CN107356761A - 接骨木凝集素及结合珠蛋白相关蛋白的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种结合珠蛋白相关蛋白(HPR)在制备诊断、鉴别诊断、和/或辅助诊断肺炎的产品中的用途。本发明还公开了一种接骨木凝集素(SNA)在制备诊断、鉴别诊断、和/或辅助诊断肺炎的产品中的用途。本发明的结合珠蛋白相关蛋白作为肺炎诊断的分子标志，不仅能区分肺炎患者与正常人，而且能区分肺炎的细菌性感染与非细菌性感染，有助于对肺炎疾病作精确的鉴别诊断，为及时、准确的临床治疗提供重要参考，具有很好的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学和医学临床诊断技术领域，具体涉及一种接骨木凝集素(Sambucus-nigra agglutinin，SNA)或结合珠蛋白相关蛋白(haptoglobin related protein，HPR)在制备诊断、鉴别诊断、和/或辅助诊断肺炎的产品中的用途。
背景技术
肺炎是全球范围内导致儿童死亡的第一病因，每年有将近200万儿童因为肺炎而死亡。
细菌、病毒和支原体是引起肺炎的几种常见病原体，不同病原体导致的肺炎治疗方案各异，如支原体肺炎，由于肺炎支原体无细胞壁，对抑制细胞壁合成的抗生素类药物不敏感而有别于细菌性感染的治疗。在诊断上，小儿肺炎的早期症状不典型，各类肺炎的症状易混淆，而且有效的早期鉴别诊断方法仍然缺乏，因此首选的治疗方案仍以经验性治疗为主，由此存在错误用药而延误病情的风险，同时抗生素的滥用也容易导致耐药菌的出现。
现今临床上常用的肺炎诊断方法仍有各种缺陷：
影像学方法(胸部X线摄片等)是广泛应用的肺炎诊断方法，但该类方法难以反映肺部的早期病变，且于病原体的鉴别诊断价值不大。病原体培养法，由于病毒和肺炎支原体培养条件苛刻，培养周期长，因此该类方法对于非细菌性肺炎的临床诊断帮助不大，而多用于实验室回顾性诊断，呼吸道正常菌丛对培养样品的污染也一定程度上限制了该方法在细菌性肺炎诊断中的应用，而血培养的阳性率过低。血清学检测方法，如病原体抗原检测，灵敏度和特异性不高，而抗体检测对于免疫力低下人群的诊断作用有限并且易受既往感染的干扰。一些新兴的分子诊断方法，如实时荧光定量PCR，由于操作复杂，易污染，对环境和仪器要求高，因而多用于实验室检测而难以在临床一线推广。
可见，临床上对于肺炎的诊断还有待开发新的分子标志物或技术。
凝集素是一类能够识别天然蛋白特定糖链结构的蛋白质。近年来，随着蛋白质组学和糖组学的发展，凝集素芯片成为一种新兴的高通量的糖基化修饰检测技术，越来越多的文献报道利用该技术筛查到疾病相关的糖基化修饰异常，并结合质谱鉴定技术，筛选到与疾病相关的糖蛋白候选标志物。
发明内容
本发明要解决目前临床上对肺炎的诊断缺乏高效准确的分子标志物的技术问题，提供一种结合珠蛋白相关蛋白(HPR)作为肺炎诊断的分子标志物，在制备用于诊断、鉴别诊断和/或辅助诊断肺炎的产品中的用途，可以帮助实现对不同类型肺炎的快速、精确诊断，为临床上对患者及时、准确的治疗提供重要参考。
此外，还提供了一种接骨木凝集素(SNA)在制备用于诊断、鉴别诊断和/或辅助诊断肺炎的产品中的用途。
为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:
在本发明的一个方面，提供了一种结合珠蛋白相关蛋白或其特异性抗体在制备诊断、鉴别诊断、和/或辅助诊断肺炎的产品中的用途。
所述产品通过检测受试者体液样品中结合珠蛋白相关蛋白的表达水平进行肺炎的诊断、鉴别诊断、和/或辅助诊断。
所述产品包括：采用免疫印迹分析(immunoblotting)、酶联免疫吸附法、抗体芯片等方法检测血清样品中HPR蛋白表达水平的产品。具体产品包括芯片或试剂盒。
