CN107361012A - 增强型绿色荧光scid小鼠模型制备方法及模型应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了增强型绿色荧光SCID小鼠模型制备方法，方法如下，通过C57BL/6‑Tg(CAG‑EGFP)小鼠与NOD/SCID小鼠多代杂交‑回交的方式、并多代筛选建立稳定遗传并且系统性表达绿色荧光的NOD/SCID/EGFP小鼠即增强型绿色荧光SCID小鼠模型片；本方法采用多代杂交‑回交的繁育方法，培育表达增强型绿色荧光蛋白基因的NOD/SCID小鼠，SCID小鼠相对于裸小鼠具有更严重的免疫功能缺陷，包括T、B细胞联合缺陷；本发明还分开该方法制备的增强型绿色荧光SCID小鼠模型的应用，在异种移植研究中相比于T淋巴细胞缺陷裸鼠更具有优势以及更高的异种移植效率，本小鼠模型是优良的荧光免疫缺陷动物模型。
Description
技术领域
本发明属于医疗领域用动物模型领域，特别涉及小鼠模型。
背景技术
荧光SCID小鼠，SCID(Severe Combined Immnue Deficiency)小鼠即重症联合免疫缺陷小鼠，由美国学者Bosma[10]等人于1983年培育成功，它是一种先天性T、B淋巴细胞双重免疫缺陷动物，因而可以成为异种移植的良好受体。1992年NOD-SCID小鼠的出现进一步降低了小鼠的免疫力，提高了人外周血单个核细胞和造血干细胞移植效率。
在过去的三十年中，由于重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠中人外周血单核细胞(PBMC)和造血干细胞(HSC)的细胞植入和相关研究的进展，推动了血液学，传染性疾病，自身免疫和肿瘤免疫学等相关领域的发展。SCID小鼠具有T、B淋巴细胞联合缺陷，但是其NK细胞仍然具有杀伤异种移植物的功能，故而，在宿主小鼠中，剩余先天或者获得性的免疫力，仍然限制着人类肿瘤异种移植模型的建立。
转基因绿色荧光小鼠首先在美国制备成功，后引入国内应用。因其全身组织器官均能发出绿色荧光，适用于研究外源性组织或细胞(常用另一种荧光标记)在该小鼠体内与宿主(小鼠)组织细胞相互作用的体内研究，但该小鼠因免疫功能健全，不能移植人的组织或细胞于其体内并成活，因此无法用于人类组织细胞的体内荧光示踪实验研究。
发明内容
为了解决上述问题，本方面利用C57BL/6绿色荧光蛋白转基因小鼠和免疫功能缺陷小鼠(NOD/SCID小鼠)进行交配，通过动物杂交-回交的方式向其体内导入EGFP基因，培育表达增强型绿色荧光蛋白基因的近交品系NOD/SCID小鼠，并进一步对其遗传背景、生物学特征、绿色荧光蛋白表达规律进行了分析。在此基础之上，采用瘤细胞或者肿瘤组织块接种的方式，建立了人脑肿瘤原位接种动物模型，并对该模型的荧光表达强度及荧光稳定性、模型制备成功率、可重复性等指标经行了评价，获得良好的效果。
根据本发明的一个方面，提供增强型绿色荧光SCID小鼠模型制备方法，方法如下，通过C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)小鼠与NOD/SCID小鼠多代杂交-回交的方式、并多代筛选建立稳定遗传并且系统性表达绿色荧光的NOD/SCID/EGFP小鼠即增强型绿色荧光SCID小鼠模型。
在一些实施方式中，多代杂交-回交的方式如下：
选取雌性C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)小鼠与雄性NOD/SCID小鼠杂交得到F1子代均为有毛荧光小鼠，筛选其中♀小鼠，待其性成熟后与亲代♂NOD/SCID小鼠交配(回交)得F2；产生F2子代性状分离，筛选其中♀有毛荧光鼠与亲代♂Foxn1nu回交，完成一个回交循环；此回交循环过程至少进行4代，鉴定杂交第四代得到表达EGFP的NOD/SCID鼠即NOD/SCID/EGFP小鼠。
