CN107326073A - 作为荧光参考标准品的 ddao 化合物 - Google Patents

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Abstract

一种作为荧光参考标准品的DDAO化合物。根据本教导，提供了利用至少一种式(I)的参比染料的方法和组合物：在一些实施方案中，方法包括测量报告染料和至少一种式(I)的参比染料的检测信号。在一些实施方案中，组合物包含式(I)的参比染料、缓冲剂、核苷酸和蛋白的选择物。

Description

作为荧光参考标准品的DDAO化合物
本申请是申请日为2011年12月28日、申请号为201180066331.X、发明名称为“作为荧光参考标准品的DDAO化合物”的发明专利申请的分案申请。
背景
在许多不同的测定中，参比染料可以是有益的。参比染料可以用于校准、归一化，和用于确保测定正被正确地进行。在可以包含多种染料来确定多个目标的多重反应中，可能难以找到发出与其他染料不同的波长且不会干扰反应的稳定的参比染料。
概述
在一些实施方案中，提供了一种方法，其中该方法可以包括(a)形成包括至少一种探针和参比染料的混合物，其中至少一种探针中的每种包括目标特异性部分和报告染料，其中每个目标特异性部分对不同的目标是特异性的，且每种报告染料与其他报告染料不同，且其中参比染料具有式(I)：
其中：
R1至R3和R6至R8中的每个独立地是-H、卤素、-CO2H、-CO2R、-SO3H、-SO3R、-CH2CO2H、-CH2CO2R、-CH2SO3H、-CH2SO3R、-CH2NH2、-CH2NHR、-NO2、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、和取代的C1-C6烷氧基，其中R是C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、和取代的C1-C6烷氧基；
单独使用的R4和R5选自C1-C6烷基和C1-C6取代的烷基，或合在一起的R4和R5选自C3-C7环烷基、C4-C7不饱和的环烷基、C3-C7取代的环烷基、或C4-C7取代的不饱和的环烷基；和(b)测量由参比染料发出的荧光；(c)测量由至少一种报告染料发出的荧光。在不同实施方案中，该方法可以另外包括基于由参比染料发出的经测量的荧光来调节由至少一种报告染料发出的经测量的荧光，以形成经调节的测量结果。在一些实施方案中，混合物包括至少两种、至少三种、至少四种、或至少五种探针。
在一些实施方案中，R1选自氢、卤素、甲基和乙基；R2和R3各自独立地是卤素；R4和R5各自独立地选自甲基和乙基；R6选自氢、卤素、甲基和乙基；R7选自氢、卤素、甲基、乙基和SO3H；且R8选自氢、卤素、甲基和乙基。在一些实施方案中，R2和R3各自是氯，且R7是氢或SO3H。在一些实施方案中，参比染料选自：
在一些实施方案中，目标特异性部分可以选自寡核苷酸、肽、抗体、抗原、小分子、代谢物和多糖。在一些实施方案中，目标可以选自多核苷酸、抗原、抗体、受体、酶、细胞器、膜和细胞。在一些实施方案中，目标特异性部分可以是寡核苷酸。在一些实施方案中，探针包括寡核苷酸、报告染料和淬灭染料。在一些实施方案中，目标可以是多核苷酸。在一些实施方案中，方法可以包括放大多核苷酸的至少一部分。
在一些实施方案中，由每种报告染料发出的荧光可以在混合物中的其他报告染料和参比染料的存在下被测量。在一些实施方案中，由参比染料发出的荧光可以在混合物中的报告染料的存在下被测量。
在一些实施方案中，方法可以包括：用第一激发波长范围照射混合物；检测由至少第一报告染料发出的辐射；用与第一激发波长范围不同的第二激发波长范围照射混合物；和检测由参比染料发出的辐射。在一些实施方案中，方法还可以包括：用第三激发波长范围照射混合物；和检测由至少第二报告染料发出的辐射。
