CN107383352B - 一种提取生物絮团中phb的方法以及应用 - Google Patents

一种提取生物絮团中phb的方法以及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提取生物絮团中PHB的方法以及应用，其包括：将从养殖水体中收集得到的生物絮团经过第一次洗涤步骤、干燥步骤、絮团菌细胞破碎步骤以及第二次洗涤步骤后，得到PHB粗提物；将PHB粗提物用氯仿进行抽提步骤和蒸干步骤后得到纯化的PHB。该方法首次以从养殖水体中收集得到的生物絮团作为提取原料，从中提取出PHB；生物絮团从养殖水体中获取，廉价易得，节约了原料成本。另外，该提取方法有利于实现水产养殖中废物的二次利用，有效减少养殖废物、废水排放和环境污染。该提取方法为水产养殖开发新型廉价免疫增强剂奠定了基础。

Description

一种提取生物絮团中PHB的方法以及应用
技术领域
本发明涉及水产动物疾病免疫防控技术领域，具体而言，涉及一种提取生物絮团中PHB的方法以及应用。
背景技术
生物絮团技术(Biofloc technology，BFT)是一种新兴的生态养殖技术，具有净化水质、降低饲料系数、促进养殖动物生长、提高成活率、增强免疫力等作用，成为国际水产养殖学研究的新热点。BFT是零水交换体系，增强养殖水域生物修复，减少养殖废水、废物排放；同时，还能切断流行病原的传播途径和减少环境胁迫，有效预防疾病的发生，最终达到低投入、高产出、养殖废物和废水“零排放”的目的。BFT已被成功用于一些经济水产动物的养殖。
生物絮团在BFT体系中发挥着重要的作用，它是养殖水体中以好氧微生物为主体的有机体和无机物，经生物絮凝形成的团聚物。絮团以菌胶团、丝状细菌为核心，附着微生物胞外产物外聚合体、胞内产物PHB(poly-β-hydroxybutyrate，聚β-羟基丁酸酯)、多糖类等物质，但这些组分对养殖动物生长、消化和免疫的影响尚不清楚，这将限制了絮团的优化和再利用。
PHB是由微生物合成的聚合体，为一定粒度的脂溶性颗粒，其生成与碳源、氮源以及C/N比密切相关。PHB具有良好的生物可降解性、生物相容性和抗凝血等特性。PHB在动物机体内可自然降解，其最终产物为β-羟基丁酸，它在动物机体血液中是一种普通的代谢物，不会带来任何毒性作用，还具有无刺激性、无免疫原性和无热原反应等特点，这决定了PHB在农业及生物医学领域中应用广泛。PHB在动物肠道内的降解产物β-羟基丁酸能促进食物消化、营养物质吸收和改善肠道微循环，提高蛋白质和矿物质的利用率，从而促进机体生长。饲料中添加适量的PHB可以促进欧洲海鲈、中华绒螯蟹等的生长；此外，Yohei等研究了不同个体大小仿刺参的肠道微生物区系，结果发现仿刺参的生长速率与其肠道内所含产PHB的微生物组成有关。采用PHB强化的轮虫和卤虫投喂中华绒螯蚤状幼体，可显著提高其蜕皮和抗弧菌感染能力。并且，PHB可提高罗非鱼血清中溶菌酶和过氧化物酶活性。PHB可以促进水产动物生长、消化和提高机体免疫力，抑制病原菌生长；同时，PHB具有良好的疏水性，这使其作为添加剂在水产饲料中有广阔的应用前景，但PHB昂贵的原料来源和生产工艺限制了其在水产养殖中的应用。因此，开发廉价的原料和提取高效的PHB，应用于水产养殖业显得尤为重要。迄今为止，还未见从生物絮团养殖水体中的生物絮团内提取PHB的研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提取生物絮团中PHB的方法，该提取方法具有操作简单、成本低、提取效率高等特点。
本发明的另一目的在于提供采用上述的提取生物絮团中PHB的方法所提取的PHB在水产养殖中的应用。
本发明是这样实现的：
一种提取生物絮团中PHB的方法，其包括：
将从养殖水体中收集得到的生物絮团经过第一次洗涤步骤、干燥步骤、絮团菌细胞破碎步骤以及第二次洗涤步骤后，得到PHB粗提物；
将上述PHB粗提物用氯仿进行抽提步骤和蒸干步骤后得到PHB。
