CN107400698B

CN107400698B - 一种波氏杆菌培养基及其制备鉴别方法

Info

Publication number: CN107400698B
Application number: CN201710607849.9A
Authority: CN
Inventors: 王雷; 郅永伟; 贾海军; 薛家兵
Original assignee: Inner Mongolia Dongda Biotechnology Co ltd; Inner Mongolia Dongda Rex Rabbit Cycle Industry Research Institute
Current assignee: Inner Mongolia Dongda Rex Rabbit Cycle Industry Research Institute; Inner Mongolia Zhongrui Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2017-07-24
Filing date: 2017-07-24
Publication date: 2020-12-08
Anticipated expiration: 2037-07-24
Also published as: CN107400698A

Abstract

本发明提供了一种波氏杆菌培养基，该波氏杆菌培养基包括动物肉粉、柠檬酸钠、NaCl以及水，还包括抑菌剂以及指示剂。使用本发明提供的波氏杆菌培养基，可以保证波氏杆菌的良好生长，添加抑菌剂抑制了杂菌生长，添加指示剂可以有效的鉴别波氏杆菌，降低检测成本、提高检测速度。本发明还提供波氏杆菌培养基的制备方法。

Description

一种波氏杆菌培养基及其制备鉴别方法

技术领域

本发明涉及兽医微生物领域，尤其涉及一种波氏杆菌培养基及其制备方法，以及利用此培养基进行波氏杆菌的鉴别方法。

背景技术

波氏杆菌为獭兔发病的主要病原菌之一，波氏杆菌病的潜伏期7～10天。成年兔表现为鼻炎和支气管炎。仔兔多呈急性病症，初期刚见鼻炎病状后，即表现呼吸困难，迅速死亡，病程2～3天。在獭兔养殖中，很难通过临床症状对波氏杆菌病原菌导致的疾病进行准确的诊断，导致用药不对症，造成獭兔的大量死亡。只有进行细菌学检查，找出病原菌才能最后确诊是否是波氏杆菌病原菌导致的疾病，因此病原菌的快速分离及鉴别成为了解决上述问题的最优方法。

目前并没有一种针对波氏杆菌的分离及鉴定的标准方法，无法快速便捷的对波氏杆菌进行分离并鉴别。被相关技术人员广泛接受的方法有两种，一是使用麦康凯培养基划线纯化，利用胆硫乳琼脂(DHL)培养基和相关的生化管或PCR技术进行鉴别；二是使用加血的马丁肉汤培养基划线纯化，利用DHL培养基和相关的生化管或PCR技术进行鉴别，但是这两种方法存在以下弊端：

一方面，上述的两种方法中使用的培养基，并不是针对波氏杆菌分离及鉴定使用的，其选择性较弱。

另一方面，针对培养基中的细菌分子进行的生化管或PCR等常规检测鉴别技术步骤繁琐，耗时较长，成本过高。例如，目前常用的PCR鉴别技术是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，能将微量的DNA大幅增加。在细菌基因组中，编码16S rRNA的rDNA基因具有良好的进化保守性，适宜分析的长度(约为1540bp)，以及与进化距离相匹配的良好变异性，所以成为细菌分子鉴定的标准标识序列。但是这种基于DNA片段的分子进行的PCR鉴别技术价格昂贵，操作过程复杂，大大降低检测速度。

因此，为了快速有效的分离鉴别波氏杆菌，提供一种能够针对波氏杆菌进行快速分离及鉴定、且成本较低的方法或者培养基具有重要意义。

发明内容

本发明旨在解决上面描述的问题。本发明的目的是提供一种波氏杆菌培养基及其制备方法以及利用此培养基进行波氏杆菌的鉴别方法，该波氏杆菌培养基加入动物肉粉为波氏杆菌的生长提供营养物质，加入抑菌剂抑制杂菌生长，加入指示剂与细菌代谢产物作用，通过培养基的颜色或者培养基中菌落的颜色鉴别波氏杆菌，例如，当培养基中不包含琼脂这一组分时，此时培养基为液体培养基，接种细菌后可以通过观察培养基的颜色鉴别波氏杆菌；当培养基中加入琼脂这一组分时，此时培养基为固体培养基，接种细菌后可以通过观察培养基中菌落的颜色鉴别波氏杆菌。该波氏杆菌培养基保证了波氏杆菌的良好生长，添加抑菌剂抑制了杂菌生长，添加指示剂可以有效的鉴别波氏杆菌，降低检测成本、提高检测速度。

