CN107353334B - 基于唾液富酪蛋白的仿生防龋多肽、其衍生物和盐及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于唾液富酪蛋白的仿生防龋功能多肽、多肽衍生物或其药学上可接受的盐,及其在制药中的用途。该仿生防龋功能多肽基于唾液富酪蛋白的防龋功能片段,并对其进行氨基酸序列调整与改良,含有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。所述多肽主要通过其“DpSpSEEK”氨基酸序列实现多肽与脱矿釉质的吸附结合,而其“EEEEE”氨基酸序列能够与钙磷离子作用并诱导羟基磷灰石成核,从而实现对早期釉质龋的原位矿化修复作用。该多肽分子量较小,合成方便,成本较低,防龋效果较好,结构稳定且安全可靠。本发明借助仿生思想,对天然唾液蛋白进行仿生,设计具有再矿化功能的防龋多肽,为龋病的防治提供了一种理想的新途径。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种基于唾液富酪蛋白的仿生防龋功能多肽、多肽衍生物或其盐及其在制药中的应用。
背景技术
龋病是一种感染性疾病,也是人类最常见的口腔疾病,发病率高,流行区广,严重影响口腔及全身健康,世界卫生组织已将其列为人类重点防治的三大非传染性疾病之一。龋病的发病机制是在口腔致龋菌产酸作用下,牙齿硬组织发生持续性脱矿,因此,促进脱矿牙体硬组织再矿化是龋病防治的重要方面。
作为经典的防龋制剂,氟化物能不同程度地降低人群中的患龋率,被公认为目前世界上最有效的防龋制剂。然而随着多种氟化物制剂使用的推广,耐氟菌株、氟斑牙、氟骨症的出现使氟化物防龋局限性日益突显。洗必泰、四环素、中药等利用抑制致龋菌防龋的制剂亦各自表现出不足。不定形磷酸钙、糖醇、中药五倍子及隔消山、纳米羟磷灰石以及树脂等的再矿化作用被先后报道,但由于效果不明显或实验结果不一,目前结论尚未统一。
针对上述问题,本领域积极探寻其他的防龋药物和方法。
借助仿生思想,对天然牙发育过程中的调控因子进行仿生,设计促矿化功能多肽,或对天然防龋成分进行仿生,已成为龋病防治的一种新的理想途径。发明人在专利CN201310354537.3和CN201310355804.9中基于釉原蛋白的氨基酸序列特征,设计并开发了一系列的小分子防龋多肽,这为发明人从天然仿生防龋因子角度出发,进一步进行仿生防龋研究提供可能、奠定基础。然而,目前的牙源性仿生防龋功能多肽的动物实验发现这些多肽的体内防龋效果欠佳,提示复杂的口腔环境和唾液中的相关成分可能影响了这些功能多肽的结构和功能。因此,构建在口腔内兼具防龋功能稳定性和结构稳定性的功能多肽,是目前仿生功能多肽防龋临床应用必需解决的问题。
在龋病的病因学研究中,除了牙齿本身作为宿主的易感因素外,唾液在龋病的发生发展过程中发挥着重要作用,被认为是龋病病因中参与调控龋病进展最重要的宿主因素之一。1912年Head首次提出了唾液可使软化牙釉质再次恢复硬度的假说,随后Pigman等人开始关注唾液对牙釉质的再矿化功能方面的研究。作为唾液中最有意义的成分,唾液蛋白参与釉质表面获得性膜的形成,对维持牙面完整性、促进已脱矿牙齿再矿化和调节口腔菌群具有重要影响。唾液是口腔内牙体硬组织紧密接触的微环境,唾液中的有机成分-唾液蛋白的防龋作用被陆续证实。其中,唾液富酪蛋白是一种酸性磷酸化蛋白,研究发现该蛋白可以选择性吸附到羟基磷灰石表面,吸附钙磷,并维持钙磷离子的过饱和状态。但是天然唾液蛋白存在着提取困难、价格昂贵、容易变性等方面的不足,因此,为实现预防或阻断龋病的目的,以唾液蛋白作为天然模板,研发合成在口腔中稳定、具有促矿化功能的仿生防龋功能多肽,具有重要的研究意义。
