CN107365848A

CN107365848A - 一种用于肝癌诊断、化疗与预后检测的分子标记物及试剂盒

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Publication number: CN107365848A
Application number: CN201710679242.1A
Authority: CN
Inventors: 黄家强; 周晓萌; 林博楠; 王晓月; 林舒晔; 田荣孟
Original assignee: Beijing Jiaotong University
Current assignee: Beijing Jiaotong University
Priority date: 2017-08-10
Filing date: 2017-08-10
Publication date: 2017-11-21
Anticipated expiration: 2037-08-10
Also published as: CN107365848B

Abstract

本发明公开了用于肝癌诊断、化疗与预后检测的分子标记物，所述分子标记物为位于PRSS3基因内的一段DNA序列，该DNA序列的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，且至少包含一个甲基化位点。本发明还公开了所述分子标记物在制备肝癌诊断、化疗与预后检测的制剂的应用。本发明基于检测PRSS3基因内DNA序列甲基化的试剂盒可以特异地检测PRSS3基因相关的DNA甲基化水平，还能够对PRSS3基因相关的DNA甲基化水平进行特异、定量检测。检测结果可以为肝癌患者病情及个体化用药监测、肿瘤早期诊断，也为患者对药物治疗的预后提供了评价方法。

Description

一种用于肝癌诊断、化疗与预后检测的分子标记物及试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域。更具体地，涉及一种用于肝癌诊断、化疗与预后检测的分子标记物及试剂盒。

背景技术

肝癌(Liver cancer/Hepatic cancer)是全球癌症死亡的主要原因之一，以肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)最为常见，近年来其发病率不断上升(Siegel R,Naishadham D,Jemal A.Cancer statistics,2013[J].CA Cancer J Clin,2013,63(1):11-30.)。据统计，2012年全球HCC新病例782,000例，有746,000人死于肝癌(Torre L A,Bray F,Siegel R L,et al.Global cancer statistics,2012[J].CA Cancer J Clin,2015,65(2):87-108.)。HCC的主要致病因素是乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染。流行病学调查显示，HBV慢性感染者是肝癌发生的主要高危人群，全球超过一半肝癌源于HBV感染。HCC最常用的监测方法是甲胎蛋白(alpha fetoprotein,α-FP或AFP)和肝脏超声。但由于相应的标志物敏感性低特异性差，多数患者就诊时已届晚期，以致肝癌的五年生存率低于5％。

研究表明，HCC发生发展的分子机制涉及到癌基因与抑癌基因表达平衡失调、相关细胞信号转导通路异常调变等，是一渐进性遗传学和表观遗传学(Epigenetics)异常改变的累积过程。表观遗传调控基因活性与表型的变化的分子机制主要包括DNA甲基化(DNAmethylation)、组蛋白修饰(Histone modification)和非编码RNA(Non-coding RNA)等方面，其中任何一个方面的异常都可能影响染色质结构和基因表达，从而导致疾病的发生。与基因突变不同，表观遗传学改变导致基因活性与表达的变化在一定条件下可以逆转，这一特性为疾病尤其是肿瘤的早诊早治提供了新的思路。如抑癌基因(Tumor suppressorgene)启动子区CpG岛异常高甲基化及组蛋白修饰异常所致基因表达与功能的异常改变对肿瘤的发生起着极其重要的作用，并作为表观遗传标志物与靶点应用于肿瘤的分子诊断与治疗。但有关基因内(intragenic)DNA甲基化和组蛋白修饰等表观遗传模式调控基因特异性表达的研究几乎没有报道。

因此，筛选基因内具有强敏感性、高特异性的肝癌诊断、化疗与预后检测的分子标志物，以及寻找有效的检测方法，建立有效监控手段，从而早诊早治具有重要的临床应用价值。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种用于肝癌诊断、化疗与预后检测的分子标记物，该分子标记物具有敏感性强、特异性高的特点。

本发明的第二个目的在于提供上述分子标记物在制备肝癌诊断、化疗与预后检测的试剂中的应用。

本发明的第三个目的在于提供一种用于肝癌诊断、化疗与预后检测的试剂盒。

为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：

本发明研究发现PRSS3基因在肝癌组织细胞中表达明显降低，并呈现基因内DNA高甲基化，免疫组化染色实验结果显示PRSS3基因在肝癌组织与癌旁组织的蛋白表达呈现明显差异。通过使用DNA甲基化抑制剂和组蛋白去乙酰化抑制剂可逆转PRSS3在肝癌细胞中的表达沉默，表明PRSS3基因在肝癌中表达沉默与其基因内DNA高甲基化和与低组蛋白修饰相关。因此，PRSS3基因内序列的DNA甲基化和组蛋白修饰可作为肝癌发展的早期诊断、化疗与预后检测的分子标志物和药物作用靶点。

本发明用于肝癌诊断、化疗与预后检测的分子标记物，所述分子标记物的为位于PRSS3基因起始密码子ATG上游序列1000bp至终止密码子TAA下游序列1000bp的DNA序列，该DNA序列的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，且至少包含一个甲基化位点。

优选的，所述分子标记物的为位于PRSS3基因起始密码子ATG上游序列300bp至终止密码子TAA下游序列700bp的DNA序列，该DNA序列的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，且至少包含一个甲基化位点。

本发明提供了上述分子标记物在制备肝癌诊断、化疗与预后检测的制剂的应用。

进一步，所述应用为所述分子标记物在制备肝癌诊断、化疗与预后检测的药物作用靶点或试剂盒中的应用。

本发明还提供了检测上述分子标记物的物质在制备肝癌诊断、化疗与预后检测的试剂中的应用。

优选的，所述物质为检测上述分子标记物的引物，以及包含上述引物的试剂或试剂盒。

本发明进一步提供了一种用于肝癌诊断、化疗与预后检测的试剂盒，包括检测PRSS3基因内的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示DNA序列的引物；优选的为检测PRSS3基因内的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示DNA序列的引物。