所述结合珠蛋白相关蛋白或其特异性抗体用于鉴别诊断细菌性肺炎与非细菌性肺炎。
在本发明的另一方面，还提供了一种接骨木凝集素在制备诊断、鉴别诊断、和/或辅助诊断肺炎的产品中的用途。
所述接骨木凝集素为I型，具有针对Neu5Ac(α2-6)Gal/GalNAc糖链的识别特异性。
所述产品包括：采用凝集素印记(lectin blot)、凝集素固相芯片、液相悬浮芯片等方法检测受试者血清样品中的蛋白Neu5Ac(α2-6)Gal/GalNAc糖基化修饰程度的产品。具体产品包括芯片或试剂盒。
在本发明的另一方面，还提供了一种诊断肺炎或鉴别诊断细菌性与非细菌性肺炎的试剂盒，该试剂盒包含：用于检测结合珠蛋白相关蛋白表达水平的特异性抗体。
在本发明的另一方面，还提供了一种诊断肺炎或鉴别诊断细菌性与非细菌性肺炎的试剂盒，该试剂盒包含：接骨木凝集素。
所述试剂盒可用ELISA、化学发光法、凝集法、胶乳法、芯片法、流式法等检测方法诊断肺炎或鉴别诊断细菌性与非细菌性肺炎。
在本发明的一种具体实施方式中，鉴别诊断细菌性与非细菌性肺炎的产品，利用包被或固定有接骨木凝集素的载体捕获受试者血清样品中的糖蛋白，再通过带有分子标记的结合珠蛋白相关蛋白的抗体进行检测。其中，分子标记包括荧光素(cy3、cy5、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 647等)、辣根过氧化物酶、生物素等。该产品还包括针对不同分子标记的HPR检测抗体进行显色或产生荧光信号的试剂，还包括进行信号放大的二抗试剂。
在本发明的另一种具体实施方式中，鉴别诊断细菌性与非细菌性肺炎的产品，利用包被或固定有结合珠蛋白相关蛋白抗体的载体捕获受试者血清样品中的结合珠蛋白相关蛋白，再通过带有分子标记的接骨木凝集素进行检测。其中，分子标记包括荧光素(cy3、cy5、AlexaFluor 532、Alexa Fluor 647等)、辣根过氧化物酶、生物素等。该产品还包括针对不同标记的接骨木凝集素进行显色或可以产生荧光信号的试剂。
在本发明的另一种具体实施方式中，鉴别诊断细菌性与非细菌性肺炎的产品，利用包被或固定有结合珠蛋白相关蛋白抗体的载体捕获受试者血清样品中的结合珠蛋白相关蛋白，再通过识别结合珠蛋白相关蛋白另一抗原表位并带有分子标记的抗体进行检测。其中，分子标记包括荧光素(cy3、cy5、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 647等)、辣根过氧化物酶、生物素等。该产品还包括针对不同标记的检测抗体进行显色或可以产生荧光信号的试剂，还可以包括进行信号放大的二抗试剂。
在本发明中，术语“诊断、鉴别诊断、和/或辅助诊断肺炎”具体指诊断、鉴别诊断和/或辅助诊断待测人是否患有肺炎以及患的是何种类型肺炎，便于临床医生准确用药，提高疗效。
本发明的结合珠蛋白相关蛋白(HPR)作为肺炎诊断的分子标志，不仅能够区分肺炎患者与正常人，而且能够区分肺炎的细菌性感染与非细菌性感染，有助于对肺炎疾病作精确的鉴别诊断，为及时、准确的临床治疗提供重要参考，具有很好的应用价值。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1是本发明实施例1凝集素芯片SNA位点信号分析结果图；
图2是本发明实施例1接骨木凝集素的lectin blot验证结果图；
图3是本发明实施例1的SNA blot的42kDa位置信号分析结果图；
图4是本发明实施例2结合珠蛋白相关蛋白的免疫印迹法验证结果图；
图5是本发明实施例3结合珠蛋白相关蛋白的大样本量检测分析结果图。
具体实施方式