发明内容
本发明的发明目的在于:针对现有技术存在的上述问题,总结现有研究成果,创新性的提供一种唾液富酪蛋白仿生防龋功能多肽,该多肽具有分子量小,结构稳定,毒副作用小,促进早期龋损再矿化效果确切的优点。
本发明采用的技术方案如下:
一种基于唾液富酪蛋白的仿生防龋功能多肽、多肽衍生物或其药学上可接受的盐,所述多肽含有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列:DSSEEKEEEEE。
上述基于唾液富酪蛋白的仿生防龋功能多肽、多肽衍生物或其药学上可接受的盐,所述多肽衍生物为多肽的酰胺化物、磷酸化物或酯化物。
根据本发明的一些具体实施例,上述基于唾液富酪蛋白的仿生防龋功能多肽、多肽衍生物或其药学上可接受的盐,所述多肽衍生物为丝氨酸磷酸化物。
根据本发明的一些具体实施例,上述基于唾液富酪蛋白的仿生防龋功能多肽、多肽衍生物或其药学上可接受的盐,所述多肽衍生物为DpSpSEEKEEEEE。
上述基于唾液富酪蛋白的仿生防龋功能多肽、多肽衍生物或其药学上可接受的盐,所述药学上可接受的盐包括但不限于多肽的盐酸盐、硫酸盐、乙酸盐、甲磺酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、柠檬酸盐、苹果酸盐、有机胺盐等。
本发明还提供了一种药物组合物,所述组合物含有上述基于唾液富酪蛋白的仿生防龋功能多肽、多肽衍生物或其药学上可接受的盐,以及合适的药学上可接受的载体和/或辅料。
所述药学上可接受的载体包括但不限于无菌液体,如水、或者动物、植物或人工合成的油或其混合物,药用辅料包括但不限于淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽糖、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇、湿润剂、乳化剂或pH缓冲剂、甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。
本发明上述的药物组合物可以在现有制剂工艺条件下制备成适宜临床应用的制剂,所述制剂包括液体制剂、固体制剂和半固体制剂,所述液体制剂包括但不限于溶液剂、注射剂,所述固体制剂包括但不限于片剂、胶囊剂,所述半固体制剂包括但不限于软膏剂、凝胶剂。
最后,本发明还提供了上述基于唾液富酪蛋白的仿生防龋功能多肽、多肽衍生物或其药学上可接受的盐在制备用于防龋的药物中的应用。
本发明的基于唾液富酪蛋白的仿生防龋功能多肽、多肽衍生物或其药学上可接受的盐,所述多肽的制备方法包括以下步骤:按照氨基酸序列,将第一个氨基酰胺化,用Fmoc保护其氨基,然后连接到固相载体Wang树脂上,然后脱掉氨基保护基;然后将氨基被Fmoc保护的第二个氨基酸在缩合剂的活化作用下与已连接在固相载体的第一个氨基酸的氨基反应形成肽键;重复上述肽键形成反应,使肽链从C端向N端生长,直至最后一个氨基酸接入,切割后得到目标多肽。这种合成方法简单易行,生产成本低。
本发明的发明人通过分析总结发现唾液富酪蛋白可通过竞争抑制唾液高分子糖蛋白对羟基磷灰石的吸附作用,进而减少了变异链球菌对牙面的粘附,富酪蛋白N端前6位氨基酸序列DpSpSEEK在其对羟基磷灰石的结合中发挥关键作用。作为富酪蛋白的主要结构功能域,DpSpSEEK的功能主要与其带负电荷的氨基酸(天冬氨酸和谷氨酸)和α螺旋结构有关。进一步,发明人通过总结发现氨基酸中的基团-COOH、-CONH2、-OH、-NH2能够吸附钙磷离子,进而促进牙体硬组织矿化,且-COOH基团的吸附能力最强,而含有-COOH基团的谷氨酸较其他氨基酸有更强的钙磷吸附能力,且侧链基团小,因此,本发明选取富酪蛋白中的DpSpSEEK序列作为羟基磷灰石吸附片段,在此基础上C端增加富含谷氨酸的亲水片段“EEEEE”,该亲水端可以与钙磷离子作用并引发羟基磷灰石成核,发挥其促矿化功能,从而产生更好的防龋效果。本发明的多肽与现有技术的釉原蛋白仿生多肽相比,在口腔中具有更好的结构稳定性和功能稳定性,与富酪蛋白相比,分子量小,容易提纯,成本低,不易变性。