本发明提供一种波氏杆菌培养基，所述波氏杆菌培养基包括动物肉粉、柠檬酸钠、NaCl以及水；其中，各组分的含量为：

其中，所述波氏杆菌培养基还包括抑菌剂，所述抑菌剂含量为0.005～0.015g。

其中，所述波氏杆菌培养基还包括指示剂，所述指示剂含量为5～15ml。

其中，所述波氏杆菌培养基包括动物肉粉、柠檬酸钠、NaCl、水、抑菌剂以及指示剂；其中，各组分的含量为：

其中，所述抑菌剂包括万古霉素，所述指示剂包括1％溴麝香草酚蓝酒精液；所述动物肉粉为兔肉粉。

其中，所述波氏杆菌培养基还包括琼脂，所述琼脂15～25g。

本发明还提供一种波氏杆菌培养基制备方法，所述制备方法包括下述步骤：

A1)取0.7～1.3L的水加入烧杯中，取动物肉粉25～35g，NaCl 3～7g，柠檬酸钠1～3g，溶解于水中并搅拌均匀，得到混合均匀的混合液；

A2)在混合液中加入pH调节剂，将混合液的pH值调节至6.8～7.5；

A3)将调节PH值后的混合溶液，分装于3～5个相同的容器中，将分装到容器中的混合溶液在115℃～125℃，101～102KPa的条件下高温灭菌15～25分钟，得到波氏杆菌培养基；

或A4)将步骤A3)所得的波氏杆菌培养基在44～55℃的无菌环境中进行冷却后，移至超净工作台，在每个容器中均加入过滤灭菌后的抑菌剂0.001～0.005g，指示剂1～5ml，得到含有抑菌剂、指示剂的波氏杆菌培养基。

其中，所述制备方法还包括：

在步骤A2)将混合液的pH值调节至6.8～7.5后，加入琼脂15～25g。

其中，制备方法还包括制备动物肉粉的步骤

所述制备动物肉粉的步骤还包括：

B1)取生动物肉25～35g，加水煮沸8～12min去除动物肉油脂后，研磨成肉糊；所得肉糊中添加蛋白酶0.2～0.4万U/g，搅拌均匀，将搅拌均匀的肉糊置于55～65℃下保温11～13小时得到保温后的肉糊，对保温后的肉糊进行加水煮沸12～17min使保温后的肉糊中的蛋白酶失活，并形成动物肉液；

B2)将步骤B1)获得的动物肉液进行离心处理，去掉残渣和油，获得动物肉浆，将动物肉浆干燥形成动物肉粉。

根据本发明提供的波氏杆菌培养基，主要的创新点是提供一种特定的针对波氏杆菌进行分离与鉴别的培养基，通过添加动物肉粉来为波氏杆菌提供营养物质，通过添加抑菌剂抑制其他杂菌的生长，通过指示剂鉴别波氏杆菌，并研究其他各组分的含量配比，以制备可用于分离与鉴别波氏杆菌的培养基。

该波氏杆菌培养基的制备组分，各组分的作用及含量说明如下：

动物肉粉是制备本发明中波氏杆菌培养基的重要组分。动物肉粉为微生物的生长提供所需氮源和碳源等主要营养物质。本发明使用动物肉粉来源相对纯净，杂质含量少，可以有效避免抑制细菌生长的弊端。本发明中的动物肉粉优选为兔肉粉，而波氏杆菌又为獭兔发病的主要病原菌之一，兔肉粉对于兔场来说，容易获得且质量有保障，其蛋白高且含脂率低的特点，不仅完全可以代替常用的蛋白胨、牛肉膏等药品，而且兔肉粉做的培养基其营养成分更加接近病菌的原始生活环境，有利于病菌的生长。

