CN107397740B - 一种协同增效抗肿瘤的多酚组合物与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于药物、食品和保健品的技术领域，公开了一种协同增效抗肿瘤的多酚组合物与应用。所述多酚组合物为苜蓿素、槲皮素、木犀草素、p‑香豆酸中两种或多种所组成的组合物，优选为苜蓿素与槲皮素的组合物、苜蓿素与木犀草素的组合物或p‑香豆酸与木犀草素组合物。本发明的组合物具有明显的抗肿瘤细胞增殖协同增效作用，其效果优于单独使用所述多酚化合物，且可以减少药物所使用的剂量，减少肿瘤细胞耐药的发生。所述多酚组合物用于制备抗肿瘤的药物、食品、保健品及功能食品添加剂。

Description

一种协同增效抗肿瘤的多酚组合物与应用

技术领域

本发明属于药物的技术领域，涉及一种协同增效抗肿瘤的组合物及其应用，尤其涉及抗肿瘤的多酚组合物，所述抗肿瘤是指抑制人乳腺癌MCF-7细胞增殖。

背景技术

现今，癌症已经成为导致人类死亡的第一大恶疾。癌症的发病率和死亡率在中国逐年攀升，从2010年至今，癌症已经成为我国致死率第一的疾病，也是我国最主要的公共健康问题之一。据统计，我国居民的癌症发病率在近十几年总体呈现上升趋势，且乳腺癌发病率位于城乡女性居民首位，是危害我国居民生命健康的最主要的恶性肿瘤之一(陈万青,郑荣寿.中国女性乳腺癌发病死亡和生存状况[J].中国肿瘤临床,2015,42(13):668-674)。

癌症的治疗目前有手术治疗、放射治疗、化学治疗等方法。化学治疗作为当今治疗肿瘤的最主要且最有效的手段之一，当其作用于靶细胞时往往伤害正常细胞，产生脏器受损、免疫功能低下、骨號抑制等毒副作用，随着化疗过程的进行，肿瘤细胞也会产生多药耐药等问题，使其疗效受到很大的限制。所以寻找可以代替传统化疗药物、可产生协同作用、逆转癌细胞的耐药性的化合物是十分紧迫的。我们已知化疗效果与化疗药物的浓度在一定范围内呈正比，但副作用会随着药物浓度的增加而增强，而且对于长期使用单一药物治疗的肿瘤患者，其机体会通过干细胞靶点表达缺失、蛋白表达变化、基因突变等机制逃避抗肿瘤药物的杀伤(Gordon R R,Nelson P S.Cellular senescence and cancerchemotherapy resistance[J].Drug Resistance Updates,2012,15(1):123-131)。因此联合用药可以通过启动的新靶点或调控蛋白表达，将有可能避免机体对药物耐受，甚至出现提高疗效、降低毒性的效果，将会成为治疗肿瘤的重要方法(王士群,朱宇珍,郑学宝.Chou—Talalay在抗肿瘤联合用药中的研究应用概况[J].中国现代应用药学,2013(4):449-453)。联合用药，在我国传统中医中药中应用的最为广泛，多味药材一同煎煮、服用，能达到很好的治病效果。探寻新的治疗方法，尤其是探索低毒、疗效好的抗肿瘤活性物质，保护和提高肿瘤患者免疫力，减轻放、化疗的毒副作用，对于预防癌症的发生，提高癌症的治疗效果，进而提高患者的生存质量具有重要意义。

多酚类物质是最重要的植物次级代谢产物之一，也是人们日常膳食中主要存在的活性物质之一。由于其具有抗氧化、抑制肿瘤细胞生长等生物活性而受到了研究人员的很大关注。选用协同增效作用的多酚类物质可以有效的提高癌症的治疗效果，降低药物的剂量。苜蓿素为黄酮类化合物，广泛存在于小麦和甘蔗中，在川西小黄菊和竹叶中也有分布；木犀草素为黄酮类化合物，存在于芹菜、花椰菜、柑橘等水果蔬菜中；槲皮素为黄酮类化合物，广泛存在于苹果、洋葱等果蔬中；p-香豆酸为酚酸类化合物，存在于花生、土豆和大蒜中，蜂蜜中也含有丰富的p-香豆酸。这些富含多酚类化合物的天然产物由于其有抗氧化、抑制肿瘤细胞生长等生物活性而受到了消费者和研究人员的很大关注。

