CN107326081A - 一种猕猴桃种质资源的鉴定方法及其应用 - Google Patents

一种猕猴桃种质资源的鉴定方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分子鉴定技术领域，具体而言，涉及一种猕猴桃种质资源的鉴定方法及其应用，所述方法包括以下步骤：扩增待测样品的ITS2序列片段并测序；参照不同已知猕猴桃的ITS2条形码序列进行序列比对，以确定待测样品的猕猴桃种。该方法可用于猕猴桃种间的种质资源分类与鉴定。

Description

一种猕猴桃种质资源的鉴定方法及其应用
技术领域
本发明涉及分子鉴定技术领域，具体而言，涉及一种猕猴桃种质资源的鉴定方法及其应用。
背景技术
猕猴桃属(学名：Actinidia)是一种源产于亚洲东部地区的木本植物。中国东北原生种猕猴桃属植物有软枣猕猴桃[Actinidia arguta(Sieb.et Zucc.)Planch.ExMiq.]，葛枣猕猴桃[Actinidia polygama(Sieb.et Zucc.)Maxim.]及狗枣猕猴桃[Actinidiakolomikta(Rupr.&Maxim.)Maxim.]等，由于地理及气候原因，这些猕猴桃属植物都具有良好的抗寒性，是猕猴桃属植物育种研究的优良基因供体。中国农业科学院特产研究所以建立资源圃的方式保存了数百份野生猕猴桃资源，其中软枣猕猴桃资源最为丰富。近年来，软枣猕猴桃资源逐渐得到研究人员及当地农民的重视，软枣猕猴桃资源具有良好的开发前景，鉴别不同软枣猕猴桃种质资源、分析东北地区猕猴桃资源的遗传多样性具有一定的现实意义。因此有必要对东北东北野生猕猴桃资源进行分子标记技术研究。
Soon-Jae Kwon等和Juan-Juan Lai等筛选了适合软枣猕猴桃资源研究的SSR引物并对不同软枣猕猴桃资源进行了聚类分析。H.Dai et al.应用RAPD标记分析了来自9个地区的32个软枣猕猴桃资源。分析表明，软枣猕猴桃有很高的遗传多样性。但上述标记均未能很好的鉴别软枣猕猴桃种内资源，所以应考虑采用其他分子标记方法对其进行研究。
DNA条形码(DNA barcoding)是近年提出的一种分子鉴定新技术，DNA条形码技术能够利用标准的、具有足够变异、易扩增且相对较短的DNA片段实现对物种的鉴定。DNA条形码概念自2003年由加拿大分类学家Paul Hebert首次提出后就在世界范围内受到了广泛关注。近几年间，DNA条形码技术逐渐成为国际生物多样性研究中的热点。2005年前后，DNA条形码概念被引入植物研究中。2009年，国际生命条形码联盟植物工作组(CBOL PlantWorking Group)初步确定并推荐使用叶绿体基因rbcL和matK片段。我国学者陈士林等对DNA条形码在药用植物资源中的研究进行了详细的论述，在对大量药用植物资源进行了研究基础上建议建立以ITS2为核心以trnH-psbA为辅的植物类药材DNA条形码鉴定体系。Laura Jaakola等利用DNA条形码技术结合高分辨率溶解曲线(high-resolution melting,HRM)成功的鉴别了蓝莓品种Northcountry和Northblue，为以DNA条形码鉴别软枣猕猴桃种内不同资源的可行性提供了参考。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种猕猴桃种质资源的鉴定方法，以解决上述问题。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明涉及一种猕猴桃种质资源的鉴定方法，包括以下步骤：
扩增待测样品的ITS2序列片段并测序；
参照不同已知猕猴桃的ITS2条形码序列进行序列比对，以确定待测样品的猕猴桃种。
上述方法可用于猕猴桃种间(inter-species)的种质资源分类与鉴定。
如上所述的方法在猕猴桃种质资源分类中的应用。
猕猴桃种质材料和新品种的鉴定是猕猴桃种质资源研究利用和新品种保护的基础，由于大量猕猴桃种质资源间存在形态相似性，所以以形态学为基础的鉴定方法对非专业人员有较大的困难，DNA条形码技术因其鉴定准确、操作简单，是较为理想的鉴定方法。目前对DNA条形码的研究利用主要集中于物种鉴定方面，以条形码技术鉴定同一物种内不同个体的报道较为罕见。本发明利用DNA条形码对中国东北地区3个猕猴桃种共180份样品进行遗传多样性分析。其中重点分析了DNA条形码鉴别软枣猕猴桃种质资源及品种的可行性；同时比较了不同条形码及其组合在三个猕猴桃种间的遗传距离。以期探究DNA条形码在猕猴桃属植物鉴定中的进一步应用。