在一些实施方案中，方法可以包括：用第一激发波长范围照射混合物；检测由至少第一报告染料发出的辐射；和检测由至少第二报告染料发出的辐射；其中由至少第一报告染料发出的辐射可以与由至少第二报告染料发出的辐射分开检测。
根据不同实施方案，方法还可以包括用第一激发波长范围照射包含核酸的样品，在用第一激发波长范围辐射样品之后检测从多种染料中的至少一种染料发出的辐射，用与第一激发波长范围不同的第二激发波长范围照射样品，和在用第二激发波长范围辐射样品之后检测从多种染料中的至少一种其他染料发出的辐射。不同的激发波长范围可以用于多种染料中的每种不同的报告染料，且用于钝态参比染料。
在一些实施方案中，可以提供组合物，其中组合物包含利用式(I)的参比染料的主要混合物：
其中：
R1至R3和R6至R8中的每个独立地是-H、卤素、-CO2H、-CO2R、-SO3H、-SO3R、-CH2CO2H、-CH2CO2R、-CH2SO3H、-CH2SO3R、-CH2NH2、-CH2NHR、-NO2、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、和取代的C1-C6烷氧基，其中R是C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、和取代的C1-C6烷氧基；
单独使用的R4和R5选自C1-C6烷基和C1-C6取代的烷基，或R4和R5合在一起选自C3-C7环烷基、C4-C7不饱和的环烷基、C3-C7取代的环烷基、或C4-C7取代的不饱和的环烷基。
在一些实施方案中，R1选自氢、卤素、甲基和乙基；R2和R3各自独立地是卤素；R4和R5各自独立地选自甲基和乙基；R6选自氢、卤素、甲基和乙基；R7选自氢、卤素、甲基、乙基和SO3H；且R8选自氢、卤素、甲基和乙基。在一些实施方案中，R2和R3各自是氯，且R7是SO3H。在一些实施方案中，参比染料选自：
根据不同实施方案，主要混合物可以包含缓冲剂、核苷酸的选择物、引物和至少一个蛋白部分，核苷酸的选择物例如但不限于脱氧核苷酸(dNTPS，即，dATP、dGTP、dCTP和TTP)。在不同实施方案中，主要混合物可以包含缓冲剂、核苷酸的选择物、引物、至少一个蛋白部分和参比染料，核苷酸的选择物例如但不限于dNTPS(即，dATP、dGTP、dCTP和TTP)。在不同实施方案中，主要混合物可以包含缓冲剂、核苷酸的选择物和至少一个蛋白部分，核苷酸的选择物例如但不限于，dNTPS(即，dATP、dGTP、dCTP和TTP)。在不同实施方案中，主要混合物可以包含缓冲剂、核苷酸的选择物、至少一个蛋白部分和参比染料，核苷酸的选择物例如但不限于，dNTPS(即，dATP、dGTP、dCTP和TTP)。在不同实施方案中，主要混合物可以冻干或悬浮在缓冲溶液中而被供应。
在一些实施方案中，试剂盒可以包括式(I)的参比染料。在一些实施方案中，参比染料可以是试剂盒中的主要混合物中的成分。在一些实施方案中，参比染料和主要混合物在试剂盒中的单独的容器中。在一些实施方案中，参比染料和至少一种探针中的每种可以在试剂盒中的单独的容器中。在一些实施方案中，参比染料可以在主要混合物中，且主要混合物和至少一种探针中的每种在试剂盒中的单独的容器中。在一些实施方案中，参比染料、主要混合物和至少一种探针中的每种可以在试剂盒中的单独的容器中。在一些实施方案中，参比染料和至少一种探针可以在试剂盒中的相同的容器中。在一些实施方案中，探针中的至少两种可以在相同的容器中，而参比染料在试剂盒中的单独的容器中。在不同实施方案中，试剂盒组分可以冻干或悬浮在缓冲溶液中而被供应。
附图简述
图1是根据本教导的方法的不同实施方案的PCR仪器的方框图。
图2是根据本教导的方法的不同实施方案的PCR仪器的方框图。
图3是示出可以利用在根据本教导的方法的不同实施方案的PCR装备仪器的控制器和界面中的示例性的计算机系统的部件的方框图。
图4是示出DDAO的荧光发射和激发光谱的图表，DDAO可以用作根据本教导的不同实施方案的参比染料。
