CN107384941B - 水稻htd5基因/其突变体及其编码蛋白与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因工程领域，具体公开了一种水稻HTD5基因/其突变体及其编码蛋白与应用。所述水稻HTD5基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。该基因的突变体htd5(high‑tillering dwarf 5)和野生型淮稻5号(HD5)相比，其株高变矮、分蘖数目增加，同时根长变短、不定根数目增加。HTD5基因作为半显性基因直接调控水稻的株高和分蘖数目，而株高和分蘖数目是构成水稻株型结构的两个重要农艺性状，因此HTD5基因有望应用于水稻株型的定向设计，并可作为重要基因的资源，有助于水稻产量的提高。

Description

水稻HTD5基因/其突变体及其编码蛋白与应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体地说，涉及水稻HTD5基因/其突变体及其编码蛋白与应用。
背景技术
随着我国人口持续增加、可耕地面积和自然资源不断减少，如何保障粮食安全已经成为我国国民经济和社会发展的重大战略问题。水稻是重要的粮食作物，占我国粮食总产的一半以上，进一步提高水稻单位面积的产量对确保我国粮食安全有重要的战略意义。水稻产量主要由有效分蘖数、穗粒数和粒重等农艺性状共同决定。发掘和克隆控制水稻分蘖性状的关键基因并研究其作用机理，将为水稻“超高产”分子设计育种提供高产基因资源和奠定理论基础。
水稻分蘖的生长发育过程分为分蘖芽的形成和伸长两个阶段。在分蘖芽的形成阶段，我国科学家在2003年率先克隆的MOC1基因是促进分蘖芽形成的关键基因。2012年我国科学家又报导了TE1/TAD1基因，其编码的泛素连接酶复合体通过降解MOC1蛋白来调控水稻分蘖数目。在分蘖芽的伸长阶段，其生长受到多种植物激素如生长素、细胞分裂素和独脚金内酯的精确调控。在植物顶端合成的生长素向基部运输并抑制侧芽的伸长，而细胞分裂素则促进分蘖芽的伸长。独脚金内酯是最近几年刚发现的调控植物分枝的新型植物激素，具有抑制侧芽(分蘖芽)伸长的作用。独脚金内酯合成或信号传导途径发生缺陷后，植株表现为矮化多分蘖的表型。
独脚金内酯是一类萜内酯，它的发现至今已有几十年的历史。1966年，人们第一次从陆地棉(Gossypiumhirsutum)的根部分泌物中发现一种可存进寄生植物种子萌发的高活性的晶体物质，并命名为独脚金醇(Strigol)。1972年，独脚金醇(Strigol)的结构被解析。从此，大量研究证明独脚金内酯是一类次级代谢产物，由根部产生并分泌，并作为根寄生植物独脚金属和列当属等萌发的刺激物。同时人们还发现独脚金内酯可刺激植物共生菌的菌丝分枝和促进植物与根瘤菌的共生。之后，人们发现一系列多分蘖突变体(包括水稻、拟南芥、大豆等)的表型变化不是已知植物激素(生长素和细胞分裂素等)含量变化引发，因此认为植物体内存在一种新的、可移动的、具有抑制植物分枝作用的激素，2008年，其被定义为独脚金内酯。至今，人们从不同植物中共发现了17种独脚金内酯类化合物。这些化学物之间结构的差异决定着它们具有不同的生物学活性。
2005年，Matusova等(2005)提出独脚金内酯由类胡箩卜素途径合成。自2008年发现独脚金内酯是一种抑制植物分枝的激素后，人们发现多个合成缺陷突变体(包括CCD7、CCD8和P450)的多分蘖表型可以通过外源施加GR24(人工合成的独脚金内酯类似物)恢复，从而第一次确定CCD7、CCD8和P450存在于独脚金内酯合成途径中。试验证明CCD7可以裂解β-胡萝卜素生成10’-apo-β-carotenal，之后CCD8将其裂解为13-apo-β-carotenone(C18)，只是一直无体内证据证明载脂蛋白类胡萝卜素(apocarotenoids)是独脚金内酯合成的中间产物。2009年，人们发现了独脚金内酯合成途径中的D27蛋白。