本发明的有益效果在于:本发明的多肽主要包含有唾液富酪蛋白中“DpSpSEEK”的吸附羟基磷灰石功能片段,又包含可以与钙磷离子作用并诱导羟基磷灰石成核的亲水氨基酸序列“EEEEE”,经过合成,该多肽分子量小,结构稳定且简单,可提高在牙釉质表面的吸附,进而发挥其原位修复的作用,促进脱矿釉质的再矿化,且对体外人口腔角质细胞无毒性,结构和功能稳定。本发明合成方便,经济实惠,效果较好且安全可靠。
附图说明
图1为实施例3基于唾液富酪蛋白的仿生防龋功能多肽对羟基磷灰石成核能力的透射电镜和选区电子衍射检测结果;
图2为实施例4基于唾液富酪蛋白的仿生防龋功能多肽对脱矿牙釉质龋的再矿化作用的的部分结果,即表面显微硬度的恢复情况;
图3为实施例4基于唾液富酪蛋白的仿生防龋功能多肽对脱矿牙釉质龋的再矿化作用的的部分结果,即偏光显微镜的检测结果;
图4为实施例4基于唾液富酪蛋白的仿生防龋功能多肽对脱矿牙釉质龋的再矿化作用的部分结果,A:龋损处理前后各组矿物丢失量比较,B:再矿化处理前后各组龋损深度比较;
图5为实施例4基于唾液富酪蛋白的仿生防龋功能多肽对脱矿牙釉质龋的再矿化作用的的部分结果,即再矿化处理前后不同龋损深度矿物质含量比较;
图6为实施例5基于唾液富酪蛋白的仿生防龋功能多肽的二级结构检测和稳定性检测的部分结果;
图7为实施例6基于唾液富酪蛋白的仿生防龋功能多肽体外细胞毒性研究的部分结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下通过具体实施例对本发明的发明内容做进一步的阐释,但不应理解为本发明的范围仅限于以下的实例,根据本发明的发明思路和全文内容,可以将以下实例中的各个技术特征做适当的组合/替换/调整/修改等,这对于本领域技术人员而言是显而易见的,仍属于本发明保护的范畴。
实施例1
一种促矿化防龋功能多肽,氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示;
SEQ ID NO.1的丝氨酸磷酸化修饰物为:DpSpSEEKEEEEE。
实施例2 SEQ ID NO.1的丝氨酸磷酸化修饰物(以下简称DE11)的制备
1、选用Fmoc-His(Trt)-Wang Resin作为树脂(载体);
2、用DCM将树脂充分溶胀;
3、用适当浓度的DBLK(六氢吡啶+DMF),将Fmoc-保护基团脱出;
4、用DMF清洗数遍,洗去DBLK;
5、称取适合的缩合剂和活化剂(HBTU,NMM)以及C端第二个Fmoc-保护氨基酸(Fomc-Leu-OH)进行偶联;
6、茚三酮检测法进行检测确保连接比较完全;
7、用DMF清洗几遍,洗去残留的各种残基和活化剂缩合剂;
8、依SEQ ID NO.1氨基酸序列进行偶联,方法参照步骤3-7;
9、将所有的氨基酸连接结束后采用步骤3,4方法脱去最后的Fmoc-保护基团;
10、用TFA切割液裂解,去除树脂和氨基酸保护基团,得到粗品;
11、送质谱确认产品正确(分子量1499.18符合理论值);
12、粗品送纯化分离,提高纯度。
实施例3 多肽对羟基磷灰石成核能力的检测
1、制备50μM多肽DE11溶液,分别加入终浓度为1.6mM Na2HPO4和3.3mM CaCl2溶液,pH调为7.4,37℃摇床孵育24h(100转/分)。