在种内资源鉴定方面，由于软枣猕猴桃种内资源间遗传差异较小，因此各条形码片段及片段组合均不能成功鉴别不同资源及品种，但是此条形码片段具有种的特异性。在种间遗传多样性分析方面及条形码筛选比较方面，不同猕猴桃种间有明显的差异，ITS2、rbcL等序列均能成功进行不同物种的鉴别。ITS序列测序成功率较低，不适合作为猕猴桃资源的条形码序列。Wilcoxon Signed Rank Tests检验表明核基因ITS2序列种间变异显著高于叶绿体条形码片段，而且核基因组作为鉴定植物残骸时有较好的种的特异性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为不同条形码片段的遗传距离比较。
具体实施方式
本发明涉及一种猕猴桃种质资源的鉴定方法，包括以下步骤：
扩增待测样品的ITS2序列片段并测序；
参照不同已知猕猴桃的ITS2条形码序列进行序列比对，以确定待测样品的猕猴桃种。
优选的，如上所述的猕猴桃种质资源的鉴定方法，扩增待测样品的ITS2序列片段时所用的引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
优选的，如上所述的猕猴桃种质资源的鉴定方法，扩增待测样品的ITS2序列片段时的退火温度为53℃～55℃；更优选的，退火温度为54℃。
优选的，如上所述的猕猴桃种质资源的鉴定方法，扩增待测样品的ITS2序列片段时的反应程序为：
更优选的，反应程序为：
优选的，如上所述的猕猴桃种质资源的鉴定方法，扩增待测样品的ITS2序列片段时，在PCR反应体系中：
DNA模板的浓度≥1.0ng/μL，正反向引物的浓度≥0.01μmol/L；
更优选的，DNA模板的浓度为1.0～1.5ng/μL，正反向引物的浓度为0.01～0.03μmol/L。
优选的，如上所述的猕猴桃种质资源的鉴定方法，所述猕猴桃种质资源包括软枣猕猴桃、狗枣猕猴桃以及葛枣猕猴桃。
优选的，如上所述的猕猴桃种质资源的鉴定方法，所述软枣猕猴桃、狗枣猕猴桃以及葛枣猕猴桃的ITS2序列片段具有如下特征：
(1).49bp处：软枣猕猴桃：G；狗枣猕猴桃：G；葛枣猕猴桃：A；
(2).61bp处：软枣猕猴桃：C；狗枣猕猴桃：T；葛枣猕猴桃：C；
(3).67bp处：软枣猕猴桃：T；狗枣猕猴桃：G；葛枣猕猴桃：A；
(4).68bp处：软枣猕猴桃：A；狗枣猕猴桃：C；葛枣猕猴桃：A；
(5).69bp处：软枣猕猴桃：C；狗枣猕猴桃：C；葛枣猕猴桃：T；
(6).81bp处：软枣猕猴桃：C；狗枣猕猴桃：C；葛枣猕猴桃：G；
(7).86bp处：软枣猕猴桃：G；狗枣猕猴桃：A；葛枣猕猴桃：G；
(8).87bp处：软枣猕猴桃：C；狗枣猕猴桃：T；葛枣猕猴桃：C；
(9).88bp处：软枣猕猴桃：C；狗枣猕猴桃：T；葛枣猕猴桃：T；
(10).92bp处：软枣猕猴桃：C；狗枣猕猴桃：T；葛枣猕猴桃：T；
(11).94bp处：软枣猕猴桃：C；狗枣猕猴桃：T；葛枣猕猴桃：T；
(12).106bp处：软枣猕猴桃：A；狗枣猕猴桃：T；葛枣猕猴桃：T；
(13).111bp处：软枣猕猴桃：A；狗枣猕猴桃：G；葛枣猕猴桃：G；
(14).124bp处：软枣猕猴桃：G；狗枣猕猴桃：A；葛枣猕猴桃：A；
(15).126bp处：软枣猕猴桃：C；狗枣猕猴桃：T；葛枣猕猴桃：T；
(16).132bp处：软枣猕猴桃：G；狗枣猕猴桃：A；葛枣猕猴桃：A；
(17).140bp处：软枣猕猴桃：T；狗枣猕猴桃：C；葛枣猕猴桃：T；
(18).146bp处：软枣猕猴桃：A；狗枣猕猴桃：C；葛枣猕猴桃：A；
(19).148bp处：软枣猕猴桃：T；狗枣猕猴桃：C；葛枣猕猴桃：T；
(20).149bp处：软枣猕猴桃：G；狗枣猕猴桃：A；葛枣猕猴桃：G；
(21).157bp处：软枣猕猴桃：C；狗枣猕猴桃：T；葛枣猕猴桃：T；
(22).161bp处：软枣猕猴桃：G；狗枣猕猴桃：A；葛枣猕猴桃：A；
(23).163bp处：软枣猕猴桃：C；狗枣猕猴桃：T；葛枣猕猴桃：T；
