物或包含所述化合物的剂型的方法的指导。
“治疗有效量”意指活性物质当施用于受试者以用于治疗疾病、病症或其他不合乎需要的医学病状时足以对所述疾病、病症或病状具有有益效果的量。治疗有效量将根据活性物质的化学特征和制剂形式、疾病或病状及其严重性以及待治疗的患者的年龄、体重和其他相关特征而变化。确定给定活性物质的治疗有效量在本领域普通技术人员的技能范围内并且通常仅需常规实验。
纤维化：
纤维化是在修复或反应过程中在器官或组织中过量纤维结缔组织的形成。这可以是反应性的、良性的或病理的状态。器官和/或组织中结缔组织的沉积可以消除下层器官或组织的结构和功能。纤维化是纤维组织的过量沉积的这种病理状态以及愈合时结缔组织沉积的过程。
纤维化类似于瘢痕形成过程之处在于，两者均涉及敷设于结缔组织(包括胶原蛋白和葡糖氨基葡聚糖)的刺激细胞。介导许多免疫和炎性反应的细胞因子在纤维化的发展中起作用。由诸如脂肪累积、病毒试剂、过量酒精消耗、肝脏毒素等因素造成的肝细胞损害不可避免地引发炎性免疫反应。肝脏中细胞因子和趋化因子的产生增加导致促炎性单核细胞(前体细胞)募集，随后这些单核细胞成熟为促炎性巨噬细胞。促炎性巨噬细胞本质上是促纤维发生的并且最终使得主要负责细胞外基质(ECM)沉积的肝星形细胞(HSC)发生活化。
导致炎症的各种免疫细胞群的浸润是在急性和慢性肝损伤之后的主要致病特性。慢性肝脏炎症导致连续肝细胞损伤，这可导致纤维化、肝硬化、ESLD以及HCC。肝内免疫细胞之间的相互作用导致 Kupffer细胞和HSC的活化和迁移增加并且是发展肝纤维化的关键事件。另外，CCR2和CCR5在肝纤维化的发病机制中的作用的证据逐渐增加[1-7,9,31]。C-C趋化因子家族的这些成员由促纤维发生细胞表达，这些促纤维发生细胞包括促炎性单核细胞和巨噬细胞、Kupffer 细胞和HSC[1-4]。CCR2信号传导通过调节骨髓衍生的成纤维细胞来在肾纤维化的发病机制中起重要作用[8]。CCR2-和CCR5-阳性单核细胞以及CCR5-阳性T淋巴细胞被局部释放的MCP-1和RANTES吸引，并且可以促成肾脏中的慢性间质炎症[10,11]。在啮齿动物中， CVC在肝脏、肠系膜淋巴结和肠(也描述为肠-肝轴)中具有高分布。肠道微生物区系的破坏及其对肠-肝轴的下游作用二者均在代谢性病症中起重要作用，这些病症诸如肥胖症、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD) 和非酒精性脂肪肝炎(NASH)[16,23]。
表1列出了由肝细胞表达的趋化因子[30]。
表1
Figure GDA0002945251210000171
肝星形细胞(HSC)的活化在肝纤维化的发病机理中起重要作用。在肝损伤之后，肝星形细胞(HSC)变得活化并且表达基质金属蛋白酶 (MMP)及其特异性组织抑制剂(TIMP)的组合[32]。在肝损伤早期，HSC 瞬时表达MMP-3、MMP-13和尿纤溶酶原激活物(uPA)并且表现出基质降解表型。细胞外基质的降解似乎并不是CCR2或CCR5依赖性的。
活化的HSC可以通过诱导单形核和多形核白细胞的浸润来扩大炎性反应。浸润单核细胞和巨噬细胞经由多种机制参与纤维化的发展，这些机制包括细胞因子分泌增加和氧化应激相关产物的生成。活化HSC可以表达CCR2和CCR5并且产生趋化因子，包括MCP-1、MIP-1α、MIP-1β以及RANTES。CCR2促进HSC趋药性和肝纤维化的发展。在人肝病中，增加的MCP-1与巨噬细胞募集以及肝纤维化和原发性胆汁性肝硬化的严重性相关。CCR5刺激HSC迁移和增殖。
在肝损伤和HSC活化的晚期阶段，模式发生改变并且细胞表达 MMP的组合，这些MMP具有降解正常肝基质的能力，同时抑制肝纤维化中累积的纤维胶原蛋白类的降解。此模式的特征在于促 -MMP-2和膜类型1(MT1)-MMP表达的组合，其驱动活性MMP-2的细胞外周生成和正常肝基质的局部降解。另外，TIMP-1的表达显著增加，导致间质胶原酶(MMP-1/MMP-13)对纤维肝胶原蛋白的降解受到更全面的抑制。在与慢性酒精性肝病相关联的肝损伤中，TNF-α、 IL-1、IL-6以及趋化因子IL-8/CXCL8的产生有所增加。TNF-α也是非酒精性脂肪性肝病的重要介质。这些途径在肝纤维化的进展中起重要作用。抑制HSC的活化并加速活化的HSC的清除可以是用于分辨肝纤维化的有效策略。
趋化因子家族在炎症中起重要调节作用。此家族的成员包括但不限于CXC受体和配体，包括但不限于CXCR1、CXCR2、CXCR3、 CXCR4、CXCR5、CXCR6、CXCR7、CXCR8、CXCR9、CXCR10、 CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、 CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、 CXCL15、CXCL16以及CXCL17；CC趋化因子和受体，包括但不限于CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、 CCL10、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、 CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、 CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR以及CCR10；C趋化因子，包括但不限于XCL1、XCL2和XCR1；以及CX3C趋化因子，包括但不限于CS3CL1和CX3CR1。这些分子可能在纤维化器官或组织中上调。在其他实施方案中，这些分子可能在纤维化器官或组织中下调。在其他实施方案中，在这些趋化因子的信号传导途径中的分子可能在纤维化器官或组织中上调。在其他实施方案中，在这些趋化因子的信号传导途径中的分子可能在纤维化器官或组织中下调。
纤维化可出现于身体内的许多组织中，这些组织包括但不限于肺、肝、骨髓、关节、皮肤、消化道、淋巴结、血管或心脏，并且通常是炎症或损害的结果。非限制性实例包括肺纤维化、特发性肺纤维化、囊肿性纤维化、肝硬化、心肌内膜纤维化、心肌梗死、心房纤维化、纵隔纤维化、骨髓纤维化、腹膜后纤维化、进行性大块纤维化、肺尘病的并发症、肾源性系统性纤维化、克罗恩氏病(Crohn’s Disease)、瘢痕瘤(Keloid)、硬皮病/系统性硬化、关节纤维化、佩罗尼氏病(Peyronie’s disease)、杜普伊特伦氏挛缩(Dupuytren’s contracture)、与动脉粥样硬化相关的纤维化、淋巴结纤维化以及粘连性囊炎。
腹膜炎
腹膜炎(腹部炎症)可以是局部的或全身的，并且可能由感染(常常是由于腹部创伤或发炎阑尾中可能发生的中空腹部器官破裂)过程或非感染过程导致。腹膜炎的症状是炎症因子到位点的募集所导致的。
感染性腹膜炎的类型包括但不限于由胃肠道部分穿孔所导致的腹膜炎(例如，Boerhaave综合症、胃溃疡、胃癌、胃溃疡、阑尾炎、憩室炎、梅克尔憩室(Meckeldiverticulum)、炎性肠病(IBD)、肠梗塞形成、肠绞窄、结肠直肠癌、胎粪性腹膜炎)、或膀胱部分穿孔所导致的腹膜炎(胆囊炎、腹部创伤、尖锐异物的摄取、内窥镜或导管的穿孔以及吻合口漏)；腹膜的破坏，甚至在空腔脏器穿孔不存在下(例如，创伤、外科创伤、持续不卧床腹膜透析以及腹腔内化疗)；自发性细菌性腹膜炎(SBP)；或全身性感染(例如肺结核)。
非感染性腹膜炎的类型包括但不限于，由例如以下各项所导致的腹膜炎：无菌体液渗漏到腹腔，诸如血液(例如，子宫内膜异位、钝性腹部外伤)、胃液(例如，胃溃疡、胃癌)、胆汁(例如，肝活组织检查)、尿液(骨盆创伤)、溶剂(例如，输卵管炎)、胰液(胰腺炎)或破裂的皮样囊肿的内容物；无菌腹部手术(例如，导致局部或最小弥漫性腹膜炎的手术，所述手术可产生异物反应和/或纤维粘连或者在手术之后在腹部无意间留下的无菌异物)；家族性地中海热、TNF受体相关性周期性综合症、卟啉症以及全身性红斑狼疮。
急性肝损伤
许多化合物可以损害肝脏。已熟知的肝损害剂包括但不限于酒精、非甾体抗炎药(NSAID)、糖皮质激素、抗生素(例如，异烟肼、呋喃妥因、阿莫西林/克拉维酸)、肼衍生物药、工业毒素诸如砷、四氯化碳和氯乙稀、草药药物诸如阿开木果(Ackee)、八角莲(Bajiaolian)、樟脑、柯拜巴脂(Copaltra)、苏铁苷、藤黄、醉椒叶、双稠吡咯啶类生物碱、七叶树叶、缬草、紫草、维生素A、石蚕、灌木群落叶、伞形毒菌瘤、中药草药疗法、抗纤复方药物(例如金不换、麻黄、首乌片、白硝皮(Bai Xian Pi))、对乙酰氨基酚、他汀类、烟酸(NiacinTM)、胺碘酮(CordaroneTM)、甲氨蝶呤(RheumatrexTM、TrexallTM)、他克林(CognexTM)以及双硫仑(AntabuseTM)。
由于过量酒精消耗而导致的肝损伤是肝病的主要原因。据估计男性每天消耗60–80g(约75–100ml/天)持续20年或更多年或女性消耗 20g/天(约25ml/天)使肝炎和纤维化的风险显著增加7％至47％。
在对乙酰氨基酚中毒之后的肝损伤是急性肝衰竭(ALF)的主要原因之一。严重对乙酰氨基酚肝毒性频繁导致急性肝衰竭(ALF)。对肝的损害或肝毒性并非由对乙酰氨基酚本身导致，而是由其代谢物之一 N-乙酰基-对-苯并醌亚胺(NAPQI)(也称为N-乙酰基亚氨基醌)导致，所述代谢物消耗肝脏的天然抗氧化剂谷胱甘肽并直接损害肝脏中的细胞，从而导致肝衰竭。在对乙酰氨基酚中毒之后的肝损伤导致肝细胞坏死，接着活化驻留免疫细胞(例如，Kupffer细胞(KC)、肝细胞、肝窦内皮细胞以及肝星形细胞)，释放各种趋化因子(例如CCL2)且免疫细胞浸润(例如，单核细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞(NK)、NKT 细胞以及T细胞)。
参与急性肝损伤的趋化因子包括但不限于CCL2、CXCL9、 CXCL10、CXCL11、CXCL1、CXCL2、CXCL8以及CXCL12[1]。例如并且未受到理论约束，在损伤时，肝脏细胞诸如肝细胞和Kupffer 细胞分泌CCL2，其导致单核细胞和巨噬细胞浸润到肝脏中。另外， CCL2促进骨髓中的单核细胞造血作用，从而增加循环单核细胞/巨噬细胞集合。然后肝脏中的巨噬细胞分泌促炎性细胞因子诸如TNF-α和IFN-γ[1]。
治疗效用的实施方案：
本发明提供治疗纤维化的方法。当在肝损伤(TAA)发作时或(TAA； HFD)不久之后而非一旦形成肝硬化(TAA)时开始CVC治疗后，观察到CVC在动物研究中的抗纤维化作用。这表明CVC的抗纤维化作用可能在具有形成的肝纤维化且处于疾病进展的显著风险下的群体中更明显。这些包括：与2型糖尿病(T2DM)和代谢综合征(MS)相关的非酒精性肝性脂肪变性(NASH)；HIV和HCV共感染、或HCV感染。
NASH
本发明的组合物可用于治疗由常见肝病非酒精性脂肪性肝炎 (NASH)引起的肝纤维化，所述肝病影响了2％至5％的美国人。尽管由于NASH导致的肝损害具有酒精性肝病的一些特征，但是它也出现于几乎不饮用或不饮用酒精的人中。NASH中的主要特性是肝脏中的脂肪，以及炎症和肝细胞损害(气球样变性)。NASH可能是严重的并且可导致肝硬化，其中肝受到永久性损害且形成瘢痕并且不再能适当起作用。非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是一种与肥胖相关病症诸如2 型糖尿病和代谢综合征相关的常见的、往往“沉默”的肝病，发生在几乎不饮用或不饮用酒精的人中，并且其特征在于脂肪在肝脏中的累积而没有其他明显的原因。[32-43]在NAFLD谱开始时是简单的脂肪变性，其特征在于脂肪在肝脏内的累积。未伴随炎症的肝脂肪变性通常是良性的且是缓慢或非进行性的。NASH是NAFLD的更高级和严重的亚型，其中脂肪变性伴随肝细胞损伤和炎症，伴随或不伴随纤维化。
肥胖相关病症的患病率逐渐升高导致NASH的患病率快速增加。大约10％至20％患有NAFLD的受试者将进行至NASH[44]。
NAFLD是慢性肝病的最常见原因。[45]大部分美国研究报道了 10％至35％的NAFLD患病率；然而，这些患病率随着研究群体和诊断方法而改变。[46]由于大约三分之一美国人口被认为是肥胖的，美国人口中NAFLD的患病率可能是约30％。[46]一项研究已发现NAFLD影响了大约27％至34％的美国人，或者据估计8.6千万至1.08 亿患者。[44]NAFLD并非美国所特有的。来自世界其他国家以及地区(包括巴西、中国、印度、以色列、意大利、日本、韩国、斯里兰卡以及中国台湾地区)的报道表明患病率范围是6％至35％(平均值是20％)。[46]由澳大利亚/澳大利亚人肝脏协会胃肠道病学会 (GastroenterologicalSociety of Australia/Australian Liver Association)进行的研究发现NAFLD影响将近550万澳大利亚人，包括40％所有年龄≥50岁的成人。[47]澳大利亚严重肥胖患者的研究发现25％的这些患者患有NASH。[48]
需要进行肝活组织检查来做出NASH的明确诊断。在美国中年人研究中，组织学确认的NASH的患病率是12.2％。[49]目前估计 NASH患病率在美国是大约9百万或1.5千万(美国人口的3％至5％)，在英国和中国有类似患病率。[46,50]在肥胖人口中NASH的患病率范围是10％至56％(平均值33％)。[46]在加拿大的消瘦个体的尸体解剖系列中，脂肪性肝炎和纤维化的患病率分别是3％和7％。[46]NASH 的患病率在发展中地区也逐渐增加，这归因于这些地区的人们开始采用更静态的生活方式和西方化膳食[51]，所述西方化膳食由具有高脂肪和糖/果糖含量的加工食品组成。[52]
NASH是一种严重的慢性肝病，其由肝脂肪变性和炎症伴随肝细胞损伤的存在所限定，伴随或不伴随纤维化。[34]慢性肝炎是纤维化的前兆，其可进展成肝硬化、终末期肝病和肝细胞癌。除了胰岛素抗性之外，改变的脂质储存和代谢、胆固醇在肝脏内的累积、由肝损伤增加导致的氧化性应激以及继发于肠微生物区系破坏的细菌移位 [34,53-56](与含有高果糖的膳食相关)全部已作为促进NASH进展的重要辅助因子牵涉在内。[57-60]由于肥胖症和糖尿病的流行性逐渐升高，预测NASH变成晚期肝病的最常见原因和肝移植的最常见原因。 [46,61-63]NASH的负荷与任何批准的治疗干预的缺乏组合代表未满足的医疗需要。
在其他实施方案中，肝纤维化与新兴肝硬化相关联。在一些实施方案中，肝硬化与酒精损害相关。在其他实施方案中，肝硬化与肝炎感染相关联，所述肝炎感染包括但不限于乙型肝炎感染和丙型肝炎感染、原发性胆汁性肝硬化(PBC)、原发性硬化性胆管炎或脂肪性肝病。在一些实施方案中，本发明提供用于治疗处于发展肝纤维化或肝硬化的风险下的受试者的方法。
在另一个实施方案中，纤维化包括非硬化性肝纤维化。在另一个其他实施方案中，受试者被人免疫缺陷病毒(HIV)感染。在又一个实施方案中，受试者被肝炎病毒感染，包括但不限于HCV(丙型肝炎病毒)。在其他实施方案中，受试者患有糖尿病。在另一个实施方案中，受试者患有2型糖尿病。在另一个实施方案中，受试者患有1型糖尿病。在另一个实施方案中，受试者患有代谢综合征(MS)。在其他实施方案中，受试者患有这些疾病或病症中的一种或多种。在另一个实施方案中，受试者处于发展这些疾病中的一种或多种的风险下。在另一个实施方案中，受试者具有胰岛素抗性。在其他实施方案中，受试者具有增加的血糖浓度、高血压、高胆固醇水平、高甘油三酯水平，或者是肥胖的。在另一个实施方案中，受试者患有多囊卵巢综合症。
在一个实施方案中，本发明提供一种治疗方法，其中塞尼克韦罗或其盐或溶剂合物与一种或多种另外的活性剂共同施用。在另一个实施方案中，所述一种或多种另外的活性剂是选自以下各项的一种或多种抗逆转录病毒药剂：进入抑制剂、核苷逆转录酶抑制剂、核苷酸逆转录酶抑制剂、非核苷逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、整合酶链转移抑制剂、成熟抑制剂及其组合。在另一个实施方案中，所述一种或多种另外的抗逆转录病毒药剂选自由以下组成的组：拉米夫定、依法韦仑、雷特格韦、vivecon、贝韦立马、α干扰素、齐多呋定、阿巴卡韦、洛匹那韦、利托那韦、替诺福韦、替诺福韦地索普西、替诺福韦前药、恩曲他滨、埃替格韦、考比泰特、地瑞纳韦、阿扎那韦、利匹韦林、度鲁特韦及其组合。在另一个实施方案中，所述一种或多种另外的活性剂是一种或多种免疫系统抑制剂。在另一个实施方案中，一种或多种另外的活性剂选自由以下组成的组：环孢霉素、他克莫司、泼尼松龙、氢化可的松、西罗莫司、依维莫司、咪唑硫嘌呤、霉酚酸、甲氨蝶呤、巴利昔单抗、达利珠单抗、利妥昔单抗、抗胸腺细胞球蛋白、抗淋巴细胞球蛋白及其组合。
某些实施方案包括用于监测和/或预测如本文所述的本发明治疗的治疗功效的方法。此类方法包括检测针对纤维化或纤维化疾病或病状进行治疗的受试者(或者在来自受试者的生物样本)中的一种或多种生物分子例如像生物标志物的水平，其中一种或多种生物分子的水平与预定标准水平相比的增加或减小指示或预测本发明治疗的治疗功效。
在一个实施方案中，本发明提供一种治疗方法，其包括检测针对纤维化或纤维化疾病或病状进行治疗的受试者中的一种或多种生物分子的水平，以及基于一种或多种生物分子的水平的增加或降低来确定治疗方案，其中所述生物分子选自由以下组成的组：脂多糖(LPS)、 LPS-结合蛋白(LBP)、16S rDNA、sCD14、肠脂肪酸结合蛋白(I-FABP)、连蛋白-1、胶原蛋白1a1和3a1、TGF-β、纤连蛋白-1、hs-CRP、IL-1β、 IL-6、IL-33、纤维蛋白原、MCP-1、MIP-1α和MIP-1β、RANTES、 sCD163、TGF-β、TNF-α、肝细胞凋亡生物标志物诸如CK-18(半胱天冬酶裂解的和总和)、或者细菌移位生物标志物诸如LPS、LBP、sCD14 和I-FABP、或者其组合。
在一个实施方案中，本发明提供一种治疗方法，其包括检测针对纤维化或纤维化疾病或病症进行治疗的受试者中的一种或生物分子的水平，其中一种或多种生物分子的水平与预定标准水平相比的增加或减小预测了对纤维化或纤维化疾病或病状的治疗功效。
在另一个实施方案中，一种或多种生物分子在来自针对纤维化或纤维化疾病或病状进行治疗的受试者的生物样本中测量。在另一个实施方案中，生物样本选择血液、皮肤、毛囊、唾液、口腔粘膜、阴道黏膜、汗液、泪液、上皮组织、尿液、精子、精液、精浆、前列腺液、射精前的分泌物(考珀液)、排泄物、活检组织、腹水、脑脊髓液、淋巴、大脑以及组织提取液样本或活检样本。