在一些实施方式中，鉴定杂交第四代为表达EGFP的NOD/SCID鼠的方法为：在自然光线表达EGFP的NOD/SCID鼠其毛发灰白色，在荧光激发条件下绿色荧光阳性；
在一些实施方式中，鉴定杂交第四代为表达EGFP的NOD/SCID鼠的方法还可以使用外周血淋巴细胞分析；
在一些实施方式中，外周血淋巴细胞分析的鉴定标准为在NOD/SCID/EGFP鼠中，其B淋巴细胞群比例小于等于0.2％，其T淋巴细胞群比例小于等于0.8％；
根据本发明的一方面，提供了增强型绿色荧光SCID小鼠模型制备方法制备的增强型绿色荧光SCID小鼠模型的应用，该增强型绿色荧光SCID小鼠模型可以用于建立转移癌临床标本原位移植瘤模型，提供相应研究平台。
本本发明采用多代杂交-回交的繁育方法，培育表达增强型绿色荧光蛋白基因的NOD/SCID小鼠，SCID小鼠相对于裸小鼠具有更严重的免疫功能缺陷，包括T、B细胞联合缺陷，故其在异种移植研究中相比于T淋巴细胞缺陷裸鼠更具有优势以及更高的异种移植效率，是更为优良的荧光免疫缺陷动物。本发明的NOD/SCID荧光小鼠的品系纯化可持续10个代次的回交以获得更好的效果，目前相关纯化工作已进行至第五代。
本发明所建立的增强型绿色荧光SCID小鼠模型是利用双色荧光示踪技术研究人体来源的组织细胞在体内的生物学特性的重要可视化研究平台。特别适用于研究人的肿瘤细胞或肿瘤干细胞如何在体内定植、增殖、改造重构宿主正常组织的过程及相关机制。也适用于观察两种不同来源的细胞(分别用红、绿色荧光标记)在体内的相互作用过程，为深入观察该过程提供一个可视化平台，相互作用结束后还可方便地采用荧光分选技术将两种不同的细胞分离以便于进行深入研究。
附图说明
图1是增强型绿色荧光SCID小鼠模型在可见光/荧光下鉴定图；
图2是外周血淋巴细胞分析图；
图3是患者磁共振图像与本发明的模型的比照图；
图4是同一患者原发乳腺癌和脑转移癌病理标本图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步的说明。
实施例1 NOD/SCID/EGFP小鼠(增强型绿色荧光SCID小鼠模型)制备
1.主要材料及仪器设备：
NOD/SCID与绿色荧光蛋白转基因鼠C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)购自南京大学模式动物研究所(SCXK苏2010-0001)；独立通风笼架购自苏州冯氏实验动物设备有限公司(IVC-Ⅱ)；生物安全柜购自新加坡忆思洁净设备有限公司(ESCO)；小动物多模式活体成像仪(In-vivo imaging system FX Pro)购自Kodak公司。荧光手电筒购自Nightsea公司，PCR仪(AB公司)，流式细胞仪(BD公司)，荧光倒置显微镜(Nikon公司)，CO2培养箱(德国Heraeus公司)。SLY系列动物脑切片模具购自北京硕林苑科技有限公司。冰冻切片机购自德国Leica公司，冰冻切片机(Leica，Germany)，荧光电筒(Nightsea，USA)，小动物多模式活体成像仪(Kodak，USA)，立体定向仪(ZH-蓝星C，淮北)。
2.繁育
选取雌性C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)小鼠与雄性NOD/SCID小鼠杂交得到F1子代均为有毛荧光小鼠，筛选其中♀小鼠，待其性成熟后与亲代♂NOD/SCID小鼠交配(回交)得F2；产生F2子代性状分离，筛选其中♀有毛荧光鼠与亲代♂Foxn1nu回交，完成一个回交循环；此回交循环过程至至少进行4代，鉴定杂交第四代得到表达EGFP的NOD/SCID鼠即NOD/SCID/EGFP小鼠。