图5是示出磺基-DDAO的荧光发射和激发光谱的图表，磺基-DDAO可以用作根据本教导的不同实施方案的参比染料。
图6是示出相比于两种其他染料，磺基-DDAO的作为温度的函数检测的荧光发射信号的图表。
图7是示出根据本教导的参比染料的化学稳定性的图表。
图8是四种报告染料标记的寡核苷酸和磺基-DDAO参比染料的不同混合物的阵列，它们以各种浓度被混合在一起以模拟基因分型测定信号的不同的可能的终点读数，和测试磺基-DDAO在十六种不同的模拟条件中的每种下用作参比染料的能力。
图9A和图9B示出使用来自图8的纯染料混合物产生的荧光信号强度的散布图。图9A是使用磺基-DDAO作为参比染料从报告染料和的背景反卷积的报告染料和排放物的图。图9B是使用磺基-DDAO作为参比染料从报告染料和的背景反卷积的报告染料和排放物的图。
图10A和图10B示出使用来自图8的纯染料混合物产生的荧光信号强度的散布图。图10A是使用磺基-DDAO作为参比染料从报告染料和的背景反卷积的报告染料和排放物的图。图10B示出使用ROX参比染料不能在报告染料和的背景中反卷积报告染料和排放物。
图11是示出当用作通用主要混合物中的参比染料、如通过测定活性测量的在四个星期时间内测量的、且在各种不同类型的探针的存在下时的磺基-DDAO的化学稳定性的图表。
图12示出根据本教导的不同实施方案的一组染料中的每种染料的归一化荧光发射光谱，其中该组包括作为参比染料的磺基-DDAO以及四种具有较短发射波长的报告染料。
图13示出根据本教导的不同实施方案的一组染料的归一化荧光发射光谱的图表，其中该组包括作为参比染料的磺基-DDAO以及四种具有较短发射波长的报告染料。
图14示出根据本教导的不同实施方案的一组染料的归一化荧光发射光谱的图表，其中该组包括作为参比染料的磺基-DDAO以及四种具有较短发射波长的报告染料。
图15是示出根据本教导的不同实施方案的一组六种染料中的每种染料的归一化荧光发射光谱的图表，其中该组包括作为参比染料的磺基-DDAO以及五种具有较短发射波长的报告染料。
图16是示出根据本教导的不同实施方案的一组七种染料中的每种染料的归一化荧光发射光谱的图表，其中该组包括作为参比染料的磺基-DDAO以及六种具有较短发射波长的报告染料。
图17是示出磺基-DDAO在四个报告Duplex SNP基因分型实验中作为参比染料的最佳使用的阵列，其中约98％的反应组产生良好的基因分型结果。
详细描述
根据本教导的方法和组合物的不同实施方案，提供了参比染料，其中参比染料具有式(I)：
其中：
R1至R3和R6至R8中的每个独立地是-H、卤素、-CO2H、-CO2R、-SO3H、-SO3R、-CH2CO2H、-CH2CO2R、-CH2SO3H、-CH2SO3R、-CH2NH2、-CH2NHR、-NO2、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、和取代的C1-C6烷氧基，其中R是C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、和取代的C1-C6烷氧基；
单独使用的R4和R5独立地选自C1-C6烷基和C1-C6取代的烷基，或合在一起的R4和R5是C3-C7环烷基、C4-C7不饱和的环烷基、C3-C7取代的环烷基、或C4-C7取代的不饱和的环烷基。
如本文使用的，"取代的"是指其中一个或多个氢原子被一个或多个非氢原子、官能基团或部分取代的分子。例如，未被取代的胺是-NH2，而非限制性的示例性的取代的胺包括(但不限于)-NHCH3和-N(CH2CH3)2。同样地，示例性的未被取代的烷基是-CH2CH3，而非限制性的示例性的相应的取代的烷基包括(但不限于)-CH2CH2COOH、-CH(NH3)CH3、和-CH＝CHCOOCH3。示例性的取代基包括(但不限于)卤素、氟、氯、溴、C1-C6烷基、C1-C6环烷基、C1-C6支链烷基、C1-C6烯烃、C1-C6环状烯烃、C1-C6支链烯烃、C1-C6炔烃、C1-C6支链炔烃、羧基、酯、硫酸酯、磺酸酯、砜、氨基、铵、酰氨基、腈、C1-C6烷氧基、苯氧基、取代的苯氧基芳香化合物、苯基、多环芳香化合物、和富电子杂环。