在一些实施方案中，所述方法包括施用赛尼克韦罗来治疗腹膜炎。在另一个实施方案中，腹膜炎是感染性腹膜炎。在另一个其他实施方案中，感染性腹膜炎由以下原因引起：胃肠道部分穿孔(例如， Boerhaave综合症、胃溃疡、胃癌、胃溃疡、阑尾炎、憩室炎、梅克尔憩室、炎性肠病(IBD)、肠梗塞形成、肠绞窄、结肠直肠癌、胎粪性腹膜炎)、或膀胱部分穿孔(胆囊炎、腹部创伤、尖锐异物的摄取、内窥镜或导管的穿孔以及吻合口漏)；腹膜的破坏，甚至在空腔脏器穿孔不存在下(例如，创伤、外科创伤、持续不卧床腹膜透析以及腹腔内化疗)；自发性细菌性腹膜炎(SBP)；或全身性感染(例如肺结核)。在另一个实施方案中，腹膜炎是非感染性腹膜炎。在另一个其他实施例中，非感染性腹膜炎是由例如以下原因导致的腹膜炎：无菌体液渗漏到腹腔，诸如血液(例如，子宫内膜异位、钝性腹部外伤)、胃液(例如，胃溃疡、胃癌)、胆汁(例如，肝活组织检查)、尿液(骨盆创伤)、溶剂(例如，输卵管炎)、胰液(胰腺炎)或甚至破裂的皮样囊肿的内容物；无菌腹部手术(例如，导致局部或最小弥漫性腹膜炎的手术，所述手术可产生异物反应和/或纤维粘连或者在手术之后在腹部无意间留下的无菌异物)；家族性地中海热、TNF受体相关性周期性综合症、卟啉症以及全身性红斑狼疮。在另一个其他实施方案中，CVC与腹膜炎治疗或药剂结合施用，所述腹膜炎治疗或药剂包括但不限于抗生素、静脉内补液和电解质平衡校正和/或手术。
在一个实施方案中，所述方法包括施用赛尼克韦罗来治疗急性肝损伤。在一个实施方案中，肝损伤由对乙酰氨基酚、酒精、化学剂和 /或毒素诱导。在另一个实施方案中，肝损伤涉及CCR2和/或CCL2 表达。在另一个其他实施方案中，CCR2和/或CCL2表达受到抑制。在又一个其他实施方案中，CCR2和/或CCL2表达被CVC抑制。在另一个其他实施方案中，CVC与用于急性肝损伤的一种或多种治疗或药剂结合施用，所述治疗或药剂包括但不限于静脉内施用或口服施用n-乙酰半胱氨酸(乙酰半胱氨酸；NAC)、糖皮质激素、皮质类固醇、己酮可可碱、磷酸二酯酶抑制药、抗-TNFα、抗氧化剂或手术(包括肝脏移植)。
剂量和施用：
特定受试者的剂量可以根据受试者的年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用时间、施用途径、排泄率以及有待通过考虑这些因素和其他因素治疗的特定疾病状况的严重程度来确定。
本发明提供一种治疗方法，其中塞尼克韦罗或其盐或溶剂合物被配制为口服组合物。
本发明提供一种治疗方法，其中塞尼克韦罗或其盐或溶剂合物例如每天施用一次或每天施用两次。剂型可施用足以治疗纤维化疾病或病状的持续时间。
在口服施用的情况下，每日剂量范围是作为活性成分(即作为本发明的化合物)每位50kg体重的成人约5至1000mg，优选约10至 600mg，并且更优选约10至300mg，最优选约15至200mg，并且药品可以例如每天施用一次或者每天以2至3次分剂量施用。
赛尼克韦罗或其盐或溶剂合物可被配制成适用于口服或可注射施用的任何剂型。当口服施用化合物时，它可被配制成用于口服施用的固体剂型，例如片剂、胶囊、丸剂、颗粒剂等等。它也可被配制成用于口服施用的液体剂型，诸如口服溶液、口服悬浮液、糖浆剂等。如本文所用的术语“片剂”是指通过将化合物和适合的辅助材料均匀混合并压制成圆形或不规则锭剂来制备的那些固体制备物，主要呈用于口服施用的常见片剂，也包括口含片剂、舌下片剂、口颊圆片、咀嚼片剂、分散片剂、可溶性片剂、泡腾片剂、缓释片剂、控释片剂、肠溶片剂等等。如本文所用的术语“胶囊”是指通过将化合物或者化合物与适合的辅助材料一起填充到中空胶囊中或密封到软胶囊材料中来制备的那些固体制备物。根据溶解度和释放特性，胶囊可以被分为硬胶囊(常规胶囊)、软胶囊(软壳胶囊)、缓释胶囊、控释胶囊、肠溶包衣胶囊等。如本文所用的术语“丸剂”是指通过经由适合的方法将化合物和适合的辅助材料混合来制备的球形或近球形固体制备物，包括滴丸、糖锭剂、小丸剂等。如本文所用的术语“颗粒”是指通过将化合物与适合的辅助材料混合制备并具有某一颗粒尺寸的干颗粒状制备物。颗粒剂可分成可溶性颗粒(通常称为颗粒)、悬浮剂颗粒、泡腾颗粒、肠溶包衣颗粒、缓释颗粒、控释颗粒等。如本文所用的术语“口服溶液”是指通过将化合物溶解在适合的溶剂中以用于口服施用来制备的沉降液体制备物。如本文所用的术语“口服悬浮液”是指通过将不溶性化合物分散在液体媒介物中来制备的用于口服施用的悬浮液，也包括干悬浮液或浓悬浮液。如本文所用的术语“糖浆剂”是指含有这些化合物的浓蔗糖水溶液。可注射剂型可通过制剂领域中的常规方法产生，并且可以选择水性溶剂或非水性溶剂。最常用的水性溶剂是注射用水，以及0.9％氯化钠溶液或其他适合的水性溶液。常用非水性溶剂是植物油，主要是注射用大豆油，以及醇类、丙二醇、聚乙二醇等等的其他水性溶液。
在一个实施方案中，提供一种包含赛尼克韦罗或其盐和富马酸的药物组合物。在某些实施方案中，赛尼克韦罗或其盐是甲磺酸赛尼克韦罗。
在其他实施方案中，赛尼克韦罗或其盐与富马酸的重量比是约 7:10至约10:7，诸如约8:10至约10:8、约9:10至约10:9或约95:100 至约100:95。在其他另外的实施方案中，富马酸的存在量是按组合物的重量计的约15％至约40％，诸如约20％至约30％或约25％。在其他另外的实施方案中，赛尼克韦罗或其盐的存在量是按组合物的重量计的约15％至约40％，诸如约20％至约30％或约25％。
在其他另外的实施方案中，赛尼克韦罗或其盐和富马酸的组合物还包含一种或多种填充剂。在更特定的实施方案中，一种或多种填充剂选自微晶纤维素、磷酸氢钙、纤维素、乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、淀粉以及碳酸钙。例如，在某些实施方案中，一种或多种填充剂是微晶纤维素。在具体实施方案中，一种或多种填充剂与赛尼克韦罗或其盐的重量比是约25:10至约10:8，诸如约20:10至约10:10或约 15:10。在其他具体实施方案中，一种或多种填充剂的存在量是按组合物的重量计的约25％至约55％，诸如约30％至约50％或约40％。在其他另外的实施方案中，组合物还包含一种或多种崩解剂。在更特定的实施方案中，一种或多种崩解剂选自交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠和羟基乙酸淀粉钠。例如，在某些实施方案中，一种或多种崩解剂是交联羧甲基纤维素钠。在具体实施方案中，一种或多种崩解剂与赛尼克韦罗或其盐的重量比是约10:10至约30:100，诸如约15:100。在其他具体实施方案中，一种或多种崩解剂的存在量是按组合物的重量计的约2％至约10％，诸如约4％至约8％或约6％。在其他另外的实施方案中，组合物还包含一种或多种润滑剂。在更特定的实施方案中，一种或多种润滑剂选自滑石、二氧化硅、硬脂精、硬脂酸镁以及硬脂酸。例如，在某些实施方案中，一种或多种润滑剂是硬脂酸镁。在具体实施方案中，一种或多种润滑剂的存在量是按组合物的重量计的约0.25％至约5％，诸如约0.75％至约3％或约1.25％。
在其他另外的实施方案中，赛尼克韦罗或其盐和富马酸的组合物基本上类似于表2的组合物。在其他另外的实施方案中，赛尼克韦罗或其盐和富马酸的组合物基本上类似于表3和表4的组合物。在其他另外的实施方案中，赛尼克韦罗或其盐和富马酸的组合物通过涉及干法制粒的方法生产。在其他另外的实施方案中，赛尼克韦罗或其盐和富马酸的任何组合物当用干燥剂包装时在暴露于约40℃约75％相对湿度下六周之后，具有的含水量不超过约4重量％，诸如不超过2重量％。在其他另外的实施方案中，任何以上提及的组合物当用干燥剂包装时在暴露于40℃75％相对湿度下12周之后，具有的总杂质水平不超过约2.5％，诸如不超过1.5％。在其他另外的实施方案中，任何以上提及的组合物的赛尼克韦罗或其盐在口服施用之后具有的平均绝对生物利用度基本上类似于溶液中的赛尼克韦罗或其盐在口服施用之后的生物利用度。在其他实施方案中，赛尼克韦罗或其盐在比格犬中具有的绝对生物利用度是约10％至约50％，诸如约27％。
在另一个实施方案中，提供一种包含赛尼克韦罗或其盐和富马酸的组合物的药物制剂。在其他实施方案中，制剂中的组合物可以呈颗粒的形式。在其他另外的实施方案中，制剂中的组合物设置于胶囊壳中。在其他另外的实施方案中，制剂的组合物设置于药囊中。在其他另外的实施方案中，制剂的组合物是片剂或片剂的组分。还在其他另外的实施方案中，制剂的组合物是多层片剂的一个或多个层。在其他另外的实施方案中，制剂包含一种或多种另外的无药物活性成分。在其他另外的实施方案中，制剂基本上类似于表9的制剂。在其他另外的实施方案中，提供具有基本上类似于表9组合物的组合物的片剂。在其他另外的实施方案中，任何以上实施方案是包衣的基材。在另一个实施方案中，提供用于制备任何以上提及的实施方案的方法。在其他实施方案中，所述方法包括将赛尼克韦罗或其盐和富马酸掺混以形成掺混物并将所述掺混物进行干法制粒。在其他另外的实施方案中，所述方法还包括将一种或多种填充剂与赛尼克韦罗或其盐和富马酸掺混以形成所述掺混物。在其他另外的实施方案中，所述方法还包括将一种或多种崩解剂与赛尼克韦罗或其盐和富马酸掺混以形成所述掺混物。在其他另外的实施方案中，所述方法还包括将一种或多种润滑剂与赛尼克韦罗或其盐和富马酸掺混以形成所述掺混物。在其他另外的实施方案中，所述方法还包括将干法制粒的掺混物压制成片剂。在其他另外的实施方案中，所述方法包括用干法制粒的掺混物填充胶囊。
另外，本发明的化合物可包含在内或者与输血用血液或血液衍生物组合使用。在一个实施方案中，本发明的化合物可包含在内或者与清除潜在HIV储库(latent HIVreservoir)的一种或多种药剂组合使用，并添加到输血用血液或血液衍生物中。通常，输血用血液或血液衍生物通过将从多个人中获得的血液混合来产生，并且在一些情况下未感染细胞被感染有HIV病毒的细胞污染。在此情况下，未感染细胞可能被HIV病毒感染。当本发明的化合物连同清除潜在HIV储库的一种或多种药剂添加到输血用血液或血液衍生物中时，可以预防或控制病毒的感染和增殖。尤其，当保存血液衍生物时，通过添加本发明的化合物来有效预防或控制病毒的感染和增殖。另外，当向个人施用被 HIV病毒污染的输血用血液或血液衍生物时，可以通过将本发明的化合物连同清除潜在HIV储库的一种或多种药剂组合添加到血液或血液衍生物中来预防病毒在个人身体内的感染和增殖。通常，例如，通过口服施用预防在使用血液或血液衍生物时的HIV感染疾病，剂量范围是作为CCR5/CCR2拮抗剂每位约60kg体重的成人约0.02至50 mg/kg，优选约0.05至30mg/kg，并且更优选约0.1至10mg/kg，并且药物每天施用一次或2至3次剂量。当然，尽管剂量范围可基于分开每日剂量所必需的单位剂量来控制，如以上所述的，特定受试者的剂量可以根据受试者的年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用时间、施用途径、排泄率以及有待通过考虑这些因素和其他因素治疗的特定疾病状况的严重程度来确定。在此情况下，施用途径也适当选择，并且本发明用于预防HIV感染疾病的药物可以在输血或使用血液衍生物之前直接添加到输血用血液或血液衍生物中。在此情况下，理想的是，在输血或使用血液衍生物之前24小时，优选12小时，更优选6小时，就将本发明的药物与血液或血液衍生物混合。
除输血用血液或血液衍生物以外，当本发明的组合物连同输血用血液或血液衍生物和/或其他活性剂一起施用时，药物优选在输血或使用血液衍生物同时或在此之前1小时施用。更优选，例如，所述药物每天施用一至3次并且施用持续4周。
组合疗法：
本发明的化合物可单独使用或者与一种或多种另外的活性剂组合使用。一种或多种另外的活性剂可以是可对有需要的受试者发挥治疗作用的任何化合物、分子或物质。一种或多种另外的活性剂可以“共同施用”，即以协作方式一起施用于受试者，无论是作为单独的药物组合物还是以单一药物组合物掺混。关于“共同施用”，一种或多种另外的活性剂也与本发明化合物同时施用，或者与本发明化合物依次施用，包括在不同时间且以不同频率。一种或多种另外的活性剂可通过任何已知途径施用，诸如口服、静脉内、肌肉内、鼻内、皮下、阴道内、直肠内等；并且治疗剂也可通过任何常规途径施用。在许多实施方案中，一种或多种另外的活性剂中的至少一种和任选的两种可以口服施用。
这些一种或多种另外的活性剂包括但不限于一种或多种抗纤维化剂、抗逆转录病毒剂、免疫系统抑制剂、CCR2和/或CCR5抑制剂或治疗、n-乙酰半胱氨酸(乙酰半胱氨酸；NAC)、糖皮质激素、皮质类固醇、己酮可可碱、磷酸二酯酶抑制药、抗-TNFα剂、抗氧化剂以及抗生素。当两种或更多种药剂组合使用时，每种药剂的剂量通常与独立使用时的药剂剂量相同，但是当药剂干扰其他药剂代谢时，适当调整每种药剂的剂量。每种药剂可以同时施用或以一定时间间隔分开施用，所述时间间隔例如小于12小时、24小时和36小时。如本文所述的剂型诸如胶囊可以适当间隔施用。例如，每天一次、每天两次、每天三次等。具体地，剂型例如每天施用一次或两次。甚至更具体地，剂型每天施用一次。在一个实施方案中，所述一种或多种抗逆转录病毒剂包括但不限于进入抑制剂、核苷逆转录酶抑制剂、核苷酸逆转录酶抑制剂、非核苷逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、整合酶抑制剂、成熟抑制剂及其组合。在一个实施方案中，所述一种或多种另外的抗逆转录病毒药剂包括但不限于拉米夫定、依法韦仑、雷特格韦、 vivecon、贝韦立马、α干扰素、齐多呋定、阿巴卡韦、洛匹那韦、利托那韦、替诺福韦、替诺福韦地索普西、替诺福韦前药、恩曲他滨、埃替格韦、考比泰特、地瑞纳韦、阿扎那韦、利匹韦林、度鲁特韦及其组合。
在一个实施方案中，一种或多种免疫系统抑制剂包括但不限于环孢霉素、他克莫司、泼尼松龙、氢化可的松、西罗莫司、依维莫司、咪唑硫嘌呤、霉酚酸、甲氨蝶呤、巴利昔单抗、达利珠单抗、利妥昔单抗、抗胸腺细胞球蛋白、抗淋巴细胞球蛋白及其组合。
在一个实施方案中，一种或多种抗生素包括但不限于青霉素类 (例如青霉素和阿莫西林)；头孢菌素类(例如头孢氨苄)；大环内酯类(例如，红霉素、克拉霉素和阿奇霉素)；氟喹诺酮类(例如氧氟沙星、左氧氟沙星和氧氟沙星)；磺胺类(例如复方新诺明和甲氧苄啶)；四环素类(例如四环素和多西环素)；氨基糖苷类(例如庆大霉素和妥布霉素)。
在一个实施方案中，一种或多种糖皮质激素包括但不限于去炎松、全身性甲泼尼龙、倍他米松、布地奈德、脱氢皮质醇、强的松、氢化可的松、地塞米松和/或可的松。
在一个实施方案中，一种或多种抗-TNFα剂包括但不限于英利昔单抗、依那西普、阿达木单抗、赛妥珠单抗和/或戈利木单抗。
在一个实施方案中，一种或多种磷酸二酯酶抑制剂包括但不限于西地那非、他达那非和/或伐地那非。
以下实施例进一步详细说明了本发明，但不应解释为限制本发明的范围。
实施例
实施例1–甲磺酸赛尼克韦罗组合物
通过在Key 1L盘式制粒机中进行湿法制粒，接着进行盘式干燥、筛选、混合并在Carver压片机上压制成片剂来制备除了酸增溶剂的身份之外均相同的一系列甲磺酸赛尼克韦罗组合物。这些制剂的组成示出在表2中。
表2
Figure GDA0002945251210000331
将片剂施用给比格犬。还施用口服溶液作为对照。测定这些制剂和口服溶液的绝对生物利用度，并且它们示出在图2中。结果显示具有富马酸的甲磺酸赛尼克韦罗具有比任何其他测试的增溶剂显著更高的生物利用度。
实施例2：甲磺酸赛尼克韦罗组合物
将甲磺酸赛尼克韦罗、富马酸、微晶纤维素、交联羧甲基纤维素钠以及硬脂酸镁掺混，干法制粒，研磨，与颗粒外微晶纤维素、交联羧甲基纤维素钠和硬脂酸镁共混，并压制成具有大于10kP的硬度和小于0.8％w/w的易碎性的片剂。所得片剂具有表3所示的组成。
表3
Figure GDA0002945251210000341
a.相当于150mg赛尼克韦罗游离碱。
b.以粉末共混物的颗粒外部分添加。
通过说明，实施例2b(即实施例2b(Ex.2b))中组分的浓度百分比和每个片剂质量给出在表4中。
表4
组分 浓度(％w/w) 每个片剂的质量(mg)
甲磺酸赛尼克韦罗 26.26 170.69<sup>a</sup>
富马酸 24.62 160.00
微晶纤维素 41.87 272.18
交联羧甲基纤维素钠 6.00 39.00
硬脂酸镁 1.25 8.13
总计 100.0 650.0
a相当于150mg赛尼克韦罗游离碱
实施例3：甲磺酸赛尼克韦罗组合物
将甲磺酸赛尼克韦罗、微晶纤维素、交联羧甲基纤维素钠以及硬脂酸镁掺混，进行干法制粒，干燥，研磨，与颗粒外微晶纤维素、交联羧甲基纤维素钠、富马酸、胶体二氧化硅和硬脂酸镁共混，并压制成具有大于10kP的硬度和小于0.8％w/w的易碎性的片剂。所得片剂具有表5所示的组成。
表5
组分 浓度(％w/w) 每个片剂的质量(mg)
甲磺酸赛尼克韦罗 26.26 28.45<sup>a</sup>
富马酸 24.62 26.67
微晶纤维素 41.87 45.36
交联羧甲基纤维素钠 6.00 39.00
硬脂酸镁 1.25 1.35
总计 100.0 108.3
a相当于25mg赛尼克韦罗游离碱
值得注意的是，表5的制剂具有与表3b相同的组分比率，并且不同之处仅在于对于每个片剂所用的组分的总量。因此，表4显示具有150mg赛尼克韦罗(基于游离碱)的片剂，而表CC-1显示具有25mg 赛尼克韦罗(基于游离碱)的片剂，其具有与表4所示的实施例2b的150mg片剂相同的组分比率。
实施例4—参考
表6的基于柠檬酸的制剂制备如下。将赛尼克韦罗、羟丙基纤维素、甘露醇和交联羧甲基纤维素钠掺混，进行湿法制粒，干燥，研磨，并与微晶纤维素、交联羧甲基纤维素钠、柠檬酸、胶体二氧化硅、滑石以及硬脂酸镁共混。将所得共混物压制成具有大于10kP的硬度和小于0.8％w/w的易碎性的片剂。用羟丙基甲基纤维素、聚乙二醇 8000、二氧化钛以及黄色氧化铁对片剂包衣。因此产生的包衣片剂与美国专利申请公布号2008/031942中公开的那些基本上相同(参见，例如，表3)。
表6
组分 mg/片剂 ％w/w
甲磺酸赛尼克韦罗 28.91 4.68
甘露醇 341.09 56.85
微晶纤维素 80.00 12.94
胶体二氧化硅 12.00 2.00
无水柠檬酸 75.00 12.14
羟丙基纤维素 12.00 1.94
交联羧甲基纤维素钠 30.00 4.85
滑石 12.00 1.94
硬脂酸镁 9.00 1.46
羟丙基甲基纤维素 11.71 1.89
聚乙二醇8000 2.69 0.44
二氧化钛 3.03 0.49
黄色氧化铁 0.57 0.09
实施例5—参考
将赛尼克韦罗和醋酸琥珀羟丙甲纤维素溶解在甲醇中并喷雾干燥成含有25重量％的赛尼克韦罗(基于赛尼克韦罗游离碱的重量)的细粉末。将所述粉末与胶体二氧化硅、微晶纤维素、甘露醇、月桂酸硫酸钠、交联羧甲基纤维素以及硬脂酸镁掺混。将掺混物压制成具有大于10kP的硬度和小于0.8％w/w的易碎性的片剂。这些片剂的最终组成示出在表7中。
表7
Figure GDA0002945251210000361
Figure GDA0002945251210000371
实施例6：CVC制剂的生物利用度
将实施例3的片剂在比格犬中的绝对生物利用度与实施例4和5 的片剂的绝对生物利用度相比较，并且与甲磺酸赛尼克韦罗的口服溶液和含有甲磺酸赛尼克韦罗粉末的明胶胶囊二者相比较。结果示出在表8中。
表8
组分 绝对生物利用度(％)
口服溶液 25.8
胶囊中的粉末 6.4
实施例3 26.6
实施例4 21.1
实施例5 12.4