下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，《分子克隆实验室手册》(New York:Cold Spring harborLaboratory Press)中所述的条件。
本发明用凝集素芯片对肺炎患者、白血病患者和正常人的血清样品进行了检测，发现与正常组、细菌性肺炎组及白血病组相比，支原体肺炎组接骨木凝集素信号显著升高，即血清样品的Neu5Ac(α2-6)Gal/GalNAc糖基化修饰水平显著增高。进一步的，通过凝集素亲和富集及质谱鉴定技术发现，支原体肺炎组血清样品中Neu5Ac(α2-6)Gal/GalNAc糖基化修饰水平的增高主要是结合珠蛋白相关蛋白的表达水平增高所致。大样本量的分子生物学验证结果还表明，结合珠蛋白相关蛋白的表达在肺炎患者中明显高于正常人，而相比于细菌性肺炎患者，结合珠蛋白相关蛋白的表达水平在支原体肺炎和病毒性肺炎患者中显著增高。由此可知，通过检测受试者血清样品中的Neu5Ac(α2-6)Gal/GalNAc糖基化修饰水平或结合珠蛋白相关蛋白的表达水平可以判断受试者是否患有肺炎以及鉴别出是何种类型肺炎(细菌性与非细菌性)。表明接骨木凝集素或结合珠蛋白相关蛋白及其抗体可用于肺炎的诊断、鉴别诊断和/或辅助诊断。
下述实施例中所用的研究对象和材料：
研究对象来源于2015年2月至2016年2月在上海儿童医学中心确诊为肺炎的患儿77例，白血病患儿6例，以及常规体检的健康儿童36例。肺炎患儿中，28例诊断为支原体肺炎，27例诊断为细菌性肺炎，22例诊断为病毒性肺炎。
所有样本均严格按照蛋白质组学要求留取，采集外周静脉血，2小时内分离血清后分装，-80℃冻存备用。
实施例1高通量凝集素芯片筛选差异糖基化修饰及验证
1.样品定量及生物素标记
样品解冻后，于4℃下13 200r/min离心15min，取中间澄清部分，用BCA法测定蛋白浓度。随后各取2μL样品，采用美国Full Moon公司的标记试剂盒进行标记。步骤如下：每2μL血清样品加入62μL标记缓冲液，混匀后加入6μL生物素标记试剂，室温反应2h；加入30μL终止液，室温下反应30min，随即进行芯片实验或冻于－80℃备用。
2.高通量凝集素芯片检测
芯片室温平衡20min，置于干燥箱中25℃干燥1h。用含2％BSA的PBST溶液室温封闭1h(50r/min)，再用PBST洗涤2次，PBS洗涤1次，每次5min。取标记后血清样品各2μL，用含500mmol/L甘氨酸的PBST稀释各样品至150μL体积上样。置于摇床(70r/min)室温孵育2h。弃去样品，用PBST洗涤2次，PBS洗涤1次，每次5min。用链霉亲和素偶联cy5的稀释溶液，室温下避光摇床(50r/mim)孵育15min。PBST洗涤2次，PBS洗涤1次，每次5min。置于50mL离心管中，去离子水洗3次，用小型离心机甩干。
3.芯片扫描与数据分析
用GenePix 4000B芯片扫描仪进行扫描。选择635nm激发光，PMT Gain设置为800，Power设置为100％，分辨率设置为10μm。采用GenePix Pro 6.0软件分析，读取信号值，中位数校正，三重复点中至少2个点信噪比(SNR)≥2为有效检出。用GraphPadPrism软件绘制各检出凝集素信号分布图，并在各组间进行差异T检验，筛选出信号差异有统计学意义的凝集素。
4.lectin blot验证与数据分析
血清样品(15μg总蛋白)经10％分离胶电泳后，200mA转膜2h至PVDF膜上，用含1％BSA的PBST封闭1h，PBST洗涤3次，每次5min。将生物素标记的凝集素用PBST稀释至5μg/mL，4℃下孵膜过夜。次日平衡至室温后，用PBST洗涤3次，每次5min，用链霉亲和素偶联cy3的稀释溶液于室温下避光孵膜30min，再用PBST洗涤3次后曝光。曝光图像用AlphaView SA软件读取特定条带信号值，随后用GraphPad Prism软件进行统计分析。