D27蛋白是一种含铁蛋白，定位于叶绿体内。2012年，人们通过对D27、CCD7和CCD8的生化反应发现独脚金内酯合成途径中一个可能的中间产物，类胡萝卜素内酯(carlactone)。虽然类胡萝卜内酯(carlactone)极有可能是独脚金内酯的前体物质，然而至今该物质未在植物体内发现。结合拟南芥的嫁接试验推测MAX1位于类胡萝卜内酯(carlactone)下游，MAX1可能催化胡萝卜素内酯(carlactone)生成独脚金内酯(strigolactone)。从分子结构看，类胡萝卜素内酯(carlactone)需要一至多个氧化酶催化才能转化成从独脚金内酯(strigolactone)，这些酶有待进一步被发现。
人们从独脚金内酯不敏感突变体中获得了独脚金内酯信号途径的信号分子或受体。拟南芥max2/水稻d3/矮牵牛rms4和水稻d14是独脚金内酯不敏感的多分蘖突变体，其体内都累积了过量的独脚金内酯。研究发现，MAX2/D3/RMS4编码一个F-box蛋白，与赤霉素(gibberellin，GA)、茉莉酸(jasmonate)和生长素(auxin)的受体属同一类F-box蛋白，这提示我们D3或D14可能是独脚金内酯的受体。D14编码一个α/β折叠水解酶家族成员，与GA受体GID1同属一个蛋白家族，提示D14也可能是独脚金内酯的受体。D14含有α/β折叠水解酶保守的催化三联体(Ser，His，Asp)。晶体结构分析发现，水稻D14、矮牵牛DAD2和拟南芥AtD14的催化三联体具有结构上的保守性。事实证明，这些蛋白可以水解独脚金内酯人工合成类似物GR24。该研究还采用酵母双杂交技术(Y2H)证明GR24存在时，DAD2可以与PhMAX2(MAX2的同源蛋白)互作。Hamiaux et al.进一步通过差式扫描荧光技术(Differential ScanningFluorimetry，DSF)测定GR24与DAD2的互作，发现GR24引起DAD2变得不稳定。Nakamura etal.通过胰蛋白酶消化法(Trypsin Digestion Assay)测定D14与GR24的结合也证明了同样的结论。上述结果表明，GR24可引起DAD2和D14蛋白的构象变化。Kagiyama et al.通过等温滴定量热法(Isothermal titration calorimetry，ITC)测定了AtD14与GR24具有结合能力。遗憾的是，至今未见D14-GR24(或其他独脚金内酯)复合物结构的报道。Nakamura etal.报道了D14-HMB((hydroxymethylbutenolide，独脚金内酯类似物((-)-2'-epi-GR7的水解产物)的结构。他们同时证明HMR是一种可以抑制植物分枝的活性物质。然而，无证据证明D14-HMR复合物存在于植物分枝抑制的信号途径中。近期，人们报道了一个显性的SL不敏感突变体dwarf53(d53)。研究表明，D53在GR24存在时与D14相互作用。D14和SCFD3的泛素连接酶同时存在时，GR24可引起D53经蛋白水解酶途径降解，因此证明D53是SL信号的抑制因子。
与其他植物激素一样，独脚金内酯的合成和活性受到其他激素复杂的调控网络的影响。尤其是生长素，它在独脚金内酯的代谢和信号调控过程中发挥重要作用。生长素是植物生长和发育过程中的一个关键因子，几乎调节植物所有的发育过程，包括植物分枝。植物生长素在植物的顶端如腋芽和幼叶中产生，通过外排载体蛋白PIN-FORMED(PIN)将其运输至不同组织。独脚金内酯通过将PIN1蛋白从维管细胞的质膜上解离从而阻止生长素从植物顶端向下运输，生长素在腋芽的大量积累引起腋芽的发育受到抑制。与PIN1相反，独脚金内酯对PIN2具有正向调节作用。生长素也是独脚金内酯合成过程的主要调节因子，它可以主要维持CCD7和CCD8基础的转录水平。豌豆去尖并经NPA(生长素运输抑制剂，1-N-naphthylphthalamic acid)处理，植物体内RMS5和RMS1，尤其是RMS1，表达量显著下调，外源施加生长素后，其表达水平得到恢复。拟南芥MAX3、MAX4和水稻D10基因对生长素具有与RMS1和RMS5相似的反应模式。独脚金内酯的合成受到独脚金内酯信号途径的反馈调节。独脚金内酯缺陷突变体中，拟南芥的MAX3和MAX4基因、水稻D10基因和矮牵牛的DAD1基因表达量上调。GR24处理可以降低拟南芥MAX3和MAX4的表达水平。普遍认为独脚金内酯的合成除了受到自身的反馈调节外，还受到一种PAT介导的长距离信号的反馈调节，即独脚金内酯通过降低生长素的运输能力从而抑制独脚金内酯的合成。