3.鉴定
3.1 可见光/荧光鉴定
增强型绿色荧光SCID小鼠模型如图1中C、D所示，C是自然光线下所见，可见其毛发灰白色，D是荧光激发条件下所见，可见绿色荧光阳性；A、B是用于建系的亲本NOD/SCID和C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)小鼠。
3.2 外周血淋巴细胞分析鉴定
如图2外周血淋巴细胞分析图所示，A是外周血有核细胞分析，P1是淋巴细胞群；Q1为B淋巴细胞群，EGFP-BALB/c裸鼠近交系外周血中其比例为59.1％；BALB/c鼠中其比例为43.8％；NOD/SCID/EGFP鼠中其比例为0.2％；Q4为T淋巴细胞群，EGFP-BALB/c裸鼠近交系外周血中其比例为0.3％；BALB/c鼠中其比例为43.2％；NOD/SCID/EGFP鼠中其比例为0.8％；鉴定标准为在NOD/SCID/EGFP鼠中，其B淋巴细胞群比例小于等于0.2％，其T淋巴细胞群比例小于等于0.8％。
实施例2 增强型绿色荧光SCID小鼠模型的应用
使用实施例1方法得到的增强型绿色荧光SCID小鼠模型可以用于乳腺癌脑转移模型的研究。
1.临床标本组织块直接接种NOD/SCID/EGFP小鼠
临床标本信息：人乳腺癌切片源于－位40岁、已婚女性手术治疗患者，由苏大附二院病理科提供。后因发生脑转移收住神经外科手术切除脑转移癌。
组织接种方法：选择4-6周龄、表达EGFP的SCID雌鼠5只，水合氯醛麻醉后消毒头部皮肤,头顶部正中纵向切开0.5cm皮肤，显露颅骨，于前囟前1.0mm，中线右侧2.5mm处，用直径1.0mm的颅钻钻颅至硬膜，然后将快速病例诊断为乳腺癌脑转移瘤手术标本剪成约3mm3碎粒,置于由本课题组研制(实用新型专利号ZL200920045200.3)脑肿瘤组织块动物原位接种针，经钻颅孔垂直进入4.0mm、后退1.0mm后将套管针内芯推进，把肿瘤组织植入到鼠的右侧尾状核。缓慢拔针，用骨蜡封闭骨孔，零号丝线缝合头皮,护理至苏醒。
2.统计学分析
所有数据均采用统计软件SPSS 18.0进行处理，计量资料以均数±标准差表示。其中，两样本均数比较采用独立样本t检验，多个样本均数的比较采用单因素方差分析(ANOVA)，以P＜0.05表示差异有统计学意义。
3.结果与研究分析
图3为患者磁共振图像与模型的比照图，如图3所示，A：一例乳腺癌脑转移患者颅脑磁共振图像；B：建立的近交系NOD/SCID/EGFP小鼠；C：接种4周后处死动物可见脑组织中肉眼可见肿瘤生长(白色实线内)；D-F：HE切片和绿色荧光激发下图像融合后可见移植瘤组织中细胞异型性明显，可见部分宿主来源EGFP+细胞参与肿瘤重构。可以用于构建研究模型。
图4为和图3中同一患者原发乳腺癌和脑转移癌病理标本图，如图4所示A-C为原发乳腺癌标本,癌细胞在低倍呈巢状分布,在高倍异形明显,组织坏死常见(B),坏死区有大量小圆细胞浸润(C)；D-F为同一患者脑转移癌标本，癌细胞在低倍呈巢状分布的特征基本被保留,但在高倍异形性更明显,以纤维形为主，坏死区同样有大量小圆细胞浸润；G-I为脑转移癌SCID小鼠原位移植瘤，癌细胞在低倍巢状分布的特征同样被保留，核深染异形虽然明显，但以圆形和多角形为主，异形核分裂像常见。
我们应用所建立的近交系NOD/SCID/EGFP小鼠建立的脑转移癌原位移植瘤模型，其HE切片和绿色荧光激发下图像融合后可见移植瘤组织中不同大小的血管腔样结构内的EGFP阳性细胞；提示宿主来源的细胞参与了肿瘤组织重构；其HE病理切与原发乳腺癌及脑转移癌临床标本病理对比，所示乳腺癌细胞呈巢状分布的特征被很好地被保留，其核深染异形明显，异形核分裂像常见。组织块原位接种NOD/SCID/EGFP小鼠能够很好地保留临床肿瘤的形态特征，且在肿瘤微环境相关研究中具有应用价值。在此基础之上可以建立转移癌临床标本原位移植瘤模型。
