CN107349198A - 蒿甲醚在制备促进脂肪分解和改善糖代谢制剂中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药领域，涉及蒿甲醚及青蒿素类似物在制药中的新用途，具体涉及蒿甲醚在制备促进脂肪分解和改善糖代谢制剂中的用途。尤其涉及蒿甲醚及青蒿素类似物在制备促进白色脂肪棕色化及在制备降低体重和改善代谢制剂中的用途。本发明经体内和体外实验证实，青蒿素类化合物有诱导白色脂肪棕色化的作用，通过促进白色脂肪棕色化的作用，起到了降低体重、改善代谢，维持糖代谢稳态、缓解脂肪肝、改善糖尿病相关症状的效果。所述的青蒿素类药物临床应用实践显示，尚未发现不可耐受的副作用，其可进一步制备促进脂肪分解和改善糖代谢制剂，用于治疗改善代谢相关的疾病。

Description

蒿甲醚在制备促进脂肪分解和改善糖代谢制剂中的用途
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及蒿甲醚及青蒿素类似物在制药中的新用途，具体涉及蒿甲醚在制备促进脂肪分解和改善糖代谢制剂中的用途。尤其涉及蒿甲醚及青蒿素类似物在制备促进白色脂肪棕色化及在制备降低体重和改善代谢制剂中的用途。
背景技术
资料显示，肥胖症及其引起的代谢性疾病已经发展为困扰全球的流行性疾病。根据国际卫生组织(World Health Organization，WHO)2015年发布的数据，全球人口的肥胖率高达13％；而在中国，成人肥胖率为6.9％。令人堪忧的是，青少年儿童的肥胖率更高，并且呈现出激增的趋势，这意味在未来的数十年中，肥胖率会持续增长。研究显示，肥胖症会引起一系列代谢性疾病，如二型糖尿病，高血压，脂肪肝等，甚至会增加某些肿瘤发病率，这将给国家和人民带来了极大的健康负担和经济负担。
研究显示，脂肪组织在肥胖的发生和进展过程处于核心位置，对于代谢健康有着举足轻重的作用。目前已知人体存在三种脂肪组织，白色脂肪，棕色脂肪和米色脂肪。白色脂肪组织以甘油三酯的形式储存能量，棕色脂肪和米色脂肪通过产热消耗能量。米色脂肪存在于白色脂肪中，具有棕色脂肪特征。从表型上看，米色脂肪可被视为白色脂肪和棕色脂肪的过度形式。白色脂肪组织中出现米色脂肪的现象被称为白色脂肪的棕色化。米色脂肪和棕色脂肪虽然所处部位不同，发育来源不同，但行使相同的产热功能，并在消耗能量方面，有同样的潜力，二者并称为产热性脂肪组织。在生理条件下，有两种激活产热性脂肪组织的情况：冷暴露和饮食摄入(尤其是高热量的食物)。在冷暴露时，产热性的脂肪组织激活，起到保持体温恒定的作用；饮食摄入时，产热脂肪激活起到缓解一过性能量高峰，从而维持代谢稳定。
产热性的脂肪组织，其分化发育、功能调节和临床应用是近几年代谢领域的研究热点。经人群调查发现，产热性脂肪组织活跃的个体，不易发胖，不易患代谢相关的疾病，如二型糖尿病等。一些改善代谢的药物，部分作用是通过激活产热性脂肪组织来实现的，如黄连素和水杨酰水杨酸等。同样，在动物模型中，无论是改变相关基因(敲除或过表达)，还是药物刺激(β肾上腺素受体激动剂等)，产热性棕色脂肪激活后，都会起到控制体重和改善代谢的作用。因此，综上所述，米色脂肪组织是人体产热性脂肪组织，具有消耗多余能量的潜力，并且能在一定条件下激活；激活产热性脂肪组织，不管是增强棕色脂肪的功能，还是促进白色脂肪棕色化，都能起到体重控制和改善代谢目的。迄今为止，没有专门靶向产热性脂肪组织来实现改善代谢的化合物或药物发现，也没有针对这个靶点实施高通量筛选。
产热性脂肪组织之所以能将储存在脂肪酸中的化学能转化成热能释放，是因为具有一个特殊的分子，解偶联蛋白1(Uncoupling Protein 1，UCP1)。UCP1定位于线粒体的内膜上，在激活的情况下，可以切断电子传递链和ATP合成的偶联，将化学能直接转化成热能。UCP1存在于产热性的脂肪组织当中，由于这种独特的组织定位，UCP1不仅是产热性脂肪组织的功能分子，也是表型标志。除了UCP1之外，PGC1α，PRDM16和Cytochrome C是参与棕色化过程的重要分子。
研究报道，肥胖和代谢的疾病的发生是生活环境和遗传因素共同作用的结果。高脂饮食诱导的肥胖小鼠是实验室常用的研究肥胖和代谢病的发生发展机制的动物模型。Ob/ob小鼠由于缺乏瘦素基因，有严重的胰岛素抵抗，自出生起就有脂肪肝，并且这些代谢障碍随着小鼠的生长逐渐加重，最终导致小鼠过早死亡。由于存在这些先天的代谢障碍，Ob/ob小鼠是实验室研究糖尿病和胰岛素抵抗的常用动物模型。体外研究脂肪细胞分育的常用细胞模型有3T3-L1和C3H10T1/2，前者模拟脂肪前体细胞分化为成熟的脂肪细胞的过程，后者反映间充质干细胞经过定向后再分化成脂肪细胞的过程。除了细胞系之外，研究脂肪的发育的细胞模型还有血管基质组分(Stromal Vascular Fraction，SVF)，SVF是原代的前体脂肪细胞，经分离培养后，经过一定诱导，可分化为白色脂肪细胞，从而在体外环境模拟前体脂肪细胞向白色脂肪分化的体内过程。
现有技术公开了蒿甲醚(Artemether，ART)是青蒿素的类似物，能高效、速效地杀灭红细胞内期疟原虫；其用于抗氯喹恶性疟及凶险型疟疾的治疗，显效迅速，短期疗效好，毒副作用小，是治疗疟疾的一线药物，应用广泛。近期研究表明蒿甲醚还有杀死肿瘤细胞和免疫调节的作用，在肿瘤和自身免疫性疾病(如系统性红斑狼疮，风湿性关节炎)的治疗中，展现出新的潜力。
目前尚未发现蒿甲醚在控制体重和改善代谢的应用潜能。除了蒿甲醚之外，青蒿素类药物还包括青蒿琥酯和双氢青蒿素，蒿乙醚，SM905，Artemiside，Artemisone和SM934等结构，其中双氢青蒿素是蒿甲醚及其他青蒿素类似物在体内的二级代谢产物。
基于现有技术的研究基础，本申请的发明人拟提供蒿甲醚及青蒿素类似物在制药中的新用途，具体涉及蒿甲醚在制备促进脂肪分解和改善糖代谢制剂中的用途。
发明内容
本发明的目的是提供蒿甲醚及青蒿素类似物在制药中的新用途，具体涉及蒿甲醚在制备促进脂肪分解和改善糖代谢制剂中的用途。尤其涉及蒿甲醚及青蒿素类似物在制备促进白色脂肪棕色化及在制备降低体重和改善代谢制剂中的用途。
本发明所述的蒿甲醚的结构如式(I)所示。
本发明还涉及除蒿甲醚之外的青蒿素类似物有促进白色脂肪棕色化的潜能。青蒿素结构如式(II)所示，青蒿素类似物如式(III)所示。
式(III)所示的青蒿素类似物是，双氢青蒿素，R为羟基；蒿乙醚，R为乙氧基；青蒿琥酯，R为丁二酸单酯基(琥珀酸酯基)；SM934，R为2-氨基乙氧基；SM905，R为2R-3-叔丁基氨基-2--羟基丙氧基；artemiside，R为硫代吗啉基；artemisone，R为1,1-二氧化硫代吗啉基。
本发明所述的的青蒿素类似物，其R基团如下表所示：
本发明经体内和体外实验证实，青蒿素类化合物有诱导白色脂肪棕色化的作用，通过促进白色脂肪棕色化的作用，起到了降低体重、、改善代谢，维持糖代谢稳态、缓解脂肪肝、改善糖尿病相关症状的效果。所述的青蒿素类药物临床应用实践显示，尚未发现不可耐受的副作用。在啮齿动物模型的研究中，有报道称高浓度的蒿甲醚会引起神经性厌食，但对于给药的剂量和时间没有明确的证据。因此整体来说，作为临床药物，蒿甲醚具有理想的安全性。
附图说明
图1显示了蒿甲醚使3T3-L1呈现出棕色脂肪细胞样的特征。
其中，图1.1，不同浓度ART处理后的3T3-L1细胞的形态变化；
图1.2不同浓度的ART处理3T3-L1后，UCP1的mRNA水平。*p<0.05，**p<0.01。
图2显示了蒿甲醚使BMP4定向的C3H10T1/2出现棕色脂肪样的形态特征，