2、分别取10μl反应后溶液滴加于铜网上,阴性对照为不加多肽的Na2HPO4和CaCl2溶液。透射电镜下观察铜网上的沉淀物形态。图1显示多肽DE11组形成的晶体较阴性对照组更加致密,呈束状或柱状形态,提示DE11具有良好的促进羟基磷灰石成核生长的能力。
3、选取电子衍射显示多肽DE11组形成的晶体沉淀物具有羟基磷灰石特征衍射环004、002和211,且004和002环的衍射增强,提示在多肽DE11的引导下,纳米晶体沿C轴生长,见图1。
实施例4 多肽对脱矿牙釉质再矿化作用的研究
本实施例通过静态再矿化实验观察多肽DE11对早期人工釉质龋的再矿化作用。
实验步骤如下:
1、釉质样本的制备:选择新鲜拔除的牛切牙,制备牛牙釉质样本。流动水下,使用三氧化二铝糊剂去除釉质表层染色、牙石以及不规则形态表面,去离子水超声荡洗20分钟后贮存于含有0.05%麝香草酚的PBS中,置于4℃冰箱中备用。分离冠根,将冠部牙体组织超声清洗20分钟,自然干燥,选取表面平整光滑、无氟斑、无色素、无裂痕的牙冠组织进行下一步操作。使用硬组织高速切割机将牙冠部分切成规格近约5×5×2mm大小的釉质块,使用抛光机并依次使用800#-1200#-2400#碳化硅水磨砂纸在流水下对唇面釉质进行磨平、抛光,去除约100μm表层釉质,以消除表面有机污染物以及不规则釉质型态。超声荡洗20分钟后自然干燥,使用环氧树脂将牙齿包埋,在釉质块唇面中央通过使用封口膜保留4mm×4mm的开窗区,开窗区之外的部位使用抗酸指甲油遮盖,抗酸指甲油分两次均匀涂布。通过表面显微硬度基线筛选出90个硬度值范围为340--380KHN的釉质块进入下一步实验。
2、人工早期釉质龋的制备:将牛牙釉质样本按釉质开窗区表面面积与溶液比率为2mm2/1ml在特定体积的脱矿液中脱矿(脱矿液:2.2mM Ca(NO3)2、2.2mM KH2PO4、50mM aceticacid、5.0mM NaN3、0.5ppm NaF,pH 4.5)。磁力搅拌仪搅拌(100转/分),37℃下脱矿72小时,在牛牙釉质样本开窗区形成脱矿早期釉质龋。
3、早期釉质龋显微硬度测定:对形成早期龋的釉质样本再次进行表面显微硬度值测定,记作SMH1,筛选出30个表面显微硬度值范围为140-220KHN的釉质块进入下一步的再矿化循环实验。将每个样本开窗区的一侧用4×2mm封口膜覆盖,并涂布抗酸指甲油封闭,以此作为再矿化循环前的早期釉质龋形态学对照。
4、静态再矿化实验:将筛选出的30个形成了早期龋的釉质样本随机分为3组,每组10个标本,按处理不同分为:实验组:多肽DE11组;阴性对照组:HEPES组;阳性对照组:1000ppm NaF组。37℃条件下,实验组标本浸泡在50uM多肽溶液处理1小时,阴性对照组标本浸泡在HEPES溶液处理1小时,阳性对照组标本浸泡在NaF溶液处理1小时,各组标本经双蒸水冲洗3次后,浸泡在人工唾液中(1.5mM CaCl2、0.9mM KH2PO4、130mM KCl、1.0mM NaN3、20mM HEPES,pH 7.0),人工唾液每天更换一次,在37℃密闭恒温箱内,使用磁力搅拌仪搅拌,100转/分。再矿化处理3天后和7天后,所有标本室温下干燥后进行进一步检测。
5、结果检测指标
5.1表面显微硬度
表面显微硬度仪各参数设置同前,再次测定再矿化处理后的釉质样本开窗区表面显微硬度,每个釉质样本测定五个点,其平均值即该样本经再矿化处理后的表面显微硬度值,记作SMH2。对三次不同阶段即分别为:正常牛牙釉质、经脱矿形成早期釉质龋、体外再矿化处理后的釉质样本进行比较,可计算得出每个样本最终的表面显微硬度恢复的百分比(SMHR%):SMHR%=(SMH2-SMH1)/(SMH1-SMH0)x 100%。
