CN107349231B - 一种松针黄酮组装抗癌药物、制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于抗癌药物制备技术领域，具体公开了一种松针黄酮组装抗癌药物、制备方法及应用。本发明的方法利用松针黄酮、氧化石墨烯和叶酸制备出抗癌药物，包括组装Fe3O4‑氧化石墨烯、组装叶酸‑Fe3O4‑氧化石墨烯、组装松针黄酮‑叶酸‑氧化石墨烯纳米药物等步骤，制备出的药物可以抑制多种癌细胞的活性，为松针黄酮、氧化石墨烯和叶酸几种物质在抗癌药物制备中的应用奠定基础。

Description

一种松针黄酮组装抗癌药物、制备方法及应用
技术领域
本发明属于抗癌药物制备技术领域，具体涉及一种松针黄酮组装抗癌药物、制备方法及应用。
背景技术
胃癌在我国各种恶性肿瘤中居首位，近年来由于食品安全、饮食习惯、生活压力增大等原因造成该病发病率、死亡率居高不下，给患者生活带来极大痛苦。目前胃癌治疗主要是手术治疗切除病灶部位和化疗放疗，对人体伤害极大。研究表明植物活性成分黄酮类化合物可通过抗氧化、激素调节、抑制肿瘤细胞增殖和转移、促进肿瘤细胞分化和凋亡等途径发挥抗肿瘤作用，疗效确切。
松针黄酮可诱导胃癌细胞凋亡，阻断细胞周期，清除胃癌自由基、活性氧簇，抑制胃癌转移；石墨烯作为一种纳米材料，氧化石墨烯作为石墨烯氧化物，本身具芳香结构，可通过共价键结合或氢键结合吸附、负载和自身结构类似的芳香药物。纳米氧化石墨烯可被细胞吸收，没有明显的细胞毒性。游离叶酸和叶酸偶联物都可以通过叶酸受体介导的胞吞作用进入细胞内，可以作为某些载体材料后装载抗癌药物。因此，叶酸修饰的氧化石墨烯的制备是一种很有前途的靶向抗癌药物载体。
然而现有技术更多的是分开松针黄酮、氧化石墨烯和叶酸的作用机理，并未发现松针黄酮-叶酸-氧化石墨烯组装的松针黄酮组装抗癌药物和相关研究，影响了松针黄酮、氧化石墨烯和叶酸在胃癌疾病药物制备中的应用。
发明内容
本发明提供的一种松针黄酮组装抗癌药物、制备方法及应用，为松针黄酮、氧化石墨烯和叶酸在胃癌疾病药物制备中的应用提供了新方法。
本发明目的是提供一种松针黄酮组装抗癌药物的制备方法，包括以下步骤：
S1，制备松针黄酮；
S2，制备氧化石墨烯；
S3，组装松针黄酮-叶酸-氧化石墨烯纳米药物
S31，组装Fe3O4-氧化石墨烯
将氧化石墨烯、三甘醇和0.50mol/L乙酰丙酮铁溶液按照25mg:6ml:3mL的比例混合，超声，N2保护下回流反应；然后向反应物中加入无水乙醇，无水乙醇与乙酰丙酮铁溶液的体积比例为20:3，磁性分离出沉淀物；然后以乙醇洗涤沉淀物，烘干，得Fe3O4-氧化石墨烯；
S32，组装叶酸-Fe3O4-氧化石墨烯
将Fe3O4-氧化石墨烯、蒸馏水、NaOH和NaClO按照25mg:25mL:1g:1g的比例混合，超声1-2h；以1mol/L的稀盐酸中和，离心，收集上层液；以蒸馏水和截留分子量2000Da的透析袋透析上层液20-24h，收集透析袋内的透析液；按照0.1g:20mL的比例将叶酸加入透析液中，超声，加入氮-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺，超声0.5-1h，得到叶酸-Fe3O4-氧化石墨烯粗品溶液，其中氮-羟基琥珀酰亚胺、1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺与叶酸的质量比例为100:50:30；
将叶酸-Fe3O4-氧化石墨烯粗品溶液用1mol/L的NaHCO3溶液和截留分子量2000Da的透析袋透析24h，收集透析袋内透析液，离心，收集沉淀，以丙酮洗涤沉淀，干燥，得到叶酸-Fe3O4-氧化石墨烯；
S33，组装松针黄酮-叶酸-氧化石墨烯纳米药物