在一些实施方案中，R1是氢、卤素、甲基、或乙基。在一些实施方案中，R2和R3各自独立地是卤素。在一些实施方案中，R4和R5各自独立地是甲基或乙基。在一些实施方案中，R6是氢、卤素、甲基、或乙基。在一些实施方案中，R7是氢、卤素、甲基、乙基、或SO3H。在一些实施方案中，R8是氢、卤素、甲基、或乙基。在一些实施方案中，R1是氢、卤素、甲基、或乙基；R2和R3各自独立地是卤素；R4和R5各自独立地是甲基或乙基；R6是氢、卤素、甲基、或乙基；R7是氢、卤素、甲基、乙基、或SO3H；且R8是氢、卤素、甲基、或乙基。在一些这样的实施方案中，R2和R3各自是氯，且R7是SO3H。
在一些实施方案中，参比染料是7-羟基-9H-1,3-二氯代-9,9-二甲基吖啶-2-酮(DDAO)的同源物。示例性的参比染料包括(但不限于)：
1,3-二氯代-7-羟基-9,9-二甲基吖啶-2(9H)-酮(DDAO)，和
6,8-二氯代-2-羟基-9,9-二甲基-7-氧代-7,9-二氢吖啶-3-磺酸(磺基-DDAO)。
可用作本教导的各种方法和组合物中的荧光参比染料的式(I)的参比染料的一些属性可以包括(但不限于)高的化学和光化学稳定性、在宽的温度范围内相对恒定的荧光发射、高的水溶解度、宽的吸附光谱、和在光谱上与测定中使用的报告染料可区别开的尖锐的发射光谱。此外，式(I)的参比染料的属性可以包括不干扰正在进行的测定，例如利用聚合酶链反应(PCR)的各种测定中的任何及其变化形式。可以干扰测定的染料可以通过(例如)抑制反应而直接干扰来这样做，或可以通过(例如)与探针染料相互作用而干扰。
本教导的参比染料可以用于需要参比染料的任何方法中。可以使用参比染料的示例性方法包括(但不限于)包括多核苷酸检测的方法、包括多核苷酸扩增的方法、和包括使用寡核苷酸、抗体、抗原、小分子、多糖等的目标检测的方法。非限制性的示例性的目标包括(但不限于)多核苷酸、抗原、抗体、受体、细胞器、膜、代谢物、酶、细胞(例如真核细胞和原核细胞)等。非限制性的示例性的多核苷酸包括来自各种包含核酸的样品的DNA和RNA。
如本文使用的，术语"包含核酸的样品"是指根据本教导存在生物样品中的核酸。预期样品可以被侵入地或非侵入地收集。样品可以在纤维、织物、香烟、口香糖、粘合剂材料、土壤或无生命物体上、在纤维、织物、香烟、口香糖、粘合剂材料、土壤或无生命物体中、在纤维、织物、香烟、口香糖、粘合剂材料、土壤或无生命物体内、来自纤维、织物、香烟、口香糖、粘合剂材料、土壤或无生命物体或与纤维、织物、香烟、口香糖、粘合剂材料、土壤或无生命物体一起存在。如本文使用的"样品"以其最宽泛的意思被使用且是指可以从其衍生基因目标或目标多核苷酸的包含核酸的样品。样品可以包括细胞、从细胞分离的染色体(例如，中期染色体扩散)、基因组DNA、RNA、cDNA等。样品可以是：动物或植物来源的，动物或植物来源包括包含核酸的任何有机体，包括(但不限于)植物、家畜、家庭宠物、和人样品；且可以源自多种源。这些源可以包括(但不限于)全血、头发、血液、尿、组织活检、淋巴、骨、骨髓、牙齿、羊水、头发、皮肤、精液、肛门分泌物、阴道分泌物、汗、唾液、口腔拭子、各种环境样品(例如，农业、水、和土壤)、研究样品、纯化样品、和裂解细胞。应明白，包含目标多核苷酸序列的核酸样品可以通过使用本领域已知的各种样品制备程序中的任何来从样品分离，例如，包括使用诸如机械力、超声处理、限制性核酸内切酶裂解、或本领域已知的任何方法的程序。