(24).173bp处：软枣猕猴桃：G；狗枣猕猴桃：A；葛枣猕猴桃：A；
(25).207bp处：软枣猕猴桃：C；狗枣猕猴桃：T；葛枣猕猴桃：T；
(26).211bp处：软枣猕猴桃：G；狗枣猕猴桃：C；葛枣猕猴桃：C；
(27).213bp处：软枣猕猴桃：C；狗枣猕猴桃：T；葛枣猕猴桃：T；
(28).215bp处：软枣猕猴桃：C；狗枣猕猴桃：A；葛枣猕猴桃：C；
(29).220bp处：软枣猕猴桃：G；狗枣猕猴桃：A；葛枣猕猴桃：A；
(30).225bp处：软枣猕猴桃：C；狗枣猕猴桃：T；葛枣猕猴桃：T；
(31).226bp处：软枣猕猴桃：G；狗枣猕猴桃：A；葛枣猕猴桃：A；
(32).229bp处：软枣猕猴桃：C；狗枣猕猴桃：G；葛枣猕猴桃：G；
(33).240bp处：软枣猕猴桃：C；狗枣猕猴桃：T；葛枣猕猴桃：T；
(34).249bp处：软枣猕猴桃：C；狗枣猕猴桃：T；葛枣猕猴桃：T；
(35).259bp处：软枣猕猴桃：C；狗枣猕猴桃：T；葛枣猕猴桃：C；
(36).269bp处：软枣猕猴桃：G；狗枣猕猴桃：G；葛枣猕猴桃：A；
(37).353bp处：软枣猕猴桃：C；狗枣猕猴桃：T；葛枣猕猴桃：T。
优选的，如上所述的猕猴桃种质资源的鉴定方法，在参照不同已知猕猴桃的ITS2条形码序列进行序列比对，以确定待测样品的猕猴桃种时，供比对的软枣猕猴桃、狗枣猕猴桃以及葛枣猕猴桃的ITS2序列片段的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3-5所示。
优选的，如上所述的猕猴桃种质资源的鉴定方法，若待测样品的ITS2序列片段与如上所述的已知猕猴桃的ITS2条形码序列当中任一品种的猕猴桃的相应位点的重和率≥80％，更优选重和率≥82％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％；
或与SEQ ID NO:3-5当中任一序列的相似性≥90％，更优选相似性≥91％、92％、93％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％则鉴定为软枣猕猴桃、狗枣猕猴桃以及葛枣猕猴桃中的相应品种。
如上所述的方法在猕猴桃种质资源分类中的应用。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例
1.材料与方法
1.1试验材料
猕猴桃属植物材料选取3个种60个不同品种及品系的资源，为探明各不同品种及品系之间是否有显著的遗传差异，并计算遗传距离，各品种及品系均随机挑选三个不同单株取样并分装标记，总计得到猕猴桃叶片样品180份。其中软枣猕猴桃种(包括软枣猕猴桃变种紫果猕猴桃)选取51个不同的品种及品系，得到叶片样品共153份；选取6个不同狗枣猕猴桃资源共18份叶片材料；选取3个葛枣猕猴桃资源共9份叶片样品。样品采自中国农业科学院特产研究所左家资源圃，采集后的材料应用硅胶干燥法保存，以备后续试验应用。资源名称及试验编号见表1。
表1.试验材料名称及编号
注：紫果猕猴桃是软枣猕猴桃的变种
1.2实验方法
1.2.1猕猴桃总DNA提取利用北京天根生化公司(TIANGEN BIOTECH(BEIJING)CO.,LTD)的离心柱型植物基因组DNA提取试剂盒(Plant Genomic DNA Kit)从硅胶干燥叶片中提取猕猴桃基因组DNA。
1.2.2PCR扩增PCR反应体系体积为30μl，其中包含：北京天根生化公司(TIANGENBIOTECH(BEIJING)CO.,LTD)2×PCR Reagent 15μl(0.1U Taq plus polymerase/μL，500μMdNTP each，20mM Tris-HCl(pH＝8.3)，100mM KCl，3mM MgCl2)，DNA模板2μl，上游引物及下游引物(2.5μM)各1.5μl，ddH2O 10μl。利用梯度PCR设置不同退火温度，优化反应条件。各序列引物及反应条件见表2。
表2.条形码序列引物及反应条件
1.2.3测序本试验PCR产物由生工生物工程(上海)股份有限公司(Sangon Biotech(Shanghai)Co.,Ltd)直接单向测序。利用CodonCode Aligner 6.0.2查看测序峰图。
