CN107389861B - 一种水稻组织培养特性的快速鉴别方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种水稻组织培养特性的快速鉴别方法。本申请的发明人在实验中意外发现水稻组织培养特性与水稻组织对特定浓度的氯酸钾溶液的抗性有直接的正相关性，并据此发现找到了一种能够快速对水稻组织培养特性进行鉴别的方法。本发明的方法使用氯酸钾溶液处理水稻幼苗，观察幼苗的受伤程度，通过特定时间段内的氯酸钾反应等级来定性，氯酸钾反应指数来定量，评价不同水稻材料对氯酸钾的抗性(敏感性)。从而实现高通量、快速简便地鉴别大量水稻材料的组织培养特性。相对于传统方法，本方法不需经过组织培养过程，具有简便高效、周期短、成本低的特点，显著提高不同水稻材料的组织培养特性的鉴别效率。

Description

一种水稻组织培养特性的快速鉴别方法

技术领域

本发明涉及生物技术和作物育种领域。具体而言，本发明涉及一种水稻组织培养特性的快速鉴别方法。

背景技术

水稻是我国乃至世界上最重要的粮食作物之一，全球60％以上的人口以稻米为主食。传统作物遗传育种方法，对提高水稻产量和品质起到重要作用。但近年来面对日益频繁的干旱、极端温度等非生物胁迫的影响，人口增长和生态环境的压力，传统育种方法难以满足育种家的需求。现代生物技术手段在改良水稻品种方面的重要性日渐凸显，特别是分子标记辅助选择、转基因技术的应用，大大加快了育种进程。通过转基因技术改良现有主栽水稻品种或杂交亲本品种，可培育出新的高产、优质、多抗的水稻新品种或杂交新组合。目前已有许多抗虫、抗病、抗逆、米质等重要性状有关外源基因，通过转基因技术导入水稻。

农杆菌介导转化法、基因枪转化法是目前主流的水稻转基因方法。这些方法通常需要经过组织培养过程。水稻的组织培养特性对转化效率有着决定性的影响。水稻组织培养特性受遗传和环境等多重因素的影响。虽然改善培养基成分、调整激素配比、优化培养条件等，可提高培养效率。但基因型对水稻组织培养特性的影响非常显著。例如粳稻和籼稻品种的组织培养特性有很大差异。对多数粳稻品种来说，已建立了较为成熟、稳定的组织培养体系，在此基础上的遗传转化容易获得成功。而多数籼稻品种由于组织培养特性较差，转化频率偏低。

现有水稻的组织培养过程，通常需要经过愈伤组织的诱导和植株的再生过程，周期较长，步骤较繁琐，需要使用无菌操作设备，因而并不适合大量水稻材料的组织培养特性的鉴定。

但是，目前在关于水稻转基因和组织培养研究方面的文献中，并未见到有关不采用愈伤组织的诱导和植株的再生过程就能够对水稻组织培养特性进行有效鉴定方面的报道。研究人员尚未发现一种通用的不采用愈伤组织的诱导和植株的再生过程就能够对水稻的组织培养特性进行有效鉴定的方法。

因此本领域迫切需要一种能够对大量水稻材料的组织培养特性，进行高通量、快速简便、省时省力的鉴别方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种鉴别方法。该方法通过设定浓度的氯酸钾溶液处理设定时期的水稻幼苗，观察设定时间段内幼苗的受伤程度，通过特点时间段内的氯酸钾反应等级来定性，氯酸钾反应指数来定量，评价不同水稻材料对氯酸钾的抗性(敏感性)；而本申请的发明人意外发现，水稻组织的氯酸钾抗性与水稻材料组织培养特性具有良好地正相关性：氯酸钾抗性好的水稻材料组织培养特性较好，氯酸钾抗性差的水稻材料组织培养特性较差。从而实现快速、批量、高通量、省时省力地鉴别不同水稻材料的组织培养特性。

具体而言，本发明提供一种水稻组织培养特性的快速鉴别方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤：