Chou-Talalay法是目前被广泛认可的药物协同作用定量分析方法，通过联合指数(CI)表示药物之间的加和、协同和拮抗作用的联合指数(CI)法是由Chou和Talaly基于质量作用定律提出的评价药物相互作用效果的指标(Chou T C.Theoretical basis,experimental design,and computerized simulation of synergism and antagonismin drug combination studies[J].Pharmacological reviews,2006,58(3):621-681)。药物剂量减少指数(DRI)是评价在达到相同效果时，药物在联合作用所使用的剂量相对于单独使用时减少的倍数。药物联合时的CI值<1，说明药物之间是协同作用，CI＝1说明药物之间是加合作用，CI值>1说明药物之间是拮抗作用(Chou T C.Theoretical basis,experimental design,and computerized simulation of synergism and antagonismin drug combination studies[J].Pharmacological reviews,2006,58(3):621-681)。

发明内容

为了克服现有技术的缺点和不足，提高单一组分多酚类物质的抗肿瘤的效果、降低药物的毒性和使用剂量，本发明的目的在于提供一种协同增效抗肿瘤的多酚组合物。本发明选用的苜蓿素/槲皮素、苜蓿素/木犀草素、p-香豆酸/木犀草素具有增效协同抗肿瘤细胞增殖作用。联合使用上述多酚组合物比单用其中一种多酚化合物能产生更强的抗肿瘤细胞增殖的作用。本发明提供的几种多酚组合物具有协同增效作用，可以提高抗肿瘤细胞增殖效果、减少药物使用剂量。

本发明的另一目的在于提供上述多酚组合物的应用。所述多酚组合物用于制备抗肿瘤药物，抑制肿瘤细胞的增殖。所述抗肿瘤是指抑制人乳腺癌MCF-7细胞增殖。本发明的多酚组合物用于制备预防肿瘤的食品。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种协同增效抗肿瘤的多酚组合物，为苜蓿素、槲皮素、木犀草素、p-香豆酸中两种或多种所组成的组合物，优选为苜蓿素与槲皮素的组合物、苜蓿素与木犀草素的组合物或p-香豆酸与木犀草素组合物。

所述苜蓿素与槲皮素的摩尔比为20:(21.5～215)、苜蓿素与木犀草素的摩尔比为20:(4.5～45)、p-香豆酸与木犀草素的摩尔比为(175～1750):(4.5～45)。

本发明的多酚组合物是通过将各组分直接混合得到。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明的组合物具有明显的抗肿瘤细胞增殖协同增效作用，其效果优于单独使用所述多酚化合物，且可以减少药物所使用的剂量，减少肿瘤细胞耐药的发生。

附图说明

图1为本发明的多酚组合物中各多酚化合物的化学结构式；

图2为亚甲基蓝法检测槲皮素、苜蓿素以及槲皮素与苜蓿素的组合物对人乳腺癌细胞MCF-7的体外增殖抑制作用的曲线图；

图3为亚甲基蓝法检测木犀草素、苜蓿素以及木犀草素与苜蓿素的组合物对人乳腺癌细胞MCF-7的体外增殖抑制作用的曲线图；

图4为亚甲基蓝法检测p-香豆酸、木犀草素以及p-香豆酸与木犀草素的组合物对人乳腺癌细胞MCF-7的体外增殖抑制作用的曲线图；

图5为p-香豆酸与木犀草素的组合物抑制人乳腺癌MCF-7细胞体外增殖的Fa-CI曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细地描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例的组合物中各成分为Sigma-Aldrich公司的标准品。