1.2.4序列处理利用Chromas 2.4对序列末端的测序不准确的片段进行初步剪切，利用ClustalX2对序列进行比对校正。利用MEGA6进一步比对，并最终的切齐、校正。
1.2.5条形码评价及资源遗传关系分析根据测序结果统计各条形码片段的基本信息，利用MEGA6.0计算不同遗传资源之间的K2P遗传距离，依据各条形码片段的遗传距离值分析不同资源种间及种内的变异情况，并作出种间变异、种内品种间及品种内的变异分布图。利用IBM SPSS Statistics 21对不同序列进行Wilcoxon Signed Rank Tests检验，配对法比较两两序列间猕猴桃种内及种间变异的大小。
2.结果与分析
2.1不同条形码片段的扩增效率、测序成功率及其他序列信息统计
各条形码候选序列的扩增效率、测序成功率、变异位点等信息统计结果见表3。
表3.候选条形码序列信息统计
*序列获得率＝扩增效率×测序成功率
序列的扩增效率、测序质量是评判候选条形码序列重要依据。各候选条形码序列及其组合的扩增效率均为100％。各片段的测序成功率有明显差异，其中ITS序列测序成功率仅为27.78％，测序成功率过低，予以淘汰，不做后续分析，因此ITS序列不能作为鉴定东北野生猕猴桃资源的条形码片段。其余候选条形码片段的序列获得率均较高，其中rbcL片段最高达到100％，ITS2序列最低为86.11％。四个候选条形码片段的序列长度从424bp-832bp不等，核基因ITS2序列变异位点最多有39个，叶绿体基因变异位点均较少，其中trnH-psbA序列变异位点最少仅有4个。可见核基因进化速率较快叶绿体基因进化速率则相对较慢，因此核基因ITS2片段对于分类鉴别亲缘关系较近的物种将更有优势。片段组合的信息位点较多，有助于物种遗传多样性的分析。各序列GC％含量均不相同，ITS2GC％含量最高达到58.45％，trnH-psbA最低仅为29.48％。
2.2基于DNA条形码的种内资源鉴定
2.2.1根据遗传距离分析不同条形码片段的资源鉴定
遗传距离是品种鉴定的重要指标之一，根据不同资源品种间及品种内遗传距离的差异可以判断候选条形码片段的物种鉴别能力。若不同资源品种间最小遗传距离大于品种内最大遗传距离，则认为序列可以成功对不同资源及栽培品种进行鉴别。不同品种间遗传距离及品种内遗传距离比较(表4)分析显示，ITS2及matK等条形码片段及其组合的品种间最小遗传距离均小于品种内最大遗传距离，所以不能用于鉴定种内资源。同样rbcL及trnH-psbA序列品种间遗传距离为0，不能区分种内资源。
表4.不同序列的品种内、种内品种间及种间距离
2.2.2barcoding gap图分析
以K2P遗传距离值为横坐标，纵坐标为不同变异条件下物种的分布情况，即可得到barcoding gap图。理想的条形码片段的不同变异水平(inter-species，intra-speciesand inter-cultivars，intra-cultivars)之间应有明显的差异，呈现出inter-species>intra-species and inter-cultivars>intra-cultivars的趋势，并且应具有明显的间隔区，即：“gap”区域。
Barcoding gap分析结果表明，各候选条形码片段品种内与种内品种间均无明显的gap区域，因此不能完成不同品种品系的区分鉴定。而种间变异与种内变异之间则存在明显的gap,能够完成物种水平的鉴定。
2.2.3NJ树鉴定
构建进化树的方法分为discrete character methods and distance methods 2种，其中discrete character methods包括Maximum Parsimony methods(MP)and MaximumLikelihood methods；distance methods包括UPGMA and Neighbor-joining(N-J).Lahaye等对进化树进行了分析，最终认为在结果相差不大时选用NJ树可以达到条形码快速简便的效果。