所述引物包括甲基化引物和非甲基化引物；其中，所述甲基化引物的上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述非甲基化引物的上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

利用上述甲基化引物，以硫化修饰后的DNA为模板进行MSP扩增，如果PRSS3基因存在甲基化，则会得到152bp大小的片段；如果PRSS3基因未发生甲基化，则不产生扩增产物。基于此，本发明将该引物称为甲基化引物。所述甲基化引物，其上游引物的Tm 60.1，GC含量68.0％，下游引物的Tm 62.2，GC含量70.4％。

利用该非甲基化引物，以硫化修饰后的DNA为模板进行MSP扩增，如果PRSS3基因未发生甲基化，则会得到155bp大小的片段；如果PRSS3基因发生甲基化，则不产生扩增产物。基于此，本发明将该引物称为非甲基化引物。所述非甲基化引物，其上游引物的Tm58.83，GC含量69.2％，下游引物的Tm59.1，GC含量69.0％。

如果上述152bp和155bp大小的两个片段均呈现在PCR扩增产物中，则提示PRSS3基因发生部分甲基化。

进一步，所述试剂盒还包括用于MSP的甲基化对照DNA模板和非甲基化对照DNA模板；

其中，所述用于MSP的甲基化对照DNA模板为经硫化修饰后的呈现90％以上高甲基化的DNA；优选的，为经硫化修饰后在PRSS3基因内区域呈现90％以上高甲基化的肿瘤细胞DNA；所述用于MSP的非甲基化对照DNA模板为正常组织细胞DNA；优选的，为PRSS3基因内区域呈现非甲基化的正常组织细胞DNA。

进一步，所述试剂盒还包括作为阴性系统对照的去离子水；

进一步，所述试剂盒还包括MSP反应所需的PCR反应试剂。

本发明的有益效果如下：

本发明用于肝癌诊断、化疗与预后检测的分子标记物，该分子标记物具有敏感性强、特异性高的特点。本发明基于检测PRSS3基因内DNA序列甲基化的试剂盒可以特异地检测PRSS3基因相关的DNA甲基化水平，还能够对PRSS3基因相关的DNA甲基化水平进行特异、定量检测。检测结果可以为肝癌患者病情及个体化用药监测、肿瘤早期诊断，也为患者对药物治疗的预后检测提供了评价方法。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1示出PRSS3在肝癌细胞系、肝癌组织及其相邻癌旁组织中的表达。A.半定量RT-PCR分析人肝癌细胞系及肝胚胎细胞L02中PRSS3RNA水平的表达。B.免疫组化染色法检测肝癌组织及癌旁中的PRSS3蛋白表达代表性结果。C.25例配对肝癌组织及其相邻癌旁中的PRSS3蛋白表达情况。

图2示出人肝癌中PRSS3基因内的DNA甲基化。A.通过MSP分析HCC细胞系中PRSS3的基因内DNA甲基化状况，其中，U：非甲基化；M：甲基化；IVD：体外的甲基化DNA作为MSP阳性控制；NL：正常血液淋巴细胞DNA作为MSP阴性控制，MSP:甲基特异性PCR。B.双亚硫酸盐测序验证MSP的PRSS3基因内甲基化。实心圆代表CpG二核苷酸甲基化位点，空心圆代表非甲基化位点。C.PRSS3基因结构示意图，显示甲基化特异性PCR(MSP)、硫化测序(BS)及ChIP-PCR扩增分析PRSS3基因的区域位置，每条竖线代表一个CpG位点，数字代表着相距TSS的位置。TSS：转录起始位点。D.使用表观药物DNA甲基化抑制剂5-aza-2’-脱氧胞苷(5-Aza-2’-deoxycytidine，5-Aza)处理人HCC细胞后PRSS3的表达变化。E.表观药5-Aza联合组蛋白去乙酰化抑制剂曲古抑菌素A(trichostatin A，TSA)处理人HCC细胞后PRSS3的表达变化；GAPDH:RT-PCR的内控。

图3示出在原发性肝癌临床组织标本中，肿瘤的恶性分化程度PRSS3的DNA甲基化相关。在HCC组织中对PRSS3的甲基化进行了分析。A，B.琼脂凝胶电泳显示MSP分析的部分结果。C.MSP方法检测人正常肝组织(Normal liver tissue)(n＝20)和原发性肝癌(Livercancer tissue)(n＝66)组织标本中的PRSS3基因内甲基化状态。D.PRSS3在肿瘤的甲基化和肿瘤的表达之间的相关性分析。*:p<0.05。

图4示出PRSS3对人HCC细胞生长特性的影响。A，B.MTT实验。C，D.软琼脂集落形成实验。E，F.流式细胞仪分析细胞周期。G.Western blotting。

图5示出PRSS3对HCC细胞迁移和侵袭能力的影响。A.细胞单层刮痕实验。B，C.显示过表达PRSS3对HCC细胞HepG2和PLC/PRF/5迁移(B)及侵袭(C)能力的影响。D.显示敲降PRSS3对HCC细胞SNU-387迁移与侵袭能力的影响。E.Western blotting。

图6示出PRSS3对HCC细胞中MAPK/ERK信号的影响。Western blotting分析过表达或敲降PRSS3对HCC细胞中MAPK/ERK信号通路中的蛋白分子的作用。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

实施例1肝癌的早期诊断与预后检测的分子标志物的发现

1、PRSS3在肝癌组织细胞中的表达降低

1.1细胞培养和加药处理

(1)肝癌细胞系(HepG2，PLC/PRF/5，Bel-7401、SMMC-7721、HBXF、SNU-387和SNU-449)，永生化的正常肝细胞系L02接种于75cm²的培养瓶中，在含体积分数10％BSA的RPMI1640培养基中常规培养，置37中常，5％CO₂培养箱孵育。待细胞融合度达到80％时按1:3比例传代培养。