如本文使用的术语"目标多核苷酸"、"基因目标"、"目标基因组基因座"等在本文可交换地使用且是指所关心的特定核酸序列。这样的目标可以是寻求被扩增的且可以在其他核酸分子的存在下存在或存在较大的核酸分子内的多核苷酸序列。目标多核苷酸可以从任何源获得，且可以包括许多不同的组成组分。例如，目标可以是核酸(例如DNA或RNA)。目标可以是甲基化的、非甲基化的、或两者。此外，应明白，所关心的特定核酸序列的上下文中使用的"目标"另外是指其替代品，例如扩增产品和天然序列。在一些实施方案中，所关心的特定核酸序列是源自降解源的短DNA分子，例如可以见于(例如但不限于)取证样品。本教导的所关心的特定核酸序列可以源自如上所述的许多有机体和源中的任一个。关于目标基因组基因座的倍数性状态，对于其中两个等位基因界定基因座的具有二倍体基因组的有机体，存在对于这样的二倍体状态的三种可能的基因型。本领域普通技术人员应明白，任何倍数性状态与界定基因型分类的有限数量的等位组合分离地相关联。因此，对于具有所关心的目标基因组基因座的任何样品的任何倍数性状态，存在有限数量和可计算数量的基因型。
如本文使用的，"DNA"是指如本领域理解的以其各种形式的脱氧核糖核酸，例如基因组的DNA、cDNA、分离的核酸分子、载体DNA、和染色体DNA。"核酸"是指任何形式的DNA或RNA。分离的核酸分子的实例包括(但不限于)包含在载体中的重组DNA分子、维持在异源宿主细胞中的重组DNA分子、部分地或基本上纯化的核酸分子、和合成的DNA分子。通常，"分离的"核酸不含天然上与以核酸源自其的有机体的基因组DNA的核酸侧接的序列(即，位于核酸的5'和3'端的序列)。此外，"分离的"核酸分子(例如cDNA分子)当通过重组技术产生时通常基本上不含其他细胞材料或培养介质，或当以化学方法合成时不含化学前体或其他化学品。
在本教导的方法和组合物的一些实施方案中，参比染料的峰值发射波长不会与报告染料的峰值发射波长重叠。本方法可以将式(I)的参比染料用于(例如)多重反应中。在方法和组合物的各种实施方案中，当使用在光谱上独特的染料来倍增(multiplexing)时，从用于测定的报告染料中可独立地检测到参比染料。
多重测定可以指示混合物中的至少两种目标的存在、不存在、量和同一性，且包括指示混合物中相同目标的存在、不存在、量和同一性的至少两种探针。在一些实施方案中，多重测定用于指示混合物中的至少三种、至少四种、至少五种、或至少六种目标的存在、不存在、量和同一性。在根据本教导的方法和组合物的各种实施方案中，多重测定可以样品阵列形式进行。在这样的多重方法中，多种目标可以在容纳装置的样品的单一样品区中被检测。这样的多重方法将区别于(例如)各种序列测定方法，其中在进行和检测序列测定之前多重PCR作为样品制备步骤被进行。在其中多重测定以样品阵列形式进行的本教导的方法和组合物的各种实施方案中，可以为用于这样的多重测定的多达六种或更多种报告染料提供式(I)的参比染料。
在一些实施方案中，混合物中的不同目标中的每种使用不同的报告染料来检测。在一些实施方案中，相同的报告染料用在两种或更多种不同的探针上以检测单一目标的存在。在一些实施方案中，每种报告染料和参比染料被分开检测，例如，通过以每个激发波长照射混合物和分开检测由每种报告染料和参比染料发出的辐射。在一些实施方案中，通过用多于一个激发波长同时照射和同时检测由报告染料中的多于一种和参比染料发出的辐射，或通过用被报告染料中的多于一种和参比染料吸收的单一激发波长照射，和然后同时地检测由报告染料中的多于一种和参比染料发出的辐射，来同时检测报告染料中的两种或更多种和参比染料。在一些实施方案中，报告染料中的一种或多种是荧光共振能量转移(FRET)染料。在一些这样的实施方案中，例如，当报告染料中的两种是FRET染料时，两种染料可以在相同的波长下吸收，但在不同的波长下发射。如将在随后更详细讨论的，在光谱上不同组的报告染料和根据式(I)的参比染料的选择物可以被选择用于根据本教导的方法和组合物的各种实施方案中。