抑菌剂的主要作用是抑制杂菌的生长，以利于目的菌落的生长。本发明优选万古霉素作为本发明抑菌剂，可以有效的抑制革兰阳性菌、革兰阴性菌等杂菌的生长，而对波氏杆菌的生长影响较小。本发明中的抑菌剂含量为0.005～0.015g，优选为0.01g，此时对杂菌的抑制效果最佳，而对波氏杆菌的影响最小。

本发明配方中包含指示剂，培养过程中，不同种类的细菌具有不同的代谢产物，通过指示剂与细菌代谢产物的作用现象可以鉴别细菌的种类。本发明优选1％溴麝香草酚蓝酒精液为指示剂，如果培养基中含有波氏杆菌，波士杆菌代谢柠檬酸钠时产生碳酸钠，1％溴麝香草酚蓝酒精液与代谢产物作用最终显示蓝色。当配制的波氏杆菌培养基中不添加琼脂为液体培养基时，接种细菌后若培养基的颜色变为蓝色则存在或认为存在波氏杆菌，若培养基的颜色为绿色则不存在波氏杆菌；当配制的波氏杆菌培养基中添加琼脂为固体培养基时，接种细菌后若培养基中菌落颜色为蓝色则存在或认为存在波氏杆菌，若培养基中菌落颜色不是蓝色则说明不存在波氏杆菌。

琼脂的主要作用是使液体培养基变为固体培养基，本发明中的培养基可以为液体培养基，也可以通过在组分中添加琼脂，使其成为固体培养基。

通过大量的研究试验，上述成分的相互配合，制得的该波氏杆菌培养基能够有效的分离与鉴别波氏杆菌，并且大大降低检测成本、提高检测速度。

作为本发明的优选示例，所述波氏杆菌培养基包括动物肉粉、柠檬酸钠、NaCl、水、抑菌剂以及指示剂；其中，各组分的含量为：

另外，本申请中的培养基选择性添加琼脂。当配制的波氏杆菌培养基为液体培养基，不添加琼脂这一组分；当配制的波氏杆菌培养基为固体培养基，添加琼脂这一组分。在实际应用过程，可根据具体的目标需求进行液体或固体培养基的配制。例如，当仅进行波氏杆菌鉴别时(包含有指示剂的波氏杆菌培养基)，可以将波氏杆菌培养基配制为液体培养基，通过接种细菌后的培养基的颜色鉴别波氏杆菌，即若培养基的颜色为蓝色则存在或认为存在波氏杆菌，若培养基的颜色为绿色则不存在波氏杆菌。例如，当需要直观统计菌落数以及菌落状况时，可以将培养基配制为固体培养基。

根据本发明的另一个方面，本发明提供一种波氏杆菌培养基制备方法，所述制备方法包括下述步骤：

A2)在混合液中加入pH调节剂，将混合液的pH值调节至6.8～7.5；

所述制备方法还包括：在步骤A2)将混合液的pH值调节至6.8～7.5后，加入琼脂15～25g。

步骤A4中包含加入过滤灭菌后的0.001～0.005g，指示剂1～5ml，得到含有抑菌剂、指示剂的波氏杆菌培养基，也可在此步骤中单独加入过滤灭菌后的抑菌剂0.001～0.005g，得到含有抑菌剂的波氏杆菌培养基。另外，每个容器中的抑菌剂以及指示剂的含量需结合相应的容器个数，计入本发明提供的波氏杆菌培养基制备的总配方组分关系中。