本发明的多酚组合物可以任何方便的肠道或非肠道途径给药的剂型一起给药。肠道给药制剂包括但不限于:胶囊、片剂、乳剂、水悬浮剂、胶体液、溶液、微胶囊、丸剂、锭剂、颗粒剂、粉剂。非肠道给药途径包括皮下、皮内、动脉、静脉、肌肉、关节、滑液、胸骨、鞘内和病灶内。其它给药途径可包括局部、直肠、经鼻、经颊、阴道、舌下、粘膜、气管或尿道。此外，本发明的药物组合物还可以通过气雾吸入或针刺等方式给药。

为了便于理解本发明,特列举以下实施例。其作用应被理解为是对本发明的诠释而绝非对本发明的任何形式的限制。

本发明的组合物中苜蓿素、槲皮素、木犀草素、p-香豆酸的化学结构式如图1所示。

实施例1

一种协同增效抗肿瘤的多酚组合物为槲皮素与苜蓿素的组合物。

槲皮素联合苜蓿素抑制人乳腺癌MCF-7细胞(购自美国ATCC公司)体外增殖的增强作用：

选用10-30代的人乳腺癌MCF-7细胞。除去细胞的培养基(DMEM，购自美国Hyclone公司)，用冷的PBS洗涤。然后，用胰蛋白酶(购自美国Gibco公司)将贴壁的细胞消化下来。消化时间为2min，加入4mL的wash培养基(购自美国Hyclone公司)终止消化。用移液管将培养液转移到离心管中，在4℃的温度下，以转速760rmp离心4～5min。将细胞以2.5×10⁴个/孔的密度铺于96孔板中，100μL每孔。在5％CO₂培养箱中保持37℃下培养6h后，每孔加入100μL的槲皮素与苜蓿素的组合物溶液(槲皮素与苜蓿素的浓度分别为0+0，21.5μM+20μM，43μM+20μM，86μM+20μM，129μM+20μM，172μM+20μM，215μM+20μM)、槲皮素溶液(0μM，50μM，100μM，150μM，200μM，250μM，300μM)或苜蓿素溶液(0μM，25μM，50μM，100μM，150μM，200μM，250μM，300μM)，每个浓度重复3个孔。0.5％(v/v)DMSO组为对照组(即空白组)。放入培养箱中培养48h后，进行亚甲基蓝染色实验。取出培养板吸出培养基，加入100μL的PBS洗涤后吸出，然后在含有细胞的孔中每孔加入50μL的亚甲基蓝溶液，在培养箱中培养1h，然后用清水漂洗去浮色，在吸水纸上拍干水分，每孔加入100μL的洗脱溶液。在振荡器上震荡20min后利用酶标仪在570nm波长下进行读数，抗肿瘤细胞增殖能力根据以下方程计算：

细胞增殖抑制率(％)＝ΔA570(加药组)/ΔA570(对照组)×100％

其中，ΔA570(加药组)为加药组减去背景的吸光度，ΔA570(对照组)为对照组减去背景的吸光度。加药组是指槲皮素组(槲皮素溶液)、槲皮素+苜蓿素组(槲皮素与苜蓿素组合物溶液)、苜蓿素组(苜蓿素溶液)。细胞增殖抑制率与细胞活力对应。

抑制癌细胞增殖的测试结果如图2所示。图2为亚甲基蓝法检测槲皮素、苜蓿素以及槲皮素与苜蓿素的组合物对人乳腺癌细胞MCF-7的体外增殖抑制作用的曲线图(图中空白组是指每个浓度下对应的一空白组)。从图中可以看出，槲皮素对MCF-7细胞的体外增殖具有很好的抑制作用，当其联合苜蓿素后，其达到相同的抑制增殖效果优于槲皮素单独作用时的效果。抑制癌细胞增殖的测试数据如表1所示，槲皮素单独作用时的EC₅₀值(抑制MCF-7细胞体外增殖的最大半数抑制浓度)为161.30±1.48μM；当槲皮素和苜蓿素联合作用后，其EC₅₀降至61.46±1.46μM。