采用上述提取生物絮团中PHB的方法所提取的PHB在水产养殖中的应用。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供的提取生物絮团中PHB的方法，该提取方法首次以从养殖水体中收集得到的生物絮团作为提取原料，生物絮团可从养殖水体中获取，廉价易得，节约了原料成本；另外，该提取方法有利于实现水产养殖中养殖废物的二次利用，有效减少养殖废物、废水排放和环境污染；还有，该提取方法通过经过第一次洗涤步骤、干燥步骤、破碎步骤以及第二次洗涤步骤得到PHB粗提物，再将PHB提物用氯仿进行抽提步骤和蒸干步骤后得到纯化的PHB，其具有提取效率和纯度较高等特点，该提取方法为水产养殖开发新型廉价免疫增强剂和养殖废物的再次利用奠定了基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例2提供的PHB提取物的扫描电镜图；
图2为本发明实施例2提供的PHB提取物的气相色谱分析结果图；
图3为本发明实施例2提供的PHB提取物的红外分析结果图；
图4为本发明实施例2提供的用于PHB含量计算的标准曲线。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例提供的一种提取生物絮团中PHB的方法以及应用进行具体说明。
一方面，本发明实施例提供了一种提取生物絮团中PHB的方法，该方法包括以下：
将从养殖水体中收集得到的生物絮团经过第一次洗涤步骤、干燥步骤、絮团菌细胞破碎步骤以及第二次洗涤步骤后，得到PHB粗提物；
将上述PHB粗提物用氯仿进行抽提步骤和蒸干步骤后得到PHB。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述养殖水体中的碳氮比为(15-20)：1，且上述养殖水体中的总悬浮物浓度在600mg/L以上。
在碳氮比为(15-20)：1、总悬浮物浓度在600mg/L以上的养殖水体中，有利于生物絮团的稳定和快速絮凝，可收集到大量的生物絮团。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述第一次洗涤步骤为：
用蒸馏水与上述生物絮团混匀洗涤、离心、弃上清，接着用丙酮与上述生物絮团混匀洗涤、离心、弃上清，再接着用蒸馏水与上述生物絮团混匀洗涤、离心、弃上清。
其中，蒸馏水的使用量、离心转速以及时间均可根据具体情况确定。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述干燥步骤为：将经过上述第一次洗涤步骤处理后的上述生物絮团进行冷冻干燥，以使生物絮团完全干燥。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述絮团菌细胞破碎步骤为：将经过上述冷冻干燥处理后的生物絮团和蒸馏水混匀后，进行低温超声波破碎，然后离心，弃上清，得到生物絮团破碎液。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述低温超声波破碎的参数为：温度3-5℃，时间为：间歇5-7s、工作5-7s，共进行8-9min；破碎处理后，弃上清。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述第二次洗涤步骤为：
用蒸馏水与上述生物絮团破碎液混匀洗涤、离心、弃上清；接着用丙酮洗涤上述生物絮团破碎液、离心、弃上清；再用蒸馏水与上述生物絮团破碎液混匀洗涤、离心、弃上清；然后将上述生物絮团破碎液烘干，即为上述PHB粗提物。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，烘干的条件为：温度50℃、时间8h，需要说明的是，烘干时间可视烘干情况作适当调整。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述抽提步骤为：按上述PHB粗提物与氯仿的质量体积比(m:V，g:mL)为1:(40-42)的比例，用氯仿与上述PHB粗提物混合，于38-42℃条件下抽提10-12h，得到含有PHB的抽提液，抽提液经过滤后得到过滤液；
进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述蒸干步骤为：将上述过滤液置于78-82℃水浴条件下蒸干，以除去残留氯仿。
综上，本发明实施例提供的提取生物絮团中PHB的方法，该提取方法首次以从养殖水体中收集得到的生物絮团作为提取原料，生物絮团从养殖水体中获取，廉价易得，节约了原料成本；
另外，该提取方法有利于实现水产养殖中废物的二次利用，有效减少养殖废物、废水排放和环境污染。
还有，该提取方法的提取效率和纯度较高，为水产养殖开发新型廉价免疫增强剂奠定了基础。
另一方面，本发明提供了采用上述任一项所述的提取生物絮团中PHB的方法所提取得到的PHB在水产养殖中的应用。