此实施例证明赛尼克韦罗在具有富马酸的干法制粒片剂(实施例 3)中的生物利用度基本上类似于口服溶液的生物利用度，并且显著高于赛尼克韦罗在具有富马酸(实施例1b)或柠檬酸(实施例4)的湿法制粒片剂中的生物利用度，并且超过赛尼克韦罗在其中无定形赛尼克韦罗在具有HPMC-AS的喷雾干燥分散剂(实施例5)中的片剂中的生物利用度两倍。这些结果令人惊讶的是，因为没有理由怀疑结晶API 的干法制粒提供了相对于湿法制粒和无定形喷雾干燥分散剂的生物利用度的显著增加。这尤其如此，因为无定形喷雾干燥分散剂频繁用于增加水难溶性药物的生物利用度。这些结果还令人惊讶的是因为富马酸具有比柠檬酸更慢的溶出时间并且以相对于CVC API更低的酸质量比率使用(柠檬酸:API的3:1相对于1.06:1富马酸:API)。因此，令人惊讶的是，对于CVC而言，富马酸已证明是比柠檬酸更有效的增溶剂。
实施例7：CVC制剂的加速稳定性
经由暴露于在40℃下的75％相对湿度的环境中，将实施例2b的片剂的加速稳定性与实施例1b、4和5的片剂的加速稳定性相比较。在研究期间，所有片剂均用干燥剂包装。如图3所示，令人惊讶的是，实施例2b的片剂远比其他湿法制粒的片剂更稳定，并且与喷雾干燥分散体片剂类似稳定。实施例2b和实施例4的片剂之间的这种稳定性差异是特别令人惊讶的，因为仅两者之间的显著差异是制备制剂的方法(干法制粒相对于湿法制粒)。这些结果也是令人惊讶的，因为先前并不知道制粒方法可能对赛尼克韦罗的生物利用度和稳定性具有影响。
实施例8：CVC制剂的稳定性
通过将片剂暴露于40℃的75％相对湿度的环境中六周来测试实施例2和3的片剂的稳定性。在研究期间，所有片剂均用干燥剂包装。这些结果示出在表9中，所述表显示这些片剂在这些条件下非常稳定。
表9
时间(周数) 含水量(％) 强度(％) 总杂质(％)
0 1.5 99.1 1.2
2 1.4 99.2 1.1
4 1.4 98.0 1.0
6 1.4 98.6 1.0
实施例9：CVC制剂的稳定性
在25℃下的动态蒸汽吸收等温线与具有甲磺酸赛尼克韦罗的实施例3和4的片剂的稳定性相关。以5％间隔从0％相对湿度到90％相对湿度进行吸收。在每个间隔时，将每种样本平衡不少于10分钟且不长于30分钟。当质量增加速率不超过0.03％w/w/分钟时或30分钟之后(无论哪一种都比较短)，停止平衡。在图4中出现的结果显示实施例2b的片剂比实施例4的片剂显著更稳定。此结果与实施例 3一致，吸湿性比实施例4显著更低。实施例4与实施例2b相比的吸湿性增加可能与较高可移动含水量相关，这可进而引起实施例4部分凝胶化和随后的稳定性降低。
实施例10：CVC制剂的生物利用度
将实施例3的片剂的生物利用度与实施例5的生物利用度以及明胶胶囊中的甲磺酸赛尼克韦罗粉末在比格犬的不同胃部状态中的生物利用度相比较。在不同预处理状态下测试生物利用度，每个预处理状态改变了胃部pH。确切地说，五肽促胃酸激素(pentagastric)预处理提供最低pH，无处理提供中等pH，并且法莫替丁处理提供最高pH。
图5中呈现的结果显示实施例3的片剂在所测试的所有条件下具有较高的生物利用度。实施例3的生物利用度在五肽促胃酸激素处理狗和未处理狗之间变化较少，而实施例4显示空腹的未处理狗(中等胃部pH)与五肽促胃酸激素处理狗(最低胃部pH)相比生物利用度显著损失。使用抑制胃酸并升高胃部pH的H2受体激动剂法莫替丁进行的预处理降低了所有样本的生物利用度，然而，实施例3的减小远小于实施例4的减小。
这些结果证明了具有富马酸的干法制粒赛尼克韦罗组合物的另外的意外益处。确切地说，当跨越潜在人胃部pH条件的完整范围施用时，此类制剂的药代动力学并未改变像喷雾干燥分散剂(实施例4) 那么多。此结果是意外的且令人惊讶的，因为其他弱碱性抗逆转录病毒药物诸如阿扎那韦的生物利用度极大受到胃部pH的影响。对于此类药物，可由疾病或医学病状(诸如胃酸缺乏症患者)导致的或者由药物诸如抗酸药、质子泵抑制剂或H2受体激动剂的共同施用导致的胃部pH变化可以将生物利用度降低至亚治疗水平。这些结果显示，当胃部pH改变时实施例3的干法制粒的、基于富马酸的甲磺酸赛尼克韦罗制剂更不容易发生生物利用度变化，这表明实施例3是更强效的制剂，其可用于具有或可能具有改变的胃部pH水平的患者中。
实施例11a-11c：甲磺酸赛尼克韦罗和拉米夫定制剂的制备
表10的甲磺酸赛尼克韦罗和拉米夫定制剂制备如下。首先，将颗粒内组分掺混并进行干法制粒，以形成作为干法制粒掺混物的组合物。然后将此干法制粒的掺混物与颗粒外组分进一步掺混以形成一种混合物。将所述混合物压制成片剂。测量150mg CVC强度片剂(实施例11b和11c)的赛尼克韦罗(CVC)和拉米夫定(3TC)在比格犬中的绝对生物利用度。结果示出在图6中。
表10
Figure GDA0002945251210000401
Figure GDA0002945251210000411
实施例12：双CCR2和CCR5拮抗剂赛尼克韦罗在NASH小鼠模型中的抗纤维化活性和抗炎活性
背景：非酒精性脂肪肝炎(NASH)的特征在于脂肪累积、慢性炎症(包括促炎性单核细胞和巨噬细胞)，并且当存在纤维化时，它可导致肝硬化或肝细胞癌。目前没有批准用于NASH的治疗。有证据表明C-C趋化因子受体(CCR)类型2及其主要配体单核细胞趋化蛋白-1促使肝脏中的促炎性单核细胞募集。赛尼克韦罗(CVC)是一种口服的、强效、双CCR2/CCR5拮抗剂，其在48周2b期研究中在143位 HIV-1-感染的成人中显示有利的安全性和耐受性(NCT01338883)。在膳食诱导的导致肝细胞癌的NASH的小鼠模型中评价CVC；提供来自所述模型的第一纤维化分期的数据。
方法：在雄性小鼠中通过在出生后单次注射200μg链脲佐菌素2 天(导致血糖控制受损)，接着从4周龄开始食用高脂肪膳食来诱导 NASH。从6至9周龄，经由每天两次口服灌胃向3组动物(n＝6/组) 施用0(媒介物)、20(低剂量)或100(高剂量)mg/kg/天的CVC剂量。在 9周龄时处死动物，并且对肝脏进行生物化学、基因表达和组织学评价。
结果：CVC治疗对体重或肝重、全血糖或肝甘油三酯不具有影响。CVC治疗组与对照(对于低剂量、高剂量和媒介物而言分别是 58±12、51±13和133±80U/L；p<0.05)相比，平均(±SD)丙氨酸转氨酶水平显著降低，并且肝羟基脯氨酸在治疗组中倾向于降低。通过实时 RT-PCR，在CVC治疗的情况下，在整个肝裂解物中的胶原蛋白1型 mRNA降低了27％-37％。通过CVC治疗相对于对照，纤维化面积百分比(通过天狼星红染色)显著降低(p<0.01)：当包括血管周隙时，对于20mg/kg/天、100mg/kg/天和对照分别是0.66％±0.16、0.64％± 0.19和1.10％±0.31；当去除血管周隙时，分别是0.29％±0.14、0.20％±0.06和0.61％±0.23。重要的是，在CVC治疗的情况下组织学非酒精性肝病活动评分(对于此模型中未治疗的小鼠，评分是0)显著降低 (对于低剂量、高剂量和媒介物分别是4.0±0.6、3.7±0.8和5.3±0.5； p<0.05)，这主要是由于炎症和气球样变性评分降低。如先前在人中所示的，在小鼠中观察到血浆单核细胞趋化蛋白-1水平的CVC剂量-相关性代偿性增加(对于低剂量和高剂量分别是1.1倍和1.5倍)，这与 CCR2的拮抗作用一致。
结论：这些数据表明目前人试验中用于HIV-1的研究性药剂CVC 在NASH小鼠模型中具有抗纤维化活性和抗炎活性，从而保证了临床研究。这些发现进一步提供了破坏CCR2/单核细胞趋化蛋白-1轴可以是一种新型NASH治疗方法的证据。
实施例13：双CCR2/CCR5拮抗剂赛尼克韦罗在硫代乙酰胺诱导型肝纤维化和肝硬化的大鼠模型中的显著抗纤维化活性
背景：在促炎性单核细胞和巨噬细胞、Kupffer细胞和肝星形细胞(HSC)上表达C-C趋化因子受体(CCR)类型2和5，这导致肝脏中的炎症和纤维发生。赛尼克韦罗(CVC；新型、强效、口服、双 CCR2/CCR5拮抗剂)在48周2b期研究中在143位HIV-1-感染的成人中具有有利的安全性/耐受性(NCT01338883)。此研究在由于硫代乙酰胺(TAA)-诱导的损伤而患有新兴肝纤维化的大鼠中评价了CVC的体内抗纤维化作用和治疗干预相对于疾病发作的时间。
方法：在雄性斯普拉-道来氏(Sprague-Dawley)大鼠中通过腹膜内施用TAA150mg/kg 3次/周持续8周来诱导纤维化。大鼠(n＝4-8/组) 接受CVC 30mg/kg/天(a)、CVC100mg/kg/天(b)或媒介物对照(c)，前 8周同时接受TAA(组1；早期干预)、在完成TAA施用之后第4-8周期间接受(组2；新兴纤维化)或者在第8-12周期间接受(组3；肝硬化逆转)。对肝进行生物化学、基因表达和组织学评价。
结果：当与TAA(组1)同时开始时，30mg(组1a)和100mg(组1b) 的CVC显著减少了纤维化(分别减少了49％和38％；p<0.001)，如通过胶原蛋白形态测定法评估的。对于组1a和组1b，1型胶原蛋白的蛋白质水平分别减少了30％和12％，而α-SMA分别减少了17％和22％。当治疗在TAA-诱导型损伤(组2)之后4周开始，对于CVC 30 mg(组2a，胶原蛋白的36％减少；p<0.001)观察到统计学上显著的抗纤维化活性，而对于CVC 100mg(组2b)并未观察到所述活性。当治疗在第8周(出现肝硬化)时开始并且持续4周(组3)时，CVC对基因表达或纤维化不存在显著作用。
结论：CVC在由于TAA而引起的非硬化性肝纤维化中是强效抗纤维化剂。所述药物在早期干预(组1)和新兴纤维化(组2a)中是有效的，而当已形成肝硬化(组3)时是无效的。
实施例14：赛尼克韦罗在低毫微摩尔浓度下实现高CCR5受体占据
背景：赛尼克韦罗(CVC)是一种新型的、每天一次的、强效的、 CCR5和CCR2拮抗剂，其已完成对先前无治疗成人中的HIV-1感染的治疗的2b期评价(NCT01338883)。此研究的目标在于，评价在使用 CVC、BMS-22(TOCRIS，一种CCR2拮抗剂)和批准的CCR5拮抗剂马拉维诺(MVC)进行治疗之后的体外受体占据和生物学。
方法：将来自5位HIV+和5位HIV-受试者的PBMC与CVC、 BMS-22或MVC孵育，接着不治疗或者使用RANTES(CCR5配体) 或MCP-1(CCR2配体)进行治疗。评价每种药物抑制CCR5或CCR2 内化的能力。通过流式细胞术评定CCR5和CCR2的细胞表面表达，并且将荧光值转化成等同可溶性荧光(MESF)分子。
结果：在RANTES不存在下，CVC和MVC二者均增加CCR5 的细胞表面表达。此作用在HIV-阴性受试者(CD4+和CD8+T细胞) 中见到的程度更大。CVC以低于MVC的有效浓度预防RANTES-诱导的CCR5内化。CVC在达到CCR5饱和时的有效浓度对于CD4+ 细胞是3.1nM并且对于CD8+T细胞是2.3nM(分别为约91％和约 90％受体占据)。对于CD4+和CD8+T细胞，MVC在12.5nM下达到饱和，这分别代表约86％和约87％受体占据。CVC和MVC达到高而不完全的CCR5饱和，这是可通过观察在RANTES不存在下使用两种药剂获得的增加的CCR5表达来扩大的作用。在MCP-1不存在下，CVC诱导CCR2内化并减少单核细胞上的细胞表面表达。BMS-22稍微增加了CCR2细胞表面表达。CVC以低于BMS-22的浓度预防 MCP-1-诱导的CCR2内化。单核细胞CCR2在6nM CVC下达到饱和，这代表约98％CCR2占据。为了达到>80％受体占据，与1.8nM CVC相比，需要平均18nM的BMS-22。
结论：CVC在体外比MVC更容易预防RANTES-诱导的CCR5 内化(在较低浓度下)，这指示CVC在体内比MVC更有效预防由 RANTES引起的细胞活化。在治疗的受试者中基线CCR5表达水平可以是体内CCR5拮抗剂活性的决定因素。CVC在低毫微摩尔浓度下在体外实现CCR2于单核细胞上的约98％受体占据，并且在MCP-1 不存在下减少了单核细胞上的CCR2表达。CVC对CCR2的高度饱和与减少的表达成对可以解释在临床中使用CVC观察到的强效CCR2阻断。CVC在体外具有强效的免疫调节活性，并且可以是慢性 HIV感染中重要的组合免疫治疗和抗逆转录病毒剂。
实施例15：CVC阻断HIV进入但并未像MVC一样导致HIV再分布到细胞外空隙中
背景：在体内，CVC在对具有CCR5-嗜性病毒7的经历治疗个体的单一治疗期间已显示功效。在IIb期临床研究(652-2-202； NCT01338883)中，CVC证明了在第24周(主要分析)与非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)依法韦仑(EFV)类似的功效，以及比非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)依法韦仑(EFV)优异的毒性特征，它们各自当与恩曲他滨(FTC)和替诺福韦(TDF)组合施用时，具有有利的安全性和耐受性。假设在研究202(实施例22)中CVC的抗逆转录病毒功效可能由于使用MVC观察到的复发现象而受到低估。因此，通过测量在储存的PBMC中的细胞内HIV DNA降低来对研究202(实施例22)进行离体亚分析，这些PBMC来自在研究第24周实现病毒学成功的30位受试者。还进行体外测定，以确定并比较CVC或MVC可能引起的任何无细胞病毒体再分布程度。
现在显示CVC并不引发病毒颗粒反弹。实际上，在使用CVC或 EFV治疗的个体中可见相当的细胞内DNA降低，这表明血浆病毒负荷是CVC治疗成功的准确量度。结构建模对于使用MVC和CVC获得的结果之间的差异提供了可能解释。
方法：细胞。在37C、5％CO2下，将表达CD4、CCR5和CXCR4 的PM-1细胞维持在含有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基(R10培养基)中。在37C、5％CO2下，将用于转染的293T细胞维持在10％ FBS、L-谷氨酰胺和抗生素的DMEM(D10培养基)病毒原液中。通过用质粒pWT/BaL转染293T细胞来产生HIV-1BaL病毒。将 Lipofectamine 2000用作转染剂。在转染后48h收集培养上清液，通过0.45μm微孔过滤器过滤，并在37C下使用每ml病毒原液50个单位的核酸酶(benzonase)处理20分钟，以去除污染的质粒DNA。将病毒原液冷冻在-80C下，以停止核酸酶活性。使核酸酶处理的病毒原液在脐带血单核细胞(CBMC)中传播。在R10培养基中将CBMC用植物凝集素(PHA-M)处理72h，之后使用HIV-1BaL感染。随后使病毒扩增培养物在补充有干扰素2(IL-2)的R10中生长并在37C、5％CO2 下孵育。
感染：在抑制浓度的CVC(20nM)和MVC(50nM)存在下将PM-1 细胞暴露于HIV-1BaL。在37C下将两种药物均与PM-1细胞孵育1h，之后添加病毒。在1ml R10培养基中每5X 105个细胞孵育500ng HIV-1BaL的p24抗原。仅病毒的对照在本文中描述为“无细胞”，其用于测量病毒衰减。在无药物对照中测量病毒吸收，由此每5X 105 个PM-1细胞添加500ng HIV-1Bal的p24Ag，所述PM-1细胞在药物处理不存在下在37C下预先孵育1h。一式二份进行每种药物处理和对照。使用QIAamp Viral RNA微小试剂盒根据制造商说明书从140 μl上清液流体中去除病毒RNA。将样本保存在-80C下，直到分析。使用定量实时逆转录PCR(qRT-PCR)测量上清液病毒负荷，所述PCR 使用引物US1SSF(5'-AACTAGGGAACCCACTGCTTAA-3'), US1SSR(5'-TGAGGGATCTCTAGTTACCAGAGTCA-3')和US1SS探针(5’-(FAM)CCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAA)以及 Invitrogen qRT-PCR Supermix试剂盒进行。循环参数是：50℃持续15 分钟、95℃持续10分钟、接着进行95℃持续15秒和60℃持续1分钟的50次循环。所有值都是2个独立实验的重复测试的结果。通过使用pBaL/wt的10倍系列稀释液来生成每个测定的标准曲线以定量 RNA拷贝数目并且相对于具有来自先前研究的已知拷贝数目的样本进行校准。
患者样本：从在研究202IIb期临床试验第24周实现病理学成功的30位患者(对于CVC 100mg、CVC 200mg和EFV分别是10位、 13位和7位)中获得外周血单核细胞(PBMC)，所述临床试验比较 CVC(100mg或200mg)或EFV与恩曲他滨/富马酸替诺福韦二吡呋酯 (FTC/TDF)的组合在具有CCR5-嗜性病毒的HIV-1感染的、先前无治疗患者中的功效、安全性和耐受性。从具有<100,000个但>1,000个病毒RNA拷贝/ml的基线病毒载量的参与者获取基线和24周的样本，这些参与者具有CD4计数≥200个细胞/μl，他们被随机指定接受CVC 或EFV。
细胞内DNA qPCR。提取总DNA，定量，并保存在-80C下。使用以上所述的US1SS引物/探针集定量细胞内强终止DNA水平。使用US1FL引物/探针集定量细胞内全长DNA水平(正向：5’-AACTA GGGAACCCACTGCTTAA；反向：5’-CGAGTCCTGCGTCGAGAGA；探针：5’-[FAM]-CCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAA)。使用GAPDH引物/探针集(正向：5’-ACCGGGAAGGAAATGAATG G；反向：5’-GCAGGAGCGCAGGGTTAGT；探针：5’-(VIC)-ACCGGCAGGCTTTCCTAACGGCT)多重复用两个DNA水平以使DNA输入归一化并验证样本完整性。
统计学分析：使用曼-惠特尼(Mann-Whitney)检验分析所有三个治疗组的体外细胞内HIV DNA水平。使用Prism 5软件分析所有数据。
赛尼克韦罗在CCR5中的分子对接
通过结构生物信息学研究联合实验室(RCSB)蛋白质数据库获得 CCR5趋化因子受体的晶体结构(蛋白质数据库识别号[PDB ID] 4MBS)并将其用作对接目标。从PubChem获得CCR5-受体拮抗剂赛尼克韦罗(以前的TAK-652/TBR-652)的结构并将其用作配体。通过使用UCSF Chimera促进配体对接结构的最小化，UCSF Chimera制备 CCR5和CVC作为DOCK计算的输入，这预测配体在CCR5七跨膜 (7TM)α-螺旋受体腔中的取向。进行对接计算，并使用尺寸最大化的网格将所有可能的对接位点包括到CCR5中。结合位点由小于
Figure GDA0002945251210000471
的来自7TM腔的所有残基(大约残基Glu283和Tyr10)组成。处理对接结果以鉴别分子内相互作用。保持测试九种姿势以用于进一步分析。为了验证对接系统的准确性，使用相同方法将MVC对接至CCR5并且确定其相对于晶体结构的取向。在观察的晶体结构与使用 AutoDock Vina获得的预测的构象之间使用PyMOL计算的均方根偏差(RMSD)是
Figure GDA0002945251210000472
这表明所述方案是合理的。
结果