将叶酸-Fe3O4-氧化石墨烯分散在磷酸盐缓冲液中，加入2mg/ml的松针黄酮溶液，避光搅拌20-24h，离心，收集下层溶液，干燥，得到松针黄酮-叶酸-氧化石墨烯纳米药物，该松针黄酮-叶酸-氧化石墨烯纳米药物即为松针黄酮组装抗癌药物。
优选的，上述松针黄酮组装抗癌药物的制备方法，S1中，制备松针黄酮的具体步骤如下：
将新鲜松针晾干或干燥，粉碎得到松针粉；向松针粉中加入相当于松针粉20-30倍质量的75％乙醇，85℃回流提取3次，其中每次回流提取1h，合并3次提取液，过滤得总提取液；将总提取液在0.08MPa旋转蒸发，浓缩得到相对密度1.10的浸膏；向浸膏中加入相当于浸膏5倍质量的水，40KHz、50℃超声溶解，4000r/min离心分离，收集得到黄酮提取液；用大孔树脂HPD450提纯黄酮提取液，收集的洗脱液经减压旋蒸浓缩、干燥得松针黄酮。
优选的，上述松针黄酮组装抗癌药物的制备方法，S31中，超声的条件为600W、40-50℃超声3-5min；烘干温度为70℃。
优选的，上述松针黄酮组装抗癌药物的制备方法，S32中，离心的条件6000r/min离心4min；干燥条件为40℃下真空干燥48h。
优选的，上述松针黄酮组装抗癌药物的制备方法，S33中，磷酸盐缓冲液为0.1mol/LpH6.86的磷酸盐缓冲液。
优选的，上述松针黄酮组装抗癌药物的制备方法，S33中，叶酸-Fe3O4-氧化石墨烯、磷酸盐缓冲液、2mg/ml的松针黄酮溶液的比例为0.05g:20mL:1mL。
本发明的第二个目的是提供一种松针黄酮组装抗癌药物的制备方法制备而成的松针黄酮组装抗癌药物。
本发明的第三个目的是提供一种松针黄酮组装抗癌药物的制备方法在制备抗胃癌药物、抗肝癌细胞药物、抗乳腺癌细胞药物或者抗肺癌细胞药物中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种松针黄酮组装抗癌药物制备抗胃癌药物、抗肝癌细胞药物、抗乳腺癌细胞药物或者抗肺癌细胞药物中的应用。
与现有技术相比，本发明提供的一种松针黄酮组装抗癌药物及制备方法，具有以下有益效果：
(1)大量现有研究表明，由于黄酮成分为多羟基酚酸类成分，进入人体促氧化产生毒性或体内酶灭活作用而大大降低抗癌活性，直接服用植物提取的总黄酮粉会使造成不良反映多、活性低的弱点。松针黄酮中总黄酮的含量达10-15％左右，并且我们以MTT法检测实施例制备的松针黄酮对荷瘤小鼠细胞的抑制活性，最高抑制率达75-80％。
(2)氧化石墨烯作为石墨烯氧化物，本身具芳香结构，可通过共价键结合或氢键结合吸附、负载和自身结构类似的芳香药物。另外，氧化石墨烯具有良好的生物相容性。使用放射性示踪剂并结合生物分析方法，证明在小鼠各种器官中，胃部滞留的最多，且时间较长，停留15天小鼠脏器没有显著性病理异常。纳米氧化石墨烯可被细胞吸收，没有明显的细胞毒性，对一些芳香类的小分子药物具有超强的吸附能力。
本发明以氧化石墨烯作装载松针黄酮，保护黄酮成分在体内不易氧化；利用氧化石墨烯胃部聚集特点，同时嵌入Fe3O4与微波产生瞬间药物遥控释放，达到定位、快速释放，对胃癌治疗产生靶向、多重效应。
(3)游离叶酸和叶酸偶联物都可以通过叶酸受体介导的胞吞作用进入细胞内。大部分恶性肿瘤细胞表面均有叶酸受体的过度表达，正常细胞表面很少表达。叶酸修饰某些载体材料后装载抗癌药物，可以和肿瘤细胞表面高度表达的叶酸受体靶向性结合，增大肿瘤药物浓度，减少正常细胞毒性。因此，叶酸修饰的氧化石墨烯的制备是一种很有前途的靶向抗癌药物载体。
本发明制备的抗癌药物可以抑制多种癌细胞的活性，有利于基于氧化石墨烯组装药物和药物突释技术，研究其影响抑制胃癌细胞作用通路的机制，进而探寻黄酮复合纳米药物的抗癌机制。为松针黄酮、氧化石墨烯和叶酸几种物质在抗癌药物制备中的应用奠定基础。