由于不同建树方法得到的效果不一样，所以对matK,rbcL,trnH-psbA三序列，通过三种算法构建系统进化树：通过MEGA6.0软件采用discrete character methods(MP,ML)和discrete character methods(UPGMA,NJ)建立系统进化树，均选择1000次重复抽样检验得到分支树节点上的自展支持率，可信度测验为bootstrap检验，使用K-2-P(Kimura-2-parameter distance)距离模型来评价品种内及品种间的差异。当同一个不同样本聚类到一起，说明品种水平上可以正确鉴定；当不同的物种聚在一起时，认为不能够正确鉴定。发现得到的结果基本一致，所以选用NJ进化树，这样就能够达到条形码快速简便的效果，所构建的进化树才会更接近真实的“进化树”。
Barcoding gap分析表明，各候选条形码片段的品种间遗传距离较小，本研究中，我们选用遗传距离较大的ITS2片段以及片段组合ITS2+rbcL构建系统进化树，以期能将同一物种内的不同物种进行鉴别
从ITS2片段的系统发育树分析中可以看出，各物种可以聚类到同一分枝中，但是物种内部不同品种间则无明显的分枝，表明ITS2序列种内变异不明显，不能用于进行物种内部不同资源的鉴定。同理，在候选条形码组合ITS2+rbcL的NJ树中同一物种聚类为一个分枝同一分枝内不同品种间没有明显的区别，因此条形码片段组合ITS2+rbcL不能鉴定同一物种内部的不同资源。
2.3基于DNA条形码的猕猴桃种间遗传多样性分析
2.3.1barcoding gap
通过barcoding gap分析各条形码片段及片段组合种内与种间遗传距离的频率分布，各候选片段及片段组合均有明显的“Barcoding gap”。说明候选条形码片段及片段组合均能成功鉴别软枣猕猴桃、葛枣猕猴桃及狗枣猕猴桃这三个中国东北地区较为常见的猕猴桃属植物。其中ITS2序列遗传距离较大，其种内遗传距离主要分布于0～0.01，种间遗传距离则在0.03～0.09之间。trnH-psbA遗传距离则最小，其种内遗传距离主要分布于0～0.001，种间遗传距离则在0.004～0.007之间。根据遗传距离的分布情况可进一步推测不同条形码片段的进化速率。遗传距离大则进化速率较快。
2.3.2候选条形码Wilcoxon Signed Rank Tests检验
分析各候选条形码片段及片段组合的种间及种内变异情况(表4)，结果表明ITS2序列种间变异最大，rbcL和matK次之，trnH-psbA种间变异最小。以不同候选条形码片段及片段组合的种间遗传距离为基础，使用IBM SPSS statistics分析软件做Wilcoxon SignedRank Tests，对上述结果进行了验证，各候选条形码片段种间遗传距离有大到小情况如下：ITS2>ITS2+rbcL>ITS2+matK>rbcL>matK>trnH-psbA，不同序列间的遗传距离值呈极显著性差异。
表5.候选条形码种间序列Wilcoxon Signed Rank Tests检验
W+ W- 物种种间相关性检验 结果
ITS2 matK W+＝6352830.00,W-＝0.00,n＝3564,P＝0.000 P<0.01,ITS2>matK
ITS2 rbcL W+＝1890540.00,W-＝0.00,n＝1944,P＝0.000 P<0.01,ITS2>rbcL
rbcL matK W+＝5226228.00,W-＝3646350.00,n＝4212,P＝0.000 P<0.01,rbcL>matK
matK trnH-psbA W+＝5270698.00,W-＝2803473.00,n＝4018,P＝0.000 P<0.01,matK>trnH-psbA
ITS2 ITS2+rbcL W+＝6546771.00,W-＝0.00,n＝3618,P＝0.000 P<0.01,ITS2>ITS2+rbcL
ITS2+rbcL ITS2+matK W+＝6449436.00,W-＝0.00,n＝3591,P＝0.000 P<0.01,ITS2+rbcL>ITS2+matK
ITS2+matK rbcL W+＝6449436.00,W-＝0.00,n＝3591,P＝0.000 P<0.01,ITS2+matK>rbcL