本发明利用近交-多次回交的繁殖技术，将免疫功能健全的转基因绿色荧光小鼠的绿色荧光蛋白基因转移至T细胞和B细胞功能联合免疫缺陷的SCID小鼠，建立了绿色荧光蛋白SCID小鼠近交系封闭群。所建立的绿色荧光蛋白SCID小鼠体内可以移植人源的组织或细胞(通常红色荧光蛋白标记)，从而实现在动物体内双色荧光示踪研究人源组织细胞与宿主组织细胞相互作用关系的目标。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的创造构思的前提下，还可以做出其它变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (6)
1.增强型绿色荧光SCID小鼠模型制备方法，其特征在于，方法如下，通过C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)小鼠与NOD/SCID小鼠多代杂交-回交的方式、并多代筛选建立稳定遗传并且系统性表达绿色荧光的NOD/SCID/EGFP小鼠即增强型绿色荧光SCID小鼠模型。
2.根据权利要求1所述的增强型绿色荧光SCID小鼠模型制备方法，其特征在于，多代杂交-回交的方式如下：
选取雌性C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)小鼠与雄性NOD/SCID小鼠杂交得到F1子代均为有毛荧光小鼠，筛选其中♀小鼠，待其性成熟后与亲代♂NOD/SCID小鼠交配(回交)得F2；产生F2子代性状分离，筛选其中♀有毛荧光鼠与亲代♂Foxn1nu回交，完成一个回交循环；此回交循环过程至少进行4代，鉴定杂交第四代得到表达EGFP的NOD/SCID鼠即NOD/SCID/EGFP小鼠。
3.根据权利要求2所述的增强型绿色荧光SCID小鼠模型制备方法，其特征在于，鉴定杂交第四代为表达EGFP的NOD/SCID鼠的方法为：在自然光线表达EGFP的NOD/SCID鼠其毛发灰白色，在荧光激发条件下绿色荧光阳性。
4.根据权利要求3所述的增强型绿色荧光SCID小鼠模型制备方法，其特征在于，鉴定杂交第四代为表达EGFP的NOD/SCID鼠的方法还可以使用外周血淋巴细胞分析。
5.根据权利要求3所述的增强型绿色荧光SCID小鼠模型制备方法，其特征在于，所述外周血淋巴细胞分析的鉴定标准为在NOD/SCID/EGFP鼠中，其B淋巴细胞群比例小于等于0.2％，其T淋巴细胞群比例小于等于0.8％。
6.根据权利要求1所述的增强型绿色荧光SCID小鼠模型制备方法制备的增强型绿色荧光SCID小鼠模型的应用，其特征在于，所述增强型绿色荧光SCID小鼠模型用于建立转移癌临床标本原位移植瘤模型。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110663637A (zh) * | 2019-09-16 | 2020-01-10 | 承德医学院 | 一种人绒毛膜癌裸鼠原位移植瘤模型的构建方法 |
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| CN105670999A (zh) * | 2016-02-01 | 2016-06-15 | 复旦大学附属华山医院 | 稳定表达绿色荧光蛋白的骨髓增生异常综合征转白细胞株 |
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