(2)肝癌细胞系和永生化的正常肝细胞系融合度达30％时，2μmol/L的去甲基化药物5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine，5-AZA)，添加到细胞培养基中，轻柔摇晃培养瓶，使药物均匀分布在培养基中，之后每24h换一次培养基，加一次5-AZA，总共需要加药4次，共96h。

1.2RNA提取和半定量RT-PCR

(1)总RNA提取

1)移液枪吸取2mL的Trizol试剂，添加到细胞培养瓶中，轻柔摇晃均匀，将液体转移到1.5mL的离心管中，用于提取总RNA。

2)移液枪吸取300吸取氯仿，添加到1.5mL的离心管中，上下颠倒，充分混匀，冰上静置10min，13000rpm，400离心10min，将上层液体转移到新的1.5mL离心管中。

3)移液枪吸取500吸取异丙醇，添加到新的1.5mL离心管中，轻柔混匀，13000rpm，400离心10min，弃上清。

4)移液枪吸取600吸取rpm，的乙醇洗涤两次，每次13000rpm，4 00离心10min，弃上清。

5)用DEPC水溶解RNA。

6)吸取1取C。nrp共2份，分别测浓度和跑胶，根据RNA浓度，A260与A280的比值及跑胶结果判断RNA的数量和质量。

7)逆转录之前，RNA置于-80之前冰箱中保存。

(2)第一条链cDNA的合成根据SuperScript First-Strand Synthesis Systemfor RT-PCR试剂盒操作流程进行：

1)将以下组分添加到0.5mL离心管中：

2)轻弹混匀，置于65混匀金属浴，孵育5min，立即置于冰上冷却。

3)短暂离心后向0.5mL加入以下组分：

4)轻弹混匀，置于37混匀金属浴，孵育2min。

5)室温加入1温加入育置于UT逆转录酶，轻弹混匀，置于25酶，金属浴，孵育10min。

6)置于37mi金属浴，孵育50min，然后再置于70再置金属浴，孵育15min以终止反应。

7)第一条链合成后，用DEPC水将反应产物稀释至100产物，随后用稀释好的cDNA作为模板用于PCR扩增：

(3)半定量RT-PCR：

1)引物设计：

①在NCBI数据库中，根据人PRSS3基因的全长编码序列，跨两个相邻外显子之间的内含子序列设计一对特异性引物，序列如下：

上游引物A：5’-GCA CAG TTG CTG TCC CCT TT-3’(如SEQ ID No.9所示)

下游引物A：5’-GCA GAA GTG GGA GCC AGA AT-3’(如SEQ ID No.10所示)

②以GAPDH作为内参，在NCBI数据库中，根据人GAPDH基因的全长编码序列，跨两个相邻外显子之间的内含子序列设计一对特异性引物，序列如下：

上游引物B：5’-GAC CAC AGT CCA TGC CAT CAC-3’(如SEQ ID No.11所示)

下游引物B：5’-GTC CAC CAC CCT GTT GCT GTA-3’(如SEQ ID No.12所示)

2)用于PCR扩增的反应体系如下：

3)将0.5mL离心管置于PCR反应仪上，进行PCR反应。

①用于PRSS3扩增的PCR反应条件如下：

②用于GAPDH基因扩增的PCR反应条件如下：

95℃5min；95℃30s，63℃30s，72℃30s，25cycles；72℃7min；4℃

4)琼脂糖凝胶电泳：

①用电子天平称取1.5g琼脂糖置于锥形瓶中，量筒量取100mL 0.5筒量取BE后倒入锥形瓶中，混合后放入微波炉内加热至溶解。

②取出锥形瓶，冷却至50形瓶左右，加入适量EB，混匀后倒入预先准备好的凝胶制备槽中，垂直插入梳子，避免气泡产生。

③胶凝固后，拔掉梳子，将胶块放入盛有TBE缓冲液的电泳槽中，将样品加入胶孔中，200V电压，15min。电泳结束后将胶块取出，放入紫外凝胶成像仪中，拍照、保存结果。

通过以上试验发现：PRSS3在肝癌细胞系呈现出低表达的状态；而在人肝胚胎细胞系L02中呈现表达状态(图1A)，表明PRSS3的表达在人肝癌肿瘤细胞中显著降低。

2、免疫组化染色验证

(1)脱蜡和水化

1)脱蜡前将组织切片放在烤片机上，70℃，1h。

2)二甲苯I中浸泡10min；二甲苯II中浸泡15min。

3)在100％乙醇I中浸泡2min；100％乙醇II浸泡2min；95％乙醇浸泡2min；80％乙醇浸泡2min；蒸馏水冲洗2次。

(2)抗原修复

高温高压热修复：取一定量的柠檬酸盐缓冲液于高压锅中，大火加热至沸腾，将脱蜡后的组织切片置于耐高压的塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，盖上锅盖，安全阀顶起后，扣上压力阀，继续加热至喷气。温度调至100℃，计时2分30秒。高压锅离开热源，放于盛有自来水盆中。安全阀将至底部，打开锅盖，冷却15min。用双蒸水洗2次，用滤纸滤干。