其中，图2.1：BMP7定向的C3H10T1/2、BMP4定向的C3H10T1/2、蒿甲醚处理的BMP4定向的C3H10T1/2的细胞形态特征；
图2.2，Western Blot检测BMP4定向的C3H10T1/2，BMP4定向的C3H10T1/2以及不同浓度的蒿甲醚处理后的BMP4定向的C3H10T1/2的棕色脂肪相关基因UCP1、PGC1a、PRDM16和CytoC的蛋白水平；
图2.3，蒿甲醚(15μMol/L)处理后，BMP4定向的C3H10T1/2的线粒体MitoTrackerGreen染色。
图3显示了蒿甲醚使SVF原代脂肪前体细胞在分化过程中获得棕色脂肪样形态特征。
其中，图3.1，不同浓度的蒿甲醚处理SVF后细胞形态的变化；
图3.2，不同浓度的蒿甲醚处理SVF后，棕色相关基因PRDM16、PGC1α和UCP1的表达水平。
图4显示了青蒿素类似物促进棕色化的作用，
其中，图4.1，青蒿素及其类似物蒿甲醚、青蒿琥酯、双氢青蒿素处理BMP4定向的C3H10T1/2的细胞形态；
图4.2，不同浓度的双氢青蒿素处理BMP4定向的C3H0T1/2后，棕色相关基因的表达水平。
图5显示了蒿甲醚抑制高脂饮食诱导的体重增加，
其中，图5A皮下注射蒿甲醚的小鼠在高脂饮食条件下的体重变化，*p<0.05；
图5B皮下注射蒿甲醚的小鼠在高脂饮食条件下体重增长情况，*p<0.05。
图6显示了皮下注射蒿甲醚减少了高脂饲养的小鼠的脂肪组织，
其中，图6A皮下注射蒿甲醚的小鼠与对照组的小鼠的腹股沟部脂肪、附睾部脂肪和肩胛间区的棕色脂肪的体积；
图6B皮下注射蒿甲醚的小鼠与对照组的小鼠的腹股沟部脂肪、附睾部脂肪和肩胛间区的棕色脂肪的重量与小鼠重量的比值，*p<0.05；
图6C皮下注射蒿甲醚的小鼠与对照组的小鼠的腹股沟部脂肪、附睾部脂肪和肩胛间区的棕色脂肪细胞的形态。
图7显示了皮下注射蒿甲醚改善高脂诱导的肥胖小鼠的糖代谢，
其中，图7A高脂饲料饲养八周后，皮下注射蒿甲醚的小鼠和对照小鼠的葡萄糖耐量曲线，*p<0.05；
图7B高脂饲料饲养八周后，皮下注射蒿甲醚的小鼠和对照小鼠的葡萄糖耐量曲线，*p<0.05。
图8显示了蒿甲醚抑制高脂饮食诱导的脂肪肝，
其中，高脂饲料饲养八周后，皮下注射蒿甲醚的小鼠和对照小鼠的肝脏细胞形态。
图9显示了皮下注射蒿甲醚诱导高脂饲养的小鼠皮下脂肪出现棕色化
其中，图9A给药八周后，高脂饲养的小鼠在4℃环境中的体温变化，*p<0.05；
图9B给药八周后，高脂饲养的小鼠暴露在4℃6hr后，腹股沟部脂肪组织中UCP1的表达。
图10显示了腹腔注射蒿甲醚抑制高脂饮食诱导的体重增长，
其中，图10A腹腔注射蒿甲醚的小鼠在高脂饮食条件下的体重变化，*p<0.05；
图10B腹腔注射蒿甲醚的小鼠在高脂饮食条件下体重增长情况，*p<0.05。
图11显示了腹腔注射蒿甲醚显著减少了高脂饲养小鼠的脂肪组织，
其中，图11A腹腔注射蒿甲醚的小鼠与对照组的小鼠的腹股沟部脂肪、附睾部脂肪和肩胛间区的棕色脂肪的体积；
图11B腹腔注射蒿甲醚的小鼠与对照组的小鼠的腹股沟部脂肪、附睾部脂肪和肩胛间区的棕色脂肪的重量与小鼠重量的比值，*p<0.05；
图11C腹腔注射蒿甲醚的小鼠与对照组的小鼠的腹股沟部脂肪、附睾部脂肪和肩胛间区的棕色脂肪细胞的形态。
图12显示了腹腔注射蒿甲醚改善高脂诱导的肥胖小鼠的糖代谢，
其中，图12A高脂饲料饲养八周后，腹腔注射蒿甲醚的小鼠和对照小鼠的随机血糖，*p<0.05；
图12B高脂饲料饲养八周后，腹腔注射蒿甲醚的小鼠和对照小鼠的葡萄糖耐量实验结果，*p<0.05；
图12C高脂饲料饲养八周后，腹腔注射蒿甲醚的小鼠和对照小鼠的胰岛素耐量情况，*p<0.05。
图13显示了高脂饲料饲养八周后，腹腔注射蒿甲醚的小鼠和对照小鼠的肝脏细胞组织学形态。
图14显示了高脂饲料饲养八周后，腹腔注射蒿甲醚的小鼠与对照组小鼠相比，血清中脂质代谢相关指标的变化，*p<0.05，**p<0.01。
图15腹腔注射蒿甲醚诱导高脂饲养的小鼠皮下脂肪出现棕色化，其中，
图15A腹腔注射蒿甲醚八周后，高脂饲养的小鼠在4℃环境中的体温变化，*p<0.05；
图15B腹腔注射蒿甲醚八周后，高脂饲养的小鼠暴露在4℃6hr后，腹股沟部脂肪组织中UCP1的表达。
图16蒿甲醚抑制糖尿病小鼠ob/ob小鼠的体重增长，
其中，图16A ob/ob小鼠，腹腔注射蒿甲醚八周的体重变化；
图16B ob/ob小鼠，腹腔注射蒿甲醚八周的体重增长变化，*p<0.05。
图17蒿甲醚改善糖尿病小鼠ob/ob的脂肪肝，其中显示ob/ob小鼠，蒿甲醚腹腔注射八周后，肝脏切片的HE染色结果。
图18腹腔注射蒿甲醚不影响健康小鼠的生长，
其中，图18A健康小鼠，普通饲料喂养，腹腔注射蒿甲醚八周，给药组小鼠和对照的体重；
图18B健康小鼠，普通饲料喂养，腹腔注射蒿甲醚八周，给药组小鼠和对照的体重增量。
图19腹腔注射蒿甲醚不影响健康瘦小鼠的糖代谢，
其中，图19A健康瘦小鼠，腹腔注射蒿甲醚八周，葡萄糖耐量的情况；
图19B健康瘦小鼠，腹腔注射蒿甲醚八周，胰岛素耐量的情况。
图20显示小鼠腹腔注射20mg/kg体重蒿甲醚没有导致肝脏损伤，健康瘦小鼠，腹腔注射蒿甲醚八周，肝脏组织切片的HE染色。
图21蒿甲醚不改变小鼠的进食量，其中，
图21A常规饲料饲养的瘦小鼠，蒿甲醚腹腔注射八周，每只小鼠每天的进食量；
图21B高脂饲料饲养的肥胖小鼠，蒿甲醚腹腔注射八周，每只小鼠每天的饲料消耗量。
具体实施方式
实施例1、蒿甲醚诱导3T3-L1白色前体脂肪细胞在分化过程中出现棕色化
1.1 材料
1.1.1 3T3-L1白色脂肪前体细胞
1.1.2 DMEM培养基(Gibco)
1.1.3 胎牛血清(Gibco)
1.1.4 小牛血清(TBD)
1.1.5 生物素(Sigma)
1.1.6 青霉素和链霉素
1.1.7 蒿甲醚(成都普菲德生物技术有限公司)
1.1.8 Trizol(Life Technology)
1.1.9 逆转录试剂盒(ThermoScientific)
1.1.10 Power SYBR Green Master Mix(ThermoScientific)
1.2 设备
1.2.1 恒温无菌孵箱Thermo Scientific Forma Series II Water Jacket
1.2.2 实时定量PCR仪Applied Biotech 7500real time PCR System
1.2.3 显微镜Olympus IX711
1.2.5 低温离心机Eppendorf Centrifuge 5427R
1.2.6 核酸定量仪器Colibri
1.3 溶液
1.3.1 培养基
3T3-L1维持培养基
3T3-L1诱导分化培养基
1.3.2 蒿甲醚储存液溶解在DMSO中，储存浓度为10mMol/L
1.3.3 生物素：160mg生物素和80mg泛酸钙溶于200ml去离子水中。加热溶解。0.22μm滤膜过滤除菌。
1.3.4 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(50mMol/L)：1.15g 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤溶于100ml 0.2M氢氧化钾中，0.22μm滤膜过滤除菌。
1.3.5 地塞米松(1mMol/L)：0.039g地塞米松溶于100ml水中，0.22μm滤膜过滤除菌。
1.3.6 胰岛素(1mg/ml)：0.1g胰岛素溶于100ml水中,加几滴盐酸使之溶解，0.22μm滤膜过滤除菌。
1.4 方法
1.4.1 白色脂肪前体细胞3T3-L1的培养和诱导分化