采用上述提取生物絮团中PHB的方法所提取得到的PHB具有纯度高、生理活性好等特点，将其应用于水产养殖例如用于投喂养殖动物可促进食物消化、营养物质吸收和改善肠道微循环，不仅提高蛋白质和矿物质的利用率，还可提高养殖对象的免疫力和存活率，该应用为提高水产养殖的经济效益提供了有力支撑。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供的提取生物絮团中PHB(poly-β-hydroxybutyrate，聚β-羟基丁酸酯)的方法包括如下步骤：
(1)生物絮团水体的培育：选择一种适宜生物絮团技术养殖的水产动物(例如异育银鲫)，根据生物絮团的形成条件，调整养殖水体中的碳氮比为20:1，促使养殖水体尽快稳定，总悬浮物浓度达到600mg/L以上时为宜。该步骤为可选步骤，在其他的实施例中，可省略该步骤。需要说明的是，在其他的实施例中，养殖水体中的碳氮比为20：1，也可以是15:1、16:1、17:1、18:1、19:1等，只要在(15-20):1的范围内均可。
(2)使用100目的浮游生物网过滤生物絮团养殖水体，收集生物絮团并快速装瓶，室温保存，待用。
(3)将收集的沥水的35mL生物絮团絮状物装于50mL离心管中，离心，8000rpm，10min，弃上清，收集下层絮团(约0.02g)。其中，生物絮团的量一般为离心管的2/3，由水体中可悬浮物(VSS)浓度决定。
(4)第一次洗涤：加入15mL灭菌蒸馏水混匀洗涤，离心，8000rpm，10min，弃上清；加入10mL丙酮混匀洗涤，离心，8000rpm，10min，弃上清，加入丙酮以去除生物絮团中菌细胞外的脂质；再加入15mL蒸馏水混匀洗涤，离心，8000rpm，10min，弃上清，通过洗涤可减少水体中离子干扰，去除胞外杂质。
(5)干燥：将装有生物絮团的离心管用保鲜膜封口，扎孔，进行冷冻干燥24h，以使生物絮团完全干燥；冷冻干燥有利于保持物质活性。
(6)破碎：在离心管中加入2/3体积的灭菌蒸馏水混匀，超声波破碎，4℃，8min(间歇5s，工作5s)，离心，8000rpm，15min，弃上清；取沉淀，得到生物絮团破碎液。
絮团菌细胞破壁后以使细菌释放出胞内的PHB。生物絮团含有G+和G-细菌，菌群组成较为复杂多样，由此决定了生物絮团中菌细胞的破壁方法不同于其他单一微生物发酵液的破壁方法，相较于SDS、NaClO等破壁方法，本发明的发明人发现采用超声波的破壁效果最佳，提取率最高。
(7)第二次洗涤：加入15mL蒸馏水与生物絮团破碎液混匀洗涤，离心，8000rpm，10min，弃上清；加入10mL丙酮混匀洗涤，离心，8000rpm,10min,弃上清。此时的丙酮的主要作用是除去菌细胞外脂类物质；同上重复再洗涤1次后，除去丙酮，向沉淀中加入15mL灭菌蒸馏水与生物絮团破碎液混匀洗涤，除去丙酮，离心，4℃，8000rpm，10min，弃上清，取沉淀，以去除胞内杂质，提高粗提物的纯度。
(8)将沉淀放入烘箱烘干，温度50℃，时间8h，即得PHB粗提物。
(9)用干净的玻璃棒将干燥后PHB粗提物移至玻璃管中，后用氯仿洗涤原盛放样品的容器并将洗涤液装入另一支玻璃管中。
(10)按PHB粗提物与氯仿的质量体积比(g:mL)为1:40的比例，向PHB粗提物中加入氯仿，于40℃条件下抽提11h，得到含有PHB的抽提液。设定参数：破壁方法、温度、抽提时间和体积比，根据响应曲面法得出本发明中设定的参数值为最佳提取参数。另外，在其他的实施例中，PHB粗提物与氯仿的质量体积比(g:mL)也可以是1:42。
(11)利用氯仿润洗后的中速定量滤纸过滤抽提液并盛放在一玻璃管中，原玻璃管用氯仿荡洗3次，通过荡洗最大限度地溶解黏在管壁上的PHB，减少误差。
(12)在通风橱中，80℃水浴锅蒸干过滤液中的氯仿，再加入5mL氯仿，60℃水浴加热蒸干1h，以去除氯仿，收集纯化后的PHB提取物44.7mg。
当然，在其他的实施例中，也可用热氯仿溶解，加热浓缩，加入数倍量的乙醇，析出PHB沉淀，经过数次处理，可有效提高PHB纯度。
实施例2
PHB定量和定性分析：紫外分光光度法、气相色谱法和红外光谱法。
(1)标准曲线的制作