不同条形码位点K2P遗传距离的综合比较，Barcoding gap分析以及WilcoxonSigned Rank Tests的结果表明：ITS不可作为中国东北原生猕猴桃资源鉴别的候选条形码片段；条形码位点ITS2,rbcL,matK,trnH-psbA不能用于栽培品种的鉴定分析，但是能够应用于不同种水平的分类鉴别。可见DNA条形码在猕猴桃属植物的分类、物种进化、遗传起源以及资源多样性分析和遗传育种等方面的研究中具有广阔的应用前景。
核基因ITS2与叶绿体基因matK,rbcL,trnH-psbA,的系统进化树分析结果(Figure.2)之间有所差异。ITS2及trnH-psbA的分析结果(Figure.2A,Figure.2D)显示葛枣猕猴桃与狗枣猕猴桃之间遗传距离较近，而与软枣猕猴桃之间遗传距离相对较远。matK及rbcL片段(Figure.2A,Figure.2D)的系统进化树显示狗枣猕猴桃与软枣猕猴桃之间遗传距离较近，而与葛枣猕猴桃之间遗传距离则较远。
3.讨论
DNA条形码在动植物物种鉴定分类中的应用已得到广泛的重视，但是将其应用于鉴别单一物种中不同资源及品种的研究还很少见.讨论DNA条形码在植物资源鉴定中的应用有助于拓展该技术的应用领域，同时，与传统的分子标记技术相比，这种以测序为基础的分子标记具有更好的准确性和稳定性。
3.1DNA条形码在软枣猕猴桃资源鉴定中的应用
本研究中应用了大量的软枣猕猴桃资源，其主要目标是探究DNA条形码在软枣猕猴桃种质资源鉴定方面的应用。中国东北地区拥有大量软枣猕猴桃资源，对这些资源的准确鉴定有助于种质资源的保存及利用，因此找到一种可行的种质资源鉴定方法十分重要。目前植物条形码研究主要集中于植物分类学及系统发育学，因此，植物核心条形码的筛选要求候选条形码片段要具有较大的种间变异而种内则相对保守。这就使得目前应用较多的条形码片段在种内不同资源间缺少足够的变异。研究较为透彻且应用较多的条形码片段由于种内变异保守，不同资源之间缺少稳定的差异序列.所以DNA条形码的方法对于软枣猕猴桃资源的鉴定中的应用还需进一步讨论，对于条形码片段的选取不应以常规的植物分类学家推荐的植物核心条形码的候选条形码为主，而应选取进化速率较快的条形码片段作为候选条形码片段。本发明中应用的条形码片段不能成功鉴别软枣猕猴桃种内的不同资源，我们认为其原因有如下三点：1.软枣猕猴桃种在遗传进化上较为保守，不同资源间遗传距离小；2.本研究中的软枣猕猴桃全部采集于中国东北部，缺乏足够的地理隔离导致样本的遗传距离较小；3.选取的条形码片段进化速率慢导致不同资源的条形码序列遗传距离小，无法达到鉴别资源的目的。
3.2不同条形码序列的遗传距离比较
比较不同条形码序列间相同两猕猴桃种的K2P遗传距离(图1)，核基因ITS2的K2P遗传距离值高于叶绿体基因，表明核基因进化较快，叶绿体基因进化相对较慢。此外，在核基因中软枣猕猴桃与狗枣猕猴桃之间的遗传距离最大，狗枣猕猴桃与葛枣猕猴桃之间遗传距离较小；而叶绿体基因进化顺序则与之不同，软枣猕猴桃与狗枣猕猴桃之间遗传距离较小，狗枣猕猴桃与葛枣猕猴桃之间遗传距离较大。这种差异表明核基因与叶绿体基因在进化上可能是相对独立的。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院特产研究所
<120> 一种猕猴桃种质资源的鉴定方法及其应用
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgcgatact tggtgtgaat 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gacgcttctc cagactacaa t 21
<210> 3
<211> 419
<212> DNA
<213> Actinidia arguta
<400> 3
gttgcgcctg aagccattag gccgagggca cgtctgcctg ggcgtcacgc attgtgtcgc 60
ccaccctacc cgagccttac caagggccgg gcgcgggtgg gcggaaattg accccccgtg 120
cacgtcagtg agcggtcggt ctaaaaatga agtcctcggc gacggacgtc acgacaagtg 180
gtggttgaca aaccgttgcg tcctgtcgtg gtcgcccccg ttgccgagcg tttgctcttc 240