结果：
凝集素芯片筛选结果显示，SNA位点在支原体肺炎组中的检测值为17,755.4±2,842.5，在细菌性肺炎组中的检测值为10,756.0±2,687.7，在正常组中的检测值为12,739.2±1,105.0，在白血病组中的检测值为12,353.3±2,315.2。检测信号在支原体肺炎组与细菌性肺炎组间差异具有统计学意义(P<0.01)，支原体肺炎组与正常组间(P<0.01)差异具有统计学意义，以及支原体肺炎组和白血病组间差异具有统计学意义(P<0.01，图1)。
Lectin blot验证结果显示(图2和图3)，42kDa位置处SNA结合信号在支原体肺炎组中明显高于细菌性肺炎组(P<0.01)和正常组(P<0.001)。表明接骨木凝集素SNA可用于支原体肺炎的鉴别诊断。图2和图3中，M为支原体肺炎组；B为细菌性肺炎组；NC为正常组。
实施例2SNA亲和富集糖蛋白的质谱鉴定和蛋白印迹法验证
1.凝集素亲和富集糖蛋白及洗脱
将1mg支原体肺炎患者血清样品与250μg生物素标记的接骨木凝集素4℃孵育过夜。次日一起与固定有链霉亲和素的琼脂糖珠子室温孵育1h，弃上清，洗去未结合样品。再用0.5mol/L的乳糖溶液室温洗脱15min，将洗脱部分超滤浓缩后，进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染，取42kDa位置条带进行质谱鉴定。
2.质谱鉴定
将所取胶条进行脱色、蛋白还原烷基化、酶解处理后，抽提酶解多肽。干燥后的多肽样品加入上样缓冲液(98％水，2％乙腈，0.1％甲酸)，震荡10min重溶，离心取30μL样品加入样品瓶上样分析。每份样品采用纳升流速HPLC液相系统Dionex ultimate3000进行分离，经Trap柱Dionex Trap column，再经C18分析柱分离，流速为400nL/min。经高效液相色谱脱盐及分离后用Bruker maxis impact UHR Q-tof质谱进行分析。串联质谱检测采用的是数据依赖扫描(Data Dependent Acquisition，DDA)模式。TOF MS扫描分辨率为20,000(FWHM)，质荷比范围设定为m/z 50-2500；峰高超过100cps(counts/second)，且电荷为+2至+4的10个丰度最大的多肽选择被MS/MS分析，质荷比范围为m/z 350-1500，每个cycle扫描累积时间为1.3s，动态排除时间15s。
3.数据分析
原始数据baf文件用Data analysis软件转换为mgf文件，用MASCOT软件(version 2.4.1)进行数据检索分析。搜库参数如下：
| Database | SwissProt_2015_02 |
| Taxonomy | |
| Enzyme | |
| Fixed modifications | Carbamidomethyl(C) |
| Variable modifications | Oxidation(M) |
| Max Missed Cleavages | 2 |
| Peptide Charge State | 2+，3+，4+ |
| Peptide mass tolerance | 20ppm |
| MS/MS tolerance | ±0.05Da |
4.鉴定蛋白的免疫印迹分析