上述制备方法按照所述顺序依次进行，以上制备过程中各组分的用量需满足本发明所述的比例关系，本领域技术人员可以根据实际情况基于上述制备方法进行适应性调整。

本发明与现有技术相比，其有益效果体现在：

第一，本发明提供的波氏杆菌培养基，促进了波氏杆菌的良好生长，尤其是加入了抑菌剂的波氏杆菌培养基有效的抑制了其他杂菌的生长，起到了良好的筛选效果，达到了选择培养基的作用。

第二，本发明提供的波氏杆菌培养基，通过观察培养基或者培养基中菌落的颜色，可以有效快捷的鉴别波氏杆菌，鉴别准确率达到83％-93％。避免了常规的PCR检测技术步骤繁琐、耗时较长，成本过高的弊端。

第三，本发明提供的波氏杆菌培养基，动物肉粉提供主要营养物质；抑菌剂抑制杂菌生长；指示剂通过与细菌代谢产物进行作用，通过培养基的颜色或培养基中菌落的颜色鉴别波氏杆菌。

第四，本发明提供的波氏杆菌培养基，优选使用的主要原料为兔肉粉，对于兔场而言取材方便，且成本较低，有利于降低兔子疾病快速诊断时的成本。

本发明制备的波氏杆菌培养基的各组分及其含量的选择、波氏杆菌培养基的制备方法，以及波氏杆菌培养基鉴别波氏杆菌方法的有益效果将通过实施例给出的具体实验数据进行说明。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互任意组合。

实施例1

按质量百分比称取各组分，其中动物肉粉为兔肉粉。

将各组分按如下步骤进行波氏杆菌培养基的制备：

A1)取1L的水加入烧杯中，取兔肉粉28g，NaCl 5g，柠檬酸钠1.5g，溶解于水中并搅拌均匀，得到混合均匀的混合液，其中，兔肉粉的制备过程为：取生兔肉35g，加水煮沸12min去除兔肉油脂后，研磨成肉糊；所得肉糊中添加蛋白酶0.4万U/g，搅拌均匀，将搅拌均匀的肉糊置于65℃下保温11小时得到保温后的肉糊，对保温后的肉糊进行加水煮沸17min使保温后的肉糊中的蛋白酶失活，并形成兔肉液；将获得的兔肉液进行离心处理，去掉残渣和油，获得兔肉浆，将兔肉浆干燥形成兔肉粉；

A2)在混合液中加入pH调节剂，将混合液的pH值调节至6.8；

A3)将调节PH值后的混合溶液，分装于3个相同的试管中，将分装到试管中的混合溶液在121℃，101KPa的条件下高温灭菌20分钟，得到波氏杆菌培养基。

实施例2：

A1)取0.9L的水加入烧杯中，取兔肉粉30g，NaCl 6g，柠檬酸钠1.3g，溶解于水中并搅拌均匀，得到混合均匀的混合液；

A2)在混合液中加入pH调节剂，将混合液的pH值调节至7.1；

A3)将调节PH值后的混合溶液，分装于4个相同的试管中，将分装到试管中的混合溶液在115℃，102KPa的条件下高温灭菌25分钟，得到波氏杆菌培养基；

A4)将步骤A3)所得的波氏杆菌培养基在44℃的无菌环境中进行冷却后，移至超净工作台，在每个试管中均加入过滤灭菌后的万古霉素0.003g，得到含有万古霉素的波氏杆菌培养基。

实施例3：

A1)取1L的水加入烧杯中，取兔肉粉27g，NaCl 4.5g，柠檬酸钠2g，溶解于水中并搅拌均匀，得到混合均匀的混合液；

A2)在混合液中加入pH调节剂，将混合液的pH值调节至7.5；

A3)将调节PH值后的混合溶液，分装于4个相同的试管中，将分装到试管中的混合溶液在122℃，101KPa的条件下高温灭菌18分钟，得到波氏杆菌培养基；

A4)将步骤A3)所得的波氏杆菌培养基在50℃的无菌环境中进行冷却后，移至超净工作台，在每个试管中均加入过滤灭菌后的万古霉素0.0025g，指示剂3ml，得到含有万古霉素、1％溴麝香草酚蓝酒精液的波氏杆菌培养基。