附图说明
图1是本发明实施例1中松针黄酮和松针黄酮组装抗癌药物抑制肿瘤细胞IC50值比较图；
其中，每种细胞左边条形柱代表松针黄酮，右边的条形柱代表松针黄酮组装抗癌药物。
具体实施方式
下面结合具体附图和实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
一种松针黄酮组装抗癌药物的制备方法，包括以下步骤：
S1，制备松针黄酮
将新鲜松针晾干或干燥后，粉碎，得到松针粉；向松针粉中加入相当于松针粉20倍质量的75％(v/v)乙醇，85℃回流提取3次，其中每次回流提取1h，合并3次提取液，过滤得总提取液；将总提取液在0.08MPa旋转蒸发，将乙醇挥发干，浓缩得到相对密度1.10的浸膏；向浸膏中加入相当于浸膏5倍质量的水，40KHz、50℃超声溶解，4000r/min离心分离，收集得到浓度为2.50-3.50mg/ml黄酮提取液；
用大孔树脂HPD450提纯黄酮提取液，收集的洗脱液经减压旋蒸浓缩、干燥得松针黄酮，具体为：大孔树脂HPD450湿法装柱，将松针黄酮提取液用1mol/l盐酸调pH到3，3ml/min流速上样，上样完成后用3倍水洗除杂，再用75％乙醇洗脱，收集洗脱液；将洗脱液减压旋蒸浓缩、干燥得松针黄酮。
S2，制备氧化石墨烯
Hummers法制备氧化石墨烯：
取10mL 3mol/LH2SO4溶液和20mL 0.50mol/LK2S2O8溶液、2g P2O5于三颈烧瓶，80℃水浴保温，加入2g天然石墨，搅拌反应3h，蒸馏水洗至中性，微孔滤膜(φ0.3μm)过滤；收集虑液并移入装有10mL 3mol/l H2SO4溶液的三颈烧瓶中，冰浴下边搅拌边加入20mL0.50mol/L KMnO4溶液，反应3h，加入相当于KMnO4溶液总体积3倍的蒸馏水，加入30％双氧水3mL，再以5ml盐酸溶液去除金属离子，以5mL水清洗去除残酸，7000r/min离心6min去除残留石墨，收集得到氧化石墨烯粗品；将氧化石墨烯粗品分散于蒸馏水中，600W超声4h，离心去除沉淀，收集的上清液经干燥后得到氧化石墨烯。
S3，组装松针黄酮-叶酸-氧化石墨烯纳米药物
S31，组装Fe3O4-氧化石墨烯
将氧化石墨烯25mg于三颈烧瓶中，加入6ml三甘醇和3mL 0.50mol/L乙酰丙酮铁溶液，混合，600W、40-50℃超声5min，N2保护下回流反应；向三颈烧瓶内的反应物中加入无水乙醇20ml，采用磁性分离器磁性分离出沉淀物；然后以乙醇洗涤沉淀物3次，70℃烘干，得Fe3O4-氧化石墨烯。
S32，组装叶酸-Fe3O4-氧化石墨烯
将Fe3O4-氧化石墨烯25mg于25mL蒸馏水中，加入NaOH和NaClO各1g，600W超声反应1h；以1mol/L的稀盐酸中和并漂洗，6000r/min离心4min，收集上层液；以蒸馏水和截留分子量2000Da的透析袋(MD45)透析24h(其中蒸馏水作为透析溶液)，收集透析袋内的透析液；将0.1g叶酸加入20mL透析液，600W超声5-10min，边搅拌边加入50mg氮-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和30mg 1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)，超声0.5h，得到叶酸-Fe3O4-氧化石墨烯粗品溶液；
将叶酸-Fe3O4-氧化石墨烯粗品溶液用1mol/L的NaHCO3溶液和截留分子量2000Da的透析袋透析24h(其中1mol/L的NaHCO3溶液作为透析溶液)，每3h换一次1mol/L的NaHCO3溶液，收集透析袋内透析液；将收集的透析液在6000r/min离心4min以除去水分，收集沉淀，以丙酮洗涤沉淀3次，40℃下真空干燥48h，得到叶酸-Fe3O4-氧化石墨烯。