首先定量HIV细胞内DNA，以便验证在研究202临床试验期间获得的病毒负荷的量度。对从此临床试验的参与者中分离的PBMC 中的全长细胞内HIV DNA水平(指示早期逆转录)进行的离体分析在第24周在所有组(CVC 100mg、CVC 200mg、EFV 600mg)中均是类似的(图7A)。对于CVC组100mg(n＝10)和CVC 200mg(n＝11)，自基线的平均倍数变化分别是0.643和0.787。EFV 600mg组(n＝7) 在24周具有0.825的自基线的平均倍数变化。这些差异不是统计学上显著的。
接着，强终止细胞内HIV DNA水平(指示晚期逆转录)与第24周的全长水平同时测量(图7B)。自基线的平均倍数变化对于CVC 100 mg组是0.49，对于CVC 200mg组是0.63，并且对于EFV 600mg组是1.01。这些平均值不是统计学上显著的。
还进行测量CVC和MVC暴露之后的细胞外病毒水平的体外实验。通过在进入抑制剂暴露的细胞感染之后4h通过qRT-PCR和P24 ELISA测量培养物流体中的病毒水平。在4h后，来自MVC处理的细胞的培养物流体比CVC处理的细胞表现出更高的与基线相比的 RNA水平(基线：1.19X 1010个拷贝/ml,4h：1.67X 1010个拷贝/ml)(图 8A)。(基线：506ng/ml,4h：520ng/ml)(图8B)。来自CVC处理的细胞的培养物流体中的病毒RNA在4小时后没有显著变化(基线：1.19 X 1010个拷贝/ml，4h：1.26X 1010个拷贝/ml)(图8A)。在用CVC处理4小时后，P24水平自基线下降(基线：506ng/ml，4h：192ng/ml)(图 8B)。无细胞和无药物对照的病毒RNA下降在4h之后类似，分别为 1.14X 1010个拷贝/ml和1.1X 1010个拷贝/ml(图8A)。在506ng/ml的基线p24水平之后，无细胞对照的p24抗原水平在4h之后是138 ng/ml。p24无药物对照水平是244ng/ml(图8B)。
在CVC和MVC处理之后细胞外病毒水平的这些差异提示检查在暴露于CVC或MVC中1h的PM-1细胞中的细胞内强终止HIV DNA水平，之后用HIV-1BaL感染。在4h之后从细胞沉淀中提取总DNA。将CVC或MVC处理的细胞的细胞内强终止HIV DNA水平与无药物对照相比较(图9)。在MVC处理的细胞中与无药物对照相比观察到0.02的相对DNA水平，而CVC处理的细胞表现出仅0.1 的相对细胞内DNA水平。MVC和CVC处理的细胞的DNA水平之间的差异是显著的。
CCR5 7TM与MVC复合的晶体结构存在(PDB ID 4MBS)并且这用于生成CCR5模型，其中CVC对接到结合袋中。预测对接姿势，其也通过将MRV重新对接到CCR5来评定；具有最有利能量的顶部姿势具有适当的取向并且与晶体结构中的构象重叠
Figure GDA0002945251210000491
计算机CCR5对接模拟指示CVC仅结合在CCR5结构的疏水袋处，所述疏水袋也称为配体结合袋(图10)。仅保持顶部9种姿势以用于进一步分析。存在三种不同的构象，即CVC表现出后对接到CCR5中并且它们聚集到三个位点(图10A、图10B)。第一位点(位点1)深入跨越到疏水袋中并且填充大体积(图10A)。第二位点(位点2)部分定位在所述袋中间，但是也从TM1与TM7之间的CCR5向外凸出(图10A)。在第三位点(位点3)，少数CVC姿势位于受体腔入口附近。
CCR5的细胞外环和跨膜结构域内的残基的定点诱变已鉴定了参与gp120结合的关键性残基；在不同位置处的突变废除、损害或影响 gp120与CCR5的结合。已鉴定为对于CCR5内的gp120结合十分重要的十三个关键性残基是Tyr37、Trp86、Trp94、Leu104、Tyr108、Phe109、Phe112、Thr177、Ile198、Trp248、Tyr251、Leu255以及Glu283。图11示出在结合袋内具有CVC(左)和MVC(右)的对接姿势的CCR5 的分子表面表示。CVC和MVC分别具有约1285和
Figure GDA0002945251210000492
的分子表面积(使用PyMOL计算)。MVC占据结合袋的中间。已确定对于 gp120结合十分重要的所有十三个残基是自MVC的
Figure GDA0002945251210000493
内，如通过 PyMOL测量的(在此研究中对于静电和/或疏水相互作用使用的截止距离)。相比之下，对接的CVC姿势占据相同的袋但不在如对于MVC 所见的中心(图11)。相反，CVC偏移至袋的一侧(图12A/B)并且确定在CCR5内的残基在CVC的
Figure GDA0002945251210000494
内的共有部分。即使CVC占据比 MVC更大的表面积，但是对于gp120结合而言重要的十三个残基中的仅七个残基是在CVC的
Figure GDA0002945251210000501
内，即Tyr37、Trp86、Tyr108、Phe109、Ile198、Leu255以及Glu283。总之，这些模拟表明CVC在CCR5的结合袋中占据与MVC类似的区域。
讨论：在此研究中观察到两种预防HIV进入的CCR5拮抗剂CVC 和MVC对细胞外病毒水平具有不同的作用。
在比较CVC与EFV(在先前无治疗受试者中两者均使用 FTC/TDF)的IIb期双盲、双模拟研究中，76％接受CVC 100mg的患者在24周实现病毒学成功(HIV RNA<50个拷贝/ml)，相比之下73％接受CVC 200mg的患者和71％接受EFV的患者实现病毒学成功。先前显示MVC可人工地增加病毒负荷，因为无细胞病毒体在MVC 存在下在入口处尝试失败之后可从靶细胞中排除。目前的研究被设计来解决CVC是否出现相同作用并且当比较进入抑制剂和逆转录酶抑制剂时细胞内DNA测量值是否可能准确代表抗病毒功效。
事实上，研究202治疗组全过程的细胞内DNA水平在选定样本中在24周时是类似的(图7)，这反映了意向治疗(ITT)分析期间观察到的趋势。所有组在第24周的全长HIV-DNA水平也是类似的，这表明CVC和EFV都具有类似抗病毒功效。在CVC组与EFV组之间观察到强终止HIV DNA水平的差异，而两个CVC组的病毒载量与EFV 相比呈现出更陡峭的下降。由于强终止HIV DNA水平受到进入抑制剂的直接影响，此结果是预期的。在EFV与CVC之间关于病毒性成功和细胞内HIV DNA水平方面的类似性表明此双CCR5和CCR2抑制剂的抗病毒效力并未被病毒负荷测量值所掩盖。
还询问CVC是否可导致病毒排斥，如在体外对于MVC所见的。病毒定量的两种单独测量qRT-PCR和p24ELISA显示MVC处理在感染后4h维持细胞外病毒水平。相比之下，使用CVC的处理导致病毒水平在4h时下降，这与无药物或无细胞对照的水平相当(图8)。尽管抗病毒机制表面上类似，但是似乎在CVC与MVC之间关于无细胞病毒与CCR5之间的相互作用存在差异。
细胞内强终止DNA体外进一步检查显示CVC与MVC相比引起虽然轻微但明显的水平增加(图9)。这可能是由于两种抑制剂对CCR5 的不同作用，这进而影响病毒与受体之间的解离速率。这提高了与 MVC相比gp120可能与CVC-结合的CCR5更持久缔合的可能性。
目标还在于通过检查CCR5的结合位点来理解CVC如何抑制 HIV进入靶细胞。工程化人CCR5构建体先前已在
Figure GDA0002945251210000511
分辨率下与 MVC复合形成结晶。尽管这不是CCR5的全长晶体结构，但是利用它来更好地理解在计算机对接测定中的CVC与CCR5的相互作用。所有CVC的传说对接模型都提示药物深入渗透到CCR5的7TM腔中，如对于MVC也可见的。然而，CVC对接姿势与细胞外环2并不接近，ECL2保持可接近的后对接。其他组已报道CCR5N-末端和ECL2结构域均在HIV-1与CCR5的相互作用中起关键性作用。另外，据报道gp120的V3环的茎部区域结合至CCR5N-末端，同时V3冠与ECL2和结合袋内的残基相互作用。基于模型，可以假设CVC并不直接干扰gp120V3环与ECL2的相互作用，因为ECL2似乎暴露在所述模型中。
可想到的是如果CCR5保持在无活性状态，则CVC可以阻断 CCR5活化。已显示在7TM区域中的两个残基Tyr37和Trp248在结合趋化因子配体时对于CCR5活化是重要的，并且也显示这对于MVC 结合是重要的。类似于MVC，CVC的不同对接姿势被埋入在疏水性结合位点中。模型显示与Trp248的接近被CVC阻断；已显示Trp248 对于CCR5活化是重要的，这解释了趋化因子受体的失活。第二个假设是MVC与CCR5的结合可导致CCR5经历总体构象变化，在CVC 存在下这可能改变较少。
基于由其他组进行的定点诱变实验和组织培养实验以及此研究中呈现的对接模式，假设MVC占据疏水袋的中间，潜在地导致CCR5 中对gp120结合十分重要的一些残基的不可接近性。这些残基对于通过直接静电或疏水性相互作用和/或水介导的氢键进行的gp120结合也是重要的。相比之下，CVC占据结合位点，并且可能甚至在对接 CVC存在下gp120仍可接近对于CCR5结合十分重要的一些残基。此假设得到定点诱变研究的支持，这些定点诱变研究表明gp120部分填充受体腔同时占据ECL2的整体。然而，gp120的V3环渗透CCR5 7TM的程度仍未知。也已报道了gp120与CCR5的解离速率在MVC 存在下有所加速，因为后者阻碍了ECL2与V3环之间的紧密缔合。基于这些研究，与MVC相比，CVC可对ECL2/V3相互作用具有不同的作用。解离和表面等离子体子共振研究以及CCR5与CVC复合而成的结晶化作用将对此主题提供有价值的信息。
需要定点诱变和生物化学研究来阐明对于CCR5与CVC的相互作用十分重要的残基。确定CCR5的N末端的近端位置也是感兴趣的。
在此研究中，已证明病毒负荷定量是CVC抗病毒功效的准确测量，并且CVC对病毒进入的抑制不会导致病毒颗粒从细胞表面回弹到细胞外环境中。计算机结构建模提供对CVC与MVC之间的功能性差异的潜在解释。需要其他研究来理解CVC如何影响gp120与 CCR5的结合。
实施例16：双CCR5/CCR2拮抗剂赛尼克韦罗在肾纤维化小鼠模型中的抗纤维化活性
背景：赛尼克韦罗(CVC)是一种新型、口服、每天一次的双 CCR5/CCR2拮抗剂，其已完成2b期HIV开发(研究202； NCT01338883)。CVC具有有利的安全曲线，其中555位受试者已使用至少一个剂量治疗，包括在48周持续时间内使用CVC治疗的115 位HIV-1-感染的成人。最近，CVC在膳食诱导的、非酒精性脂肪肝炎(NASH)的小鼠模型和硫代乙酰胺诱导的纤维化的大鼠模型中证实了显著的抗纤维化活性。在此，在通过单侧输尿管梗阻(UUO)诱导的良好建立的肾纤维化小鼠模型中评价CVC。
方法：在手术程序前的那天(第-1天)将测试动物分配至体重匹配的治疗组。雄性CD-1小鼠(N＝51；年龄7-8周)通过无菌剖腹术经历右输尿管的假手术或总体连接(即UUO)(图12)。从第0至5天：经历假手术的小鼠通过每天两次口服灌胃接受媒介物对照(0.5％甲基纤维素+1％Tween-80)；患有永久性UUO的小鼠通过每天两次口服灌胃接受媒介物对照、CVC 7mg/kg/天或CVC 20mg/kg/天。另一组从第 -1天至第4天接受3mg/kg/天的抗转化生长因子TGF-β1抗体化合物 1D11(阳性对照)，腹膜内每天注射一次，并且从第0天至第5天接受媒介物对照。在研究中最初包括CVC 100mg/kg/天组(N＝9)，但是所述组早期由于频死状态而终止(未进行分析，因为没有动物持续到第5 天)。高达2000mg/kg/天的CVC剂量在不涉及手术程序的小鼠毒性研究中耐受良好。在第5天，使动物麻醉，采集血液和组织，之后处死。
研究终点：研究终点包括：a)体重和肾脏重量；b)在通过苦味酸天狼猩红染色的组织学定量图像分析评价的阻塞肾脏中的纤维化(以盲方式使用光学显微镜[在200x下]获得并评估的十张图像/深度/肾脏，以便能够对60％-70％肾脏皮质区域进行取样)，并且所述肾脏通过复合胶原容积分数(CVF[％总成像面积])评分定量，所述复合胶原容积分数表示为跨越三个解剖学上不同(200–250μM间隔)的组织切片的平均阳性染色或自阻塞肾脏的深度；c)冷冻肾脏皮质组织生物活检的羟基脯氨酸含量，如通过生物化学分析评定的；d)促纤维化和炎性生物标志物(包括MCP-1、胶原蛋白1a1、胶原蛋白3a1、TGF-β1、纤连蛋白-1、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)以及结缔组织生长因子-1 (CTGF-1)的mRNA表达；通过使用相对表达进行
Figure GDA0002945251210000531
(Life TechnologiesTM,Carlsbad,CA,USA)测定来测定的，所述相对表达被归一化为HPRT(次黄嘌呤磷酸核糖转移酶)。
统计学分析：数据表示为平均值±平均值标准偏差(SEM)。使用 GraphPad
Figure GDA0002945251210000541
(GraphPad Software,Inc.,San Diego,CA,USA)进行统计学分析。通过未配对t-检验分析在假手术+媒介物对照与UUO+ 媒介物对照组之间以及UUO+媒介物对照与UUO+化合物-1D11(阳性对照)组之间的治疗差异。通过使用Dunnett氏检验(事后比较)进行单向ANOVA来分析在UUO+媒介物对照与CVC-剂量组之间的治疗差异。
方法：在良好建立的肾纤维化小鼠UUO模型中，CVC证明了显著抗纤维化作用，如通过胶原容积分数或CVF的降低所限定的(对于组织学阻塞的肾脏切片中的胶原蛋白染色呈阳性的面积％)。阻塞肾脏中观察到胶原蛋白1a1、胶原蛋白3a1、TGF-β1和纤连蛋白-1mRNA表达下降的趋势，但这些并未达到统计显著性。总之，CVC的作用模式、在动物模型(肾和肝)中的抗纤维化活性以及广泛安全性数据库支持纤维化疾病的进一步评估。计划在患有NASH和肝纤维化的非 HIV感染患者中进行概念验证研究。还计划在HIV-1感染的患者中进行III期试验，以评价当与指南优选的第三药剂共同施用时作为新型‘骨架(backbone)’相对于富马酸替诺福韦二吡呋酯/恩曲他滨 (TDF/FTC)的固定剂量的CVC/拉米夫定(3TC)组合。
结果：体重和阻塞肾脏重量：CVC 7mg/kg/天和化合物1D11(阳性对照)对体重没有影响，而CVC 20mg/kg/天导致体重在第5天相对于UUO+媒介物对照组的体重适度但显著的减小(5％)(p<0.05)(图13；以克[g]显示的体重变化)。未观察到对阻塞或对侧肾脏重量或肾脏重量指数相对于UUO+媒介物对照组(数据未显示)的显著治疗效果 (CVC或化合物1D11[阳性对照])。组织学：CVF的复合测量(针对三种深度求取的面积％平均值[±SEM])在UUO+媒介物对照组中比假手术组显著更高(11.4±1.0-倍；p<0.05)(图14)。CVC 7和20mg/kg/天以及化合物1D11(阳性对照)相对于UUO+媒介物对照组显著削弱UUO- 诱导的CVF复合测量的增加(针对三种深度求取的平均值[±SEM])(分别减少28.6％±8.8％、31.8％±6.8％和50.3％±7.3％；p<0.05)。
羟基脯氨酸含量：来自UUO+媒介物对照组的阻塞肾脏的羟基脯氨酸含量(蛋白质的％)相对于假手术组显著增加(0.72％相对于0.27％； p<0.05)(数据未示出)。相对于UUO+媒介物对照组，测试的任一CVC 剂量都不影响UUO-诱导的阻塞肾羟基脯氨酸含量增加；然而化合物 1D11(阳性对照)组具有显著更低水平(0.55％相对于0.72％；p＜ 0.05)(数据未示出)。
促纤维化和炎性生物标志物mRNA表达：对于每个评价的生物标志物(MCP-1、胶原蛋白1a1、胶原蛋白3a1、TGF-β1、纤连蛋白-1、α-SMA以及CTGF-1)，UUO+媒介物对照组中的mRNA表达与假手术组中的表达相比显著增加(p<0.05)(图15)。CVC 7和20mg/kg/天削弱了UUO-诱导的胶原蛋白1a1、胶原蛋白3a1、TGF-β1以及纤连蛋白-1mRNA表达的增加。然而，这些与UUO+媒介物对照组相比的减少并未达到统计学显著性。相对于UUO+媒介物对照组，化合物 1D11(阳性对照)显著减少了UUO-诱导的胶原蛋白1a1、胶原蛋白3a1、 TGF-β1以及纤连蛋白-1的mRNA表达的增加(p<0.05)。与UUO+媒介物对照组相比，CVC 7和20mg/kg/天以及化合物1D11(阳性对照) 对于UUO-诱导的阻塞肾皮质MCP-1、α-SMA和CTGF-1mRNA表达的增加不具有显著作用(对于α-SMA和CTGF-1mRNA未示出数据)。
结论：在良好建立的肾纤维化小鼠UUO模型中，CVC证明了显著抗纤维化作用，如通过胶原容积分数或CVF(对于组织学阻塞的肾脏切片中的胶原蛋白染色呈阳性的面积％)的降低所限定的。阻塞肾脏中观察到胶原蛋白1a1、胶原蛋白3a1、TGF-β1和纤连蛋白-1mRNA表达下降的趋势，但这些并未达到统计显著性。总之，CVC的作用模式、在动物模型(肾和肝)中的抗纤维化活性以及广泛安全性数据库支持纤维化疾病的进一步评估。计划在患有NASH和肝纤维化的非 HIV感染患者中进行概念验证研究。还计划在HIV-1感染的患者中进行III期试验，以评价当与指南优选的第三药剂共同施用时作为新型‘骨架’相对于富马酸替诺福韦二吡呋酯/恩曲他滨(TDF/FTC)的固定剂量的CVC/拉米夫定(3TC)组合。
实施例17：APRI和FIB-4纤维化评分的改进与持续48周接受赛尼克韦罗的HIV-1感染成人中的sCD14减少相关。
背景和目标：一种新型、口服、每天一次的CCR2/CCR5拮抗剂赛尼克韦罗(CVC)已在临床试验中证明了有利的安全性和抗-HIV活性。CVC在肝病的两种动物模型中证明了抗纤维化活性。在研究 202(NCT01338883)中对APRI和FIB-4评分进行事后分析。
方法：将143位患有CCR5嗜性HIV-1、BMI≤35kg/m2且无明显肝病(即，ALT/AST级别≤2，总胆红素≤ULN，无HBV、HCV、活动或慢性肝病或肝硬化)的成人4:1随机分成CVC或依法韦仑(EFV)。计算APRI和FIB-4评分。在无缺失数据的患者中评定从基线(BL)至第24周和第48周的评分分类变化。评价APRI和FIB-4评分自BL 的变化与MCP-1(CCR2配体)和sCD14(炎性生物标志物)水平之间的相关性。
结果：在BL时，服用CVC比服用EFV更多的患者具有APRI≥0.5 和FIB-4≥1.45；超过这些阈值的CVC患者的比例在第24周和第48 周降低(表)。在第24周观察到在APRI评分的变化与MCP-1水平 (p＝0.014)之间以及FIB-4评分与sCD14水平(p＝0.011)之间的显著相关性，并且在第48周观察到APRI(p＝0.028)和FIB-4评分(p＝0.007)的变化与sCD14水平之间的显著相关性。(表11)。
表11
Figure GDA0002945251210000571
[表]