水稻分蘖受独脚金内酯激素的直接调控，独角金内酯作为一种新的植物激素，其研究至今已取得了显著进展，但其代谢和信号传导途径尚有大量空白亟待补充，同时其与生长素间的互作机制至今尚无定论。因此发现与水稻有关的突变体并从中克隆到独脚金内酯途径的新成员，对解析水稻分蘖的调控网络具有重要的理论意义，为水稻株型的遗传改良提供更多的基因资源，直接应用于水稻育种中有助于提高水稻产量。
发明内容
本发明的目的是提供一种对水稻株高和分蘖数目具有显著影响的水稻HTD5基因/其突变体及其编码蛋白与应用。
本发明首先提供一种调控水稻株高和分蘖数目的HTD5蛋白，其具有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。例如，在非活性区段的碱基改变、缺失，均不会影响蛋白的功能。
本发明还提供了编码上述蛋白的CDS序列，其具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
本发明还提供了水稻HTD5基因全长序列(HTD5基因组序列)，其具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，全长1198bp，包含6个外显子，编码区长687bp(如SEQ ID NO.2所示序列)，编码228个氨基酸的蛋白产物(如SEQ ID NO.3所示序列)，该HTD5基因组序列可分离自水稻基因组序列。
进一步地，本发明还提供了一种与水稻株高和分蘖数目相关的SNP分子标记，位于水稻HTD5基因426位点，该位点发生C/T的碱基突变导致株型的多态性。
本发明提供一种水稻HTD5基因突变体htd5，其具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。该突变体htd5与HTD5基因组序列相比，区别在于，第426位的C突变为T，从而引起脯氨酸(Pro，P)突变为亮氨酸(Leu，L)，该突变发生在HTD5基因组序列第3个外显子上。
上述水稻HTD5基因突变体htd5编码的蛋白具有SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列。
进一步地，本发明提供含有水稻HTD5基因或突变体htd5的载体。
并进一步提供水稻HTD5基因或突变体htd5在水稻株型改良中，以及在影响水稻分蘖数目中的应用。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
(1)本发明首次提供了水稻HTD5基因(核苷酸序列如SEQ ID No.1所示)及其编码的蛋白(氨基酸序列如SEQ ID No.3所示)。
(2)本发明通过观察htd5突变体的表型，发现HTD5基因突变后会直接影响水稻分蘖数目及株高。本发明利用HTD5 3’UTR-RNAi及HTD5 CDS-RNAi转化水稻htd5突变体，发现可以恢复突变体正常株高和分蘖数目的表型，因而确定了HTD5基因可以直接调控株高和分蘖数目而被应用于水稻株型的控制，以提高水稻生产力。
附图说明
图1为htd5突变体与野生型淮稻5号的表型。
图2为htd5突变体与野生型HD5杂交后F1个体表型。
图3为HTD5基因定位与结构图。
图4为载体HTD5 3’UTR-RNAi结构示意图。
图5为载体HTD5 CDS-RNAi结构示意图。
图6为HTD5 3’UTR-RNAi和HTD5 CDS-RNAi转化水稻htd5突变体可恢复其表型。