在3.5cm的细胞培养皿接种2.5×105个3T3-L1白色脂肪前体细胞，用维持培养基培养3天，细胞增殖至接触抑制状态(Contact inhibition)。达到接触抑制后48小时，换诱导分化培养基，加入诱导分化混合物，诱导分化混合物包括0.5mMol/L的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(Mix)，1μMol/L的地塞米松(Dex)，和1μg/ml的胰岛素(Insulin)。诱导分化混合物简称MDI。加入MDI的这一天定义为分化第0天。在以上培养基中培养2天后，更换新鲜的诱导分化培养基，培养基中加入1μg/ml的胰岛素。再培养2天后，更换新鲜的诱导分化培养基，此后每隔一天，更换培养基，直至分化到第8天。
1.4.2 化合物处理
蒿甲醚储存在DMSO中，储存浓度为10mMol/L，在分化第0天加入MDI的同时，加入蒿甲醚(5，10或15μMol/L)处理，此后每次更换培养基，都加入同样浓度的蒿甲醚，直至3T3-L1分化成熟。
1.4.3 提取3T3-L1的细胞总RNA并逆转录成cDNA
在3.5cm的培养皿中诱导分化成熟的3T3-L1，分化方法参照方法1.4.1用PBS清洗后，用1ml Trizol充分裂解细胞，彻底混匀后，加入200μl的氯仿，剧烈震荡后，室温静置15min，在4℃条件下离心，离心条件为12000g，10min，此时由于层析作用，裂解液分为三层，小心吸取上层水相溶液转移至新的离心管，加入500μl异丙醇，轻轻混匀后室温静置10分钟，4℃离心，12000g，10min，弃上清，可见管底有乳白色半透明状沉淀，用DEPC水稀释75％的乙醇清洗沉淀3遍，4℃，7500g离心，5min，弃去上清，室温晾干，60μl DEPC水溶解沉淀，用Colibri Tepertec定量后-80℃保存。
取1μg RNA进行逆转录合成相应的cDNA，逆转录试剂盒为ThermoScientificRevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit。合成体系如下
M-MLV Reaction Buffer 4μl
10mM dNTP 2μl
RNA酶抑制剂 1μl
M-MLV逆转录酶 1μl
DEPC水 Up to 20μl
合成条件如下：
合成的cDNA保存在-20℃冰箱中
1.4.4 Real time qPCR
反应体系
CYBR Green Master Mix 15μl
上游引物 0.5μl
下游引物 0.5μl
RNA模板 0.5μl
ddH2O 14.5μl
以上体系共30μl，分为三个复孔，每个复孔10μl
反应条件
扩增18S的正向引物序列为GTAACCCGTTGAACCCCATT；反向引物序列为CCATCCAATCGGTAGTAGCG。
扩增UCP1的正向序列为AGGCTTCCAGTACCATTAGGT；反向引物为CTGAGTGAGGCAAAGCTGATTT
根据ΔΔCT法计算mRNA的相对量，用18S作为内参，再将对照的mRNA水平设定为1，各个处理组与对照组对比，得出相对量
1.4.5 数据分析
数据差异性由Student T test方法分析，p<0.05时，认为有统计学差异。
1.5 结果
1.5.1 蒿甲醚使3T3-L1呈现出棕色脂肪细胞样的特征
在显微镜Olympus IX711下观察细胞形态并记录，如图1.1所示，对照组(Control)的3T3-L1呈现出典型的白色脂肪细胞特征，细胞体积较大，脂滴大而圆，脂滴数量较少；经过蒿甲醚(Artemether，ART)处理后的3T3-L1，呈现出典型的棕色样特征，细胞体积较小，脂滴小而密集。并且这种变化有浓度依赖性的趋势，随着蒿甲醚的浓度增加，3T3-L1脂肪细胞的变化越明显。
1.5.2 蒿甲醚上调3T3-L1中UCP1的表达
提取3T3-L1的总RNA，逆转录成cDNA，用Real time qPCR检测UCP1的mRNA水平，与对照组相比，ART处理的3T3-L1中UCP1的表达显著上调，并呈现出浓度依赖性的趋势。
3T3-L1是经典的白色脂肪前体细胞，蒿甲醚使3T3-L1在分化过程中获得了棕色样的特征，不仅具有棕色脂肪的形态特征，也出现了棕色脂肪的标记UCP1的表达。
实施例2、蒿甲醚诱导C3H10T1/2间充质干细胞在分化成脂肪细胞的过程中出现棕色脂肪样特征
2.1 材料
2.1.1 C3H10T1/2间充质干细胞系
2.1.2 DMEM培养基(Gibco)
2.1.3 胎牛血清(Gibco)
2.1.4 小牛血清(TBD)
2.1.5 生物素(Sigma)
2.1.6 青霉素和链霉素
2.1.7 蒿甲醚(成都普菲德生物技术有限公司)
2.1.8 BMP4(R&D)
2.1.9 BMP7(Prospec)
2.1.8 PVDF膜(Millipore Immunobilon)
2.1.9 化学发光液numECL ultra(新赛美生物科技有限公司)
2.1.10 MitoTracker Green(Life Technology)
2.1.11 其余未提及试剂均购自Sigma
2.2 设备
2.2.1 恒温无菌孵箱Thermo Scientific Forma Series II Water Jacket
2.2.2 显微镜Olympus IX711
2.2.3 电泳仪BioRad PowerPac HC
2.2.4 自动化学发光仪ImageQuant LAS4000Mini
2.3 溶液
2.3.1 培养基
C3H10T1/2维持培养基
C3H10T1/2诱导分化培养基
2.3.2 蒿甲醚储存液溶解在DMSO中，储存浓度为10mMol/L
2.3.3 生物素：160mg生物素和80mg泛酸钙溶于200ml去离子水中。加热溶解。0.22μm滤膜过滤除菌。
2.3.4 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(50mMol/L)：1.15g 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤溶于100ml 0.2M氢氧化钾中，0.22μm滤膜过滤除菌。
2.3.5 地塞米松(1mMol/L)：0.039g地塞米松溶于100ml水中，0.22μm滤膜过滤除菌。
2.3.6 胰岛素(1mg/ml)：0.1g胰岛素溶于100ml水中,加几滴盐酸使之溶解，0.22μm滤膜过滤除菌。
2.3.7 细胞蛋白提取所用的裂解液
2.4 方法
2.4.1 C3H10T1/2的培养和分化
将7.5×105C3H10T1/2接种在3.5cm细胞培养皿上。用维持培养基培养3-5天。接种的次日在培养基中加入BMP4(终浓度为20ng/ml)待细胞增殖至接触抑制状态。达到接触抑制状态两天后更换培养基为诱导分化培养基，同时加入诱导混合物(0.5mMol/L Mix，1μMol/L Dex，1ng/ml insulin，100nMol/L吲哚美辛，1nM T3)，这一天被定义为分化第0天，诱导2天后，换新鲜诱导分化培养基，并加入1ng/ml胰岛素和1nMol/L T3，继续培养两天后，此后每隔一天更换新鲜培养基，直至分化第8天细胞成熟。此时分化成熟的细胞为白色脂肪细胞。
将7.5×105C3H10T1/2接种在3.5cm细胞培养皿上。用维持培养基培养3-5天。接种的次日在培养基中加入BMP7(终浓度为100ng/ml)待细胞增殖至接触抑制状态。达到接触抑制状态两天后更换培养基为诱导分化培养基，同时加入诱导混合物(0.5mM Mix，1μM Dex，1ng/ml insulin，100nM吲哚美辛，1nM T3)，这一天被定义为分化第0天，诱导2天后，换新鲜诱导分化培养基，并加入1ng/ml胰岛素和1nM T3，继续培养两天后，此后每隔一天更换新鲜培养基，直至分化第8天细胞成熟。此时分化成熟的细胞为棕色脂肪细胞。