表1槲皮素、槲皮素联合苜蓿素抑制MCF-7细胞体外增殖的最大半数抑制浓度(EC₅₀)

实施例2

一种协同增效抗肿瘤的多酚组合物为木犀草素与苜蓿素的组合物。

木犀草素联合苜蓿素抑制人乳腺癌MCF-7细胞体外增殖的增强作用：

选用10-30代的人乳腺癌MCF-7细胞(购自美国ATCC公司)。除去细胞的培养基(DMEM，购自美国Hyclone公司)，用冷的PBS洗涤。然后，用胰蛋白酶(购自美国Gibco公司)将贴壁的细胞消化下来。消化时间为2min，加入4mL的wash培养基(购自美国Hyclone公司)终止消化。用移液管将培养液转移到离心管中，在4℃的温度下，以转速760rmp离心4～5min。将细胞以2.5×10⁴个/孔的密度铺于96孔板中，100μL每孔。在5％CO₂培养箱中保持37℃下培养6h后，每孔加入100μL木犀草素和苜蓿素的组合物溶液(木犀草素和苜蓿素的浓度分别为0+0，4.5μM+20μM，9μM+20μM，18μM+20μM，27μM+20μM，36μM+20μM，45μM+20μM)、木犀草素溶液(0μM，10μM，20μM，30μM，40μM，50μM，60μM，70μM)或苜蓿素溶液(0μM，20μM，30μM，40μM，50μM，60μM，70μM)，每个浓度重复3个孔。0.5％(v/v)DMSO组为对照组(即空白组)。放入培养箱中培养48h后，进行亚甲基蓝染色实验。取出培养板吸出培养基，加入100μL的PBS洗涤后吸出，然后在含有细胞的孔中每孔加入50μL的亚甲基蓝溶液，在培养箱中培养1h，然后用清水漂洗去浮色，在吸水纸上拍干水分，每孔加入100μL的洗脱溶液。在振荡器上震荡20min后利用酶标仪在570nm波长下进行读数，抗肿瘤细胞增殖能力根据以下方程计算，

细胞增殖抑制率(％)＝ΔA570(加药组)/ΔA570(对照组)×100％

其中，ΔA570(加药组)为加药组减去背景的吸光度，ΔA570(对照组)为对照组减去背景的吸光度。加药组是指木犀草素组(木犀草素溶液)、木犀草素+苜蓿素组(木犀草素与苜蓿素组合物溶液)、苜蓿素组(苜蓿素溶液)。

抑制癌细胞增殖的测试结果如图3所示。图3为亚甲基蓝法检测木犀草素、苜蓿素以及木犀草素与苜蓿素的组合物对人乳腺癌细胞MCF-7的体外增殖抑制作用的曲线图(图中空白组是指每个浓度下对应的一空白组)。从图中可以看出，木犀草素对MCF-7细胞的体外增殖具有很好的抑制作用，当其联合苜蓿素后，其达到相同的抑制增殖效果优于木犀草素单独作用时的效果。抑制癌细胞增殖的测试数据如表2所示，木犀草素单独作用时的EC₅₀值为28.45±0.91μM，当苜蓿素和木犀草素联合作用后其EC₅₀降至14.91±0.34μM。

表2木犀草素、木犀草素与苜蓿素抑制MCF-7细胞的最大半数抑制浓度(EC₅₀)