图7为载体pCAMBIA 1305.1-HTD5 promoter::GUS结构示意图。
图8为HTD5基因在水稻各组织中表达模式分析。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施例中使用的水稻(Oryza sativa)品种淮稻5号为标准品种，水稻矮化多分蘖突变体htd5来自中国农业科学院作物科学研究所李学勇课题组，相关文献正在撰写中。
实施例1htd5突变体的获得与表型分析
通过EMS诱变粳稻品种淮稻5号，获得一个矮化多分蘖突变体htd5(high-tillering dwarf 5)。该突变体从幼苗期至成熟期均表现出明显的矮化和多分蘖表型，与野生型HD5差异显著。调查抽穗期HD5的株高为102.34cm，htd5突变体的株高为48.28cm，仅为HD5株高的47.18％；HD5单株分蘖数目为17.3个，htd5突变体的分蘖数目为95.2个，为HD5的5.50倍(图1A、1B、1E、1F)。同时htd5突变体还表现出冠状根变短但数目增多的表型(图1C、1D、1G、1H)。
实施例2 htd5突变体与野生型HD5杂交后F1个体表型
htd5突变体与野生型HD5杂交后代F1个体呈现出两亲本的中间表型，抽穗期HD5的株高为72.1cm，htd5突变体为38.4cm，F1杂合体为43.3cm(图2A、2B)；抽穗期HD5每株的分蘖数为13.2个，htd5突变体为79.7个，F1杂合体为38.5个(图2A、2C)。可见杂合体的株高和分蘖数目均介于两亲本之间，表明htd5为半显性突变体。随机调查htd5突变体与HD5构建的F2分离群体中248个单株，发现69个单株具有正常株高，58个单株矮化，121个单株表现为半矮化，经卡方适合度检测(χ2＝1.12<χ2 0.05＝5.99)符合1:2:1的分离比例。因此htd5突变性状受一对半显性基因控制。
实施例3水稻HTD5基因的获得
将htd5突变体与表型正常且多态性高的籼稻品种Dular杂交获得F2分离群体，进行遗传分析与基因定位。对F2代发生性状分离的株系分析表明，F2群体中正常株高、矮化、半矮化单株分离比亦符合1:2:1的分离比例(χ2＝0.92<χ2 0.05＝5.99)。
以F2的20个突变体为材料，利用均匀分布于水稻12条染色体上的170个Indel标记，将候选基因定位于第5号染色体，与Indel标记M3与M4连锁，两个标记间的物理距离为817Kb(图3A)。为了进一步精细定位候选基因，继续扩大F2代定位群体到290株，并在区间内开发新的标记(见表1)，最终将其定位在InDel标记M9和M10之间103kb区间内(图3B)。参照水稻基因组注释网站(Rice Genome Annotation Project，http://rice.plantbiology.msu.edu/)，该区域内存在12个开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)，其中6个基因编码的蛋白具有明确的生化功能(图3C)。其中编号为LOC_Os05g09480的基因序列，其基因功能与表型有关，为此分两段对该基因的全长基因组DNA进行PCR扩增，所用引物见表2，每段大小为1.3kb左右，使用DNAStar软件分析野生型和突变体的测序结果。在htd5突变体中，该基因编码区第185位的C突变为T(如SEQ ID NO.4所示序列)，从而第62位氨基酸引起脯氨酸(Pro，P)突变为亮氨酸(Leu，L)(图3D，如SEQ ID NO.5所示序列)。HTD5基因组DNA全长1198bp(如SEQ ID NO.1所示序列)，包含6个外显子，编码区长687bp(如SEQID NO.2所示序列)，编码228个氨基酸的蛋白产物(如SEQ ID NO.3所示序列)。该定位区间内其他5个编码已知蛋白的基因，测序未发现突变位点。
表1
Figure GDA0002215241570000081
表2
Figure GDA0002215241570000082