准确称取0.002g PHB标准品(Sigma-ALDRICH)于10mL玻璃试管中，加10mL氯仿，60℃水浴1h，将其倒入20mL容量瓶中，加氯仿补至20mL，此时浓度为100μg/mL；从中吸取0.5mL于另一个10mL容量瓶中加氯仿补至10mL，此时浓度为5μg/mL，从标准液中分别吸取1、1.5、2、2.5、3、3.5mL加入6只10mL玻璃管中，加氯仿补至5mL；另取空白管加5mL氯仿，80℃水浴，蒸干氯仿，加3mL浓硫酸，震荡摇匀，带塞100℃水浴10min，冷却至室温，D2灯，测A235处吸光值。以PHB浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线，结果如图4所示。
PHB含量的定量分析
称取实施例1中步骤12后获得的PHB提取物于玻璃带帽试管中，加入3mL浓硫酸，震荡摇匀，带塞100℃水浴10min，冷却至室温，D2灯，测A235处吸光值。根据标准曲线，计算PHB含量。结果显示：44.7mg PHB提取物中含有42.48mg PHB，PHB浓度为950.3mg/g。提取率＝(PHB提取物中的PHB含量/干生物絮团中的PHB含量)×100％。0.2g干生物絮团通过高效液相色谱法测得PHB的含量为46.04mg。经上述公式计算得到，采用实施例1的提取方法的PHB提取率达92.3％。
(2)PHB定性分析：按照常规方法通过扫描电镜观察PHB提取物的表面形态结构以及元素分析，PHB中碳元素含量为63.56％，氧元素含量为35.93％(结果如图1所示)。气相色谱法分析其单体组成，样品保留时间为2.214min(结果如图2所示)，PHB标准品Sigma-ALDRICH)的保留时间是2.189min。红外图谱分析显示(图3)，纯化后的样品在1724cm-1处有一最大吸收峰，那是羧酸中羟基的吸收峰；在2850cm-1处存在-CH伸缩振动；同时在3436cm-1、2976cm-1、2933cm-1处存在-CO、-CH3、-CH2的振动(结果如图1所示)。如上结果表明，提取物即为纯度较高的PHB。
综上，本发明实施例提供的提取PHB的方法能够从生物絮团技术养殖系统的生物絮团中高效提取出PHB，PHB的纯度较高，且提取率可达92.3％。
相对于PHB在其他领域的提取方法，本发明实施例提供的提取PHB的方法具有以下优点：1)生产PHB的原料廉价易得，节约原料成本，同时，帮助实现水产养殖中废物的二次利用，有效减少养殖废物、废水排放和环境污染；2)生物絮团由多种微生物组成，不同于其他PHB提取时，均采用单一菌种的发酵液，这将增大生物絮团中PHB的提取难度，本专利中的提取方法与他人有很大不同，该法提高了PHB的提取率和纯度；3)PHB已被证实具有促进养殖动物生长和免疫力的功能，本发明为水产养殖开发新型廉价免疫增强剂奠定基础。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种提取生物絮团中PHB的方法，其特征在于，其包括：
将从养殖水体中收集得到的生物絮团经过第一次洗涤步骤、干燥步骤、絮团菌细胞破碎步骤以及第二次洗涤步骤后，得到PHB粗提物；
将所述PHB粗提物用氯仿进行抽提步骤和蒸干步骤后得到PHB；
其中，所述养殖水体中的碳氮比为(15-20)：1，且所述养殖水体中的总悬浮物浓度在600mg/L以上；
所述第一次洗涤步骤为：用蒸馏水与所述生物絮团混匀洗涤、离心、弃上清，接着用丙酮与所述生物絮团混匀洗涤、离心、弃上清，再接着用蒸馏水与所述生物絮团混匀洗涤、离心、弃上清；
所述干燥步骤为：将经过所述第一次洗涤步骤处理后的所述生物絮团进行冷冻干燥；
所述絮团菌细胞破碎步骤为：将经过冷冻干燥处理后的生物絮团和蒸馏水混匀后，进行低温超声波破碎，然后离心，弃上清，得到生物絮团破碎液，所述低温超声波破碎的参数为：温度3-5℃，时间为：间歇5-7s、工作5-7s，共进行8-9min；
所述第二次洗涤步骤为：用蒸馏水与所述生物絮团破碎液混匀洗涤、离心、弃上清；接着用丙酮洗涤所述生物絮团破碎液、离心、弃上清；再用蒸馏水与所述生物絮团破碎液混匀洗涤、离心、弃上清；然后将所述生物絮团破碎液烘干，即为所述PHB粗提物；
所述抽提步骤为：按所述PHB粗提物与氯仿的质量体积比为1:(40-42)的比例，用氯仿与所述PHB粗提物混合，于38-42℃条件下抽提10-12h，得到含有PHB的抽提液，抽提液经过滤后得到过滤液；
所述蒸干步骤为：将所述过滤液置于78-82℃水浴条件下进行第一次蒸干，再加入氯仿，置于58-62℃水浴条件下进行第二次蒸干。
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