结论：在无明显肝病的此群体中，CVC治疗与APRI和FIB-4评分的改进相关联，并且在第48周在APRI和FIB-4评分的变化与 sCD14水平之间观察到相关性。已证明的CCR2/CCR5拮抗作用、动物模型中的抗纤维化作用以及广泛的临床安全性数据全部支持CVC 在肝纤维化中的临床研究。
实施例18：赛尼克韦罗在非酒精性脂肪肝炎STAM模型中的体内功效研究
进行此体内功效研究以检查赛尼克韦罗在非酒精性脂肪肝炎 STAMTM小鼠模型中的作用。
材料和方法
实验设计和治疗
研究组
组1-媒介物：自6周龄开始向十八只NASH小鼠口服施用10 mL/kg体积的媒介物，每天两次(9:00和19:00)。
组2-赛尼克韦罗20mg/kg(CVC-低)：自6周龄开始向十八只 NASH小鼠口服施用10mg/kg剂量的补充有赛尼克韦罗的媒介物，每天两次(20mg/kg/天)(9:00和19:00)。
组3-赛尼克韦罗100mg/kg(CVC-高)：自6周龄开始向十八只 NASH小鼠口服施用50mg/kg剂量的补充有赛尼克韦罗的媒介物，每天两次(100mg/kg/天)(9:00和19:00)。
表12汇总了治疗方案：
表12
Figure GDA0002945251210000581
结果
部分1：用于评定CVC的抗NASH/纤维化作用的研究
体重改变和一般情况，直到第9周(图16)
在治疗期期间，体重逐渐增加。在治疗期期间媒介物组与CVC- 低组或CVC-高组之间平均体重没有显著差异。本研究中没有动物在整个治疗期期间显示一般情况的恶化。
在第9周在处死那天的体重(图17A和表13)
媒介物组与CVC-低组或CVC-高组之间平均体重没有显著差异 (媒介物：18.9±3.3g，CVC-低：19.5±2.0g，CVC-高：18.7±0.9g)。
表13：在第9周的体重和肝重
Figure GDA0002945251210000591
在第9周的肝重和肝重与体重的比率(图17B和图17C以及表13)
媒介物组与CVC-低组或CVC-高组之间平均肝重没有显著差异 (媒介物：1270±326mg，CVC-低：1334±99mg，CVC-高：1307±119 mg)。
媒介物组与CVC-低组或CVC-高组之间平均肝重与体重的比率没有显著差异(媒介物：6.6％±0.8％，CVC-低：6.9％±1.0％，CVC- 高：7.0％±0.8％)。
在第9周的全血和生物化学
全血糖数据示出在图18A-图18D和表14中。
媒介物组与CVC-低组或CVC-高组之间血糖水平没有显著差异 (媒介物：590±108mg/dL，CVC-低：585±91mg/dL，CVC-高：585 ±91mg/dL)。4.4.2.血浆ALT(图18B，表14)。CVC-低组和CVC-高组显示与媒介组相比的血浆ALT水平显著降低(媒介物：133±80 U/L，CVC-低：58±12U/L，CVC-高：52±13U/L)。
表14：在第9周的血液和肝脏生物化学
Figure GDA0002945251210000592
Figure GDA0002945251210000601
血浆MCP-1数据示出在图18C和表14中。与媒介物组相比， CVC-高组显示血浆MCP-1水平的显著增加。媒介物组与CVC-低组之间血浆MCP-1水平没有显著差异(媒介物：60±4pg/mL，CVC-低： 68±16pg/mL，CVC-高：91±14pg/mL)。
血浆MIP-1β数据示出在图18D、表14中。媒介物组与CVC-低组或CVC-高组之间血浆MIP-1β水平没有显著差异(媒介物：18±5 pg/mL，CVC-低：18±2pg/mL，CVC-高：20±4pg/mL)。
在第9周的肝脏生物化学
肝甘油三酯含量数据示出在图18D和表14中。媒介物组与CVC- 低组或CVC-高组之间肝甘油三酯含量没有显著差异(媒介物：40.8± 20.4mg/g肝，CVC-低：48.5±16.1mg/g肝，CVC-高：51.7±14.1mg/g 肝)。
肝羟基脯氨酸含量数据示出在图18E和表14中。与媒介物组相比，肝羟基脯氨酸含量在CVC-低组和CVC-高组中倾向于降低(媒介物：0.75±0.18μg/mg，CVC-低：0.63±0.05μg/mg，CVC-高：0.62± 0.09μg/mg)。
在第9周的组织学分析
HE染色和NAFLD活动评分数据示出在图19和图20以及表15 中。来自媒介物组的肝切片显示出严重的小泡性和大泡性脂肪沉积、肝细胞气球样变性和炎性细胞浸润。与媒介物组相比，CVC-低组和 CVC-高组显示炎性细胞浸润和肝细胞气球样变性的适度改进，具有NAS的显著减小(媒介物：5.3±0.5，CVC-低：4.0±0.6，CVC-高： 3.7±0.8)。HE染色切片的代表性显微照片示出在图19中。
表15：在第9周的NAFLD活动评分
Figure GDA0002945251210000611
天狼星红染色数据示出在图21、图22、图23和表16中。来自媒介物组的肝切片显示在肝小叶的中心周围区域中胶原蛋白沉积。与媒介物组相比，中心周围区域中的胶原蛋白沉积在CVC-低组和CVC- 高组中显著减少。与媒介物组相比，纤维化面积(天狼星红阳性面积) 在CVC-低组和CVC-高组中显著降低(媒介物：1.10％±0.31％，CVC- 低：0.66％±0.16％，CVC-高：0.64％±0.19％)。与媒介物组相比，改良纤维化面积也在CVC-低组和CVC-高组中显著减少(媒介物：0.61％±0.23％，CVC-低：0.29％±0.14％，CVC-高：0.20％±0.06％)。
表16：在第9周的组织学分析
Figure GDA0002945251210000621
Figure GDA0002945251210000622
Figure GDA0002945251210000631
肝脏天狼星红染色切片的代表性显微照片示出在图21中。
F4/80免疫组织化学数据示出在图22和图23以及表16中。来自媒介物组的肝切片的F4/80免疫染色证明了F4/80+细胞在肝小叶中的累积。媒介物组与CVC-低组或CVC-高组之间F4/80+细胞的数目和大小以及炎症面积(F4/80-阳性面积)百分比没有显著差异(媒介物： 4.99％±1.10％，CVC-低：4.77％±1.02％，CVC-高：4.96％±0.60％)。
F4/80免疫染色切片的代表性显微照片示出在图22中。
F4/80+CD206+和F4/80+CD16/32+免疫组织化学数据示出在图 24、图25、图26、图27、图28以及表16中。媒介物组与CVC-低组或CVC-高组之间F4/80+CD206+细胞在巨噬细胞中的百分比没有显著差异(媒介物：34.3％±4.2％，CVC-低：34.7％±6.3％，CVC-高：33.1％±3.0％)。媒介物组与CVC-低组之间F4/80+CD16/32+细胞在巨噬细胞中的百分比没有显著差异。与媒介物相比，F4/80+CD16/32+ 细胞的百分比在CVC-高组中倾向于增加(媒介物：33.5％±3.7％， CVC-低：38.7％±7.6％，CVC-高：41.5％±8.2％)。媒介物组与CVC-低组之间M1/M2比率没有显著差异。在CVC-高组中，M1/M2比率与媒介物相比倾向于增加(媒介物：99.6％±20.2％，CVC-低：112.3％±17.0％，CVC-高：125.1％±21.9％)。
F4/80和CD206、F4/80和CD16/32双免疫染色切片的代表性显微照片示出在图24和图26中。
油红染色数据示出在图29、图30和表16中。媒介物组与CVC- 低组或CVC-高组之间脂肪沉积以及脂肪沉积面积(油红阳性面积)百分比没有显著差异(媒介物：9.66％±5.02％，CVC-低：6.51％±3.88％， CVC-高：7.23％±3.59％)。
油红染色切片的代表性显微照片示出在图29中。
TUNEL染色数据示出在图31、图32和表16中。与媒介物组相比，TUNEL阳性细胞的百分比在CVC-低组中显著增加。媒介物组与 CVC-高组之间TUNEL-阳性细胞的百分比没有显著差异(媒介物： 36.0％±3.7％，CVC-低：43.3％±2.9％，CVC-高：39.0％±5.3％)。
肝脏中TUNEL-阳性细胞的代表性显微照片示出在图31中。
在第9周的基因表达分析数据示出在图33和表17-18中。
表17：在第9周的基因表达分析
Figure GDA0002945251210000641
表18：在第9周的P值
Figure GDA0002945251210000651
TNFα
媒介物组与CVC-低组或CVC-高组之间TNFαmRNA表达水平没有显著差异(媒介物：1.00±0.24，CVC-低：1.16±0.39，CVC-高： 1.09±0.23)。
MCP-1
媒介物组与CVC-低组或CVC-高组之间MCP-1mRNA没有显著差异(媒介物：1.00±0.31，CVC-低：1.05±0.50，CVC-高：1.00±0.53)。
1型胶原蛋白
与媒介物组相比，1型胶原蛋白mRNA表达水平在CVC-低组中显著下调。与媒介物组相比，1型胶原蛋白mRNA表达水平在CVC- 高组中倾向于下调。(媒介物：1.00±0.42，CVC-低：0.63±0.10，CVC- 高：0.73±0.04)。
TIMP-1
媒介物组与CVC-低组和CVC-高组之间TIMP-1mRNA表达水平没有显著差异(媒介物：1.00±0.46，CVC-低：0.75±0.32，CVC-高： 0.80±0.20)。
部分2：用于评定CVC的抗HCC作用的研究
体重改变，直到第18周(图35)
在治疗期期间，体重逐渐增加。在治疗期期间媒介物组与CVC- 低组或CVC-高组之间平均体重没有显著差异。
存活分析数据示出在图36中。在对照组中十二只小鼠中的四只在第59天(ID112)、第75天(ID113,115)和第84天(ID116)死亡(施用第一天被指示为第0天)。在CVC-低组中十二只小鼠中的六只在第 62天(ID209)、第64天(ID217)、第75天(ID212)、第76天(ID213)、第84天(ID215)以及第86天(ID208)死亡。在CVC-高组中十二只小鼠中的五只在第62天(ID317)、第65天(ID312)、第70天(ID316)、第 78天(ID314)以及第85天(ID309)死亡。在死亡动物中没有异常的尸检发现，除了NASH的典型肝病变。媒介物组与CVC-低组或CVC- 高组之间存活率没有显著差异。通过委托人指示，在18周龄时比计划的(计划在20周龄时处死)更早处死其余动物。
在第18周在处死那天的体重示出在图37A和表19中。与媒介物组相比，体重在CVC-高组中倾向于降低。媒介物组与CVC-低组之间平均体重没有显著差异(媒介物：23.0±2.3g，CVC-低：22.9±3.5 g，CVC-高：20.8±2.7g)。
表19：在第18周的体重和肝重
Figure GDA0002945251210000661
在第18周的肝重和肝重与体重的比率数据示出在图37B和图 37C以及表19。媒介物组与CVC-低组或CVC-高组之间平均肝重没有显著差异(媒介物：1782±558mg，CVC-低：1837±410mg，CVC- 高：1817±446mg)。媒介物组与CVC-低组或CVC-高组之间平均肝重与体重的比率没有显著差异(媒介物：7.7％±2.2％，CVC-低：8.3％±2.8％，CVC-高：8.8％±2.3％)。
在第18周的肝的肉眼分析
肝的肉眼外观示出在图38A-图38C中。
在肝表面上形成的可见肿瘤结节的数目示出在图39和表20中。媒介物组与CVC-低组或CVC-高组之间每只个体小鼠的肝肿瘤结节数目没有显著差异(媒介物：2.4±4.1，CVC-低：1.5±1.9，CVC-高： 3.6±2.5)。
表20：在第18周的肝的肉眼分析
Figure GDA0002945251210000671
在肝表面上形成的可见肿瘤结节的最大直径示出在图40和表20 中。媒介物组与CVC-低组或CVC-高组之间肿瘤的最大直径没有显著差异(媒介物：4.0±4.7mm，CVC-低：4.8±5.4mm，CVC-高：5.3 ±5.1mm)。
在第18周的组织学分析
HE染色数据示出在图41中。在媒介物组中，HE染色揭示了炎性细胞浸润、大泡性和小泡性脂肪沉积、肝细胞气球样变性、改变的病灶以及结节病变。媒介物组中八只小鼠中的六只展现出HCC病变。在CVC-低组中六只小鼠中的五只中和在CVC-高组中七只小鼠中的六只中检测到HCC病变。媒介物组与CVC-低组或CVC-高组之间没有发现明显差异。
HE染色切片的代表性显微照片示出在图41中。
GS免疫组织学化学数据示出在图42中。分别在媒介物组中八只小鼠中的六只中、CVC-低组中六只小鼠中的五只中以及CVC-高组中七只小鼠中的七只中检测到切片中的GS阳性结节。
GS染色切片的代表性显微照片示出在图42中。
CD31免疫组织化学数据示出在图43和图44以及表21中。与媒介物组相比，CD31阳性面积在CVC-低组中倾向于降低。与媒介物组相比，CD31阳性面积在CVC-高组中倾向于增加(媒介物：2.71％± 1.36％，CVC-低：1.47％±1.10％，CVC-高：3.68％±1.37％)。
CD31染色切片的代表性显微照片示出在图43中。
表21：在第18周的组织学分析
Figure GDA0002945251210000681
表22：在第18周的P值
Figure GDA0002945251210000682
Figure GDA0002945251210000691
总结和讨论
在第9周的分析中，使用低剂量和高剂量CVC的治疗以剂量依赖性方式显著减少纤维化面积，这证实CVC在本研究中具有抗纤维化作用。使用低剂量和高剂量CVC的治疗还降低1型胶原蛋白的 mRNA表达水平和肝羟基脯氨酸含量，这支持了它的抗纤维化性质。与媒介物组相比，CVC治疗组以剂量依赖性方式显著降低血浆ALT 水平和NAS。NAS的改善可归因于小叶炎症和肝细胞气球样变性的减少。因为肝细胞气球样变性来源于氧化应激诱导的肝细胞损伤，并且与NASH的疾病进展有关[26；27]，所以这强烈地暗示CVC通过抑制肝细胞损伤和气球样变性来改善NASH病理学。总之，CVC在本研究中具有潜在的抗NASH作用和保肝作用。
如人中所示，血浆MCP-1水平在本研究中通过使用CVC的治疗而增加，这表明CVC对CCR2具有剂量依赖性拮抗性，但血浆MIP-1β水平并未显示因所述治疗而发生的任何显著变化。为了研究CVC的作用机制，评价了CVC对巨噬细胞群体的作用。初步结果证实，与媒介物组相比，CVC展示高M1/M2比率倾向性，这表明CVC可能通过调节发炎肝脏中的巨噬细胞亚群的平衡来抑制纤维发生。这将在未来进行进一步研究。
在第18周的分析中，在CVC治疗组中未观察到对NASH衍生的HCC的作用。总之，CVC在本研究中显示抗NASH、保肝和抗纤维化作用。
实施例19：CVC的受体结合特性和代谢物
CVC作为CCR2拮抗剂具有独特的体外特性，其50％抑制浓度 (IC50)为5.9nmol/L。CVC以剂量依赖方式抑制RANTES、MIP-1α和MIP-1β与表达CCR5的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的结合，其IC50 分别为3.1、2.3和2.3nmol/L。在人中，CVC对于离体CD4+在3.1nM 浓度下且对于CD8+T-细胞在2.3nM浓度下实现≥90％对CCR5的受体占据[4]。CVC抑制MCP-1与CCR2b的结合，其IC50为5.9nmol/L。 CVC在6nM下在人中离体实现CCR2于单核细胞上的约98％受体占据，并且在MCP-1不存在下减少了单核细胞上的CCR2表达。CVC 仅稍弱地抑制配体与CCR3和CCR4的结合。CVC并不抑制配体与 CCR1或CCR7的结合。CVC阻断RANTES诱导的Ca2+转移。
在动物研究中检测到CVC的两种代谢物(M-I和M-II)(参见实施例20)；M-II是猴或狗中的主要代谢物，M-I是所有物种中的少量代谢物。M-I抑制RANTES与表达CCR5的细胞的结合，其IC50为6.5 nmol/L，所述IC50是CVC的IC50的大约2倍。M-II对RANTES的结合不具有作用。
实施例20：代谢物的鉴定
在以3mg/kg单剂量口服施用[14C]-CVC来喂养动物之后，未变化的CVC是大鼠和狗的血浆中检测到的主要组分，CVC与总14C的 AUC0-24比率分别为58.9％和47.4％[44]。在猴中，这个比率仅是 12.9％，但是检测到相对大量的代谢物M-II，M-II与总14C的AUC0-24比率为34.3％。特别是在狗和猴中，M-II在口服施用之后的量比在IV 施用之后显著更大。这些结果表明，CVC可在到达系统循环之前代谢成M-II。在大鼠、狗和猴的血浆中还检测到微量代谢物，包括M-I、 T-1184803和T-1169518。据推测，代谢物M-I是通过氧化CVC的亚磺酰基部分来形成的，并且M-II是通过后续还原所述亚磺酰基部分，并裂解[(1-丙基-1H-咪唑-5-基)甲基]亚磺酰基基团的C-S键，随后S- 甲基化来形成的。
临床试验
实施例21：HIV-1感染的成人受试者中的短期功效数据
方法
进行2a期双盲、随机、安慰剂对照、剂量递增研究，其在具有 CCR5-嗜性HIV-1感染的受试者中持续10天评价CVC单一疗法的抗病毒活性、PK、安全性和耐受性。要求参与者经历过抗逆转录病毒治疗，初次使用CCR5拮抗剂，HIV-1RNA水平为至少5000个拷贝 /mL，并且CD4+细胞计数为至少250个细胞/mm3。随后将10名受试者的组以每个群组4:1受试者的比率纳入，以接受CVC(25、50、75、 100或150mg)或相匹配的安慰剂。所有受试者接收每天一次剂量的 CVC或安慰剂，持续10天，并追踪到第40天。
人口统计和其他基线特征
将总共54位受试者纳入本研究。人口统计在剂量组间大体上类似。每个剂量组中的大多数受试者是男性(66.7％至100％)，并且中值年龄的范围是33.5岁(安慰剂组)至45.0岁(150-mg组)。大多数受试者是白种人或非裔美国人。中值BMI的范围是22.9kg/m2(100-mg组) 至27.4kg/m2(25-mg组)。中值HIV-1RNA值的范围是4.00log10个拷贝/mL(150-mg组)至4.60log10个拷贝/mL(75-mg组)。中值CD4+ 细胞计数在150-mg组(508.0个细胞/mm3)中最高，并且在其余组中其范围是402.0至460.0个细胞/mm3。
功效和安全性结果
CVC示出对HIV-1RNA水平强效作用，这种作用在完成治疗之后持续。在初次使用CCR5-拮抗剂、经历过治疗的HIV-1感染受试者中，25-、50-、75-和150-mg剂量的与基线相比的中值最低点变化分别为-0.7、-1.6、-1.8和-1.7log10个拷贝/mL。这些结果证实CVC具有强效拮抗CCR5活性。HIV-1RNA水平的平均变化示出在图45中。
对MCP-1(CCR2的配体，它是一种在促炎性单核细胞上表达的趋化因子共受体，也称作CCL2)、hs-CRP和IL-6的变化进行探索性评定，并且观察到MCP-1的显著剂量依赖性增加(表23)。