血清样品(15μg总蛋白)经10％分离胶电泳后200mA转膜2h至PVDF膜上，用丽春红染62kDa位置的白蛋白条带作上样量参照，PBST洗去染料。用含1％BSA的PBST封闭1h，PBST洗涤3次，每次5min。将抗结合珠蛋白相关蛋白的抗体(兔源)用PBST稀释5000倍，4℃下孵膜过夜。次日平衡至室温后，用PBST洗涤3次，每次5min，用辣根过氧化物酶标记的二抗(羊抗兔)稀释溶液于室温下孵膜1h，再用PBST洗涤3次，加显色液曝光。曝光图像用AlphaView SA软件读取特定条带信号值，随后用GraphPad Prism软件进行统计分析。
结果：
质谱鉴定结果显示，所鉴定位置打分和丰度最高的蛋白为结合珠蛋白和结合珠蛋白相关蛋白。进一步通过免疫印迹分析发现(图4)，结合珠蛋白相关蛋白在支原体肺炎患者血清样品中的表达量明显高于细菌性肺炎患者(P<0.001)和正常人(P<0.001)，表明结合珠蛋白相关蛋白在血清中的表达水平可用于支原体肺炎的鉴别和诊断。图4中，M为支原体肺炎组；B为细菌性肺炎组；NC为正常组。
实施例3结合珠蛋白相关蛋白的大样本量检测分析
1.结合珠蛋白相关蛋白的免疫印迹检测
将支原体肺炎患儿血清(n＝22)，细菌性肺炎患儿血清(n＝21)，病毒性肺炎患儿血清(n＝22)，及健康儿童血清(n＝21)配制成50倍稀释的电泳样品，另外10个健康儿童的血清等比例混合后配制成50倍稀释的电泳样品(作为参照品)，所有样品等体积上样5μL(相当于0.1μL原血清)，其它操作同实施例2。
2.数据分析
曝光图像用AlphaView SA软件读取特定条带信号值。各样品检测值均除以参照品检测值，所得相对值用于GraphPad Prism软件进行统计分析。
结果：
大样本量检测结果分析显示(见图5)，与正常组相比，HPR表达量水平在各肺炎组中均显著升高，表明HPR可以用于肺炎的诊断。进一步分析发现，与细菌性肺炎组相比，HPR表达水平在支原体肺炎组和病毒性肺炎组中更高(P<0.01与P<0.05)，表明HPR具有细菌性肺炎与非细菌性肺炎的鉴别诊断应用价值。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.结合珠蛋白相关蛋白在制备诊断、鉴别诊断、和/或辅助诊断肺炎的产品中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述产品通过检测受试者体液样品中结合珠蛋白相关蛋白的表达水平进行肺炎的诊断、鉴别诊断、和/或辅助诊断。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述结合珠蛋白相关蛋白用于鉴别诊断细菌性肺炎与非细菌性肺炎。
4.接骨木凝集素在制备诊断、鉴别诊断、和/或辅助诊断肺炎的产品中的用途。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述产品通过检测受试者体液样品中蛋白糖基化修饰程度进行肺炎的诊断、鉴别诊断、和/或辅助诊断。
6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述接骨木凝集素为I型，能与结合珠蛋白相关蛋白的修饰糖链结合。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的用途，其特征在于，所述产品包括芯片或试剂盒。
8.根据权利要求2或5所述的用途，其特征在于，所述体液样品为血清。
9.一种诊断肺炎或鉴别诊断细菌性与非细菌性肺炎的试剂盒，包含：用于检测结合珠蛋白相关蛋白表达水平的特异性抗体。
10.一种诊断肺炎或鉴别诊断细菌性与非细菌性肺炎的试剂盒，包含：接骨木凝集素。
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