实施例4

A1)取1L的水加入烧杯中，取兔肉粉25g，NaCl 5g，柠檬酸钠1.5g溶解于水中并搅拌均匀，得到混合均匀的混合液，其中，兔肉粉的制备过程为：取生兔肉25g，加水煮沸8min去除兔肉油脂后，研磨成肉糊；所得肉糊中添加蛋白酶0.2万U/g，搅拌均匀，将搅拌均匀的肉糊置于55℃下保温11小时得到保温后的肉糊，对保温后的肉糊进行加水煮沸12min使保温后的肉糊中的蛋白酶失活，并形成兔肉液，将获得的兔肉液进行离心处理，去掉残渣和油，获得兔肉浆，将兔肉浆干燥形成兔肉粉；

A2)在混合液中加入pH调节剂，将混合液的pH值调节至7.2，在此混合溶液中加入琼脂17g；

A3)将调节PH值后的混合溶液，分装于5个相同的锥形瓶中，将分装到锥形瓶中的混合溶液在118℃，101KPa的条件下高温灭菌22分钟，得到波氏杆菌培养基。

实施例5

A1)取0.9L的水加入烧杯中，取兔肉粉30g，NaCl 6g，柠檬酸钠1g，溶解于水中并搅拌均匀，得到混合均匀的混合液；

A2)在混合液中加入pH调节剂，将混合液的pH值调节至7.3，在此混合溶液中加入琼脂15g；

A3)将调节PH值后的混合溶液，分装于5个相同的锥形瓶中，将分装到锥形瓶中的混合溶液在121℃，101KPa的条件下高温灭菌20分钟，得到波氏杆菌培养基；

A4)将步骤A3)所得的波氏杆菌培养基在48℃的无菌环境中进行冷却后，移至超净工作台，在每个锥形瓶中均加入过滤灭菌后的万古霉素0.001g，得到含有万古霉素的波氏杆菌培养基。

实施例6

A1)取0.7L的水加入烧杯中，取兔肉粉33g，NaCl 3g，柠檬酸钠3g，溶解于水中并搅拌均匀，得到混合均匀的混合液；

A2)在混合液中加入pH调节剂，将混合液的pH值调节至7.2，在此混合溶液中加入琼脂25g；

A3)将调节PH值后的混合溶液，分装于5个相同的锥形瓶中，将分装到锥形瓶中的混合溶液在125℃，101KPa的条件下高温灭菌20分钟，得到波氏杆菌培养基；

A4)将步骤A3)所得的波氏杆菌培养基在51℃的无菌环境中进行冷却后，移至超净工作台，在每个锥形瓶中均加入过滤灭菌后的万古霉素0.0024g，1％溴麝香草酚蓝酒精液1ml，得到含有万古霉素、1％溴麝香草酚蓝酒精液的波氏杆菌培养基。

实施例7～实施例9参考实施例6的制备过程，各组分的用量需满足本发明所述的比例关系，本领域技术人员可以根据实际情况基于上述制备方法进行适应性调整。具体实施例情况如表1所示：

表1波氏杆菌培养基具体实施例列表

对比例

为了进一步说明本发明的有益效果，选择目前较为常用的肉汤培养基作为对比实施例，需要说明的是，为了更直观的统计菌落数及观察菌落的生长状况，将对比例配制为固体培养基，并且选取实施例中的固体培养基(即实施例4～实施例9)进行测试，对于实施1～实施例3的液体培养基不再进行测试。

制备该肉汤培养基各组分的含量如表2所示：

表2对比例组分含量列表

组分	牛肉膏	蛋白胨	NaCl	水	琼脂
						含量	3g	10g	5g	1L	20g

测试例1

为了全面的说明波氏杆菌培养基对于波氏杆菌的培养效果，使用本波氏杆菌培养基对波氏杆菌进行接种培养，并对培养结果进行测试。将上述实施例4～实施例9与对比例应用于波氏杆菌进行接种培养，具体过程如下：