(3)封闭：

1)用蒸馏水配制新鲜的3％双氧水，将切片放于3％双氧水中15min，双蒸水洗3次，再用1×PBS洗3次，每次5min。

2)正常山羊血清孵育15min。

(4)滴加适当抗-PRSS3抗体，稀释比为1:50，4℃孵育过夜。

(5)用1×PBS洗3次，每次5min。

(6)滴加适量试剂1(内源性过氧化物酶阻断剂)，37℃孵育25min。

(7)用1×PBS洗3次，每次5min。

(8)滴加适量试剂2(辣根酶标羊抗小鼠/兔IgG聚合物)，37℃孵育25min。

(9)用1×PBS洗3次，每次5min。

(10)显色：避光滴加DAB显色剂(1滴DAB显色剂：1mL DAB稀释液)，室温5min。

(11)复染，自来水冲洗，苏木精复染2min，盐酸-酒精分化，温水蓝化。

(12)依次用80％乙醇，洗1次；95％乙醇洗1次；100％乙醇I洗2min；100％乙醇II洗2min；二甲苯I浸泡3min；二甲苯II浸泡3min。

(13)常规树脂封片。

免疫组化染色实验结果如图1B所示，图中呈现蓝色为复染剂苏木精标记的细胞核，据此观察组织和细胞形态的本底颜色。图中呈现明显棕褐色为阳性着染蛋白，提示PRSS3蛋白表达；相反的，其它未能呈黄褐色或不明显或不呈现，提示蛋白表达减弱或阴性。从图1B中可以看出，PRSS3在肝癌组织与癌旁组织的蛋白表达呈现明显差异，即在癌旁组织呈现明显黄褐色(PRSS3蛋白表达阳性)，在癌组织中几乎不着色(PRSS3蛋白表达阴性)，表明应用免疫组化染色PRSS3根据显示组织不同部位着色信号的强弱，可将肿瘤组织和正常细胞区分开来，因此，PRSS3免疫组化染色可应用于区分肝癌组织与癌旁组织。

根据德国半定量评分系统对细胞阳性着色强度和阳性细胞数目进行分级。根据细胞阳性着色程度，可分为：阴性＝0；弱阳性＝1；中等阳性＝2；强阳性＝3。根据阳性细胞数量，可分为：0％＝0(无阳性细胞)，1–24％＝1(阳性细胞总数在25％以下)，25–49％＝2(阳性细胞数目在25％-49％)，50–74％＝3(阳性细胞数在50％-74％)，75–100％＝4(阳性细胞数在75％-100％)。最后免疫反应值(0-12)＝细胞阳性着色程度*阳性细胞数量。根据上述评分系统，对免疫组化染色法显示出的25例配对肝癌组织及其相邻癌旁中的PRSS3蛋白表达进行了分析，并以盒型图呈现，结果如图1C所示，结果表明肝癌组织中PRSS3蛋白表达量明显高于癌旁组织。

3、PRSS3在肝癌组织细胞中的低表达与其基因内DNA表观修饰相关

经过筛选鉴定(具体方法详见实施例4和实施例5)，肿瘤细胞中PRSS3基因内呈现显著高甲基化状态(图2A，B和C)。使用表观药物DNA甲基化抑制剂5-aza-2’-脱氧胞苷(5-Aza-2’-deoxycytidine，5-Aza)或组蛋白去乙酰化抑制剂曲古抑菌素A(trichostatin A，TSA)可逆转PRSS3在肝癌细胞中的表达沉默，而且二者联合用药具有增强效应，表明PRSS3在肝癌组织细胞中表达沉默受表观调控(图2D和E)，表明PRSS3在肝癌中表达沉默与其基因内(intragenic)DNA高甲基化和与低组蛋白修饰相关。

MSP方法检测人正常肝组织(Normal liver tissue)(n＝20)和原发性肝癌(Livercancer tissue)(n＝66)组织标本中的PRSS3基因内甲基化状态(图3A和B)。从图3C中可以看出PRSS3基因内在人正常肝组织100％呈现非甲基化状态；而在原发性肝癌组织标本中则呈现甲基化状态高达80％，提示在原发性肝癌组织标本中PRSS3基因内的高甲基化。

通过临床验证，即分析25个原发性肝癌患者肿瘤组织及其邻近癌旁组织样本中PRSS3基因内甲基化与其表达的相关性(图3D)，表明PRSS3基因内甲基化在决定其表达的作用。进一步通过分析病人的临床病理资料与PRSS3基因内DNA高甲基化修饰的相关性，发现PRSS3基因内DNA甲基化与肝癌的恶性分化程度显著相关(P<0.05)(表1)。

以上结果提示PRSS3基因内甲基化可作为肝癌早诊及预后的分子标志物。

表1PRSS3基因内DNA高甲基化修饰与肝癌病人临床病理资料的相关性

4、功能验证PRSS3在肝癌细胞中抑癌基因样作用

通过分别在HCC细胞HepG2、PLC/PRF/5或SNU-387上过表达PRSS3或敲降PRSS3，观察PRSS3对人HCC发展的潜在影响，验证了PRSS3在肝癌细胞中的生物学作用，并深入探讨其作用机制，以确定PRSS3基因内甲基化作为肝癌早诊及预后的分子标志物的可靠性。

在肝癌细胞中外源性表达PRSS3可显著抑制肝癌细胞的增殖(图4A)、克隆形成(图4C)并与细胞周期阻滞相关(图4D和G)；而且可显著抑制肝癌细胞的侵袭与转移(图5A、B、C和E)。在肝癌细胞中敲降PRSS3可促进肝癌细胞体外显著生长(图4B)克隆形成(图4E)、伴有细胞周期改变(图4F和G)，并可显著促进肝癌细胞的侵袭与转移(图5D和E)。同时还发现PRSS3在肝癌细胞中的生物学作用可能通过与MEK/ERK通路相关(图6)，针对该通路的靶点药在肿瘤化疗等联合治疗治疗中具有重要作用。