在第10天，与安慰剂组中的略微下降相比，在25-、50-、75-和 150-mg剂量组中，最小二乘均数MCP-1水平分别比基线高出56.3、 94.2、34.4和334.3pg/mL。在50-和150-mg剂量下，这些结果是统计学上显著的(分别是p＝0.024和p<0.001)。这些结果证实CVC具有强效拮抗CCR2活性。CVC在此10天研究中对hs-CRP或IL-6水平总体上无影响。
表23
Figure GDA0002945251210000721
缩写：LS，最小二乘
a P-值是单侧的并且是基于每个剂量CVC与安慰剂的比较，无需多重比较调整。
不良事件
赛尼克韦罗在所研究的剂量下大体上耐受良好，并且没有鉴定出安全问题。没有死亡、SAE或其他重大AE，并且未因为AE而中断。大多数治疗中出现的AE的严重性是轻度或中度。与其他剂量组中的受试者相比，接受150mg CVC(即，研究的最高剂量)的受试者具有更多AE，但所有剂量组的AE严重性是相当的。在此研究中，最常见(≥10％)治疗中出现的AE为恶心(18.5％)、腹泻(16.7％)、头疼(14.8％) 和疲劳(11.0％)。
实验室安全性
在观测期期间，在25mg(2位受试者)、50mg(2位受试者)、100 mg(1位受试者)和150mg(1位受试者)剂量组中有6位受试者ALT和 /或AST升高，并且安慰组中有1位受试者AST升高。所有升高都是 1级，孤立的，除了在2名具有超过单次升高的受试者(均在50-mg剂量组中)除外，并且都在没有后遗症的情况下消解。具有超过单次升高的2位受试者是在50mg剂量组，并且这些受试者中的一位受试者在基线时具有1级升高AST。在治疗期间在100mg和150mg剂量组中的受试者中观察到AST升高(在每个剂量组的1名受试者中观察到)，其在继续治疗期间恢复到正常值。在研究期间没有出现ALT 或AST的2-4级升高。
仅3级或更高级实验室异常是25mg剂量组中在给药前存在的3 级低磷血症、50mg剂量组中在基线时具有3级甘油三酯的受试者中的4级升高甘油三酯以及在先前具有胰腺炎病史的受试者中各自有的3级和4级淀粉酶和脂肪酶。
心血管安全性和身体检查
在150-mg剂量组中在基线时具有收缩血压2级升高的受试者中观察到3级收缩性高血压。没有临床相关身体检查或ECG发现。
如先前所述，CVC具有作为CCR5和CCR2拮抗剂的双重活性。对MCP-1(CCR2的配体，也称作CCL2)、hs-CRP和IL-6的变化进行探索性评定，并且观察到MCP-1的显著剂量依赖性增加(参见表24)。在第10天，与安慰剂组中的略微下降相比，在25、50、75和150mg 剂量组中，最小二乘均数MCP-1水平分别比基线高出56.3、94.2、 34.4和334.3pg/mL。在50和150mg剂量下，这些结果是统计学上显著的(分别是p＝0.024和p<0.001)。这些结果证实CVC具有强效拮抗CCR2活性。CVC在此10天研究中对hs-CRP或IL-6水平总体上无影响。
表24：依据群组对MCP-1水平进行的汇总-研究201
Figure GDA0002945251210000741
Figure GDA0002945251210000751
抗性数据
在研究201中，在基线、第7天和第40天(或在“提前终止”访问时，如果适用的话)时进行药物抗性测试。所有具有可评价样本的受试者仍然完全对CVC敏感。
病毒嗜性
对研究201中所有受试者的病毒嗜性进行测试，以排除其病毒是 CXCR4嗜性或双重/混合的。在筛选时所有受试者都具有CCR5-嗜性病毒(基于增强的敏感性曲线测定)。总计39位服用CVC的受试者在治疗之后具有可评价样本，并且发现这些受试者中有一位(在CVC 150mg剂量组中)在第10天具有双重/混合嗜性病毒。进一步测试(在另一个使用不同测定的实验室中)揭示，这位受试者在基线时主要具有CXCR4-嗜性病毒，因此，根据入选标准，这位受试者不应纳入研究中。此受试者并未响应于CVC治疗；此受试者的HIV-1RNA的最大降低是0.13log10个拷贝/mL，低于基线值。
药代动力学/药效动力学关系
对于研究201中测试的所有剂量，对于“制剂F1”，在暴露时不止观察到剂量比例增加，将所述制剂用于所有群组，但100mg剂量群组除外。
使用以下最大作用(Emax)模型表征药物反应：
Figure GDA0002945251210000761
其中E是作用，E0是基线作用(固定至0)，Imax是最大抑制，C 表示PK变量(AUC0-24、Cmax或稳态浓度[Css])，IC50是对应于50％最大抑制的PK变量的值并且γ是描述s形程度(sigmoidicity)的形状参数。
PK/PD模型中CVC的Emax是-1.43log10个拷贝/mL。基于Emax 模型，预期25、50、75和150mg剂量的CVC的平均Css产生药物最大抑制作用的54.9％、79.8％、85.9％和95.9％。因此，75和150mg QD 的剂量水平展示出强效抗病毒活性，其中PD作用大于HIV-1感染的受试者中CVC的Emax的80％。
实施例22：HIV-1感染的成人受试者中的长期功效数据
研究202的功效结果
研究设计和目标
这是一种随机、双盲、双模拟、48周比较研究，其评价CVC 100 mg和CVC 200mg与批准的抗逆转录病毒药剂依法韦仑(EFV，
Figure GDA0002945251210000762
)相比的功效和安全性，它们全部与批准的抗逆转录病毒药剂恩曲他滨/富马酸替诺福韦二吡呋酯(FTC/TDF)组合施用于仅有CCR5嗜性病毒的HIV-1感染的、初次抗逆转录病毒治疗的成人受试者中。将具有HIV-2、乙型肝炎和/或丙型肝炎、肝脏肝硬化或任何已知活动性或慢性活动性肝病的病史的受试者从研究中排除。
计划以2:2:1比率将大约150位受试者随机分配(143位受试者实际上随机分配)给CVC 100mg+安慰剂、CVC 200mg+安慰剂或批准的抗病毒药剂依法韦仑(EFV)+安慰剂，它们全部与批准的抗病毒剂恩曲他滨/富马酸替诺福韦二吡呋酯(FTC/TDF)组合，以固定剂量组合制剂
Figure GDA0002945251210000763
提供为开放标签研究药物。在前25位研究受试者中进行药代动力学评定，以确认在所选的CVC 100mg和CVC 200mg 的剂量下实现充分CVC血浆暴露，然后纳入剩余的研究群体。
人口统计和基线特征
大多数受试者为男性(94％)和白人(62％)，平均年龄为35岁，并且平均身体质量指数为26.2kg/m2。总共32％的受试者是美国黑人/ 非裔美国人。此外，24％的随机分配受试者是西班牙裔。
在基线时，HIV-1感染的中值持续时间(即第一次阳性HIV-1测试到知情同意日期的时间[月])是8个月，平均HIV-1RNA为4.50log10个拷贝/mL。(80％的受试者的病毒载量<100,000个拷贝/mL)，并且平均CD4+细胞计数为402个细胞/mm3(58％的受试者的CD4+细胞计数≥350个细胞/mm3)。
主要功效结果
主要功效终点是第24周的病毒学应答，使用FDA快照算法定义为HIV-1RNA<50个拷贝/mL。具有病毒学成功(应答)的受试者的百分比在三个治疗组中是相当的(CVC 100mg76％，CVC 200mg 73％，并且EFV 71％)。与CVC 100mg组(17/59受试者，29％)和CVC 200mg组(15/56受试者，27％)相比，EFV组中更多受试者提前终止研究(11/28 受试者，39％)。
第48周的数据与第24周观察到的数据一致。随时间推移具有病毒学成功的受试者的百分比在3个治疗组中大体上是相当的，但与 EFV组相比，第48周时CVC组更高(CVC100mg 68％，CVC 200mg 64％并且EFV 50％)。
次要和探索性分析
炎症的生物标志物
作为探索性分析，测量炎症生物标记物MCP-1、sCD14、高敏感性C-反应蛋白[hs-CRP]、白介素-6[IL-6]、D-二聚体以及纤维蛋白原) 的水平。MCP-1、sCD14、hs-CRP、IL-6、D-二聚体和纤维蛋白原的基线值和在第24周和第48周与基线相比的变化汇总在表25中。
表25
Figure GDA0002945251210000781
Figure GDA0002945251210000791
N＝受试者数目；
注意：基线被定义为在开始研究治疗之前最后一个未缺失评定；
*使用LSMeans基于具有治疗、基线和基线时HIV-1 RNA的因素的ANCOVA模型与EFV组进行的成对比较显示的p值＜0.001。
#如使用控制基线HIV-1RNA的van Elteren检验评定的治疗组之间的差异是统计学上显著的(p-值；0.048)。
使用CVC观察到MCP-1(CCR2的配体)随时间增加的剂量-反应，而MCP-1在EFV组中保持基线值(参见图46)。EFV与CVC 100mg 和CVC 200mg治疗组之间血浆MCP-1与基线相比的变化的差异在第24周和第48周是统计学上显著的(p＜0.001)(参见表25)。
此外，在两个CVC治疗组中，观察到sCD14在48周治疗期间的下降(重复sCD14分析的线性混合模型分析，参见下文)，而在EFV 组中，在相同的观察期内观察到sCD14增加(参见图47)。可溶性CD14 是单核细胞活化的生物标记物，并且独立地与大型长期群组研究中HIV感染患者的发病率和死亡率相关以及与患有慢性病毒性肝炎的患者和患有严重肝纤维化的患者中的较差临床结果相关。
sCD14样本最初在2个独立批次中进行分析：批次1包括第24 周初步分析前的样本，并且批次2包括第32周和第48周(研究结束) 样本。来自2-批次分析的sCD14与基线相比的变化的结果呈现在表 25中。对全部在一个批次中分析的存档样本进行重复分析，以获得不同时间点的分析一致性。为了控制协变量的作用，对sCD14与基线相比的变化进行线性混合模型重复测量分析(分析日期为2013年9 月)。除CVC 200mg组中从基线到第32周的变化以外，与使用EFV 观察到的增加相比，使用两种剂量(100和200mg)的CVC在48周治疗期间观察到的sCD14水平降低(LS均数)是统计学上显著的 (p<0.05)(参见表26和图47)。
表26
Figure GDA0002945251210000801
Figure GDA0002945251210000811
在CVC和EFV治疗组中，其他炎症生物标记物(hs-CRP、IL-6、 D-二聚体)的变化是类似的。
APRI和FIB-4评分
此外，在来自根据严格合格标准(HIV-1感染且无ALT/AST级别≥2，总胆红素>ULN、HBV和/或HCV、活动或慢性肝病、肝硬化或 BMI>35kg/m2)纳入无明显肝病的受试者的此研究的数据的事后比较分析中，在≥10％的所有CVC治疗受试者中随着时间推移观察到AST与血小板比率指数(APRI)和组合了标准生化值、血小板、ALT、AST 和年龄(FIB-4)评分的无创肝纤维化指数评分的改进(合并CVC 100 mg和200mg的数据)(图48)。在EFV组中，在第24周有5％的受试者以及在第48周有6％的受试者的APRI评分与基线相比下降一个类别；用EFV治疗的受试者的FIB-4评分没有下降一个类别，其中所有受试者在基线时均具有评分<1.45。
如上所述，在此研究中，CVC还对sCD14(一种单核细胞活化的重要标记物)具有显著影响。在上述相同事后比较分析中，CVC治疗受试者在第24周的FIB-4评分的变化与sCD14水平之间以及在第48 周的APRI和FIB-4评分的变化与sCD14水平之间观察到统计学上显著的相关性。第48周结果示出在图49和图50中。
安全性结果
暴露程度
在CVC组中，摄入研究药物(CVC或EFV)的平均持续时间比EFV 治疗组长(CVC100mg和200mg分别为41.2和40.9周，对比EFV 的36.2周)，在EFV组中，这受到较高中断率的影响。
所有不良事件汇总
总计，CVC 100mg组、CVC 200mg组和EFV组中分别有51位受试者(88％)、48位受试者(84％)和27位受试者(96％)发生至少1次 AE。最常报道的AE(3个治疗组中任一组中≥10％受试者的优选术语) 是恶心、上呼吸道感染、腹泻、头疼、皮疹事件、疲劳、头晕、鼻咽炎、异常梦境、失眠、淋巴结病、抑郁以及梅毒(表27)。在这些最常报道的AE中，在CVC组中，头疼、疲劳和上呼吸道感染比EFV组报道更频繁；并且在EFV组中，头晕、异常梦境、失眠、淋巴结病、抑郁和梅毒比CVC组报道更频繁。
表27
Figure GDA0002945251210000821
N＝受试者数目；n＝观察次数；
注意：使用MedDRA版本13.1将不良事件编码。仅报道发作日期从研完药物的第一次给药日期至研究药物停用后30天内之间的不良事件。时于经历相同编码事件超过一次的受试者，仅呈现具有最高严重度的事件。
a注意暴露是基于ITT群体。
b包括皮疹、斑状丘疹、瘙痒性皮疹、全身性皮疹和流行性皮疹。
大多数AE是轻度或中度(1级或2级)。3级或4级AE汇总在表 29中。经历≥3级AE的受试者的百分比在CVC组中(总计4％)比在 EFV组中(15％)更低。EFV组中的一位受试者(受试者06007)具有自杀意念的4级AE，这被认为是严重的。在CVC治疗的受试者中没有报道4级AE。在超过1位受试者中没有报道≥3级的AE(优选术语)。
表28提供了死亡、SAE、AE、不同严重程度的AE、与研究药物相关的AE以及导致停药的AE的概述。
表28
Figure GDA0002945251210000831
N＝受试者数目；n＝观察次数；
注意：使用MedDRA版本13.1将不良事件编码。仅报道发作日期从研究药物的第一次给药日期至研究药物停用后30天内之间的不良事件。对于经历相同编码事件超过一次的受试者，仅呈现具有最高严重度的事件。
a注意暴露是基于ITT群体。
b根据研究人员所知被认为至少可能与研究药物(即，CVC、EFV或 FTC/TDF)相关的AE。
表29
Figure GDA0002945251210000841
N＝受试者数目；n＝观察次数；
注意：使用MedDRA版本13.1将不良事件编码。仅报道发作日期从研究药物的第一次给药日期至研究药物停用后30天内之间的不良事件。对于经历相同编码事件超过一次的受试者，仅呈现具有最高严重度的事件。
a注意暴露是基于ITT群体。
b在CVC 100mg组中的受试者10004和54001。
c在CVC 200mg组中的受试者06009、42001和45005。
d在EFV组中的受试者06005、06007、46003和48001。
e注意：这项(EFV组中的自杀意念)是4级事件；所有其他事件均是3级。
严重不良事件汇总在表30中。
表30-直至第48周具有严重不良事件的受试者数目(％)-安全性群体
Figure GDA0002945251210000851
N＝受试者数目；n＝观察次数；
注意：使用MedDRA版本13.1将不良事件编码。仅报道发作日期从研究药物的第一次给药日期至研究药物停用后30天内之间的不良事件。对于经历相同编码事件超过一次的受试者，仅呈现具有最高严重度的事件。
a注意暴露是基于ITT群体。
导致停用的不良事件
导致研究药物停用的AE汇总在表31中。总之，导致研究药物停用的Ae发生在CVC200mg组的1位受试者(2％)中和EFV组的6 位受试者(21％)中。在超过1位受试者中报道的导致研究药物停用的 AE(首选术语)是失眠和眩晕，在EFV组中分别报道于3位和2位受试者中；以及抑郁，在CVC 200mg组中报道于1位受试者中并且在 EFV组中报道于1位受试者中(失眠、眩晕和抑郁全部都是EFV的常见AE)。
表31-直至第48周具有导致研究药物停用的不良事件的受试者数目(％)-安全性群体
Figure GDA0002945251210000861
N＝受试者数目；n＝观察次数；
注意：使用MedDRA版本13.1将不良事件编码。仅报道发作日期从研究药物的第一次给药日期至研究药物停用后30天内之间的不良事件。对于经历相同编码事件超过一次的受试者，仅呈现具有最高严重度的事件。
a注意暴露是基于ITT群体。
b在CVC 200mg组中的受试者06001。
c在EFV组中的受试者02016、16031、20004、26001、46003和48001。
具有不同级别的治疗发生的实验室异常的受试者数目的综述给出在表32中。
表32
Figure GDA0002945251210000862
N＝受试者数目；n＝观察次数；
a百分比是基于具有给定实验室测定的受试者数目。
3级或4级(最差毒性级别)治疗发生的实验室异常汇总于表33 中。除了在CVC200mg组中更频繁观察到的CPK异常以外，具有3 级或4级实验室异常的受试者的百分比在治疗组之间没有差异。
表33-直到第48周的治疗发生的3级或4级(最差级别；DAIDS) 实验室参数-安全性群体
Figure GDA0002945251210000871
N＝受试者数目；n＝观察次数；
a百分比是基于具有给定实验室评定的受试者数目。
在CVC 200mg组中观察到的肌酸磷酸激酶(CPK)的3级或4级增加比在其他两个治疗组中更频繁。在CVC组中具有CPK的3级或 4级CPK增加的12位受试者(CVC 100mg有3位受试者且CVC 200 mg有9位受试者)中，11位受试者具有在一个单一时间点下观察到的 CPK升高(8位受试者具有3级升高并且3位受试者具有4级升高)(注意：这11位受试者中的1位[受试者48015]在第8周和第36周具有单独的3级CPK升高)。第12位受试者(受试者42001)具有2次连续的CPK升高(3级之后4级)，它们在后续访问时继续治疗的同时恢复到正常值。没有CPK升高与临床症状相关；没有受试者因CPK升高而停药，并且在CVC组与EFV组之间没有与肌肉骨骼病症相关的 AE的差异。
CPK与基线相比的变化示出在图51中。在任何治疗组中对于 CPK没有观察到随着时间推移的实际值或与基线相比的变化的明显趋势。
所选目标肝脏参数中具有分级的治疗发生的实验室异常的受试者的数目示出在表34中。没有观察到4级ALT或AST升高。除了一个3级AST升高以外，所有的ALT和AST升高均是1级或2级。在1位受试者(CVC 100mg组中的48015)中的3级AST升高是在单一时间点下被观察到的并且是无症状的；所述受试者并未因3级AST 升高而停用研究药物并且没有报道与AST升高相关的AE。此外，这位具有3级AST升高的受试者没有任何分级胆红素升高，但在与3 级AST升高相同的研究访问时具有一次单一3级CPK增加。所有胆红素异常均是1级或2级。大多数ALT、AST和胆红素升高都是短暂的，在后续访问时继续治疗后恢复至基线值，与任何临床症状不相关，并且没有造成停药。
表34-直到第48周选定肝脏参数的治疗发生的最差级别 (DAIDS)实验室异常-安全性群体
Figure GDA0002945251210000891
N＝受试者数目；n＝观察次数；
a百分比是基于具有给定实验室评定的受试者数目。
在第24和48周进行探索性分析，以评价具有治疗发生的实验室不良事件的受试者中的CVC暴露。特别受关注的是CPK升高(鉴于 CPK异常在CVC 200-mg组中的发生率增加)，以及受关注的肝脏参数(AST、ALT和胆红素)。两个暴露参数(Cavg和Cmin)被认为可合理地探索与实验室异常可能的关系；然而Cavg被认为是最相关的，因为它反映总体CVC暴露。