波氏杆菌菌液制备：取波氏杆菌标准菌株1株，接种于固体肉汤培养基中进行复苏处理后，挑取固体肉汤培养基生长的一个波氏杆菌菌落接种于4ml液体肉汤培养基中，在36～38℃富集(即培养)46～50h后得到含有波氏杆菌的肉汤培养基溶液(即波氏杆菌菌液)。

实施例应用于波氏杆菌的接种培养，具体培养过程如下：取六个相同规格的培养皿，每个培养皿中依次加入实施例4～实施例9中的波氏杆菌培养基3ml(倒平板)，在上述6个培养皿中均涂布接种500μl波氏杆菌菌液并于37℃下培养48h。

对比例应用于波氏杆菌的接种培养，具体培养过程如下：取与实施例相同规格的一个培养皿，在培养皿中加入对比例中的肉汤培养基3ml(倒平板)，在培养皿中涂布接种500μl波氏杆菌菌液并于37℃下培养48h。

对上述实施例与对比例应用于波氏杆菌菌株的培养结果进行测试，具体测试结果如表3所示：

表3实施例与对比例应用于波氏杆菌菌株培养的实验测试结果

需要说明的是：阳性菌落数是指菌落中的目标菌落数，即本发明中的波氏杆菌菌落数；阴性菌落数是指菌落中的杂菌菌落数，即本发明中的除波氏杆菌以外的全部菌落数；筛选率＝(阳性菌落数÷菌落总数)×100％，显色准确率＝(与PCR检测结果相同的菌落数÷菌落总数)×100％。

筛选率：体现了培养基对杂菌的抑制效果以及对目标菌落的培养效果。

显色判定：培养基培养22～26小时后，如果培养基中的菌落为蓝色则存在或认为存在波氏杆菌，若培养基中菌落不是蓝色则不是或不存在波氏杆菌。

测试例2

将实施例7应用于疑似波氏杆菌感染死亡獭兔器官进行培养测试，具体过程如下：

取病兔肺、兔肝脏、兔脾脏各25g，分别置于4ml液体肉汤培养基中于36～38℃富集(即培养)46～50h后，得到与兔肺、兔肝脏以及兔脾脏相对应的细菌菌液。

取三个同规格的培养皿，每个培养皿中分别加入实施例7的波氏杆菌培养基3ml(倒平板)，在上述3个培养皿中分别涂布接种500μl与兔肺、兔肝脏以及兔脾脏相对应的细菌菌液，于37℃下培养48h。

将实施例7应用于疑似波氏杆菌感染死亡獭兔器官的实验具体测试结果如表4所示：

表4实施例7应用于疑似波氏杆菌感染死亡獭兔器官的实验测试结果

由上述测试例可知，本发明的波氏杆菌培养基对波氏杆菌具有良好的培养与鉴别效果：

与对比例相比，本发明中实施例中的菌落总数均等于或高于对比例，菌落直径均大于对比例。由此可见本发明中的波氏杆菌培养基中的菌落生长状况良好。

与对比例相比，本发明实施例的对于阳性菌落的筛选率远高于对比例，尤其是实施5到实施例9这些包含有万古霉素的波氏杆菌培养基对于波氏杆菌的筛选率约为75％～86％，对比例为41.7％，实施5到实施例9的筛选率远远高于对比例。由此可见本发明中的波氏杆菌培养基可以有效的抑制杂菌的生长，相对的促进目标菌落即波氏杆菌的培养。

与对比例相比，包含有1％溴麝香草酚蓝酒精液的实施例6到实施例9的波氏杆菌培养基能够在不使用生化管以及PCR技术进行鉴别的情况下，通过波氏杆菌培养基中菌落的颜色鉴别出波氏杆菌，鉴别准确率约为83％～93％。这保证了对于波氏杆菌快速有效的分离鉴别，大大缩短了獭兔波氏杆菌病的初步诊断时间和步骤，提高波氏杆菌的初步诊断效率。对比例无法通过培养基中的菌落颜色鉴别出波氏杆菌，需借助生化管以及PCR检测技术才能鉴别波氏杆菌，操作过程复杂，检测速度较低。