功能实验表明，PRSS3在肝癌细胞中呈现抑癌基因的作用，进一步证实临床检测结果，不仅提示PRSS3基因的表观调控与肝癌发生相关，而且表明PRSS3基因的表观修饰可作为肝癌发展的早期诊断与预后检测的分子标志物，还可为肝癌化疗潜在靶标。

这些研究发现不仅为肝癌的发生发展提供了新的机制，也为基因内表观修饰在肝癌个体化诊断治疗的临床应用提供新的线索，因而具有重要的科学价值和临床意义。基于表观变化的早期发生及可逆转的特点，PRSS3基因DNA高甲基化，可作为肝癌早期诊断、化疗和预后检测的分子标志物，还可为肝癌的靶向治疗提供了新的途径。

实施例2PRSS3基因内DNA甲基化的专用引物的设计

从NCBI呈现的PRSS3基因序列中选取富含CG的DNA区域，确定可能的CpG岛；根据DNA甲基化修饰在基因内分布特性(Wang，Y.,et al.Sci Rep 2016,6:22051.)，通过人工比对分析，从GenBank选取特定的PRSS3基因序列中富含CG的DNA区域，用软件Primer Express3.0设计多条引物对,筛选出以下甲基化引物和非甲基化引物，所有引物由华大公司(北京)合成。

所述甲基化引物的上游引物核苷酸序列为：5'-GGTACGCGGATAGGGAGGGGATATC-3'(如SEQ ID No.3所示)，下游引物核苷酸序列为：5'-TAATATACGCATCGATACCGCAACCCG-3'(如SEQ ID No.4所示)；所述非甲基化引物的上游引物核苷酸序列为：5'-GGGTATGTGGATAGGGAGGGGATATT-3'(如SEQ ID No.5所示)，下游引物核苷酸序列为：5'-AATAATATACACATCAATACCACAACCCA-3'(如SEQ ID No.6所示)。

实施例3检测PRSS3基因内DNA甲基化修饰的试剂盒的组成

一种检测PRSS3基因内DNA序列甲基化修饰的试剂盒，即用于肝癌诊断、化疗与预后检测的试剂盒，包含核苷酸序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的甲基化引物，核苷酸序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的非甲基化引物、用于MSP的甲基化对照DNA模板(经硫化修饰后在PRSS3基因内区域呈现90％以上甲基化的DNA)、非甲基化对照DNA模板(PRSS3基因内区域呈现非甲基化的正常组织细胞DNA)、作为阴性系统对照的去离子水、PCR反应试剂。

实施例4细胞及组织中PRSS3甲基化的检测

(1)肝细胞系DNA的提取流程

1)将处于生长对数期、状态良好的上述肝癌细胞系和正常肝细胞系，移除培养基，用冰冷的1×PBS轻柔清洗细胞两次。

2)加胰酶1mL，消化1min，再加入2mL RPIM-1640完全培养基中和，轻柔吹打悬浮细胞，移至15mL离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，收集细胞。

3)加入DNA提取液2mL，蛋白酶K(10mg/mL)100μL，吹打混匀后，置50℃恒温水浴锅中，3h。

4)取出，冷却至室温，加入等体积的酚/氯仿，上下颠倒混匀，4200rpm离心15min，小心转移上层液体至新的15mL离心管中。

5)加入1/10体积的7.5mol/L醋酸铵，2倍体积的无水乙醇，轻柔混匀，10000rpm离心20min，弃上清。

6)加入70％乙醇500μL，洗涤沉淀两次，13000rpm离心5min，弃上清，风干。

7)加入pH 8.0TE溶液100μL溶解DNA，取其中1μL DNA溶液，用NanoDrop 2000c超微量核酸分析仪测DNA浓度，剩余样品储存于-20℃冰箱。

(2)肝组织DNA提取流程

1)取液氮罐中冻存肝组织，切取200mg到1g，用预冷研钵研磨组织标本。

2)每100mg组织标本加入1mL DNA提取液，100μL10mg/mL的蛋白酶K，轻柔吹打混匀置于50℃恒温水浴锅中，消化过夜，在刚开始消化的1h内颠倒混匀数次。

3)之后步骤同肝细胞系DNA提取流程。

(3)阳性对照IVD(In Vitro Methylation DNA)样品的制备流程

1)吸取50μg肝癌细胞系DNA至1.5mL EP管中，加双蒸水至150μL。

2)依次向1.5mL EP管中加入60μL双蒸水、25μL10×缓冲液、2.5μL 32mmol/L SAM、12.5μL SSS1甲基化酶，轻弹混匀，置于37℃，孵育4h。