S33，组装松针黄酮-叶酸-氧化石墨烯纳米药物
将0.05g的叶酸-Fe3O4-氧化石墨烯分散在50mL 0.1mol/L pH6.86的磷酸盐缓冲液中，加入2mg/ml的松针黄酮1mL，避光搅拌24h，离心，分别收集下层溶液和上层溶液，其中下层溶液于30℃下真空干燥12h，得到松针黄酮-叶酸-氧化石墨烯纳米药物，该松针黄酮-叶酸-氧化石墨烯纳米药物即为本发明的松针黄酮组装抗癌药物。
我们利用液相色谱法分析出本发明实施例1制备出的松针黄酮中总黄酮的含量达10-15％左右，其化学组分如表1所示，由表1可以看出，松针黄酮主要包含3,5,4-三羟基-3-甲氧基-6甲基黄酮-7-O-β-D-葡萄苷、3,5,7,4-四羟基-6-甲基黄酮-7-O-β-D-葡萄苷、5,7,8,4-四羟基-3-甲氧基-6-甲基黄酮-8-O-β-D-葡萄苷、3,5,7,4-四羟基-6-甲基黄酮-3-O-β-D-葡萄苷、3,5,6,7,4-五羟基黄酮-3-O-β-D-葡萄苷、杨梅素-3-O-β-D-葡萄苷、山奈酚-3-O-β-D-葡萄苷、山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖、柚皮素-7-O-β-D-葡萄苷。
表1松针黄酮化学成分
Figure BDA0001398602070000081
Figure BDA0001398602070000091
我们分别测试了本发明实施例1制备出的松针黄酮组装抗癌药物对肿瘤细胞体外增殖抑制率，包括未组装的松针黄酮抑制效果和组装成松针黄酮组装抗胃癌药的抑制效果，结果如表2所示。由表2可知，松针黄酮组装抗癌药物具有明显的体外抑制肿瘤作用，随着药物浓度的增加，抑制率逐步提高。当剂量达到8μg/mL时，对肺癌细胞A549和胃癌细胞SGC-7901抑制率分别达到90.46％、86.12％，具有明显抑制作用。图1是本发明实施例1中松针黄酮和松针黄酮组装抗癌药物抑制肿瘤细胞IC50值比较图，其中，每种细胞左边条形柱代表松针黄酮，右边的条形柱代表松针黄酮组装抗癌药物；由图1可知，松针黄酮组装抗癌药物抑制肺癌细胞A549的活性最强(IC50＝2.77μg/mL)，抑制胃癌细胞SGC-7901的活性次之(IC50＝3.78μg/mL)，且抑制作用均比未组装的松针黄酮高。需要说明的是人肝癌细胞BEL-7402、胃癌细胞SGC-7901、乳腺癌细胞Bcap-37、肺癌细胞A549等本发明实验中用到的癌细胞均为市售。
表2松针黄酮组装后对肿瘤细胞体外增殖抑制率(n＝3，
Figure BDA0001398602070000092
)
Figure BDA0001398602070000093
Figure BDA0001398602070000101
分别测定松针黄酮中各组分对肿瘤细胞的抑制作用，结果如表3所示，由表3可知，松针黄酮类是抑制肺癌细胞A549和胃癌细胞SGC-7901的主要活性成分，其中山奈酚-3-O-β-D-葡萄苷是抑制两种癌细胞的主要活性成分，其IC50分别为15.62μg/mL、16.22μg/mL。
表3松针黄酮主要成分抑制肿瘤细胞IC50值(μg/mL,
Figure BDA0001398602070000102
n＝3)
Figure BDA0001398602070000103
大量现有研究表明，由于黄酮成分为多羟基酚酸类成分，进入人体促氧化产生毒性或体内酶灭活作用而大大降低抗癌活性，直接服用植物提取的总黄酮粉会使造成不良反映多、活性低的弱点。然而，我们以MTT法检测实施例制备的松针黄酮对荷瘤小鼠细胞的抑制活性，最高抑制率达75-80％。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (8)