另外，取实施例7的波氏杆菌培养基，取疑似波氏杆菌感染死亡动物器官加入到实施例7的波氏杆菌培养基进行培养，其鉴别准确率约为83％～88％。其培养基结果也再次证明本发明中的波氏杆菌培养基，可以有效的鉴别波氏杆菌，能够快速有效的诊断兔子的是否患有波氏杆菌病。

综上所述，本发明具有下述有益效果：

第一，本发明提供的波氏杆菌培养基，促进了波氏杆菌的良好生长，尤其是加入了抑菌剂的波氏杆菌培养基有效的抑制了其他菌类的生长，起到了良好的筛选效果，达到了选择培养基的作用。

第二，本发明提供的波氏杆菌培养基，通过观察最终培养基或者培养基中菌落的颜色，可以有效快捷的鉴别波氏杆菌，鉴别准确率达到83％-93％。避免了常规的PCR检测技术步骤繁琐、耗时较长，成本过高的弊端。

第三，本发明提供的波氏杆菌培养基，动物肉粉提供主要营养物质，；抑菌剂抑制杂菌生长；指示剂通过与细菌代谢产物进行作用，通过培养基的颜色或培养基中菌落的颜色鉴别波氏杆菌。

第四，本发明提供的波氏杆菌培养基中，使用的主要原料为兔肉粉，对于兔场而言取材方便，且成本较低，有利于降低兔子疾病快速诊断时的成本。

最后应说明的是：在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包含一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个…”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制。尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims

1.一种波氏杆菌培养基制备方法，其特征在于，所述制备方法包括下述步骤：

A1）取1~ 1.1L的水加入烧杯中，取动物肉粉30~31g，NaCl 5 ~ 7g，柠檬酸钠2.5~ 3g，溶解于水中并搅拌均匀，得到混合均匀的混合液；

A2）在混合液中加入pH调节剂，将混合液的pH值调节至6.8~7.5，加入琼脂 20~25g；

A3）将调节PH值后的混合溶液，分装于3~5个相同的容器中，将分装到容器中的混合溶液在115℃~125℃，101~102KPa的条件下高温灭菌15~25分钟，得到波氏杆菌培养基；

A4)将步骤A3）所得的波氏杆菌培养基在44~55℃的无菌环境中进行冷却后，移至超净工作台，在每个容器中均加入过滤灭菌后的抑菌剂0.009~ 0.01g，指示剂 8~ 10ml，得到含有抑菌剂、指示剂的波氏杆菌培养基；

所述抑菌剂为万古霉素，所述指示剂为1%溴麝香草酚蓝酒精液；所述动物肉粉为兔肉粉。

2.如权利要求1所述波氏杆菌培养基制备方法，其特征在于，所述波氏杆菌培养基包括动物肉粉、柠檬酸钠、NaCl、水、抑菌剂以及指示剂；其中，各组分的含量为：

动物肉粉 30g

柠檬酸钠 2.5g

NaCl 5g

水 1L

抑菌剂 0.01g

指示剂 10ml

琼脂 20g。

3.如权利要求1所述波氏杆菌培养基制备方法，其特征在于，所制备方法还包括制备动物肉粉的步骤，

所述制备动物肉粉的步骤还包括：

B1)取生动物肉25 ~ 35g，加水煮沸8~12min去除动物肉油脂后，研磨成肉糊；所得肉糊中添加蛋白酶0.2 ~0.4万U/g，搅拌均匀，将搅拌均匀的肉糊置于55~65℃下保温11~13小时得到保温后的肉糊，对保温后的肉糊进行加水煮沸12~17min使保温后的肉糊中的蛋白酶失活，并形成动物肉液；

B2）将步骤B1）获得的动物肉液进行离心处理，去掉残渣和油，获得动物肉浆，将动物肉浆干燥形成动物肉粉。