步骤S1、配制预定浓度的氯酸钾溶液；

步骤S2、取目标水稻材料备用；

步骤S3、将所述目标水稻材料置于所配制的预定浓度的氯酸钾溶液中；

步骤S4、确定所述目标水稻材料经所配制的预定浓度的氯酸钾溶液处理预定时间后的反应强度；

步骤S5、基于所述目标水稻材料的反应强度和所述氯酸钾溶液的浓度确定所述目标水稻材料的组织培养特性。

优选地，所述氯酸钾溶液的浓度为0.5％～3％。

优选地，所述目标水稻材料为无菌水萌发9～15天后的二叶期幼苗。

优选地，所述反应强度包括：在预定时间段内，不同时间点观察的实际叶片枯黄和/或卷曲数量的百分率(％)的平均值。

优选地，特定时间点的实际叶片枯黄和/或卷曲数量的百分率(％)＝(卷曲数量变化百分率+枯黄数量变化百分率)/2。

优选地，所述步骤S5包括基于叶片的颜色和卷曲来对反应强度分级。

优选地，所述方法包括基于所述目标水稻材料叶片的颜色和卷曲对所述目标水稻材料的组织培养特性进行定性分级，或者基于所述目标水稻材料叶片枯黄或卷曲数量的百分率对所述目标水稻材料的组织培养特性进行定量分级。

优选地，所述水稻包括栽培稻、野生稻和水稻的近缘野生品种。

优选地，组织培养的起始材料来自营养器官、生殖器官或原生质体，所述营养器官至少包括：根、茎、叶的整体或部分细胞、组织，所述生殖器官至少包括花、果实、种子的整体或部分细胞、组织。

另一方面本发明提供一种用于水稻组织培养特性快速鉴别的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：盒体、氯酸钾溶液，所述氯酸钾溶液置于所述盒体内，所述氯酸钾溶液的浓度为0.5％～3％，更优选为1.5％。申请人发现，一旦氯酸钾浓度高于3％，水稻组织培养特性与处理后反应强度的相关性会明显降低。

本发明中设定时期的水稻幼苗为无菌水萌发9～15天后的二叶期幼苗，优选为12天；设定时间段为12～120小时，优选为72小时。

本发明的鉴别方法中，定性地将幼苗对氯酸钾的反应分为三个等级，其代表数值为0、1、2等。0级：幼苗生长正常，叶片绿色，无枯黄、卷曲；1级：叶片枯黄或卷曲；2级：叶片枯黄并且卷曲。

本发明的鉴别方法中定量地以叶片枯黄或卷曲数量的百分率作为衡量组织培养特性的判据。并且还可以基于该组织培养特性的判据对组织培养特性进行量化分级，分为：无反应(0％)、少许(25％)、一半(50％)、大部分(75％)、完全(100％)。特定时间点的实际叶片枯黄和/或卷曲数量的百分率(％)＝(卷曲数量变化百分率+枯黄数量变化百分率)/2。

叶片枯黄或卷曲数量百分率的数值越小表面抗性越好，0％表示对氯酸钾无明显反应，抗性好，100％表示反应最强，最敏感，抗性差。

本发明中所涉及的“水稻”优选为栽培稻。

本发明中所涉及的“组织培养”的起始材料来自营养器官(根、茎、叶的整体或部分细胞、组织)、生殖器官(花、果实、种子的整体或部分细胞、组织)、原生质体，优选为胚，更优选为成熟胚。

本发明中所涉及的“组织培养”指的是利用如前所述的起始材料，培养获得愈伤组织、悬浮细胞系、原生质体等，优选为愈伤组织，更优选为成熟胚来源的愈伤组织。

本发明中所涉及的“组织培养”指的是利用如前所述的起始材料，培养获得愈伤组织、悬浮细胞系、原生质体等，再进一步培养获得完整的再生植株、再生器官(如根、芽)、胚状体等，优选为完整的再生植株。