2.4.2 蒿甲醚处理
在分化第0天，即加入诱导分化混合物的同时，在培养基中加入化合物，化合物的储存浓度为10mMol/L，终浓度分别为5μMol/L，10μMol/L和15μMol/L。更换新鲜培养基时，同时补充相应的化合物，化合物一直伴随细胞至分化成熟。
2.4.3 提取细胞总蛋白
在3.5cm分化成熟的C3H10T1/2，分化方法见2.4.1，加入300μl裂解液，充分裂解细胞，将裂解液转移至1.5ml离心管中，100℃加热10min，4℃离心13000g，10min，去除上层脂质，将中层澄清的裂解液转移至新的离心管，取2.5μl裂解液用BCA法进行定量，取200μl裂解液与50μl Loading Buffer混合，100℃加热10min，保存在-20℃待用。
2.4.4 Western blot
取30μg C3H0T1/2的蛋白上样至10％的聚丙烯酰胺凝胶，进行电泳，用80V进行基层胶的电泳，100V进行分离胶的电泳，直至目的条带分散开。在冰浴中转膜至PVDF膜，转膜条件为100V，100min，转膜结束后，在用TBST(TBS缓冲液+0.5％Tween)配制的5％的脱脂牛奶中封闭1hr。与特异性抗体孵育，4℃过夜。次日，用TBST清洗PVDF膜，室温，10min，清洗三次，与对应二抗共孵，室温1hr，在用TBST清洗三次，条件同一抗，与化学发光试剂共孵，室温1min，ImageQuant LAS4000Mini自动化学发光仪，曝光，记录结果。抗体货号和抗体稀释比例见下表：
抗体 货号 稀释比例
β-acting Proteintech HRP-60008 1：10000
PRDM16 Abcam Ab106410 1：200
PGC1α Abcam Ab54481 1：400
UCP1 Abcam Ab10983 1：200
CytoC Proteintech 10993-1-AP 1：1000
二抗 Jackson Immunology 111-035-003 1：10000
2.4.4 MitoTracker Green标记活性的线粒体
在3.5cm培养皿分化成熟后的C3H10T1/2，培养基去除，加入1ml PBS，在PBS中加入MitoTraker Green，终浓度为100ng/ml，37℃孵育10min，在荧光显微镜下观察绿色荧光，并取代表性视野拍照记录
2.5 结果
2.5.1 蒿甲醚使BMP4定向的C3H10T1/2出现棕色脂肪样的形态特征
C3H10T1/2是具有多向分化潜能的间充质干细胞，在BMP4定向的情况下分化成白色脂肪细胞，在BMP7定向的情况下分化成棕色脂肪细胞。在BMP4定向的C3H10T1/2分化过程中，同时加入蒿甲醚(15μMol/L)处理。观察细胞形态，BMP7定向的C3H10T1/2具有典型的棕色脂肪细胞特征，细胞较小，脂滴小而多；BMP4定向的C3H10T1/2具有典型的白色脂肪细胞特征，细胞较大，脂滴大而少；在BMP4定向的C3H10T1/2分化过程中，同时加入蒿甲醚(15μMol/L)处理，细胞出现了棕色样的特征，与BMP7定向的细胞形态类似(如图2.1所示)。
2.5.2 蒿甲醚使BMP4定向的C3H10T1/2细胞分化成熟后，棕色脂肪相关基因表达上调
以BMP7定向的C3H10T1/2作为阳性对照，用不同浓度的蒿甲醚(5，10，15μMol/L)处理BMP4定向的C3H10T1/2，用Western blot检测棕色脂肪相关基因的蛋白水平，其中β-actin作为内参。结果显示，蒿甲醚使BMP4定向的C3H10T1/2细胞中棕色相关基因UCP1、PGC1a、PRDM16和CytoC的蛋白水平增高，并且有浓度依赖性的趋势(如图2.2所示)。
2.5.3 蒿甲醚使BMP4定向的C3H10T1/2的线粒体生物合成增强
用MitoTracker Green标记BMP4定向的C3H10T1/2的线粒体，观察到蒿甲醚(15μMol/L)处理后的C3H10T1/2的线粒体生物合成明显增强(如图2.3所示)。
BMP4使C3H10T1/2间充质干细胞分化成具有白色脂肪特征的细胞，在蒿甲醚处理后，BMP4定向的C3H10T1/2分化成熟后，呈现棕色脂肪细胞样特征，表现在细胞形态、相关基因表达和线粒体生物合成增强三个方面。
实施例3 蒿甲醚使血管基质组分(Stromal Vascular Fraction，SVF)在分化过程中获得棕色脂肪细胞样特征
3.1 材料
2.1.1 雄性C57BL/6J小鼠(4-6week，上海斯莱克实验动物有限公司)
2.1.2 DMEM/F12(1:1)培养基(Gibco)
2.1.3 胎牛血清(Gibco)
2.1.4 生物素(Sigma)
2.1.5 青霉素和链霉素
2.1.6 蒿甲醚(成都普菲德生物技术有限公司)
2.1.7 PVDF膜(Millipore Immunobilon)
2.1.8 化学发光试剂numECL ultra(新赛美生物科技有限公司)
2.1.10 其余未提及试剂均购自Sigma
3.2 设备
3.2.1 恒温无菌孵箱Thermo Scientific Forma Series II Water Jacket
3.2.2 显微镜Olympus IX711
3.2.3 电泳仪BioRad PowerPac HC
3.2.4 自动化学发光仪ImageQuant LAS4000Mini
3.3 溶液
3.3.1 SVF的培养基(分化和培养)
3.3.2 细胞蛋白提取所用的裂解液
3.4 方法
3.4.1 SVF的分离、培养和分化
取雄性小鼠腹股沟部脂肪剪碎，用胶原酶37℃处理15min，离心，250rpm 10min，用F12/DMEM培养基重悬沉淀，取2.5×105个细胞接种在3.5cm培养皿，培养皿预先用1ml多聚赖氨酸处理30min。当细胞接触抑制两天后(定义为分化第0天)，按照脂肪细胞分化方案进行诱导，具体过程如下：用含有10％胎牛血清，0.5mMol/L Mix，1μMol/L Dex，5μg/mlInsulin，1μMol/L Rosiglitazone的F12/DMEM诱导2天后，换含有10％胎牛血清，5μg/mlinsulin，1μMol/L的Rosiglitazone，DMEM/F12继续培养2天，此后每隔一天更换含10％胎牛血清的DMEM/F12培液,直至细胞分化到第8天。
3.4.2 蒿甲醚处理SVF
在分化第0天，加入不同浓度的蒿甲醚(5，10，15μMol/L)处理SVF，此后更换新鲜培养基，都加入相应浓度的蒿甲醚，直至细胞分化成熟。
3.4.3 提取SVF细胞总蛋白和Western Blot
提取SVF总蛋白的方法同2.4.3，Western blot方法以及抗体货号同2.4.4
3.5 结果
3.5.1 蒿甲醚使SVF原代脂肪前体细胞在分化过程中获得棕色脂肪样形态特征
在SVF原代前体脂肪细胞分化过程中，加入不同浓度的蒿甲醚处理细胞，直至SVF分化成熟，与标准分化的对照细胞相比，蒿甲醚处理后的细胞体积较小，具有多腔小脂滴的特征。并且这中变化有浓度依赖性的趋势(如图3.1所示)。
3.5.2 蒿甲醚在SVF在分化过程中上调了棕色脂肪相关基因的表达
用Western Blot检测蒿甲醚处理后SVF细胞中棕色相关基因的表达水平。发现PRDM16、PGC1α和UCP1的表达水平随着蒿甲醚浓度的升高逐渐升高。如图3.2所示。
SVF是原代脂肪前体细胞，在蒿甲醚的作用下，SVF在体外分化成具有棕色脂肪特征的脂肪细胞。