gaccctaacg tgccgttgcc acggcttcga tcgcgacccc aggtcaggcg ggattacccg 300
ctgagtttaa gcatatcaat aagcggagga aaagaaactt acaaggattc ccctagtaac 360
ggcgagcgaa ccgggaatag cccagcttga aaatcgggcg atctcgttgt ccgaattgt 419
<210> 4
<211> 419
<212> DNA
<213> Actinidia kolomikta
<400> 4
gttgcgcctg aagccattag gccgagggca cgtctgcctg ggcgtcacgc attgtgtcgc 60
tcacccgccc cgagccttac caaggattgg gtgtgggtgg gcggatattg gccccccgtg 120
cacattagtg aacggtcggc ctaaacacaa agtccttggc aatggacgtc acaacaagtg 180
gtggttgaca aaccgttgcg tcctgttgtg cttgacccca ttgctaaggg tttgctcttt 240
gaccctaatg tgccgttgtc acggcttcga tcgcgacccc aggtcaggcg ggattacccg 300
ctgagtttaa gcatatcaat aagcggagga aaagaaactt acaaggattc ccttagtaac 360
ggcgagcgaa ccgggaatag cccagcttga aaatcgggcg atctcgttgt ccgaattgt 419
<210> 5
<211> 418
<212> DNA
<213> Actinidia polygama
<400> 5
gttgcgcctg aagccattag gccgagggca cgtctgcctg ggcgtcacac attgtgtcgc 60
ccacccaatc cgagccttac gaagggctgg gtgtgggtgg gcggatattg gccccccgtg 120
cacattagtg aacggtcggt ctaaaaatga agtccttggc aatggacgtc acaacaagtg 180
gtggttgaca aaccgttgcg tcctgttgtg cttgccccca ttgctaaggg ttgctctttg 240
accctaatgt gccgttgcca cggcttcaat cgcgacccca ggtcaggcgg gattacccgc 300
tgagtttaag catatcaata agcggaggaa aagaaactta caaggattcc cttagtaacg 360
gcgagcgaac cgggaatagc ccagcttgaa aatcgggcga tctcgttgtc cgaattgt 418

Claims (10)

1.一种猕猴桃种质资源的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
扩增待测样品的ITS2序列片段并测序；
参照不同已知猕猴桃的ITS2条形码序列进行序列比对，以确定待测样品的猕猴桃种。
2.根据权利要求1所述的猕猴桃种质资源的鉴定方法，其特征在于，扩增待测样品的ITS2序列片段时所用的引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
3.根据权利要求2所述的猕猴桃种质资源的鉴定方法，其特征在于，扩增待测样品的ITS2序列片段时的退火温度为53℃～55℃。
4.根据权利要求3所述的猕猴桃种质资源的鉴定方法，其特征在于，扩增待测样品的ITS2序列片段时的反应程序为：
5.根据权利要求1任一项所述的猕猴桃种质资源的鉴定方法，其特征在于，扩增待测样品的ITS2序列片段时，在PCR反应体系中：
DNA模板的浓度≥1.0ng/μL，正反向引物的浓度≥0.01μmol/L。
6.根据权利要求1～5任一项所述的猕猴桃种质资源的鉴定方法，其特征在于，所述猕猴桃种质资源包括软枣猕猴桃、狗枣猕猴桃以及葛枣猕猴桃。