如本文使用的术语"参比染料"是指式(I)的荧光染料。在一些实施方案中，参比染料被包括在混合物中且用于归一化测定和混合物中的其他染料(例如报告染料)的信号。如本领域普通技术人员将明白的，分析中存在可以影响结果的变化的许多变量。参比染料检测信号可以提供参考信号，参考信号可以用于调节报告染料检测信号以校正由实验变化(例如移液)引起的波动，波动可以造成样品浓度或体积的变化，以及系统变化，例如报告、参考和背景信号的检测不一致性的系统变化，和热不一致性的系统变化。在不同实施方案中，调节报告染料的经测量的检测信号可以包括从报告染料的经测量的检测信号除去或减去参比染料的经测量的检测信号。在不同实施方案中，调节报告染料的经测量的检测信号可以包括任何数学操作，其中参比染料的经测量的检测信号用于调节报告染料的经测量的检测信号。
在一些实施方案中，参比染料被包括在一组混合物中的每种混合物中且可以用于归一化整个混合物。例如，在一些实施方案中，参比染料可以被包括在多孔板(例如96孔板)的全部孔中且可以用于归一化孔位置对荧光信号检测的影响。在根据本教导的方法和组合物的各种实施方案中，式(I)的参比染料可以用作"自由染料"，意思是其不与另一种分子例如另一种染料或寡核苷酸共轭。
如本文使用的术语"报告染料"是指用于混合物中以指示混合物中的目标的存在、不存在、量、活性和同一性的部分。报告染料可以包括(但不限于)荧光染料和颗粒、磷光染料和颗粒、量子点、镧系元素、和化学发光体。报告染料可以是荧光共振能量转移(FRET)染料或非FRET染料。在一些实施方案中，报告染料可以连接至选自寡核苷酸、肽、抗体、小分子和多糖的部分，其中该部分对报告染料赋予特异性。在一些实施方案中，连接至赋予特异性的该部分的报告染料被称为"探针"。在一些实施方案中，报告染料指示测定中的目标分子的存在、不存在、量、活性和同一性，其中对报告染料赋予特异性的该部分对目标分子是特异性的。
如本文使用的术语"探针"是指包括目标特异性部分和至少一种报告染料的分子，其用于检测混合物中的目标的存在、不存在、量、活性和同一性。目标特异性部分可以共价地或非共价地连接到至少一种报告染料。非限制性的示例性的目标特异性部分包括寡核苷酸、肽、抗体、抗原、小分子、和多糖。在不同实施方案中，包括肽和报告染料的探针可以被称为"标记的肽"；包括抗体和报告染料的探针可以被称为"标记的抗体"；包括抗原和报告染料的探针可以被称为"标记的抗原"；包括小分子和报告染料的探针可以被称为"标记的小分子"；且包括多糖和报告染料的探针可以被称为"标记的多糖"。
如本文使用的，术语"扩增(amplifying)"、"扩增(amplification)"和相关的术语是指增加所需的核酸的量的任何过程。本教导中可以采用各种已知的扩增程序中的任一种，其包括(但不限于)PCR(参见例如，美国专利4,683,202)，包括定量和实时PCR；以及各种结扎介导的方法中的任一种，包括LDR和LCR(参见例如，美国专利第5,494,810号；第5,830,711号；和第6,054,564号)。另外的非限制性的扩增程序包括(但不限于)等温方法例如滚动圆扩增和解螺旋酶依赖性扩增。本领域技术人员将容易地明白，各种可能的扩增程序可应用在本教导的上下文中。
在一些实施方案中，探针包括寡核苷酸，且至少一种报告染料可以用于扩增反应中。在一些实施方案中，探针包括寡核苷酸、报告染料和淬灭染料。在一些这样的实施方案中，例如探针中，探针的寡核苷酸部分的降解使报告染料与淬灭染料分离且产生来自报告染料的可检测的信号。在一些实施方案中，探针包括两种杂交的寡核苷酸，其中的一种包括报告染料，且其中的另一种包括淬灭染料，使得当寡核苷酸被杂交时，报告染料信号被淬灭。在一些实施方案中，例如在杂交至探针寡核苷酸中的一种的目标的存在下，报告染料和淬灭染料被分离，使得来自报告染料的信号是可检测的。