3)依次加入5μL32mmol/L SAM、6μL SSS1甲基化酶，轻弹混匀，37℃，孵育4h。

4)向1.5mL EP管中加入260μL酚/氯仿(1:1)，上下颠倒混匀后，12000rpm离心10min，小心转移上清至新的1.5mL EP管中。

5)加入350μL氯仿，12000rpm离心3min，小心地将上清转移到新的1.5mL EP管中。

6)依次加入1μL糖原、35μL 7.5mol/L乙酸铵、3倍体积无水乙醇，上下颠倒混匀。

7)置于-20℃冰箱，沉淀2h；13000rpm离心，20min，弃上清，

8)加入500μL70％乙醇，13000rpm离心5min，弃上清，风干后溶解于100μL双蒸水中。

9)取1μL样品，用NannoDrop 2000c测所得DNA浓度，剩余样品置于-20℃冰箱保存。

(4)细胞和组织DNA样品硫化

1)取2μg基因组DNA于1.5mL离心管中，用双蒸水稀释至50μL。

2)加5.5μL 2mol/L NaOH，混匀，置于37℃，孵育15min。

3)依次加30μL新鲜配制的10mmol/L氢醌，520μL新鲜配制的3mol/L亚硫酸氢钠，混匀，置于50℃水浴锅中孵育16h。

4)将1.5mL EP管从水浴锅中取出，放置试管架上，冷却至室温。

5)将纯化柱安装到真空泵上，编号，用2mL塑料吸管轻柔地将硫化后DNA样品转移到纯化柱内。

6)用移液枪吸取1mL DNA Clean-Up Resin，加入到纯化柱中，轻柔吹打混匀，打开柱子下面的阀门，用真空泵抽吸液体，液体吸干后关闭阀门。

7)用2mL塑料吸管吸取2mL 80％的异丙醇，加到纯化柱内，打开柱子下面的阀门，用真空泵抽吸液体，液体吸干后关闭阀门。

8)取下纯化柱，安装到新的1.5mL的离心管中，加入50μL预热至55℃的双蒸水，10000rpm离心1min。

9)加入5.5μL 3mol/L氢氧化钠，混匀，静置5min。

10)依次加入1μL糖原，17μL 7.5mol/L醋酸铵，3倍体积的无水乙醇，上下颠倒混匀，-80℃沉淀2h。

11)低温离心，4℃，13000rpm，30min，弃上清。

12)加入500μL 70％乙醇，清洗一遍，4℃，13000rpm离心5min，弃上清，风干。

13)加入20μL双蒸水溶解，-80℃保存。

(5)甲基化特异性PCR(Methylation-specific PCR，MSP)

1)MSP甲基化引物序列：

上游引物5'-GGTACGCGGATAGGGAGGGGATATC-3'(如SEQ ID No.3所示)

下游引物5'-TAATATACGCATCGATACCGCAACCCG-3'(如SEQ ID No.4所示)

MSP非甲基化引物序列：

上游引物5'-GGGTATGTGGATAGGGAGGGGATATT-3'(如SEQ ID No.5所示)

下游引物5'-AATAATATACACATCAATACCACAACCCA-3'(如SEQ ID No.6所示)。

2)用于PCR扩增的反应体系如下：

每一组PCR反应包括一个阳性对照，体外用Sss I甲基转移酶处理肝癌细胞DNA样品作为PCR模板，一个阴性对照，用正常人外周淋巴细胞DNA作为PCR模板。

3)PCR反应条件如下：

95℃5min；95℃/30s，60℃/30s，72℃/30s，35cycles；72℃7min；4℃。

4)凝胶电泳：MSP产物在2％的琼脂糖胶上电泳。

(6)结果判定

图2以硫化修饰后的DNA作为甲基化对照，人外周血淋巴细胞DNA作为非甲基化对照，去离子水作为阴性系统对照建立对照体系，分别用甲基化引物及非甲基化引物对肝癌细胞系和组织标本进行MSP检测。

IVD标记为甲基化对照，NL标记非甲基化对照，H₂O为阴性系统对照。

结果判读方法如下：

用甲基化引物(图中以M表示)进行扩增，有扩增产物，而用非甲基化引物(图中以U表示)进行扩增，无扩增产物的标本，判读为完全甲基化；

用甲基化引物及非甲基化引物进行扩增，均有扩增产物的标本，判读为部分甲基化；

用非甲基化引物进行扩增，有扩增产物，用甲基化引物进行扩增，无扩增产物的标本，判读为非甲基化。

部分甲基化及完全甲基化的标本均判读为甲基化。

扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果如图所示：图2A中，四株肝癌细胞系中，HepG2、PLC/PRF/5为甲基化状态；SNU-449呈现部分甲基化状态；SNU-387呈现非甲基化状态；肝胚胎细胞系L02则呈现部分甲基化状态；图3A中，正常肝组织均为未甲基化状态；图3B中，肝癌组织均为甲基化或部分甲基化状态。

实施例5亚硫酸氢钠测序法验证

(1)亚硫酸氢钠修饰和PCR扩增

1)肝癌细胞系(HepG2，PLC/PRF/5，SNU-387)和正常肝细胞系L02硫化过程同上。

2)引物设计：BSSQ的引物覆盖MSP引物PCR产物的大小为286bp(图2C)。引物序列如下：

上游引物5’-TTGATTTGTATGGGATTTGTGG-3’(SEQ ID No.7所示)

下游引物5'-ACCTTCCCCTCACCCTACAAC-3'(SEQ ID No.8所示)

3)用于PCR扩增的反应体系如下：

4)PCR反应条件如下：

95℃/5min；95℃/30s，60℃/30s，72℃/30s，35cycles；72℃/7min；4℃

5)凝胶电泳：PCR产物在2％的琼脂糖胶上电泳。

6)电泳结束后，在紫外凝胶成像仪内将正确的单一条带切胶回收，放置干净的1.5mL的离心管中，用于后续胶回收。

(2)PCR产物溶胶回收

1)用移液枪吸取500μL的BL液体，将其加入到收集管中，室温离心1min，转速为12000rpm，弃废液。

2)称取1.5mL EP管中切下来的胶块的重量。

3)用移液枪吸取溶胶液，置于1.5mL EP管中，将EP管放置于50℃电热恒温水浴箱中，至胶块完全溶解。

4)将冷却至室温的溶胶液从1.5mL的EP管中转移到含有吸附柱的收集管中，室温放置2min，然后室温离心1min，转速为12000rpm。

5)用移液枪吸取600μL漂洗液，加入到置于收集管中的吸附柱内，室温离心1min，转速为12000rpm。离心后弃废液，再重复一次。

6)室温空离2min，转速为12000rpm，然后在室温风干。

7)用移液枪吸取30μL洗脱液，加入到吸附膜的正中央，室温离心2min，转速为12000rpm。将管底液体收集置于-20℃冰箱保存。

(3)克隆

1)PCR胶回收产物克隆到pEASY-T1克隆载体上，根据pEASY-T1Cloning Kit说明书操作流程进行。连接反应体系及反应条件如下：

混匀后，置于25℃金属浴上，反应10min，反应结束后迅速置于冰上，用于后续转化实验。

2)将连接产物加入到50μL刚解冻的Trans1-T1感受态细胞内，用手指轻轻弹管底，使其混匀，置于冰上，反应30min。

3)置于事先加热至42℃金属浴中，反应90s，迅速置于冰上2min。

4)吸取250μL平衡至室温的LB液体培养基，加入到1.5mL的EP管中，200rpm，37℃孵育1h。

5)避光移取8μL IPTG(500mmol/L)和40μL X-gal(20mg/mL)于1.5mL EP管中，轻弹混合后加在LB固体培养平板上，涂布棒均匀地涂开，倒置于37℃电热恒温培养箱，30min。