相对于鉴别水稻组织培养特性的传统方法，本方法不需要经过组织培养过程，具有以下突出优点，简便高效、周期短、成本低，显著提高不同水稻材料的组织培养特性的鉴别效率。

因此，本发明方法的优点在于，简便高效、周期短、成本低，显著提高不同水稻材料的组织培养特性的鉴别效率。

附图说明

图1为经72小时处理后对氯酸钾的抗性反应指数为0％的水稻品种的组织培养表现；

图2为经72小时处理后对氯酸钾的抗性反应指数为25％的水稻品种的组织培养表现；

图3为经72小时处理后对氯酸钾的抗性反应指数为50％的水稻品种的组织培养表现；

图4为经72小时处理后对氯酸钾的抗性反应指数为75％的水稻品种的组织培养表现；

图5为经72小时处理后对氯酸钾的抗性反应指数为100％的水稻品种的组织培养表现；

从图中对比可以看出，氯酸钾抗性好(数值为0％)的水稻品种，愈伤组织生长状态良好，呈鲜亮的淡黄色；而氯酸钾抗性差(数值为100％)的水稻品种，愈伤组织生长状态最差，褐化严重。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

实施例1水稻氯酸钾抗性的评价方法

(1)水稻氯酸钾溶液的处理

成熟的水稻种子用去离子水培养9～15天后，取二叶期幼苗20～50株，置于250mL的三角烧瓶中，加入150mL的1.5％的氯酸钾溶液，浸泡处理根72小时，分别在0、12、24、36、48、60、72小时观察幼苗的受伤程度，并记录相关评价指标。

不同类型的水稻幼苗对氯酸钾表现不同的敏感性，主要反映在叶片的受伤程度。抗氯酸钾的幼苗生长正常，叶片无枯黄、卷曲的症状，对氯酸钾敏感的幼苗叶片则出现枯黄或卷曲、枯黄且卷曲等症状。

(2)水稻氯酸钾抗性的评价指标

为了便于评价，将幼苗对氯酸钾的反应分为三个等级，其代表数值为0、1、2等，当然，本领域技术人员可以根据其自身的需求对反应等级进行更细化的分级。0级：幼苗生长正常，叶片绿色，无枯黄、卷曲；1级：叶片枯黄或卷曲；2级：叶片枯黄并且卷曲。

定量地，利用氯酸钾处理过程之后叶片枯黄或卷曲数量的百分率来作为衡量水稻幼苗对氯酸钾的抗性水平。水稻幼苗对氯酸钾的抗性水平可以根据叶片枯黄或卷曲数量的百分率分为少许(25％)、一半(50％)、大部分(75％)、完全(100％)。特定时间点的实际叶片枯黄或卷曲数量的百分率(％)＝(卷曲数量变化百分率+枯黄数量变化百分率)/2。特定时间段内的氯酸钾反应指数为在设定时间段内，不同时间点观察的实际叶片枯黄和/或卷曲数量的百分率(％)的平均值。0％表示对氯酸钾无明显反应，抗性好，100％表示反应最强，最敏感，抗性差。

通过氯酸钾反应等级来定性，氯酸钾反应指数来定量评价特定水稻材料在一段时间内对氯酸钾反应的整体表现，有利于不同水稻材料的相互比较和客观评价。

实施例2水稻材料的组织培养

(1)成熟胚愈伤组织诱导

选择具有不同氯酸钾抗性的水稻材料，将成熟种子去掉颖壳后，用70％酒精浸泡种子1min，倒掉酒精。用含有1滴Tween 20的50％次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4％)溶液浸泡种子40min(180r/min)。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5遍至溶液澄清，无次氯酸钠气味。无菌水浸泡种子过夜。用解剖刀沿种子的糊粉层将胚剥下，将胚接种于愈伤诱导培养基上。(诱导培养基的成分包括N6大量元素、B5微量元素、MS铁盐、B5维生素、500mg/L脯氨酸、500mg/L谷氨酰胺、300mg/L酪蛋白酶水解物、30g/L蔗糖、2mg/L2，4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、3g/L植物凝胶，该诱导培养基的pH值为5.80。)25～30℃光照培养愈伤组织。