实施例4 除蒿甲醚之外，其它青蒿素类似物也有促进棕色化的作用
4.1 材料
4.1.1 C3H10T1/2间充质干细胞系
4.1.2 DMEM培养基(Gibco)
4.1.3 胎牛血清(Gibco)
4.1.4 小牛血清(TBD)
4.1.5 青霉素和链霉素
2.1.6 蒿甲醚，青蒿素，青蒿琥酯，双氢青蒿素(成都普菲德生物技术有限公司)
2.1.7 PVDF膜(Millipore Immunobilon)
2.1.8 化学发光第五numECL ultra(新赛美生物科技有限公司)
2.1.9 MitoTracker Green(Life Technology)
2.1.10 其余未提及试剂均购自Sigma
4.2 设备
4.2.1 恒温无菌孵箱Thermo Scientific Forma Series II Water Jacket
4.2.2 显微镜Olympus IX711
4.2.3 电泳仪BioRad PowerPac HC
4.2.4 自动化学发光仪ImageQuant LAS4000Mini
4.3 方法
4.3.1 C3H10T1/2的培养和分化
同方法2.4.1
4.3.2 化合物处理
青蒿素、青蒿琥酯和双氢青蒿素保存在DMSO中，储存浓度为10mMol/L，在分化第0天加入图4.1所示的浓度，每隔两天更换新鲜培养基，都补充相应浓度的化合物，直至细胞分化成熟。
4.3.3 C3H10T1/2细胞总蛋白提取和Western blot
提取C3H10T1/2细胞总蛋白的方法同2.4.3
Western blot方法以及抗体货号同2.4.4；
4.4 结果
4.4.1 与对照相比，蒿甲醚(Artemether)处理后的C3H10T1/2呈现出棕色脂肪细胞样的特征：细胞体积较小，拥有多腔小脂滴。青蒿素(Artemisinin)、青蒿琥酯(Artesunate)和双氢青蒿素(Dihydroartemisinin)，处理后的C3H10T1/2，均呈现出相似的形态特征(如图4.1所示)
4.4.2 双氢青蒿素上调了棕色相关基因的表达
双氢青蒿素(Dihydroartemisinin，DHA)是青蒿素及其类似物的二级代谢产物，如果双氢青蒿素有促进棕色化的作用，说明青蒿素及其类似物都有促进棕色化的作用。分别用不同浓度(1，2.5，5，7.5μMol/L)的双氢青蒿素处理BMP4定向的C3H10T1/2后，用Westernblot检测棕色脂肪相关基因PGC1α和UCP1的表达水平，发现棕色相关基因的表达水平随着双氢青蒿素的浓度逐渐上升(如图4.2所示)；
结果证实，青蒿素类似物具有促进白色脂肪棕色化的潜力。
实施例5 蒿甲醚抑制高脂饮食诱导的体重增加
5.1 材料
5.1.1 雄性C57BL/6J小鼠(4-6week)(上海斯莱克实验动物有限公司)
5.1.2 高脂饲料(Research Diets)
5.1.3 天平(赛多利斯)
5.1.4 蒿甲醚(成都普菲德生物技术有限公司)
5.2 方法
5.2.1 小鼠的饲养和给药
小鼠在复旦大学实验动物中心SPF级动物实验室饲养，室温21℃-23℃，每12hr光暗循环，诱导肥胖小鼠所用的高脂饲料脂肪含量60％。小鼠成长至8-week龄时，随机分成对照组和给药组，每组8只。在用高脂饲料喂养的同时，皮下注射蒿甲醚。蒿甲醚稀释在PBS中，浓度为15μMol/L，双侧腹股沟注射，每侧注射200μl，对照小鼠注射相同体积的PBS。给药持续八周，每周记录小鼠的体重。
5.2.2 数据分析
数据差异性由Student T test方法分析，p<0.05时，认为有统计学差异。
5.3 结果
皮下注射蒿甲醚的小鼠体重明显低于对照组小鼠，在给药六周后，两组之间的体重差异达到统计学差异，如图5A所示。给药组小鼠的体重增长明显比对照组慢，如图5B所示。
皮下注射蒿甲醚显著抑制了小鼠在高脂饲养条件下的体重增长。
实施例6 皮下注射蒿甲醚减少了高脂饲养的小鼠的脂肪组织
6.1 材料
6.1.1 雄性C57BL/6J小鼠(4-6week)(上海斯莱克实验动物有限公司)
6.1.2 高脂饲料(Research Diets)
6.1.3 多聚甲醛(4％，Sigma)
6.1.4 蒿甲醚(成都普菲德生物技术有限公司)
6.2 方法
6.2.1 小鼠的饲养和给药
小鼠在复旦大学实验动物中心SPF级动物实验室饲养，室温21℃-23℃，每12hr光暗循环，诱导肥胖小鼠所用的高脂饲料脂肪含量60％。小鼠成长至8-week龄时，随机分成对照组和给药组，每组8只。在用高脂饲料喂养的同时，皮下注射蒿甲醚。蒿甲醚稀释在PBS中，浓度为15μMol/L，双侧腹股沟注射，每侧注射200μl，对照小鼠注射相同体积的PBS。给药持续八周。断颈处死小鼠，解剖取出小鼠的腹股沟部脂肪(Inguinal，皮下脂肪)，附睾部脂肪(Gonadal，内脏脂肪)和肩胛间区的棕色脂肪(BAT，经典的棕色脂肪)，称重、固定，委托上海赛戈生物技术有限公司对脂肪组织进行组织学分析，组织学分析过程包括固定、石蜡包埋、切片和HE染色等步骤。
6.2.2 数据分析
数据差异性由Student T test方法分析，p<0.05时，认为有统计学差异。
6.3 结果
取出三块具有代表性的脂肪组织(腹股沟部脂肪，附睾部脂肪和棕色脂肪)进行分析，发现皮下注射蒿甲醚的小鼠脂肪组织的体积(图6A)和重量(图6B)比对照组明显小。脂肪组织的切片和染色显示给药组小鼠的脂肪细胞明显小于对照组(图6C)；
蒿甲醚降低了高脂饲养的小鼠的脂肪体积和重量，蒿甲醚引起的体重降低主要是由脂肪组织的减少引起的。
实施例7 皮下注射蒿甲醚改善高脂诱导的肥胖小鼠的糖代谢
7.1 材料
7.1.1 雄性C57BL/6J小鼠(4-6week，上海斯莱克实验动物有限公司)
7.1.2 高脂饲料(Research Diets)
7.1.3 葡萄糖注射液
7.1.4 注射用胰岛素(优泌林)
7.1.5 血糖仪(Roche OneTouch ExtraEasy)
7.1.6 血糖试纸(Roche OneTouch ExtraEasy)
7.1.8 蒿甲醚(成都普菲德生物技术有限公司)
6.2 方法
6.2.1 小鼠的饲养和给药
小鼠在复旦大学实验动物中心SPF级动物实验室饲养，室温21℃-23℃，每12hr光暗循环，诱导肥胖小鼠所用的高脂饲料脂肪含量60％。小鼠成长至8-week龄时，随机分成对照组和给药组，每组8只。在用高脂饲料喂养的同时，皮下注射蒿甲醚。蒿甲醚溶解在PBS中，浓度为15μMol/L，双侧腹股沟注射，每侧注射200μl，对照小鼠注射相同体积的PBS。给药持续八周
6.2.2 葡萄糖耐量实验
小鼠禁食12-16hr，腹腔注射2mg/kg体重的葡萄糖注射液，在注射后0min，30min，60min，90min和120min时，剪尾取血，用OneTouch ExtraEasy血糖仪和OneTouch ExtraEasy血糖试纸检测血糖并记录。
6.2.3 胰岛素耐量实验
腹腔注射0.75U/kg体重的胰岛素，于注射后0min，15min，30min，45min和60min时，剪尾取血，测血糖
6.2.4 数据分析
数据差异性由Student T test方法分析，p<0.05时，认为有统计学差异。
6.3 结果
皮下注射蒿甲醚的小鼠在高脂饲养八周后，葡萄糖耐量显著优于对照小鼠(图7A)，胰岛素耐量也明显优于对照组小鼠(图7B)；
在高脂饮食的饲养条件下，给药八周后，皮下注射蒿甲醚的小鼠的糖代谢和胰岛素敏感性明显比对照小鼠好，说明蒿甲醚有维持葡萄糖代谢稳态的作用。
实施例8 蒿甲醚抑制高脂饮食诱导的脂肪肝
8.1 材料
8.1.1 雄性C57BL/6J小鼠(4-6week)(上海斯莱克实验动物有限公司)