6)当LB固体培养平板上的液体被完全吸收后，取出菌液，4000rpm，离心1min，去掉上清，只保留150μL液体，用移液枪缓慢吹打液体，混匀后加入到培养板上，涂板，先正置于37℃电热恒温培养箱培养30min，然后倒置于培养箱内，继续培养14h。

7)进行蓝白斑筛选，用枪头挑取挑大的、白色的克隆，将其置于含有0.1％氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，培养14h。

(4)质粒提取

1)收菌：将培养14h的菌液于室温10000rpm离心2min，彻底弃除上清。

2)重悬：加入250μL含RNaseA的细胞悬浮液，反复吹打充分悬浮细菌。

3)裂解：加入250μL裂解液，轻轻上下颠倒混匀，室温反应5min，但是不要超过5min。

4)中和：加入350μL中和缓冲液(S3)，轻轻上下颠倒混匀，室温离心10min，转速为12000rpm。

5)DNA结合：转移上清到置于收集管中的吸附柱内，室温离心1min，转速为12000rpm，弃掉管底液体。

6)清洗：加入500μL漂洗液，室温离心30s，转速为12000rpm，弃掉管底液体。

7)重复上一步骤，最后空离2min，彻底去除液体。

8)洗脱：加入30μL到吸附洗脱液膜正中央，静置1min，室温离心1min，转速为12000rpm。

9)储存：将收集到的质粒DNA储存于-20℃冰箱。

(4)重组子鉴定及测序

1)采用BamH I和Xho I双酶切体系进行鉴定，双酶切反应体系为：

2)酶切反应条件为：30℃，30min；37℃，30min。

3)凝胶电泳：跑1％琼脂糖胶鉴定。

4)测序：用M13R引物进行测序，分析测序结果。

(6)结果判定

图2B中白色空心圆代表非甲基化位点，黑色实心圆代表甲基化位点。分析测序结果如图所示，HepG2、PLC/PRF/5显示高度甲基化状态；L02显示较低程度的低度甲基化状态；SNU-387肝癌细胞为半甲基化状态，与实施例4的MSP检测结果基本一致。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京交通大学