如图1-5所示，其中分别示出了5种不同氯酸钾抗性的水稻品种在愈伤组织培养之后的结果。从图中可以看出，氯酸钾抗性越好(数值为0％)的水稻品种(A)，愈伤组织生长状态越好，呈鲜亮的淡黄色；而氯酸钾抗性越差(数值为100％)的水稻品种(B)，愈伤组织生长状态越差，褐化严重。

(2)愈伤组织再生植株

将通过上述方法获得的愈伤组织，置于分化再生培养基上(分化再生培养基成分包括N6大量元素、B5微量元素、MS铁盐、B5维生素、1g/L酪蛋白酶水解物、30g/L蔗糖、30g/L山梨醇、500mg/L MES、2.5mg/L CuSO4、1.5mg/L萘乙酸(NAA)、1mg/L 6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)、AA氨基酸、2.5g/L植物凝胶，该分化再生培养基pH值为5.80)，25～30℃光照培养，至出现完整再生植株。

为了找到更多可以对水稻品种的培养特性进行检验的材料，申请人还利用稀盐酸、高锰酸钾等做了类似实验，但是，申请人发现水稻品种的组织培养特性与对这些材料的抗性没有直接的线性对应关系。

虽然上面结合本发明的优选实施例对本发明的原理进行了详细的描述，本领域技术人员应该理解，上述实施例仅仅是对本发明的示意性实现方式的解释，并非对本发明包含范围的限定。实施例中的细节并不构成对本发明范围的限制，在不背离本发明的精神和范围的情况下，任何基于本发明技术方案的等效变换、简单替换等显而易见的改变，均落在本发明保护范围之内。

Claims (7)

1.一种水稻组织培养特性的快速鉴别方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤：

步骤S1、配制预定浓度的氯酸钾溶液，所述氯酸钾溶液的浓度为0.5%~3%； 步骤S2、取目标水稻材料备用； 步骤S3、将所述目标水稻材料置于所配制的预定浓度的氯酸钾溶液中； 步骤S4、确定所述目标水稻材料经所配制的预定浓度的氯酸钾溶液处理预定时间后的反应强度； 步骤S5、基于所述目标水稻材料的反应强度确定所述目标水稻材料的组织培养特性，所述组织培养特性对应于目标水稻材料的生长状态， 其中，所述方法包括基于所述目标水稻材料叶片的颜色和卷曲对所述目标水稻材料的组织培养特性进行定性分级，或者基于所述目标水稻材料叶片枯黄或卷曲数量的百分率对所述目标水稻材料的组织培养特性进行定量分级。

2.根据权利要求1所述的水稻组织培养特性的快速鉴别方法，其特征在于，所述目标水稻材料为无菌水萌发9~15天后的二叶期幼苗。

3.根据权利要求1所述的水稻组织培养特性的快速鉴别方法，其特征在于，所述反应强度包括：在预定时间段内，不同时间点观察的实际叶片枯黄和/或卷曲数量的百分率（%）的平均值。

4.根据权利要求3所述的水稻组织培养特性的快速鉴别方法，其特征在于，特定时间点的实际叶片枯黄和卷曲数量的百分率（%）＝（卷曲数量变化百分率＋枯黄数量变化百分率）／2。

5.根据权利要求1所述的水稻组织培养特性的快速鉴别方法，其特征在于，所述水稻包括栽培稻、野生稻和水稻的近缘野生品种。

6.根据权利要求1所述的水稻组织培养特性的快速鉴别方法，其特征在于，组织培养的起始材料来自营养器官、生殖器官或原生质体，所述营养器官至少包括：根、茎、叶的整体或部分细胞、组织，所述生殖器官至少包括花、果实、种子的整体或部分细胞、组织。

7.一种用于水稻组织培养特性快速鉴别的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：盒体、氯酸钾溶液，所述氯酸钾溶液置于所述盒体内，所述氯酸钾溶液的浓度为0.5%~3%，所述试剂盒用于按照权利要求1中所述方法进行水稻组织培养特性快速鉴别。

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