1.一种松针黄酮组装抗癌药物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，制备松针黄酮；
将新鲜松针晾干或干燥，粉碎得到松针粉；向松针粉中加入相当于松针粉20-30倍质量的75％乙醇，85℃回流提取3次，其中每次回流提取1h，合并3次提取液，过滤得总提取液；将总提取液在0.08MPa旋转蒸发，浓缩得到相对密度1.10的浸膏；向浸膏中加入相当于浸膏5倍质量的水，40KHz、50℃超声溶解，4000r/min离心分离，收集得到黄酮提取液；用大孔树脂HPD450提纯黄酮提取液，收集的洗脱液经减压旋蒸浓缩、干燥得松针黄酮；
S2，制备氧化石墨烯；
S3，组装松针黄酮-叶酸-氧化石墨烯纳米药物
S31，组装Fe3O4-氧化石墨烯
将氧化石墨烯、三甘醇和0.50mol/L乙酰丙酮铁溶液按照25mg:6ml:3mL的比例混合，超声，N2保护下回流反应；然后向反应物中加入无水乙醇，无水乙醇与乙酰丙酮铁溶液的体积比例为20:3，磁性分离出沉淀物；然后以乙醇洗涤沉淀物，烘干，得Fe3O4-氧化石墨烯；
S32，组装叶酸-Fe3O4-氧化石墨烯
将Fe3O4-氧化石墨烯、蒸馏水、NaOH和NaClO按照25mg:25mL:1g:1g的比例混合，超声1-2h；以1mol/L的稀盐酸中和，离心，收集上层液；以蒸馏水和截留分子量2000Da的透析袋透析上层液20-24h，收集透析袋内的透析液；按照0.1g:20mL的比例将叶酸加入透析液中，超声，加入氮-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺，超声0.5-1h，得到叶酸-Fe3O4-氧化石墨烯粗品溶液，其中氮-羟基琥珀酰亚胺、1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺与叶酸的质量比例为100:50:30；
将叶酸-Fe3O4-氧化石墨烯粗品溶液用1mol/L的NaHCO3溶液和截留分子量2000Da的透析袋透析24h，收集透析袋内透析液，离心，收集沉淀，以丙酮洗涤沉淀，干燥，得到叶酸-Fe3O4-氧化石墨烯；
S33，组装松针黄酮-叶酸-氧化石墨烯纳米药物
将叶酸-Fe3O4-氧化石墨烯分散在磷酸盐缓冲液中，加入2mg/ml的松针黄酮溶液，避光搅拌20-24h，离心，收集下层溶液，干燥，得到松针黄酮-叶酸-氧化石墨烯纳米药物，该松针黄酮-叶酸-氧化石墨烯纳米药物即为松针黄酮组装抗癌药物。
2.根据权利要求1所述的松针黄酮组装抗癌药物的制备方法，其特征在于，S31中，超声的条件为600W、40-50℃超声3-5min；烘干温度为70℃。
3.根据权利要求1所述的松针黄酮组装抗癌药物的制备方法，其特征在于，S32中，离心的条件6000r/min离心4min；干燥条件为40℃下真空干燥48h。
4.根据权利要求1所述的松针黄酮组装抗癌药物的制备方法，其特征在于，S33中，磷酸盐缓冲液为0.1mol/LpH6.86的磷酸盐缓冲液。
5.根据权利要求4所述的松针黄酮组装抗癌药物的制备方法，其特征在于，S33中，叶酸-Fe3O4-氧化石墨烯、磷酸盐缓冲液、2mg/ml的松针黄酮溶液的比例为0.05g:20mL:1mL。
6.根据权利要求1所述的制备方法制备而成的松针黄酮组装抗癌药物。
7.根据权利要求1所述的松针黄酮组装抗癌药物的制备方法在制备抗胃癌药物、抗肝癌细胞药物、抗乳腺癌细胞药物或者抗肺癌细胞药物中的应用。
8.根据权利要求6所述的松针黄酮组装抗癌药物制备抗胃癌药物、抗肝癌细胞药物、抗乳腺癌细胞药物或者抗肺癌细胞药物中的应用。
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