8.1.2 高脂饲料(Research Diets)
8.1.3 蒿甲醚(成都普菲德生物技术有限公司)
8.2 方法
小鼠在复旦大学实验动物中心SPF级动物实验室饲养，室温21℃-23℃，每12hr光暗循环，诱导肥胖小鼠所用的高脂饲料脂肪含量60％。小鼠成长至8-week龄时，随机分成对照组和给药组，每组8只。在用高脂饲料喂养的同时，皮下注射蒿甲醚。蒿甲醚稀释在PBS中，浓度为15μMol/L，双侧腹股沟注射，每侧注射200μl，对照小鼠注射相同体积的PBS。给药持续八周。断颈处死小鼠，取出小鼠肝脏组织，委托上海赛戈生物公司进行组织固定、石蜡包埋、切片和HE染色的组织学分析。
7.4 结果
高脂饲料饲养八周后，对照组小鼠的肝脏出现了明显的脂质堆积，而皮下注射蒿甲醚的小鼠的肝脏只出现了少量脂质，脂肪肝的情况明显比对照组小鼠改善；
皮下注射蒿甲醚有效抑制了高脂饮食诱导的脂肪肝发生。
实施例9 皮下注射蒿甲醚诱导高脂饲养的小鼠皮下脂肪出现棕色化
9.1 材料
9.1.1 雄性C57BL/6J小鼠(4-6week，上海斯莱克实验动物有限公司)
9.1.2 高脂饲料(Research Diets)
9.1.3 小鼠体温仪(Physitemp BAT-12)
9.1.4 UCP1抗体(Abcam，ab10983，1:50)
9.1.5 蒿甲醚(成都普菲德生物技术有限公司)
9.2 方法
9.2.1 小鼠的饲养和给药
小鼠在复旦大学实验动物中心SPF级动物实验室饲养，室温21℃-23℃，每12hr光暗循环，诱导肥胖小鼠所用的高脂饲料脂肪含量60％。小鼠成长至8-week龄时，随机分成对照组和给药组，每组8只。在用高脂饲料喂养的同时，皮下注射蒿甲醚。蒿甲醚溶解在PBS中，浓度为15μMol/L，双侧腹股沟注射，每侧注射200μl，对照小鼠注射相同体积的PBS。给药持续八周。小鼠禁食，置于4℃饲养箱，每隔2hr测其直肠温度，6hr后，断颈处死小鼠，取腹股沟部脂肪，进行组织学分析。组织学分析包括组织固定、石蜡包埋、切片和UCP1的免疫组化实验委托上海赛戈生物有限公司代做。
9.2.2 数据分析
数据差异性由Student T test方法分析，p<0.05时，认为有统计学差异。
9.3 结果
给药八周后，当暴露在4℃环境中，皮下注射蒿甲醚的小鼠的体温明显高于对照小鼠(图9A)。在冷暴露环境中保存体温是由产热性脂肪组织承担的生理功能。取出小鼠的附睾部脂肪进行UCP1的免疫组化检测显示给药组的小鼠的皮下脂肪出现了明显的UCP1表达(图9B)；
皮下给药八周后，皮下注射蒿甲醚的小鼠的体温保存能力明显增强，皮下脂肪出现明显的棕色化。说明蒿甲醚抑制体重增长和改善代谢的作用是通过促进皮下脂肪棕色化化实现的。
实施例10 腹腔注射蒿甲醚抑制高脂饮食诱导的体重增长
10.1 材料
10.1.1 雄性C57BL/6J小鼠(4-6week)
5.1.2 高脂饲料(Research Diets)
5.1.3 天平(赛多利斯)
5.1.4 蒿甲醚(武汉菲尔德生物化学有限公司)
5.1.5 椰子油(阿拉丁)
5.2 方法
5.2.1 小鼠的饲养和给药
小鼠在复旦大学实验动物中心SPF级动物实验室饲养，室温21℃-23℃，每12hr光暗循环，诱导肥胖小鼠所用的高脂饲料脂肪含量60％。小鼠成长至8-week龄时，随机分成对照组和给药组，每组8只。在用高脂饲料喂养的同时，腹腔注射。腹腔注射用的蒿甲醚保存在椰子油中，储存浓度为6mg/ml(20mMol/L),避光，4℃储存。按照20mg/kg体重给给药组小鼠注射蒿甲醚。每周给药两次，给药持续八周，每周记录小鼠体重。
5.2.2 数据分析
数据差异性由Student T test方法分析，p<0.05时，认为有统计学差异。
10.3 结果
腹腔注射蒿甲醚的小鼠体重明显低于对照组小鼠，在给药三周后，两组之间的体重差异达到统计学差异，如图10A所示。给药组小鼠的体重增长明显比对照组慢，如图10B所示
腹腔注射蒿甲醚有效抑制高脂饮食诱导的体重增长。
实施例11 腹腔注射蒿甲醚显著减少了高脂饲养小鼠的脂肪组织
11.1 材料
11.1.1 雄性C57BL/6J小鼠(4-6week，上海斯莱克实验动物有限公司)
11.1.2 高脂饲料(Research Diets)
11.1.3 多聚甲醛(4％，Sigma)
11.1.4 蒿甲醚(成都普菲德生物技术有限公司)
11.1.5 椰子油(阿拉丁)
11.2 方法
11.2.1 小鼠的饲养和给药
小鼠在复旦大学实验动物中心SPF级动物实验室饲养，室温21℃-23℃，每12hr光暗循环，诱导肥胖小鼠所用的高脂饲料脂肪含量60％。小鼠成长至8-week龄时，随机分成对照组和给药组，每组8只。在用高脂饲料喂养的同时，腹腔注射。腹腔注射用的蒿甲醚保存在椰子油中，储存浓度为6mg/ml(20mMol/L)，避光，4℃储存。按照20mg/kg体重给给药组小鼠注射蒿甲醚。每周给药两次，给药持续八周。断颈处死小鼠，解剖取出小鼠的腹股沟部脂肪(Inguinal，皮下脂肪)，附睾部脂肪(Gonadal，内脏脂肪)和肩胛间区的棕色脂肪(BAT，经典的棕色脂肪)，称重、固定，委托上海赛戈对脂肪组织进行组织学分析，包括固定、石蜡包埋、切片和HE染色。
11.2.2 数据分析
数据差异性由Student T test方法分析，p<0.05时，认为有统计学差异。
11.3 结果
取出三块具有代表性的脂肪组织进行分析，发现皮下注射蒿甲醚的小鼠脂肪组织的体积(图11A)和重量(图11B)比对照组明显小。脂肪组织的切片和染色显示给药组小鼠的脂肪细胞明显小于对照组(图11C)；
腹腔注射蒿甲醚有效抑制了高脂饮食导致的脂肪堆积。
实施例12 腹腔注射蒿甲醚改善高脂诱导的肥胖小鼠的糖代谢
12.1 材料
12.1.1 雄性C57BL/6J小鼠(4-6week，斯莱克实验动物有限公司)
12.1.2 高脂饲料(Research Diets)
12.1.3 蒿甲醚(成都普菲德生物技术有限公司)
12.1.4 椰子油(阿拉丁)
12.1.5 葡萄糖注射液
12.1.6 注射用胰岛素(优泌林)
12.1.7 血糖仪(Roche OneTouch ExtraEasy)
12.1.8 血糖试纸(Roche OneTouch ExtraEasy)
12.1.9 水合氯醛(10％，Sigma)
12.1.10 全自动生化分析仪以及检测血糖的校准品Cfas和试剂盒(Roche)
12.2 方法
12.2.1 小鼠的饲养和给药
小鼠在复旦大学实验动物中心SPF级动物实验室饲养，室温21℃-23℃，每12hr光暗循环，诱导肥胖小鼠所用的高脂饲料脂肪含量60％。小鼠成长至8-week龄时，随机分成对照组和给药组，每组8只。在用高脂饲料喂养的同时，腹腔注射蒿甲醚。腹腔注射用的蒿甲醚保存在椰子油中，储存浓度为6mg/ml(20mMol/L)，避光，4℃储存。按照20mg/kg体重给给药组小鼠注射蒿甲醚。每周给药两次，给药持续八周。
12.2.2 葡萄糖耐量实验
小鼠禁食12-16hr，腹腔注射2mg/kg体重的葡萄糖注射液，在注射后0min，30min，60min，90min和120min时，剪尾取血，用OneTouch ExtraEasy血糖仪和OneTouch ExtraEasy血糖试纸检测血糖并记录。
12.2.3 胰岛素耐量实验
腹腔注射0.75U/kg体重的胰岛素，于注射后0min，15min，30min，45min和60min时，剪尾取血，测血糖
12.2.4 随机血糖监测
用10％的水合氯醛麻醉小鼠，通过眼眶取血，全血离心，4℃，300rpm，5min，取血清，用全自动生化分析仪检测血糖的校准品Cfas和试剂盒(Roche)检测血糖的水平。