实施例4HTD5 3’UTR-RNAi载体转化水稻htd5突变体
为了进行功能互补实验，构建了HTD5基因的RNAi干扰载体。根据RNAi干扰的原则设计引物，分别在HTD5基因的3’UTR和CDS区域设计引物，尽量避免蛋白结构保守区，引物序列如表3所示。利用表3中的RNAi(3’UTR)-1引物扩增获得位于HTD5基因3’UTR区250bp的片段，并在片段两端引入Kpn I位点，重组到LH-FAD2-1390RNAi载体的Kpn I酶切位点中去；在该载体的基础上，利用RNAi(3’UTR)-2引物扩增获得相同的片段，并在片段两端引入SnaBI酶切位点，重组到含有第一个片段的载体的SnaBI酶切位点中去，这样就获得了含有HTD5基因3’UTR区两段反向互补的片段的RNAi干扰载体(如图4所示)。另外利用表3中的RNAi(CDS)-1引物扩增获得位于HTD5基因CDS区342bp的片段，并在片段两端引入Kpn I位点，重组到LH-FAD2-1390RNAi载体的Kpn I酶切位点中去；在该载体的基础上，利用RNAi(CDS)-2引物扩增获得相同的片段，并在片段两端引入Sna BI酶切位点，重组到含有第一个片段的载体的Sna BI酶切位点中去，这样就获得了含有HTD5基因CDS区两段反向互补的片段的RNAi干扰载体(如图5所示)。
将构建好RNAi干扰载体用电击法转入农杆菌EHA105，水稻htd5突变体结的种子诱导愈伤作为受体材料，用农杆菌介导的转化方法进行水稻的转化。用3’UTR区域片段构建的RNAi干扰载体获得了9个独立的转化株系，用CDS区域片段构建的RNAi干扰载体获得了8个独立的转化株系。它们均表现为株高变高，分蘖数变少，与野生型相似的表型(图6)。以上结果表明，确实是由于HTD5基因的突变造成了htd5突变体分蘖数目增多和株高变矮的表型。
表3
Figure GDA0002215241570000101
实施例5水稻HTD5基因表达模式
为明确HTD5基因的组织表达模式，采用Real-time PCR的方法检测水稻各个组织包括根、茎、叶、叶鞘、花、种子、分蘖芽以及幼穗中该基因表达水平，结果显示HTD5基因在水稻的不同组织、部位广泛表达，尤其在根、幼叶中表达量最高，其次在幼穗、分蘖芽、叶鞘和花表达量也较高，在茎和种子中的表达量最低(图8)。为了更直观和准确的研究HTD5在各个组织中的表达情况，我们克隆了HTD5起始密码子ATG上游2.55Kb的序列，并将其融合在GUS基因上游，构成HTD5 promoter-GUS载体，如图7所示。用该载体转化粳稻品种日本晴，并对转基因植株各发育时期进行GUS染色分析。根、分蘖芽、叶片、叶鞘、茎节中均能检测到GUS活性，这与htd5突变体的综合表型结果一致，包括分蘖增加、茎节变短、根长变短、侧根数目增多等，说明HTD5突变后影响了上述器官的发育(图8)。实施例5中涉及的引物序列如表4所示。
表4
Figure GDA0002215241570000111
Figure GDA0002215241570000121
Figure GDA0002215241570000131
Figure GDA0002215241570000141

Claims (6)

1.一种与水稻株高和分蘖数目相关的SNP分子标记，其特征在于，其位于SEQ ID No.1所示HTD5基因序列的第426位点，该位点发生C/T碱基突变导致株型的多态性。
2.一种水稻HTD5基因突变体htd5，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
3.权利要求2所述水稻HTD5基因突变体htd5编码的蛋白。
4.含有权利要求2所述突变体htd5的载体。
5.权利要求2所述突变体htd5在水稻株高改良中的应用。
6.权利要求2所述突变体htd5在提高水稻分蘖数目中的应用。
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