<120> 一种用于肝癌诊断、化疗与预后检测的分子标记物及试剂盒

<130> JLC17I0371E

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2000

<212> DNA

<213> PRSS3基因启动子上游1000bp至下游1000bp的DNA序列

<400> 1

tggtccgttt ttacagagtg ctgattggtg tgtttacaaa cctttagcta gacacagagt 60

gctgattggt gcatttacag tcctttagct agacagaaaa gttctccaag tccccaccaa 120

ttagctggac acagagcact gattggtgca tttttacaga gtgctgattg gtgtgtttac 180

aaacctttag ctagacacag agcgctgatt gatgctttta caatccttta gctagacaga 240

aaagttctcc aagtccccac caattagctg gacacagagc actgattggt gtattttcac 300

agagtgctga ttggtgtgtt tacaaacctt tagctagaca cagagcgtag acacagagcg 360

ctgattgatg cttttacaat cctttagcta gacagaaaag ttctccaagt ccccatcaga 420

cccagaagcc cagccagctt cacctctcag tagcttacag aagaggaccc cgctgccaca 480

gcacaatacc acaaagaaag tcatgcgctc ctcagcagga agcccccttc tccgggacag 540

ggactttgtt tccttctcag ctctattgcc agcacctaga actgtgccca cctgtcagat 600

ctgttatcag atgggaacgt ggcagatttg ttgaatgaat gaaggaatga atgaactatg 660

tgacactcaa acttagccac caaacttaaa ctagaaaaac tgggttgtgg tccctgatgg 720

accgttggtg ccttcttcct ttgctggacg gtgatctgtg gctgtttctc cggtgtgttc 780

gcagtggttg cctggcttgg taacaaacac tcttcagagc cacagcctgt gctcgggctc 840

ctcgccgcct cccaggccct gcgatctctt tgcatcccag gaggtcccgg ttggttgcag 900

tcctcctggg tgactcagga accagcctct cctgaagcac acagcctagg gagttcctgg 960

ggccagagac atctccaagg gaaggtcaag ggcctggagg atgtgcggac ctgacgacag 1020

atgccccgca cgctggccgg gaccgggaag ggcggtcaag tgtggaaagg gtctggcggc 1080

tgccaggcct ggcagagtgg agcggggcgg ggcgcagcgg ggcggggcgg gcctggagct 1140

gcacccgctt ctgggtggac gcacttggcg agcggcgcgg gatgcagacg gctgcgaggc 1200

gctgggcaca ggtcagacgt cagtacccgc agggggcttg aaactggagg agggctcgaa 1260

gggagaggga gccccgccaa ggagcggggc tgtgatggag agggggttcc gactcgcatg 1320

ggacctgcgg gggagggtac gcggacaggg aggggatacc gactgggagg ggctcaggga 1380

cagggatgga ggctcctcta ggggaggacg ggaggggatg gagggccctg gtgtcgcaga 1440

agcccacctg gggccccctc cgggctgcgg caccgatgcg cacactactc ccaccgcccc 1500

cgagtgccta tgtccggctg gccgcggccc tggaatgaat attgctcagt cccccgcgag 1560

tcaggtctgc cgcgttgcag ggtgagggga aggtgtgaag ccccgggcct ccgtctgccc 1620

cgtgagtccg ggaacgcgcg cccccgtgga tgccacctgg cccctgagct gtgtccagtc 1680

acagctcaca tagctctggg cactggtacc ccgactgcct ttccttgtta gctgcgatac 1740

acaaatacat gagccagatc ctttcctgag gccaggaagc ctggaatcta ataacattgg 1800

gcggtggata aagtcccccg atccagtgct tagcttccgt taatggagcc atggatggaa 1860

gcggatgtca ggcgcagtgg gggagaaatt tgcgggggtg gccctgtcta gggccagaga 1920

aacaacctct gaagcttaga tccagcccta gagggaagaa agatgtgagt ttcagccagg 1980

gaaacctagc actttaagaa 2000

<210> 2

<211> 1000

<212> DNA

<213> PRSS3基因启动子上游300bp至下游700bp的DNA序列

<400> 2

tgggttgtgg tccctgatgg accgttggtg ccttcttcct ttgctggacg gtgatctgtg 60

gctgtttctc cggtgtgttc gcagtggttg cctggcttgg taacaaacac tcttcagagc 120

cacagcctgt gctcgggctc ctcgccgcct cccaggccct gcgatctctt tgcatcccag 180

gaggtcccgg ttggttgcag tcctcctggg tgactcagga accagcctct cctgaagcac 240

acagcctagg gagttcctgg ggccagagac atctccaagg gaaggtcaag ggcctggagg 300

atgtgcggac ctgacgacag atgccccgca cgctggccgg gaccgggaag ggcggtcaag 360

tgtggaaagg gtctggcggc tgccaggcct ggcagagtgg agcggggcgg ggcgcagcgg 420

ggcggggcgg gcctggagct gcacccgctt ctgggtggac gcacttggcg agcggcgcgg 480

gatgcagacg gctgcgaggc gctgggcaca ggtcagacgt cagtacccgc agggggcttg 540

aaactggagg agggctcgaa gggagaggga gccccgccaa ggagcggggc tgtgatggag 600

agggggttcc gactcgcatg ggacctgcgg gggagggtac gcggacaggg aggggatacc 660

gactgggagg ggctcaggga cagggatgga ggctcctcta ggggaggacg ggaggggatg 720

gagggccctg gtgtcgcaga agcccacctg gggccccctc cgggctgcgg caccgatgcg 780

cacactactc ccaccgcccc cgagtgccta tgtccggctg gccgcggccc tggaatgaat 840

attgctcagt cccccgcgag tcaggtctgc cgcgttgcag ggtgagggga aggtgtgaag 900

ccccgggcct ccgtctgccc cgtgagtccg ggaacgcgcg cccccgtgga tgccacctgg 960

cccctgagct gtgtccagtc acagctcaca tagctctggg 1000

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 甲基化引物的上游引物

<400> 3

ggtacgcgga tagggagggg atatc 25

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 甲基化引物的下游引物

<400> 4

taatatacgc atcgataccg caacccg 27

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 非甲基化引物的上游引物

<400> 5

gggtatgtgg atagggaggg gatatt 26

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 非甲基化引物的下游引物

<400> 6

aataatatac acatcaatac cacaaccca 29

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 亚硫酸氢钠修饰的上游引物

<400> 7

ttgatttgta tgggatttgt gg 22

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 亚硫酸氢钠修饰的下游引物

<400> 8

accttcccct caccctacaa c 21

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 半定量RT-PCR上游引物A

<400> 9

gcacagttgc tgtccccttt 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 半定量RT-PCR下游引物A

<400> 10

gcagaagtgg gagccagaat 20

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 半定量RT-PCR上游引物B

<400> 11

gaccacagtc catgccatca c 21

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 半定量RT-PCR下游引物B

<400> 12

gtccaccacc ctgttgctgt a 21

Claims

1.一种用于肝癌诊断、化疗与预后检测的分子标记物，其特征在于，所述分子标记物为位于PRSS3基因内的一段DNA序列，该DNA序列的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，且至少包含一个甲基化位点。

2.根据权利要求1所述的分子标记物，其特征在于，所述DNA序列的核苷酸序列如SEQID No.2所示。

3.权利要求1或2所述的分子标记物在制备肝癌诊断、化疗与预后检测的试剂中的应用。

4.权利要求1或2所述的分子标记物在制备肝癌诊断、化疗与预后检测的药物作用靶点或试剂盒中的应用。

5.检测权利要求1所述的分子标记物的物质在制备肝癌诊断、化疗与预后检测的试剂中的应用。

6.一种用于肝癌诊断、化疗与预后检测的试剂盒，其特征在于：包括检测PRSS3基因内的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示DNA序列的引物；优选的为检测PRSS3基因内的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示DNA序列的引物。

7.根据权利要求6所示的的试剂盒，其特征在于：所述引物包括甲基化引物和非甲基化引物；其中，所述甲基化引物的上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述非甲基化引物的上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括用于MSP的甲基化对照DNA模板和非甲基化对照DNA模板。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：所述用于MSP的甲基化对照DNA模板为经硫化修饰后的呈现90％以上高甲基化的DNA；优选的，为经硫化修饰后在PRSS3基因内区域呈现90％以上高甲基化的肿瘤细胞DNA；所述用于MSP的非甲基化对照DNA模板为正常组织细胞DNA；优选的，为PRSS3基因内区域呈现非甲基化的正常组织细胞DNA。

10.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括去离子水和PCR反应试剂。