5.2偏光显微镜及横断显微放射照相
样本经再矿化处理后取出,去离子水冲洗,超声震荡20分钟,自然干燥,使用硬组织切割机垂直于开窗区对釉质样本进行表面切片处理,每个切片包含再矿化处理前后即早期人工龋部分和再矿化循环处理后两部分,切片约厚250μm,进而使用进口打磨砂纸在抛光机流水下将切片打磨成约100μm厚的薄片,最后将使用去离子水清洗后的磨片在经水浸渍后用偏光显微镜观察,数码图像由系统专用软件获取(NikonACT-1forL-1,Nikon,日本)。将切片固定于横断显微放射照相的特制载体上,经CuK X-ray,20kV,20mA的条件下曝光25s,呈像后采用Transversal Microradiography Software 2006(Inspektor ResearchSystems BV,荷兰)对图像进行分析,得到样本龋深,矿物含量的变化。
结果:再矿化后表面显微硬度检测结果如图2所示,标本分别经再矿化处理3天和7天后,NaF组和多肽组表面显微硬度值恢复百分比均显著高于阴性对照(P<0.05)。偏光显微镜显示:各组再矿化前制备的人工龋均表现为典型的表层下脱矿,具有负性双折射的完整表层和位于表层下呈阳性双折射的病损体部。再矿化后,NaF组及多肽组标本龋损表层明显增厚,且龋损深度变浅,见图3。横断显微放射照相分析结果如图4所示,①体外静态再矿化处理前后,HEPES组釉质样本的矿物丢失量无明显变化,而NaF组和多肽DE11组釉质标本的矿物丢失量明显减少,且较体外再矿化处理前有统计学差异(P<0.05),见图4A;②体外再矿化处理前后,HEPES组釉质样本的龋损深度无明显变化,而NaF组和多肽组釉质标本的龋损深度明显变浅,且较体外再矿化处理前有统计学差异(P<0.05),见图4B;③对经体外再矿化处理后各组釉质样本的不同龋损深度的矿物含量分析表明,在龋损表层20μm处NaF组和多肽组与HEPES组釉质样本矿物含量无明显差异,在龋损20-150μm处,NaF组和多肽组釉质样本的矿物质含量明显高于HEPES组,且差异有统计学意义(P<0.05),见图5。综上,再矿化实验结果证实,该防龋功能多肽具有促进脱矿牙釉质再矿化的功能。
实施例5 多肽的圆二色光谱分析
目前针对研究蛋白多肽类药物的众多研究表明,蛋白多肽类药物的结构稳定性对其功能发挥以及远期的临床研究应用具有重要意义,且由于本发明所设计合成的功能多肽针对的是口腔龋病研究领域,因此对前述设计合成的唾液蛋白仿生防龋功能多肽进行结构稳定性检测尤为必要。圆二色谱检测技术(Circular dichroism简称CD)是研究稀溶液中蛋白质构象的一种快速、简单、较准确的方法。本实验用于测量多肽的结构,以验证其设计原理的有效性。
实验仪器
Jasco J-1500CD Spectrometer(日本)
实验步骤
25℃条件下,测量容器透光长度1mm,紫外光波长范围190nm至240nm。每个样品扫描10次取平均值。样品多肽浓度0.2mg/ml,溶于20mM HEPES溶液,分别测定2h和24h多肽的结构稳定性。所得数据通过公式计算出摩尔椭圆率绘制图表如下(图6)。
实验结果:圆二色谱结构检测结果表明该多肽具有典型的β折叠/转角的二级结构,多肽在HEPES溶液中2小时和24小时检测结果表明随着多肽在溶液中时间的延长,其二级结构无明显改变,因此,该多肽在24小时内具有较为稳定的二级结构,为其远期的临床应用提供了有力保障。
实施例6 多肽的生物安全性检测
通过观察多肽对人口腔上皮细胞(Human oral keratinocytes,HOK)活力的影响,检测多肽是否具有细胞毒性。HOK的活力通过Cell Counting Kit-8(CCK-8)进行测定。.