非限制性的示例性的探针包括(但不限于)探针(参见例如，美国专利第5,538,848号)、茎环分子信标(参见例如，美国专利第6,103,476号和第5,925,517号，以及Tyagi和Kramer，1996，Nature Biotechnology 14：303-308)、无茎或线性信标(参见例如，WO 99/21881)、PNA分子信标(参见例如，美国专利第6,355,421号和第6,593,091号)、线性PNA信标(参见例如，Kubista等人，2001，SPIE4264：53-58)、非FRET探针(参见例如，美国专利第6,150,097号)、探针(参见例如，美国专利第6,548,250号)、茎环和双重ScorpionTM探针(参见例如，Solinas等人，2001，Nucleic Acids Research29：E96和美国专利第6,589,743号)、凸环探针(参见例如，美国专利第6,590,091号)、伪结探针(参见例如，美国专利第6,589,250号)、cyclicons(参见例如，美国专利第6,383,752号)、MGB EclipseTM探针(Epoch Biosciences)、发夹探针(参见例如，美国专利第6,596,490号)、肽核酸(PNA)点火探针、半组装的纳米微粒探针、和二茂铁改性的探针。参见例如，美国专利第6,485,901号；Mhlanga等人，2001,Methods 25：463-471；Whitcombe等人，1999，Nature Biotechnology.17：804-807；Isacsson等人，2000,Molecular Cell Probes.14：321-328；Svanvik等人，2000，Anal Biochem.281：26-35；Wolffs等人，2001，Biotechniques766：769-771；Tsourkas等人，2002,Nucleic Acids Research.30：4208-4215；Riccelli等人，2002,Nucleic Acids Research30：4088-4093；Zhang等人，2002Shanghai.34：329-332；Maxwell等人，2002，J.Am.Chem.Soc.124：9606-9612；Broude等人，2002，TrendsBiotechnol.20：249-56；Huang等人，2002，Chem Res.Toxicol.15：118-126；和Yu等人，2001，J.Am.Chem.Soc 14：11155-11161。在一些实施方案中，探针包括黑洞猝灭剂(Biosearch)、Iowa Black(IDT)、QSY猝灭剂(Molecular Probes)、以及Dabsyl和Dabcel磺酸酯/羧酸酯猝灭剂以及Epoch猝灭剂。标记探针还可以包括两种探针，其中例如荧光团是在一种探针上，且猝灭剂在另一种探针上，其中两种探针在目标上一起杂交使信号猝灭，或其中在目标上杂交经由荧光的变化而改变信号特征。标记探针还可以包括荧光素染料与磺酸基而不是羧酸酯基的磺酸酯衍生物、荧光素的亚磷酰胺形式、CY 5的亚磷酰胺形式(例如从Amersham可得到)。在一些实施方案中，使用相互螯合标记物，例如溴化乙锭、Green I(Molecular Probes)、和(Molecular Probes)，由此允许在没有标记探针的情况下扩增产物的实时或终点的可视化。
在一些实施方案中，包括寡核苷酸和报告染料的探针可以被称为"标记的寡核苷酸"。此外，标记的寡核苷酸的寡核苷酸部分可以具有任何长度，例如至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少12、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少120、至少150、至少200等核苷酸长度。标记的寡核苷酸的寡核苷酸部分可以包括脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、肽核酸(PNA)、前述的任一种的衍生物、和前述的任一种的组合。与寡核苷酸的组成无关，等效于DNA或RNA碱基的寡核苷酸的每个单位被称为"核苷酸"。
根据本教导的方法和组合物的不同实施方案，在光谱上可区别的一组报告染料和根据式(1)的参比染料可以用于各种测定中，例如(但不限于)各种扩增测定，其中可以利用热循环仪器。