7.根据权利要求6所述的猕猴桃种质资源的鉴定方法，其特征在于，所述软枣猕猴桃、狗枣猕猴桃以及葛枣猕猴桃的ITS2序列片段具有如下特征：
(1).49bp处：软枣猕猴桃：G；狗枣猕猴桃：G；葛枣猕猴桃：A；
(2).61bp处：软枣猕猴桃：C；狗枣猕猴桃：T；葛枣猕猴桃：C；
(3).67bp处：软枣猕猴桃：T；狗枣猕猴桃：G；葛枣猕猴桃：A；
(4).68bp处：软枣猕猴桃：A；狗枣猕猴桃：C；葛枣猕猴桃：A；
(5).69bp处：软枣猕猴桃：C；狗枣猕猴桃：C；葛枣猕猴桃：T；
(6).81bp处：软枣猕猴桃：C；狗枣猕猴桃：C；葛枣猕猴桃：G；
(7).86bp处：软枣猕猴桃：G；狗枣猕猴桃：A；葛枣猕猴桃：G；
(8).87bp处：软枣猕猴桃：C；狗枣猕猴桃：T；葛枣猕猴桃：C；
(9).88bp处：软枣猕猴桃：C；狗枣猕猴桃：T；葛枣猕猴桃：T；
(10).92bp处：软枣猕猴桃：C；狗枣猕猴桃：T；葛枣猕猴桃：T；
(11).94bp处：软枣猕猴桃：C；狗枣猕猴桃：T；葛枣猕猴桃：T；
(12).106bp处：软枣猕猴桃：A；狗枣猕猴桃：T；葛枣猕猴桃：T；
(13).111bp处：软枣猕猴桃：A；狗枣猕猴桃：G；葛枣猕猴桃：G；
(14).124bp处：软枣猕猴桃：G；狗枣猕猴桃：A；葛枣猕猴桃：A；
(15).126bp处：软枣猕猴桃：C；狗枣猕猴桃：T；葛枣猕猴桃：T；
(16).132bp处：软枣猕猴桃：G；狗枣猕猴桃：A；葛枣猕猴桃：A；
(17).140bp处：软枣猕猴桃：T；狗枣猕猴桃：C；葛枣猕猴桃：T；
(18).146bp处：软枣猕猴桃：A；狗枣猕猴桃：C；葛枣猕猴桃：A；
(19).148bp处：软枣猕猴桃：T；狗枣猕猴桃：C；葛枣猕猴桃：T；
(20).149bp处：软枣猕猴桃：G；狗枣猕猴桃：A；葛枣猕猴桃：G；
(21).157bp处：软枣猕猴桃：C；狗枣猕猴桃：T；葛枣猕猴桃：T；
(22).161bp处：软枣猕猴桃：G；狗枣猕猴桃：A；葛枣猕猴桃：A；
(23).163bp处：软枣猕猴桃：C；狗枣猕猴桃：T；葛枣猕猴桃：T；
(24).173bp处：软枣猕猴桃：G；狗枣猕猴桃：A；葛枣猕猴桃：A；
(25).207bp处：软枣猕猴桃：C；狗枣猕猴桃：T；葛枣猕猴桃：T；
(26).211bp处：软枣猕猴桃：G；狗枣猕猴桃：C；葛枣猕猴桃：C；
(27).213bp处：软枣猕猴桃：C；狗枣猕猴桃：T；葛枣猕猴桃：T；
(28).215bp处：软枣猕猴桃：C；狗枣猕猴桃：A；葛枣猕猴桃：C；
(29).220bp处：软枣猕猴桃：G；狗枣猕猴桃：A；葛枣猕猴桃：A；
(30).225bp处：软枣猕猴桃：C；狗枣猕猴桃：T；葛枣猕猴桃：T；
(31).226bp处：软枣猕猴桃：G；狗枣猕猴桃：A；葛枣猕猴桃：A；
(32).229bp处：软枣猕猴桃：C；狗枣猕猴桃：G；葛枣猕猴桃：G；
(33).240bp处：软枣猕猴桃：C；狗枣猕猴桃：T；葛枣猕猴桃：T；
(34).249bp处：软枣猕猴桃：C；狗枣猕猴桃：T；葛枣猕猴桃：T；
(35).259bp处：软枣猕猴桃：C；狗枣猕猴桃：T；葛枣猕猴桃：C；
(36).269bp处：软枣猕猴桃：G；狗枣猕猴桃：G；葛枣猕猴桃：A；
(37).353bp处：软枣猕猴桃：C；狗枣猕猴桃：T；葛枣猕猴桃：T。
8.根据权利要求6所述的猕猴桃种质资源的鉴定方法，其特征在于，在参照不同已知猕猴桃的ITS2条形码序列进行序列比对，以确定待测样品的猕猴桃种时，供比对的软枣猕猴桃、狗枣猕猴桃以及葛枣猕猴桃的ITS2序列片段的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3-5所示。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，若待测样品的ITS2序列片段与权利要求7当中任一品种的猕猴桃的相应位点的重和率≥80％，或与SEQ ID NO:3-5当中任一序列的相似性≥90％，则鉴定为软枣猕猴桃、狗枣猕猴桃以及葛枣猕猴桃中的相应品种。
10.权利要求1～9任一项所述的方法在猕猴桃种质资源分类中的应用。
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