实施例3

一种协同增效抗肿瘤的多酚组合物为p-香豆酸与木犀草素的组合物。

p-香豆酸联合木犀草素抑制人乳腺癌MCF-7细胞体外增殖的协同作用：

选用10-30代的人乳腺癌MCF-7细胞(购自美国ATCC公司)。除去细胞的培养基(DMEM，购自美国Hyclone公司)，用冷的PBS洗涤。然后，用胰蛋白酶(购自美国Gibco公司)将贴壁的细胞消化下来。消化时间为2min，加入4mL的wash培养基(购自美国Hyclone公司)终止消化。用移液管将培养液转移到离心管中，在4℃的温度下，以转速760rmp离心4～5min。将细胞以2.5×10⁴个/孔的密度铺于96孔板中，100μL每孔。在5％CO₂培养箱中保持37℃下培养6h后，每孔加入100μL木犀草素和p-香豆酸的组合物溶液(木犀草素和p-香豆酸的浓度分别为0+0，4.5μM+175μM，9μM+350μM，18μM+700μM，27μM+1050μM，36μM+1400μM，45μM+1750μM)、木犀草素溶液(0μM，5μM，10μM，15μM，20μM，25μM，30μM，35μM，40μM，45μM)或p-香豆酸溶液(0μM，250μM，500μM，750μM，1000μM，1250μM，1750μM，2000μM，2250μM)，每个浓度重复3个孔。0.5％(v/v)DMSO组为对照组。放入培养箱中培养48h后，进行亚甲基蓝染色实验。取出培养板吸出培养基，加入100μL的PBS洗涤后吸出，然后在含有细胞的孔中每孔加入50μL的亚甲基蓝溶液，在培养箱中培养1h，然后用清水漂洗去浮色，在吸水纸上拍干水分，每孔加入100μL的洗脱溶液。在振荡器上震荡20min后利用酶标仪在570nm波长下进行读数，抗肿瘤细胞增殖能力根据以下方程计算，

细胞增殖抑制率(％)＝ΔA570(加药组)/ΔA570(对照组)×100％

其中，ΔA570(加药组)为加药组减去背景的吸光度，ΔA570(对照组)为对照组减去背景的吸光度。

抑制癌细胞增殖的测试结果如图4和5所示。图4为亚甲基蓝法检测p-香豆酸、木犀草素以及p-香豆酸与木犀草素的组合物对人乳腺癌细胞MCF-7的体外增殖抑制作用的曲线图。从图中可以看出，木犀草素和p-香豆酸分别对MCF-7细胞具有良好的抑制增殖的作用，当木犀草素浓度为20μM时，MCF-7细胞增殖的抑制率为38％左右，当p-香豆酸浓度为1750μM时，其抑制MCF-7细胞的增值率为44％左右，当1750μM的p-香豆酸联合45μM的木犀草素时，约有86％的细胞的增殖被抑制。

图5为p-香豆酸与木犀草素的组合物抑制人乳腺癌MCF-7细胞体外增殖的Fa-CI曲线图。从图中可知，木犀草素和p-香豆酸联合指数CI均低于1，表现出了协同作用，其中当抑制37％的MCF-7细胞增殖(即Fa为0.63)时，CI值为0.93±0.03，随着浓度的增大，CI值降低。当抑制86％的MCF-7细胞增殖(即Fa为0.14)时，联合作用的协同指数为0.66±0.07，属于协同到中等协同范围。p-香豆酸和木犀草素联合抑制50％MCF-7细胞增殖的药物减少指数(DRI)和协同指数(CI)如表3所示，在EC₅₀时，木犀草素的DRI值为1.80±0.07，而p-香豆酸的DRI达到了4.04±0.11，也就是说明p-香豆酸联合木犀草素作用于MCF-7细胞，达到50％细胞增殖抑制率时，其药物所使用的剂量与单独使用p-香豆酸达到相同效果所使用的剂量相比减少了4倍左右。

表3p-香豆酸和木犀草素联合抑制50％MCF-7细胞增殖的DRI和CI值

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种协同增效抗肿瘤的多酚组合物，其特征在于：

为苜蓿素与槲皮素的组合物、苜蓿素与木犀草素的组合物或p-香豆酸与木犀草素的组合物；

组合物中，所述苜蓿素与槲皮素的摩尔比为20:(21.5～215)、苜蓿素与木犀草素的摩尔比为20:(4.5～45)、p-香豆酸与木犀草素的摩尔比为(175～1750):(4.5～45)；

所述的肿瘤为人乳腺癌；所述的人乳腺癌的细胞为MCF-7细胞。

2.根据权利要求1所述协同增效抗肿瘤的多酚组合物的应用，其特征在于：所述多酚组合物用于制备抗肿瘤药物。

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