尽管由于研究治疗组之间的差异而存在关于CPK升高的剂量-反应关系的可能信号，但这些广泛的探索性分析都未能揭露任何暴露- 反应关系。评价Ln暴露对比CPK严重度等级＞2的概率的逻辑回归分析输出没有确定CVC暴露和CPK升高之间存在关联。没有CPK升高的频率或严重度相对于CVC暴露渐增的趋势。
对ALT、AST和胆红素升高进行类似分析，并且这些分析并未揭示CVC暴露与肝脏相关性实验室异常之间的任何明显的关系(图 52-图55)。
代谢参数
具有空腹访问时分级的治疗发生的空腹实验室异常的受试者的数目示出在表35中。总胆固醇、LDL胆固醇、甘油三酯或葡萄糖的所有异常均为1级或2级。在CVC组中具有总胆固醇和LDL胆固醇异常的受试者的百分比比在EFV组中更低，这与在CVC治疗期间胆固醇随时间的减少相一致(图56)。
表35-直到第48周在空腹访问时的治疗发生的最差级别 (DAIDS)空腹实验室异常
Figure GDA0002945251210000901
N＝受试者数目，n＝观察次数。
注意：(LDL)胆固醇的4级异常和甘油三酯的1级异常在DAIDS分级标度下不可用。
a百分比是基于具有给定实验室评定的受试者数目。
HbAlc、HOMA-IR、空腹LDL、空腹HDL、空腹总胆固醇、空腹总胆固醇/HDL比率以及空腹甘油三酯的平均基线值和与基线相比的变化示出在表36中。代谢参数与基线相比的平均变化示出在图56 中。在CVC治疗(包括CVC 100mg和200mg两者)期间观察到总胆固醇的减少，这主要是由于LDL胆固醇的减少(参见表36)。与此相反，在EFV治疗期间观察到LDL胆固醇以及HDL胆固醇的增加。在所有治疗组中观察到空腹总胆固醇/HDL比率的少量和相当的下降。没有观察到葡萄糖、胰岛素、HOMA-IR、HbAlc和甘油三酯随时间推移的显著变化(参见表36)。
表36-直到第48周的空腹代谢实验室参数与基线相比的平均变化-安全性群体
Figure GDA0002945251210000911
Figure GDA0002945251210000921
HbAlc＝A型血红蛋白；HDL＝高密度脂蛋白；HOMA-IR＝评定的稳态模型-胰岛素抗性；
LDL＝低密度脂蛋白；N＝受试者数目。
注意：基线被定义为在研究治疗开始之前最后一个无缺失评定。
在任何治疗组中，在第24周和第48周没有观察到腰臀比与基线相比的显著变化。
心血管安全性
治疗期间最差的治疗发生的ECG异常汇总于表37中。CVC组中具有＞30-60毫秒的QTc增加的受试者的比例与EFV组相比较低。在CVC 100mg组中仅1位受试者具有＞60msec的QTc增加。没有受试者具有延长的或病理上延长的QTc。
在任何治疗组中在治疗期期间，没有观察到ECG参数的临床相关变化。
表37-直到第48周治疗期期间最差的治疗发生的ECG异常
Figure GDA0002945251210000931
N＝受试者数目；a＝观察次数。
注意：百分比是基于具有给定ECG参数的受试者数目。
a QTcF；正常＜450ms≤界线≤480ms＜延长≤300ms＜病理。
b QTcB；正常＜450ms≤界线≤480ms＜延长≤300ms＜病理。
c异常ORS；低异常≤50ms＜正常＜120ms≤异常。
d这位受试者(受试者06004)在第24周具有120ms的QRS值并且具有125ms的筛选值和＜120ms(即111ms；参见列表16.2.8.7)的基线值。
e异常PR；正常＜210nm≤高异常
f异常HR；低异常≤50bpm＜正常＜120bpm≤高异常。
生命体征
在任何治疗组中均未观察到关于任何生命体征参数(收缩压和舒张压、心率)的临床相关平均变化。来自2期试验的关于MCP-1的数据观察结果。已显示MCP-1蛋白和基因表达在患有慢性肝病伴随不同程度的肝损伤和纤维化的患者的肝组织中上调。如先前所示，在非临床和临床研究中在CVC治疗之后观察到血浆MCP-1水平的代偿性增加，这表明强效的CCR2阻断。虽然继发于CVC的CCR2拮抗作用的MCP-1水平的持久代偿性增加在人中的影响目前尚不清楚，但现有数据基于48周安全性数据未表明肝胆病症或肝脏参数异常的风险增加。
没有在临床病理学参数或任何组织(包括肝脏)中通过在1000 mg/kg/天的高剂量下的显微评价看见炎症的任何指示，其中在慢性(3 和9个月)猴毒性研究中的血浆MCP-1水平是对照的约5倍。
事实上，在NASH的小鼠模型中观察到的CVC在100mg/kg/天剂量下的抗纤维化作用与显著增加的血浆MCP-1水平一起可见。另外，在CVC治疗长达48周的受试者中观察到APRI和FIB-4纤维化指数评分的改善，尽管MCP-1有显著和持续的升高。另外，在此研究中，CVC在用CVC 100mg和200mg治疗长达48周的115位受试者中普遍耐受良好。
第1年和第2年的NAS和肝纤维化分期(NASH CRN系统和Ishak) 的变化将通过组织学进行评定。也将对肝活检物上胶原蛋白的形态定量评定的变化进行评定。将评价疗效终点和MCP-1血浆水平之间的相关性，以确定使用CVC治疗所观察到的持久MCP-1增加是否在具有由NASH所引起的肝纤维化的受试者中造成潜在风险。
实施例23：炎症和免疫功能的生物标志物
使用CVC观察到MCP-1(CCR2的配体)随时间推移而增加的剂量 -反应，所述配体是单核细胞上可见的趋化因子受体，而MCP-1在EFV 组中保持基线值。EFV与CVC 100mg和CVC200mg治疗组之间血浆MCP-1与基线相比的变化的差异在第24周和第48周是统计学上显著的(p<0.001)，这表明CVC具有强效且剂量依赖性CCR2阻断作用。此外，在两个CVC治疗组中均观察到sCD14(单核细胞活化的生物标记物和HIV感染的死亡率的独立预测因子)在前24周内的下降，而在EFV组中，在相同的观察期内观察到sCD14的增加。在第24 周和第48周之间，sCD14水平在CVC治疗的受试者中恢复到基线值，而它们在EFV治疗的受试者中继续上升。CVC组和EFV组之间与基线相比的变化的差异在第24周和第48周以及在重复分析中的第48 周是统计学上显著的(p<0.001)。这些结果表明了CVC对降低单核细胞活化的潜在作用。
在治疗组之间没有观察到其他炎症生物标记物(hs-CRP、纤维蛋白原、IL-6和D-二聚体)和免疫功能的生物标记物(CD4+T细胞上或CD8+T细胞上的总CD38+表达和总HLA DR+表达)与基线相比的变化的有意义差异。
实施例24：与细菌易位相关联的生物标记物的测量
在CVC治疗的受试者中sCD14水平的降低也可以等同于细菌易位的减少，所述细菌易位是在具有HIV感染的患者[15]以及患有 NASH[16-18]、酒精性肝病[17,19]、HIV/HCV共感染[20]以及肝硬化 [21]的患者中普遍观察到的现象。细菌易位是由于肠上皮细胞紧密连接(TJ)的破坏而产生，其损害肠粘膜屏障，所述现象通常被称为肠漏。肠完整性的降低已与免疫缺陷和/或肠道菌群的显著变化(也被称为生态失调和细菌过度生长)相关联。微生物产物诸如脂多糖(LPS)和16S 核糖体DNA(16S rDNA)的后续易位有助于免疫活化。LPS(革兰氏阴性细菌的细胞壁的组分)结合膜或可溶性CD14(sCD14；在LPS激活单核细胞后产生)和髓样分化蛋白-2(MD-2)-TLR4复合物[14]。
脂多糖在单核细胞和巨噬细胞中是炎性细胞因子特别是TNF-α的最有效的诱导物。高血浆sCD14水平预测HBV和HCV感染的疾病进展，而不依赖于肝脏炎症、纤维化和疾病进展的其他标记物[20]。暴露于肠源性细菌产物(最显著的是内毒素，包括LPS)导致肝脏炎症、肝细胞损伤和肝纤维化[22]。经由TLR4依赖性机制的Kupffer细胞活化和肝星形细胞的后续活化都是纤维发生的有效驱动因子[19]。
此假设将通过测试来自研究652-2-202、即将进行的肝损害研究 652-1-121和肝纤维化PoC研究652-2-203的归档样本中的细菌易位的生物标记物来进行评价。这些生物标记物将包括LPS、LPS结合蛋白(LBP)、sCD14、肠脂肪酸结合蛋白(I-FABP)。
实施例25-基于CVC临床1期数据和2期的结论
HIV感染的受试者中的数据CVC已经在健康志愿受试者(n＝390) 中的14个单剂量和多剂量生物利用度研究和DDI研究中以及HIV感染的受试者(n＝159)(包括用CVC治疗长达48周的115位受试者)中的两个2期研究中进行评价。
在仅给予CVC的1期研究中观察到的最常见的不良事件与1期研究单元中通常报道的情况一致。总之，不良事件的模式表明CVC 在评价高达800mg的单剂量CVC以及在持续10天的多个高达200 mg的日剂量下的这些1期研究中普遍耐受良好。在这些研究中观察到的转氨酶升高的频率和幅度与科学文献中针对1期研究所描述的模式一致。已经在2a期的10-天CVC单一疗法研究中以25-mg至 150-mg的剂量(n＝44)以及在2b期的48周功效和安全性研究中以CVC 100mg和CVC 200mg的剂量(n＝115)评价CVC。在两项研究中和所有剂量下，CVC均呈现有利的不良事件概况。基于来自2b期研究的 48周数据，CVC与肝胆病症或转氨酶升高的风险增加并不相关。在此研究中，在CVC治疗的受试者中观察到总胆固醇和LDL胆固醇的降低。在48周治疗期期间，没有观察到临床相关的ECG参数的变化或任何生命体征参数的变化。没有观察到关于不良事件、实验室异常 (包括CPK、ALT、AST和胆红素升高)或剂量限制性毒性的明显剂量或暴露关系。
基于来自1期程序的数据和来自HIV感染受试者的研究的2期数据，计划在研究652-2-203中，评价在患有由NASH所引起的肝纤维化的受试者的治疗中持续2年时间段每天服用一次的CVC 150 mg(主要研究终点在第1年)。所述研究的交叉设计将评价连续2年的CVC治疗以及在1年安慰剂治疗接着1年CVC治疗的安全性和疗效。 CVC治疗对由NASH所引起的肝纤维化的影响的标准评定将基于来自肝活检的组织学数据和组织学改善的其他量度来进行。安全性和耐受性将被评定，并且将对肝或其它器官毒性的体征进行仔细监测，包括由独立的数据监测委员会进行的定期数据审查。预期所述研究将阐明CVC的抗炎和抗纤维化活性及其对由NASH所引起的肝纤维化的影响，并且针对CVC 150mg的安全性和耐受性评定提供另外的数据。
实施例26-评价NASH中的肝组织学改善的CVC研究
基于指示CVC具有抗炎和抗纤维化活性并且普遍耐受良好的非临床和临床数据，Tobira计划在2期研究中在患有由NASH所引起的肝纤维化的受试者中探究CVC。该2期研究将评价CVC用于治疗患有肝纤维化的成年受试者中的NASH的功效，这些成年受试者由于至少一种影响因素的存在而处在疾病进展的风险下，所述至少一种影响因素包括2型糖尿病(T2DM)、具有由国家胆固醇教育计划(National Cholesterol Education Program,NCEP)所定义的代谢综合征(MS)的至少1个标准的高身体质量指数(BMI)(>25kg/m2)、桥接纤维化和/或明确型NASH(NAS≥5)。
所述2期研究被设计用于评价CVC治疗这种严重病状的潜力并解决患有由NASH所引起的肝纤维化的患者的未满足的重大医疗需求。所述研究是随机、双盲、安慰剂对照研究，其被设计用于在患有由NASH所引起的肝纤维化的受试者中评价CVC 150mg与安慰剂相比的疗效和安全性。研究群体由患有由NASH(NAS≥4)所引起的肝纤维化(NASH临床研究网络[CRN]阶段1-3)且处于疾病进展的风险下的受试者组成。
将在研究652-2-203中基于以下考虑因素评价CVC 150mg(DP7 制剂)的剂量对患有肝纤维化的受试者中的NASH的治疗作用：
预期CVC将提供抗炎和抗纤维化活性，这主要是由于其对CCR2 和CCR5共受体的拮抗作用以及对促炎性单核细胞募集、迀移和浸润到肝损伤部位所产生的作用。因此，对于选择用于本研究的剂量的主要考虑因素是确保CVC血浆暴露足以提供CCR2和CCR5的近乎最大的拮抗作用。
CVC对CCR2和CCR5的拮抗作用已在体外和离体研究中以及 CVC治疗HIV-1感染的2个临床研究(2a期研究652-2-201和2b期研究652-2-202)中进行评价。在每种情况下，观察到CCR2和CCR5的强效且浓度依赖的拮抗作用。通过在这2个2期研究中分别测量血浆MCP-1(CCR2的配体)浓度与基线相比的变化和血浆HIV-RNA(HIV 进入所需的CCR5共受体)的变化，建立CCR2和CCR5拮抗作用的临床证据。
在研究652-2-202中，在115位HIV-1感染受试者中评价长达48 周(CVC摄入的平均[SE]持续时间：41.1[1.33]周)的CVC 100mg和 CVC 200mg(DP6制剂)的剂量，并且发现在HIV感染的治疗中是有效的和耐受良好的。基于表明渐增的CVC血浆浓度与改善的病毒学结果相关的暴露-反应分析，CVC 200mg被认为是用于在3期研究中对作为治疗HIV感染的抗病毒剂的CVC进一步评价的适当剂量。
然而，当在相同给药条件下施用CVC时(研究652-1-111、 652-1-110、652-2-202)，与HIV感染受试者相比，在非HIV感染的健康志愿受试者中的CVC血浆暴露似乎更高。在研究652 2 203中将评价CVC 150mg的剂量对患有肝纤维化的受试者中的NASH的治疗作用。基于引用的现有数据，所述剂量被认为是在治疗相关的范围内并且预期将在患有NASH和肝纤维化的受试者中提供与CVC 200mg相当的暴露，CVC 200mg在研究652-2-202中进行评价并且被发现产生强效的CCR2和CCR5拮抗作用。
计划共有250位受试者(每个治疗组125位受试者)，并且总研究治疗持续时间为2年。研究群体将包括患有NASH(NAS≥4)和肝纤维化(阶段1至3[NASH CRN系统])的受试者，其由于≥1种影响因素的存在而处于增加的疾病进展风险：
2型糖尿病的书面证据
具有如NCEP所定义的代谢综合征的下列标准中的至少1种的高 BMI(>25kg/m2)：
中心性肥胖:腰围≥102cm或40英寸(男性)，≥88cm或35英寸(女性)
血脂异常：TG≥1.7mmol/L(150mg/dL)
血脂异常：HDL-胆固醇<40mg/dL(男性)，<50mg/dL(女性)
血压≥130/85mmHg(或接受高血压治疗)
空腹血糖≥6.1mmol/L(110mg/dL)；或
桥接纤维化(NASH CRN阶段3)和/或明确型NASH(NAS≥5)。
将会有2个治疗期。治疗期1将由1年的双盲随机治疗(CVC 150 mg或匹配的安慰剂)组成。受试者和研究人员在时期1期间将对治疗分配保持不知情。在治疗期2期间，原本随机分配到CVC 150mg的受试者将继续再接受所述治疗一年，并且原本随机分配到安慰剂的受试者将从安慰剂交叉到CVC 150mg。
受试者将接受研究药物，每天一次(QD)，持续2年。所述研究将包括2个治疗期：治疗期1(第一年)和治疗期2(第二年)。合格的受试者将在治疗的第一年期间(治疗期1)被分配来接受CVC(n＝126)或匹配的安慰剂(n＝126)。对于治疗期2，安慰剂治疗的受试者的一半(在基线处随机分配)将交叉到CVC，而另一半将在第二年的治疗中继续接受安慰剂。在基线处(第1天)，在筛选评价之后，合格的受试者将利用通过筛选时根据NAS(4或≥5)和纤维化分期(≤2或>2)分层的置换区组随机化(permuted block randomization)分配给治疗组。合格的受试者将以2:1:1的比率被随机分配至以下3个治疗组之一：
表38
组 N 治疗期1 治疗期2
A 126 CVC 150mg,QD CVC 150mg,QD
B 63 匹配的安慰剂，QD CVC 150mg,QD
C 63 匹配的安慰剂，QD 匹配的安慰剂，QD
CVC和匹配的安慰剂将作为双盲研究药物施用。研究药物(CVC/ 匹配的安慰剂)应每天早上与食物一起服用。
主要终点(第1年)活检必须在治疗期1结束前的1个月内和开始治疗期2之前进行。最后(第2年)活检必须在研究药物治疗结束前的 1个月内进行。
招募将在有限数量的地点开始，直到最多20位受试者已被随机分配和治疗并且安全性数据已由数据监测委员会(Data Monitoring Committee,DMC)审查。第一DMC审查将在第一位受试者被招募的3 个月内，或当最多20位受试者已被随机分配并且至少10位受试者已被治疗1个月时进行，无论哪种情况先发生。一旦DMC已评价这些最初的10至20位受试者的安全性数据并确定所述研究可以继续，就将进行其余研究受试者的后续招募。
在治疗期1期间，所有受试者将在第1个月的第2周和第4周接受安全性评定。另外，最初的20个受试者将在第1个月的第1周和第3周接受安全性评定。所有受试者将在第2个月期间每2周接受一次研究访问评定，在第3至6个月期间接受每月一次的访问，并在第 8、10和12个月接受访问。在治疗期2期间，受试者将在第13至15 个月期间以及第18、21和24个月接受每月访问。
关键性评定
在研究期间：
肝活检将在筛选时、在主要终点处(第1年：治疗期1结束前的1 个月内和开始治疗期2之前)和在第2年(治疗结束前的1个月内)进行
促炎性细胞因子、炎症的生物标记物、肝细胞凋亡的生物标记物、细菌易位的生物标记物、空腹代谢参数、肾参数以及eGFR将在基线处以及第3、6、12、15、18和24个月时进行测量。
在可用的部位，非侵入性肝成像(例如，超声瞬时弹性成像[TE]、二维磁共振弹性成像[MRE]、声辐射力脉冲[ARFI])的评定将在基线处以及在第6、12、18和24个月时进行。
CVC的药代动力学样本将在基线处(在即将开始治疗前的给药前样本)、第0.5、3和15个月(给药前和给药后至少1小时)以及第6、 12、18和24个月(给药前)时进行收集。
体重、腰围、臀围、臂围和三头肌皮褶厚度将在基线处和第3、 6、12、15、18和24个月时进行测量。身高将在筛选时和第12个月时进行测量。
身体检查和实验室分析将在每次访问时进行。ECG将在基线处和在第3、6、12、15、18和24个月时进行。
不良事件和伴随用药将在每次访问时进行评定。
知情同意书和关于NASH、肝纤维化和肝活检程序的患者教育材料将在筛选访问时进行审查。
研究药物日记将在分配研究药物的同时被提供给每个受试者。所述日记将在所有治疗期间访问和早期停药访问时进行审查。
受试者将在接受其最后治疗后的1个月返回临床，以结束研究随访评价。
所述研究的主要功效目标将是评价第1年的非酒精性脂肪肝病 (NAFLD)活动评分(NAS)相对于筛选活检的肝组织学改善，所述改善由最小2分的NAS改善以及小叶炎症和气球样变性分类的至少1分的改善和没有纤维化分期的同时恶化(恶化被定义为进展至桥接纤维化或肝硬化)所定义。