12.2.5 数据分析
数据差异性由Student T test方法分析，p<0.05时，认为有统计学差异。
12.3 结果
腹腔注射蒿甲醚的小鼠在高脂饲养八周后，随机血糖明显低于对照组，葡萄糖耐量显著优于对照小鼠(图7A)，胰岛素敏感性也显优于对照组小鼠(图7B)；
腹腔注射蒿甲醚有效降低了高脂饲养的肥胖小鼠的血糖，显著改善了葡萄糖代谢和胰岛素敏感性。
实施例13 腹腔注射蒿甲醚有效抑制高脂饮食诱导的肥胖小鼠的脂肪肝发生
13.1 材料
13.1.1 雄性C57BL/6J小鼠(4-6week)(上海斯莱克实验动物有限公司)
13.1.2 高脂饲料(Research Diets)
13.1.3 蒿甲醚(成都普菲德生物技术有限公司)
13.1.4 椰子油(阿拉丁)
13.2 方法
小鼠在复旦大学实验动物中心SPF级动物实验室饲养，室温21℃-23℃，每12hr光暗循环，诱导肥胖小鼠所用的高脂饲料脂肪含量60％。小鼠成长至8-week龄时，随机分成对照组和给药组，每组8只。在用高脂饲料喂养的同时，腹腔注射蒿甲醚。腹腔注射用的蒿甲醚保存在椰子油中，储存浓度为6mg/ml(20mMol/L)，避光，4℃储存。按照20mg/kg体重给给药组小鼠注射蒿甲醚。每周给药两次，给药持续八周。断颈处死小鼠，取出肝脏组织固定，委托上海赛戈生物有限公司对肝脏进行组织学分析，组织学分析过程包括组织的固定、石蜡包埋、切片和HE染色。
13.4 结果
高脂饲料饲养八周后，对照组小鼠的肝脏出现了明显的脂质堆积，而腹腔注射蒿甲醚的小鼠的肝脏只出现了少量脂质，肝脏细胞的形态基本接近正常，如图13所示；
腹腔注射蒿甲醚有效抑制了高脂饮食诱导的脂肪肝发生。
实施例14 腹腔注射蒿甲醚抑制了高脂饮食导致的血脂升高
14.1 材料
14.1.1 雄性C57BL/6J(4-6week)小鼠(斯莱克实验动物有限公司)
14.1.2 高脂饲料(Research Diets)
14.1.3 蒿甲醚(成都普菲德生物技术有限公司)
14.1.4 椰子油(阿拉丁)
14.1.5 水合氯醛(10％，Sigma)
14.1.6 全自动生化分析仪所用脂类校准标准品Cfas Lipid和其他校准品Cfas，各相关指标的检测试剂盒(Roche)
14.2 方法
14.2.1 小鼠的饲养和给药
小鼠在复旦大学实验动物中心SPF级动物实验室饲养，室温21℃-23℃，每12hr光暗循环，诱导肥胖小鼠所用的高脂饲料脂肪含量60％。小鼠成长至8-week龄时，随机分成对照组和给药组，每组8只。在用高脂饲料喂养的同时，腹腔注射蒿甲醚。腹腔注射用的蒿甲醚保存在椰子油中，储存浓度为6mg/ml(20mMol/L)，避光，4℃储存。按照20mg/kg体重给给药组小鼠注射蒿甲醚。每周给药两次，给药持续八周。
14.2.2 小鼠的血清指标检测
用10％的水合氯醛麻醉小鼠，通过眼眶取血，全血离心，4℃，300rpm，5min，取血清，脂类校准标准品Cfas Lipid，高密度脂蛋白Cfas和低密度脂蛋白Cfas，以及各相关指标的检测试剂盒。
14.2.3 数据分析
数据差异性由Student T test方法分析，p<0.05时，认为有统计学差异。
14.3 结果
在高脂饲养八周后，腹腔注射蒿甲醚的小鼠血清中的甘油三酯(Triglyceride)和高密度脂蛋白(High Density Lipoprotein，HDL)与对照组没有差别。血清胆固醇(Cholestrol)和低密度脂蛋白(Low Density Lipoprotein，LDL)与对照组相比显著下降，如图14所示；
蒿甲醚显著改善了高脂饮食导致的血脂紊乱。
实施例15 腹腔注射蒿甲醚诱导高脂饲养的小鼠皮下脂肪出现棕色化
15.1 材料
15.1.1 雄性C57BL/6J小鼠(4-6week)
15.1.2 高脂饲料(Research Diets)
15.1.3 小鼠体温仪(Physitemp BAT-12)
15.1.4 UCP1特异性抗体(Abcam，ab10983，1:50)
15.1.5 蒿甲醚(成都普菲德生物技术有限公司)
15.1.6 椰子油(阿拉丁)
15.2 方法
15.2.1 小鼠的饲养和给药
小鼠在复旦大学实验动物中心SPF级动物实验室饲养，室温21℃-23℃，每12hr光暗循环，诱导肥胖小鼠所用的高脂饲料脂肪含量60％。小鼠成长至8-week龄时，随机分成对照组和给药组，每组8只。在用高脂饲料喂养的同时，腹腔注射蒿甲醚。腹腔注射用的蒿甲醚保存在椰子油中，储存浓度为6mg/ml(20mMol/L)，避光，4℃储存。按照20mg/kg体重给给药组小鼠注射蒿甲醚。每周给药两次，给药持续八周。小鼠禁食，置于4℃饲养箱，每隔2hr测其直肠温度，6hr后，断颈处死小鼠，取腹股沟部脂肪，进行组织学分析。组织学分析包括组织固定、石蜡包埋、切片和UCP1的免疫组化实验委托上海赛戈生物有限公司代做。
15.2.2 数据分析
数据差异性由Student T test方法分析，p<0.05时，认为有统计学差异。
15.3 结果
给药八周后，当暴露在4℃环境中，腹腔注射蒿甲醚的小鼠的体温明显高于对照小鼠(图14A)。在冷暴露环境中保存体温是由产热性脂肪组织承担的生理功能。取出小鼠的附睾部脂肪进行UCP1的免疫组化检测显示给药组的小鼠的皮下脂肪出现了明显的UCP1表达(图14B)；
腹腔注射蒿甲醚八周后，给药组小鼠的体温保存能力明显增强，皮下脂肪出现明显的棕色化。说明蒿甲醚抑制体重增长的作用是通过促进皮下脂肪棕色化化实现的。
实施例16 蒿甲醚抑制糖尿病小鼠ob/ob小鼠的体重增长
16.1 材料
16.1.1 雄性ob/ob小鼠(4week，南京大学模式动物中心)
16.1.2 天平(赛多利斯)
16.1.3 蒿甲醚(成都普菲德生物技术有限公司)
16.1.4 椰子油(阿拉丁)
16.2 方法
16.2.1 小鼠的饲养和给药
Ob/ob小鼠在复旦大学实验动物中心SPF级动物实验室饲养，室温21℃-23℃，每12hr光暗循环。小鼠成长至4-week龄时，随机分成对照组和给药组，每组4只。给药组通过腹腔注射蒿甲醚。腹腔注射用的蒿甲醚保存在椰子油中，储存浓度为6mg/ml(20mMol/L)，避光，4℃储存。按照20mg/kg体重给给药组ob/ob小鼠注射蒿甲醚。每周给药两次，给药持续八周。每周称重并记录。
14.2.3 数据分析
数据差异性由Student T test方法分析，p<0.05时，认为有统计学差异。
16.3 结果
给药组的ob/ob小鼠的体重有低于对照组的趋势，但没有达到统计学差异(图16A)。但给药组的小鼠的体重增长明显比对照组慢(图16B)。说明蒿甲醚显著抑制了ob/ob小鼠的体重增长，但给药八周时，给药组和对照组之间的差异没有达到统计学意义；
蒿甲醚有效抑制了糖尿病动物模型ob/ob小鼠的体重增长。
实施例17 蒿甲醚改善糖尿病小鼠ob/ob的脂肪肝
17.1 材料
17.1.1 雄性ob/ob小鼠(4-week，南京大学模式动物中心)
17.1.2 蒿甲醚(武汉菲尔德生物化学有限公司)
17.1.3 椰子油(阿拉丁)
17.2 方法
Ob/ob小鼠在复旦大学实验动物中心SPF级动物实验室饲养，室温21℃-23℃，每12hr光暗循环。小鼠成长至4-week龄时，随机分成对照组和给药组，每组4只。给药组通过腹腔注射蒿甲醚。腹腔注射用的蒿甲醚保存在椰子油中，储存浓度为6mg/ml(20mMol/L)，避光，4℃储存。按照20mg/kg体重给给药组ob/ob小鼠注射蒿甲醚。每周给药两次，给药持续八周。小鼠断颈处死，取出肝脏组织固定进行石蜡包埋、切片和HE染色，组织学分析过程委托上海赛戈生物公司代做。