具体步骤如下:
1、HOKs接种96孔板中,每孔2×103个细胞,培养覆盖面积大约为50%。使用20%胎牛血清(FBS)DMEM培养基培养。
2、将含有终浓度为50-500μM多肽的培养液加入细胞中,将多肽处理过的和未处理(阴性对照)的细胞在CO2培养箱中(5%CO2,37℃恒温)培养24h。未加多肽的细胞培养基为阴性对照。
3、按照Am-blue试剂盒指导手册对于每个时间点的细胞进行操作。
4、使用酶标仪在450nm处读取数值。
实验结果如图7所示,体式显微镜下观察多肽DE11组(图7B)的细胞形态和阴性对照组(图7A)无明显差别,图7C中所得数据为每孔内液体吸光度,吸光度越高,说明细胞活性越好,在处理时间24h后,多肽处理对细胞增殖几乎没有影响。使用方差分析检验计算后,P值均大于0.05,均无统计学意义,说明多肽处理后对细胞活力几乎无影响。
以上试验例说明本发明的仿生防龋功能多肽具有良好的促进羟基磷灰石成核的能力,并能够促进脱矿牙釉质再矿化,降低脱矿牙釉质的龋深及矿物丢失;同时,该多肽具有良好的结构和功能稳定性,且无明显细胞毒性。综上,该多肽在龋病防治领域具有重要的研究价值。
以上所述仅为本发明的优选实施例,对本发明而言仅是说明性的,而非限制性的;本领域普通技术人员理解,在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变,修改,甚至等效变更,但都将落入本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
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<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(11)
<400> 1
Asp Ser Ser Glu Glu Lys Glu Glu Glu Glu Glu
1 5 10
Claims (4)
1.一种基于唾液富酪蛋白的仿生防龋功能多肽,其特征在于,所述多肽为SEQ ID No.1所示氨基酸序列的丝氨酸磷酸化物DpSpSEEKEEEEE。
2.一种药物组合物,其特征在于,含有如权利要求1所述的基于唾液富酪蛋白的仿生防龋功能多肽,以及合适的药学上可接受的载体和/或辅料。
3.一种含有如权利要求2所述的药物组合物的制剂,其特征在于,所述制剂为液体制剂、固体制剂或半固体制剂,所述液体制剂为溶液剂或注射剂,所述固体制剂为片剂或胶囊剂,所述半固体制剂为软膏剂或凝胶剂。
4.如权利要求1所述的基于唾液富酪蛋白的仿生防龋功能多肽在制备用于防龋的药物中的应用。
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CN107108751A (zh) * | 2014-09-24 | 2017-08-29 | 西安大略大学 | 唾液富酪蛋白肽 |
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2017
- 2017-08-30 CN CN201710760346.5A patent/CN107353334B/zh active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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Non-Patent Citations (1)
Title |
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The Association of Basic Proline-rich Peptides from Human Parotid Gland Secretions with Caries Experience;M. Ayad等;《Journal of Dental Research》;20001231;第79卷(第4期);第976-982页 * |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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Also Published As
Publication number | Publication date |
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