次要功效目标包括评价在第2年无肝纤维化分期的同时恶化(恶化被定义为进展至桥接纤维化或肝硬化)的NASH解决；在第1年无肝纤维化分期的同时恶化(恶化被定义为进展至桥接纤维化或肝硬化) 的NASH解决；CVC在患有肝纤维化的成年受试者的1年和2年NASH治疗中的安全性和耐受性；CVC在群体PK分析中的血浆PK 的表征；评价第2年的NAS的肝组织学改善，由最小2分的NAS改善和超过1个类别的至少1分的改善以及没有纤维化分期的同时恶化 (恶化被定义为进展至桥接纤维化或肝硬化)所定义；在第1年和第2 年在患有肝纤维化的成人受试者中评价CVC相对于安慰剂的疗效，如肝活检物上的形态定量胶原蛋白的变化所测定；在第1年和第2年评价组织学纤维化分期(非酒精性脂肪性肝炎临床研究网络[NASH CRN]系统和Ishak)的变化；在第1年和第2年评价肝组织纤维发生蛋白(α-平滑肌肌动蛋白[α-SMA])的变化；在第3、6、12、15、18和24 个月评价非侵入性肝纤维化标记物(APRI、FIB-4、透明质酸、FibroTest (FibroSure)、NAFLD纤维化评分[NFS]和增强肝纤维化测试[ELF])与基线相比的变化；在第1年和第2年评价肝细胞凋亡的生物标记物与基线相比的变化；在第3、6、12、15、18和24个月评价肝脏参数和空腹代谢参数与基线相比的变化；在第3、6、12、15、18和24个月评价体重、BMI、腰围、腰臀比、臂围和三头肌皮褶厚度与基线相比的变化。
第三目标包括评价无创肝成像方法(例如，超声瞬时弹性成像 [TE]、二维磁共振弹性成像[MRE]、声辐射力脉冲[ARFI])在第6、12、 18和24个月(在可用的部位)时与基线相比的变化；促炎性细胞因子和炎症的生物标记物在第3、6、12、15、18和24个月时与基线相比的变化；肾小球滤过率估计值(eGFR)和肾参数在第3、6、12、15、 18和24个月时与基线相比的变化；以及与细菌易位相关的生物标记物在第3、6、12、15、18和24个月时与基线相比的变化。
实施例27–赛尼克韦罗在硫乙醇酸盐诱导的小鼠腹膜炎模型中的作用
总结：小鼠硫乙醇酸盐诱导的腹膜炎模型是常用的临床前模型，其用于评定抗炎细胞的募集并评定巨噬细胞的活化。此研究的目标是评价赛尼克韦罗(CVC)在小鼠硫乙醇酸盐诱导的腹膜炎(TIP)模型中的作用。从第1天至第5天，动物通过口服灌胃以10mL/kg的剂量体积接受媒介物、CVC或阳性对照。在组2至组5中的每天两次(BID) 给药间隔开大约12小时。在第4天，在给予媒介物、CVC或阳性对照之后2小时(在对BID组首次给药之后2小时)，动物接受1mL/动物的体积的盐水(组1)或3.85％硫乙醇酸盐(TG)的腹膜内注射。
表39-实验设计
Figure GDA0002945251210001031
TG＝硫乙醇酸盐
*对照动物接受对于CVC的媒介物(DI水中的0.5％(w/v)甲基纤维素、1％
Figure GDA0002945251210001033
80(pH约1.3))
在此研究中评价以下参数和终点：临床体征、体重、腹膜灌洗细胞计数、外周血细胞计数以及药代动力学评价。没有治疗相关的临床体征或对体重的作用。没有观察到循环血液细胞计数的清楚的变化。在鼠类硫乙醇酸盐腹膜炎模型中进行CVC施用之后，观察到在腹膜炎症细胞募集(在总白细胞和单核细胞群体)方面的明确剂量相关性降低。在三个剂量水平下的CVC的血浆暴露具有剂量相关性增加。当 BID给予时与QD相比CVC似乎更有效，这与使用BID给药实现的更高血浆浓度和小鼠中已知的短半衰期(约2小时)一致。
研究设计：从第1天至第5天，动物通过口服灌胃以10mL/kg 的剂量体积接受媒介物(DI水中的0.5％(w/v)甲基纤维素、1％
Figure GDA0002945251210001032
80(pH约1.3)、CVC或阳性对照(地塞米松(Dex),批次071M1180V)。在组2至组5中的BID给药间隔开大约12小时。一次制备制剂以用于整个研究并且将试样等分以用于给药的每一天。
在第4天，在给予媒介物、CVC或阳性对照之后2小时(在对BID 组首次给药之后2小时)，动物接受1mL/动物的体积的盐水(组1)或 3.85％硫乙醇酸盐(组2-7)的腹膜内注射。在此实验中将地塞米松用作阳性对照，因为它是已知减少许多动物模型中的炎症的皮质类固醇。鼠类炎症模型指示当每天施用时地塞米松的有效剂量范围是0.3至3 mg/kg QD。在此基础上，对此特定研究，选择1mg/kg的中间剂量。
在一生中的程序、观察和测量：每天至少进行一次发病率/死亡率检查。在给药之前并且在验尸之前记录体重。
最终程序：在硫乙醇酸盐注射之后48小时通过CO2窒息处死所有动物并且使用2.5mL含有0.01M EDTA的冰冷无菌无Ca2+/Mg2+ PBS进行腹膜灌洗。通过初始穿刺部位使用2.5mL的第二注射重复灌洗并且将每只动物的样本合并。
将灌洗流体放置于湿冰上，以等待使用Advia分析仪对总细胞计数和分类细胞计数进行处理。在灌洗收集之后，从每只小鼠中通过心脏内穿刺术或者从腔静脉收集血液样本(0.7mL)(记录收集时间)。将 0.5mL血液放置于EDTA管中，将其转移到临床病理学并使用Advia 分析仪对分类细胞计数进行分析。将0.2mL血液放置于K2EDTA管中并处理成血浆。通过离心(3000rpm，在4℃下持续10分钟)收集血浆并放置于干冰上。对样本进行分析以测定CVC血浆水平。在血液收集之后，然后通过对腹主动脉进行切片来对动物放血。
统计学分析：对由灌洗和血液样本获得的分类细胞计数进行使用事后比较Dunnett氏统计分析的单向ANOVA。与组2相比，进行分析。
结果
死亡率：在进行研究期间没有出现死亡率。
临床观察：在进行研究期间没有注意到不寻常的临床体征。
体重：在CVC施用之后(第1天至第6天)体重没有显著的变化。来自地塞米松组(第7组)的体重从第1天至第6天稍微降低。体重数据呈现在图57A、图57B以及图57C中。
腹膜灌洗：在使用硫乙醇酸盐诱导的所有组中都观察到单核细胞 /巨噬细胞和总白细胞的增加。当与TG对照(组2)相比时观察到明显的CVC的剂量相关性作用，从而在剂量≥20mg/kg下达到统计学显著性(p<0.05)。而且，当BID给予时与QD相比，CVC似乎更有效，因为在20mg/kg BID(10mg/kg/剂量)下观察到的募集的减小大于在 20mg/kg QD下观察到的减小。与硫乙醇酸盐对照(组2)相比，对于组 3至组6，总白细胞的减少分别是0.8％、22.2％、57.6％和14.2％，而对于组3至组6，单核细胞的减少分别是5.7％、45.2％、76.5％和26.0％。地塞米松使总白细胞计数减少26.6％并且使单核细胞减少38.1％。数据呈现在图57-图60。
血细胞评价：没有观察到循环血液细胞计数的清楚的变化。在组平均值中观察到总白细胞和单核细胞的稍微差异；然而，所述差异被认为是与单个变化相关的并且总白细胞是在此品种小鼠的历史范围内(280至3870个细胞/μL)。组平均值总结呈现在表40中并且个别数据呈现在图57中。
PK分析：在BID给药之后，近似波谷处的CVC血浆水平(给药后14小时)以剂量相关性方式增加。在20mg/kg/天，与BID给药相比，使用QD给药可见更低血浆水平。数据汇总在表40中。
表40-循环血细胞计数(平均值±标准误差)
Figure GDA0002945251210001061
动物如表41所列出给药。
表41-实验设计
Figure GDA0002945251210001062
TG＝硫乙醇酸盐；*对照动物接受时于CVC的媒介物(DI水中的0.5％(w/v)甲基纤维素、 1％
Figure GDA0002945251210001063
80(pH约1.3))
动物从第1天至第5天通过口服灌胃接受测试物质。在组2至组 5中的每天两次(BID)给药间隔开大约12小时。在第6天收集血液样本以用于评定血浆水平。通过心脏内穿刺术或者从腔静脉收集样本，将其置于K2EDTA管中并处理成血浆。将样本冷冻保存在-70°至-90°，直到分析为止。由于处死时间(在硫乙醇酸盐施用之后48小时)由主要端点所陈述，在给药后大约14小时对组2-5收集样本并且在给药后 26小时对其余组收集样本。对动物105、201、303和503没有收集样本。
通过KCAS(Shawnee，KS)使用先前验证的LC/MS/MS猴血浆方法(50μL测定，范围10.0-1920ng/mL)测定血浆中的CVC水平。
表42提供接受CVC的每个剂量组的平均血浆水平。所有剂量组的个别值提供在图61中。在组1、2和7中未注意到可检测的CVC。
表42-在第6天小鼠中的CVC的血浆水平(平均值和标准偏差)
Figure GDA0002945251210001071
Figure GDA0002945251210001073
标称时间、实际收集时间是14.5小时(组3)、15小时(组4)、15.5小时(组5)和28小时(组6)
Figure GDA0002945251210001072
5个样本中的3个低于LLOQ(10ng/mL)
在BID给药之后，近似波谷处的CVC血浆水平(给药后约14-16 小时)以剂量相关性方式增加。在20mg/kg/天，与BID给药相比，使用QD给药可见较低的血浆水平。
结论：在鼠硫乙醇酸盐腹膜炎模型中进行CVC施用之后，观察到在腹膜炎症细胞募集(在总白细胞和单核细胞群体)方面的明确剂量相关性降低。在三个剂量水平下的CVC的血浆暴露具有剂量相关性增加。当BID给予时与QD相比CVC似乎更有效，与使用BID给药实现的更高血浆浓度和小鼠中已知的短半衰期(约2小时)一致。
实施例28-CCR2+浸润单核细胞促成对乙酰氨基酚诱导的急性肝损伤-抑制CCR2和CCL2的治疗含义
背景和目标：在对乙酰氨基酚(APAP)中毒之后的肝损伤是急性肝衰竭(ALF)的主要过程之一。APAP引起肝细胞坏死，接着活化驻留的免疫细胞如Kupffer细胞(KC)，释放各种趋化因子(例如，CCL2)和免疫细胞浸润(例如，单核细胞)。CCR2+单核细胞促成APAP诱导的损伤并研究了在药代动力学方面阻断CCR2或CCL2的治疗潜能。
方法：通过静脉内注射APAP(250mg/kg体重)使C57BL/6J(WT) 和Ccr2-/-小鼠经历ALF。分析在Ccr2-/-和WT小鼠以及皮下使用 mNOX-E36(强效CCL2抑制剂)或使用口服CCR2/CCR5拮抗剂赛尼克韦罗(CVC)治疗的WT小鼠中的肝损伤和免疫细胞表型。
结果：Ccr2-/-小鼠在APAP注射之后12h与WT小鼠相比显示显著减少的肝损伤，如通过组织学和减小的ALT值确定的(p<0.05，图62)。流式细胞术分析显示Ccr2-/-小鼠肝脏中促炎性Ly6C+单核细胞衍生的巨噬细胞的数目显著减少，而中性粒细胞或其他免疫细胞子集的数目仍与WT小鼠类似。虽然肝IL1β、TNF-α和CCL2在WT 和Ccr2-/-小鼠中类似地降低，但是IL10在来自Ccr2-/-小鼠的肝脏中较高(p<0.05)，并列的是肝巨噬细胞上的差异标记物表达(CD1d, CD68)。两种药理学抑制剂mNOX-E36或CVC能够显著降低APAP- 损伤肝脏中的单核细胞累积，从而能够显著保护使其免于肝损害 (ALT水平，对于mNOX是p<0.05并且对于CVC是p<0.01)。
结论：通过抑制趋化因子受体CCR2或其配体CCL2(MCP-1)来靶向促炎性单核细胞的不利作用是限制在对乙酰氨基酚过量给药之后的肝损伤的有前景治疗选项。
实施例29：双CCR2/CCR5拮抗剂赛尼克韦罗导致实验急性肝损伤中的促炎性CCR2+单核细胞浸润的强效且显著的减少
研究目标：急性肝衰竭(ALF)是伴随肝功能急速恶化且具有有限治疗选项的威胁生命的病状。在小鼠模型中，毒性剂如四氯化碳(CCl4) 或对乙酰氨基酚(APAP)所导致的肝损伤导致促炎性单核细胞通过 CCR2–CCL2(也称为MCP-1)趋化因子途径快速浸润到肝脏中。赛尼克韦罗(CVC)是一种口服、每天一次的CCR2/CCR5拮抗剂，其目前在2b期临床试验中在患有NASH和肝纤维化的成人中评价。评价 CVC抑制体内CCl4和APAP-诱导的急性肝损伤的单核细胞浸润。
方法：通过CCl4(0.6ml/kg IP)或APAP(250mg/kg IV)使 C57BL/6J(WT)和CCR2-缺陷型小鼠经历ALF。在两种模型中，小鼠通过口服灌胃接受CVC(100mg/kg)或媒介物。分析肝损伤和免疫细胞表型。对于机制研究，通过FACS分选来自受损肝脏的单核细胞衍生的巨噬细胞子集和驻留巨噬细胞(Kupffer细胞)并使其经历基于阵列的Nanostring基因表达分析。
结果：根据趋化因子受体CCR2，CCl4和APAP二者均导致受伤肝脏中Ly6C+单核细胞衍生的巨噬细胞快速且大量累积。对于 CCl4和APAP诱导的急性肝损伤，口服施用CVC显著降低了血液中的促炎性Ly6C+单核细胞(p<0.01)和肝脏中的单核细胞衍生的巨噬细胞。CVC治疗将肝脏中的Ly6C+单核细胞衍生的巨噬细胞在CCl4之后36h从5.49％±0.49％(肝脏白细胞)降低至0.95％±0.14％并且在 APAP之后12h从6.01％±0.66％降低至0.95％±0.11％(对于两个模型，p<0.001，83％-84％降低)。CVC对浸润单核细胞的抑制与ALT 从4365U/L±951减少至1088U/L±486(p<0.01,75％减少)和坏死面积分数从27.9％±4.05％减少至10.9％±3.50％(p<0.01，61％减少)对 APAP诱导的肝损伤进行的显著保护相关联。另外，Nanostring基因分析揭示趋化因子、趋化因子受体和toll样受体在Ly6C+CCR2+单核细胞衍生的巨噬细胞中的表达与急性肝损伤中的Ly6C-CCR2-相应物相比有所上调。进而，骨髓衍生的单核细胞的过继转移加重了 APAP诱导的肝损伤，从而进一步证实了ALF中CCR2+单核细胞的促炎性表型。
结论：CVC是促炎性单核细胞到急性肝损伤模型中的肝脏中的浸润的强效抑制剂。另外，CVC可被认为是限制对乙酰氨基酚过量给药后的肝损伤的有前景治疗选项。
实施例30：CCR2+浸润单核细胞促成对乙酰氨基酚诱导的急性肝损伤-抑制CCR2和CCL2的治疗含义背景和目标：在对乙酰氨基酚(APAP)中毒之后的肝损伤是急性肝衰竭(ALF)的主要过程之一。 APAP引起肝细胞坏死，接着活化驻留的免疫细胞如Kupffer细胞(KC)，释放各种趋化因子(例如，CCL2)和免疫细胞浸润(例如，单核细胞)。假设CCR2+单核细胞促成APAP诱导的损伤并研究了在药代动力学方面阻断CCR2或CCL2的治疗潜能。
方法：通过静脉内注射APAP(250mg/kg体重)使C57BL/6J(WT) 和Ccr2-/-小鼠经历ALF。分析在Ccr2-/-和WT小鼠以及皮下使用 mNOX-E36(强效CCL2抑制剂)或使用口服CCR2/CCR5拮抗剂赛尼克韦罗(CVC)治疗的WT小鼠中的肝损伤和免疫细胞表型。目前在II 期试验中测试两种药剂针对不同并发症(分别为糖尿病性肾病或 NASH)的人对应物。
结果：Ccr2-/-小鼠在APAP注射之后12h与WT小鼠相比显示显著减少的肝损伤，如通过组织学和减小的ALT值确定的(p<0.05，图63)。流式细胞术分析显示Ccr2-/-小鼠肝脏中促炎性Ly6C+单核细胞衍生的巨噬细胞的数目显著减少，而中性粒细胞或其他免疫细胞子集的数目仍与WT小鼠类似。虽然肝IL1β、TNF-α和CCL2在WT 和Ccr2-/-小鼠中类似地降低，但是IL10在来自Ccr2-/-小鼠的肝脏中较高(p<0.05)，并列的是肝巨噬细胞上的差异标记物表达(CD1d, CD68)。两种药理学抑制剂mNOX-E36或CVC能够显著降低APAP- 损伤肝脏中的单核细胞累积，从而能够显著保护使其免于肝损害 (ALT水平，对于mNOX是p<0.05并且对于CVC是p<0.01)。
结论：通过抑制趋化因子受体CCR2或其配体CCL2(MCP-1)来靶向促炎性单核细胞的不利作用是限制在对乙酰氨基酚过量给药之后的肝损伤的有前景治疗选项。
实施例31：双CCR2/CCR5拮抗剂赛尼克韦罗在肝纤维化和肾纤维化动物模型中的抗纤维化作用
背景和目标：C-C趋化因子受体类型2(CCR2)和5(CCR5)及其配体(包括CCL2和CCL5)之间的相互作用通过促进单核细胞/巨噬细胞募集和组织浸润以及肝星形细胞活化来介导纤维发生。赛尼克韦罗 (CVC)是具有针对两种受体的毫微摩尔效力的口服、双CCR2/CCR5 拮抗剂。在一系列炎症和纤维化的临床前模型中评价CVC的抗炎和抗纤维化作用。
方法：在硫乙醇酸盐诱导的腹膜炎小鼠模型中体内评定单核细胞 /巨噬细胞募集。在小鼠单核细胞上离体评价CCL2-诱导的趋药性。在硫代乙酰胺诱导的肝纤维化大鼠模型中和膳食诱导的非酒精性脂肪肝炎(NASH)和肾纤维化的小鼠模型中评价CVC抗纤维化作用。研究评定包括体重和肝重/肾重、肝功能测试、肝/肾形态学和胶原蛋白沉积、纤维发生基因和蛋白质表达以及药代动力学分析。
结果：CVC降低了体内单核细胞/巨噬细胞募集和离体单核细胞迁移。CVC显示抗纤维化作用，其中三个纤维化动物模型中的胶原蛋白沉积(p<0.05)和1型胶原蛋白蛋白质和mRNA表达显著降低。在NASH模型中，CVC显著减小了非酒精性脂肪肝病活动评分(p< 0.05，相对于对照)。CVC治疗对体重或肝重/肾重不具有显著的影响。
结论：CVC在一系列动物纤维化模型中显示抗炎性和抗纤维化活性，支持了对于纤维化疾病的人测试。在患有NASH和肝纤维化的成人的2b期研究目前正在进行中(CENTAUR研究652-2-203； NCT02217475)。
本文中的详述描述了本发明的各个方面和实施方案，然而，除非另外指出，否则它们都不意图限制。实际上，本领域技术人员在通读本公开后将能设想可在不背离本发明的范围和精神的情况下做出的变化、改变和调整，除非另外指示，否则所有这些均应被视为本发明的一部分。本申请人因此设想本文所述的本发明将仅由所附权利要求书所限制。
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Claims (13)

1.包含治疗有效量的塞尼克韦罗或其盐以及富马酸的药物组合物在制备用于治疗有需要的受试者的腹膜炎的药物中的用途。
2.如权利要求1所述的药物组合物的用途，其中所述腹膜炎是感染性的或非感染性的。
3.如权利要求1所述的药物组合物的用途，其中所述腹膜炎与胃肠道的穿孔相关联。
4.如权利要求1所述的药物组合物的用途，其中所述腹膜炎与流体到腹膜中的渗漏相关联。
5.如权利要求1所述的药物组合物的用途，其中所述腹膜炎与外来物相关联。
6.如权利要求1所述的药物组合物的用途，其中所述药物组合物被配制为口服组合物。
7.如权利要求1所述的药物组合物的用途，其中所述药物组合物每天施用一次或每天施用两次。
8.如权利要求1所述的药物组合物的用途，其中所述药物组合物进一步包含一种或多种另外的活性剂或治疗。
9.如权利要求8所述的药物组合物的用途，其中所述一种或多种另外的活性剂或治疗是一种或多种抗生素、糖皮质激素、皮质类固醇、己酮可可碱、磷酸二酯酶抑制剂、抗TNFα剂以及抗氧化剂。
10.如权利要求9所述的药物组合物的用途，其中所述一种或多种抗生素选自由以下组成的组：青霉素类、头孢菌素类、大环内酯类、氟喹诺酮类、磺胺类、四环素类以及氨基糖苷类或其组合。
11.如权利要求8所述的药物组合物的用途，其中所述一种或多种另外的活性剂或治疗是n-乙酰半胱氨酸(乙酰半胱氨酸；NAC)。
12.如权利要求11所述的药物组合物的用途，其中所述NAC静脉内施用。
13.如权利要求11所述的药物组合物的用途，其中所述NAC口服施用。
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