17.3 结果
与对照组相比，蒿甲醚给药组的ob/ob小鼠的脂肪肝明显缓解(图17)；蒿甲醚有效缓解了糖尿病动物模型ob/ob的脂肪肝。
实施例18 腹腔注射蒿甲醚不影响健康小鼠的生长
18.1 材料
18.1.1 雄性C57BL/6J小鼠(4-6week)
18.1.2 常规饲料(上海斯莱克实验动物有限公司)
18.1.3 天平(Satorius)
18.1.4 蒿甲醚(武汉菲尔德生物化学有限公司)
18.1.5 椰子油(阿拉丁)
18.2 方法
18.2.1 小鼠的饲养和给药
小鼠在复旦大学实验动物中心SPF级动物实验室饲养，室温21℃-23℃，每12hr光暗循环。小鼠成长至8-week龄时，随机分成对照组和给药组，每组8只。给药组通过腹腔注射蒿甲醚。腹腔注射用的蒿甲醚保存在椰子油中，储存浓度为6mg/ml(20mMol/L),避光，4℃储存。按照20mg/kg体重给给药组小鼠注射蒿甲醚，对照组小鼠注射100μl椰子油。每周给药两次，给药持续八周，每周记录小鼠体重。
18.2.2 数据分析
数据差异性由Student T test方法分析，p<0.05时，认为有统计学差异。
18.3 结果
在给药八周的时间内，给药组的小鼠的体重和对照组没有出现差异(图18A)。给药组小鼠的体重增长与对照组也没有显著差别(图18B)；腹腔注射蒿甲醚不影响健康瘦小鼠的正常生长。
实施例19 腹腔注射蒿甲醚不影响健康瘦小鼠的糖代谢
19.1 材料
19.1.1 雄性C57BL/6J小鼠(4-6week，斯莱克实验动物有限公司)
19.1.2 常规饲料(上海斯莱克实验动物有限公司)
19.1.3 葡萄糖注射液
19.1.4 注射用胰岛素(优泌林)
19.1.5 血糖仪(Roche OneTouch ExtraEasy)
19.1.6 血糖试纸(Roche OneTouch ExtraEasy)
19.2 方法
19.2.1 小鼠的饲养和给药
小鼠在复旦大学实验动物中心SPF级动物实验室饲养，室温21℃-23℃，每12hr光暗循环。小鼠成长至8-week龄时，随机分成对照组和给药组，每组8只。腹腔注射用的蒿甲醚保存在椰子油中，储存浓度为6mg/ml(20mMol/L),避光，4℃储存。按照20mg/kg体重给给药组小鼠注射蒿甲醚，对照组小鼠注射100μl椰子油。每周给药两次，给药持续八周。
19.2.2 葡萄糖耐量实验
小鼠禁食12-16hr，腹腔注射2mg/kg体重的葡萄糖注射液，在注射后0min，30min，60min，90min和120min时，剪尾取血，用OneTouch ExtraEasy血糖仪和OneTouch ExtraEasy血糖试纸检测血糖并记录。
19.2.3 胰岛素耐量实验
腹腔注射0.75U/kg体重的胰岛素，于注射后0min，15min，30min，45min和60min时，剪尾取血，测血糖
19.2.4 数据分析
数据差异性由Student T test方法分析，p<0.05时，认为有统计学差异。
19.3 结果
健康瘦小鼠，腹腔注射蒿甲醚，持续八周后，给药组小鼠的葡萄糖耐量曲线与对照组没有差别，说明葡萄糖代谢没有受到蒿甲醚影响，如图18A所示。给药组小鼠的胰岛素耐量曲线与给药组也没有差别，如图19B所示；腹腔注射蒿甲醚不改变健康瘦小鼠的糖代谢。
实施例20 小鼠腹腔注射20mg/kg体重蒿甲醚没有导致肝脏损伤
20.1 材料
20.1.1 雄性C57BL/6J小鼠(4-6week)
20.1.2 常规饲料(上海斯莱克实验动物有限公司)
20.1.3 蒿甲醚(武汉菲尔德生物化学有限公司)
20.1.4 椰子油(阿拉丁)
20.2 方法
小鼠在复旦大学实验动物中心SPF级动物实验室饲养，室温21℃-23℃，每12hr光暗循环。小鼠成长至8-week龄时，随机分成对照组和给药组，每组8只。给药组通过腹腔注射蒿甲醚。腹腔注射用的蒿甲醚保存在椰子油中，储存浓度为6mg/ml(20mMol/L)，避光，4℃储存。按照20mg/kg体重给给药组小鼠注射蒿甲醚，对照组注射100μl椰子油。每周给药两次，给药持续八周。小鼠断颈处死，取肝脏组织固定。肝脏组织的固定、石蜡包埋、切片和HE染色委托赛戈生物有限公司代做。
20.3 结果
健康瘦小鼠在腹腔注射蒿甲醚八周后，肝脏细胞形态正常，与对照组小鼠没有差别，如图20所示；腹腔注射蒿甲醚，20mg/kg体重，每周两次，持续八周的条件下，蒿甲醚没有肝脏毒性。
实施例21 蒿甲醚不改变小鼠的进食量
21.1 材料
21.1.1 雄性C57BL/6J小鼠(4-6week，上海斯莱克实验动物有限公司)
21.1.2 常规饲料(上海斯莱克实验动物有限公司)
21.1.3 高脂饲料(Research Diets)
21.1.4 蒿甲醚(武汉菲尔德生物化学有限公司)
21.1.5 椰子油(阿拉丁)
21.2 方法
21.2.1 小鼠的饲养和给药
小鼠在复旦大学实验动物中心SPF级动物实验室饲养，室温21℃-23℃，每12hr光暗循环。小鼠成长至8-week龄时，随机分成四组，每组8只，分别是高脂对照组，高脂给药组，常规给药组和常规对照组。给药组(高脂和常规饲料)通过腹腔注射蒿甲醚。腹腔注射用的蒿甲醚保存在椰子油中，储存浓度为6mg/ml(20mMol/L)，避光，4℃储存。按照20mg/kg体重给给药组小鼠注射蒿甲醚，对照组注射100μl椰子油。每周称重饲料，记录每组小鼠的饲料的消耗量。
21.2.2 数据分析
数据差异性由Student T test方法分析，p<0.05时，认为有统计学差异。
21.3 结果
高脂饲养组，给药组小鼠的饲料消耗和对照组基本一致，没有差异，如图21A所示。常规饲养组，给药组小鼠的饲料消耗量和对照组也没有差别，如图21B所示.；不管是在常规饲料饲养的条件下，还是高脂饲料饲养的条件下，腹腔注射蒿甲醚不影响小鼠的正常进食。在本实施例的条件下，蒿甲醚没有引起神经性厌食。

Claims (7)

1.蒿甲醚在制备促进脂肪分解和改善糖代谢制剂中的用途，所述的蒿甲醚的结构如式(I)所示：
2.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的蒿甲醚还选自如式(II)所示的青蒿素类似物或如式(III)所示的青蒿素类似物，
3.按权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的式(III)所示的青蒿素类似物，其中，双氢青蒿素，R为羟基；蒿乙醚，R为乙氧基；青蒿琥酯，R为丁二酸单酯基(琥珀酸酯基)；SM934，R为2-氨基乙氧基；SM905，R为2R-3-叔丁基氨基-2--羟基丙氧基；artemiside，R为硫代吗啉基；artemisone，R为1,1-二氧化硫代吗啉基。
4.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的蒿甲醚促进白色脂肪棕色化。
5.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的蒿甲醚控制体重、改善代谢。
6.按权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的蒿甲醚用于制备改善代谢相关的疾病药物中的用途。
7.按权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的改善代谢相关的疾病是降低肥胖引起的高血糖、胰岛素抵抗、血脂紊乱和脂肪肝。
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