根据如图1所示的热循环仪器100的不同实施方案，热循环仪器可以包括放置在容纳在样品支撑装置中的多个样品112上的加热盖110。样品支撑装置的一些实例可以包括(但不限于)管、小瓶、和允许选择样品容量的多孔板，例如标准微孔板96孔、384孔板。在不同实施方案中，样品支撑装置可以是能够每分析处理数千样品的微量装置，例如各种微流体装置、微缩卡装置和微芯片装置。在不同实施方案中，样品支撑装置可以由具有多个样品区域的基本上平面的支撑物(例如玻璃、金属或塑料载玻片)制造。样品支撑装置的各种实施方案中的样品区域可以包括通孔、凹陷、压痕、和脊及其组合，它们在基材的表面上形成的规则的或不规则的阵列的图案。在不同实施方案中，样品支撑装置可以具有在样品区域和加热盖110之间的覆盖物。样品支撑装置可以具有以样品阵列形式布置的样品区域。本领域普通技术人员将认识到，样品支撑装置的许多实例是以行和列阵列图案的。根据本教导的样品阵列形式可以包括方便的任何图案和样品支撑装置中的样品区域的可寻址的布置，包括样品支撑装置中的单一行或列的样品区域。
在热循环仪器100的各种实施方案中，包括样品块114、用于加热和冷却的一个或多个元件116、和热交换器118。根据本教导的热块总成的各种实施方案包括图1的热循环仪系统100的部件114-118。
在图2中，热循环系统200的各种实施方案具有热循环仪器100的实施方案的部件，且另外具有检测系统，检测系统包括成像仪210和光学器件212。应注意，尽管热循环仪系统200配置成在分析期间检测来自样品支撑装置中的样品的信号，但根据本教导的检测系统可以用于在已经完成分析之后检测来自热循环仪系统100的信号。
检测系统可以具有发射电磁能的电磁辐射源、和用于接收来自样品支撑装置中的样品216的电磁能的检测器或成像仪210。能够检测来自样品216的电磁能的检测器或成像仪210，可以是电荷耦合装置(CCD)、背面薄冷CCD、前侧发光CCD、CCD阵列、光电二极管、光电二极管阵列、光电倍增管(PMT)、PMT阵列、互补金属氧化物半导体(CMOS)传感器、CMOS阵列、电荷注入装置(CID)、CID阵列等。检测器可以适合于将信息传送至用于存储、关联和操纵数据的数据收集装置，例如，计算机或其他信号处理系统。另外，检测系统的光学器件212可以包括(例如)但不限于以下的部件：各种正透镜和负透镜、镜子、以及激发和发射滤波器。
关于检测系统的电磁辐射源的各种实施方案，这样的源可以包括(但不限于)白光、卤素灯、激光器、固态激光器、激光二极管、微丝激光器、二极管固态激光器(DSSL)、垂直腔表面发射激光器(VCSEL)、LED、磷包覆的LED、有机LED(OLED)、薄膜电致发光器件(TFELD)、磷光OLED(PHOLED)、无机-有机LED、使用量子点技术的LED、LED阵列、LED总体(ensemble of LED)、使用LED的泛光灯系统、和白色LED、白炽灯、弧光灯、气灯、以及荧光管。光源可以具有高的辐射率，例如激光器，或低的辐射率，例如LED。上述不同类型的LED可以具有中到高的辐射率。
多个激发和发射滤波器组可以采用在现有的热循环装置中，其中每个滤波器组可以包括预选择的激发和发射滤波器以在PCR的不同阶段提供与样品中的寡核苷酸浓度成比例的信号的准确响应。耦合组的滤波器中的激发滤波器可以被选择为允许从光源接收的与预定染料的峰值激发波长接近的光波长穿过。激发滤波器还可以配置成阻断大于和小于峰值激发波长的光波长。同样地，该组滤波器中的发射滤波器可以被选择为允许接近峰值发射波长的光穿过同时还阻断在峰值发射波长之外的波长。以这样的方式且如随后更详细讨论的，在光谱上可区别的染料物质的选择物连同检测系统、和热循环设备的数据处理能力可以提供用于在(例如)多重测定中检测多个染料信号。
在使用中，与热循环装置一起使用的检测系统可以通过将来自电磁辐射源的激发束碰撞在样品支撑装置中的样品上，由此产生来自多个样品116、216的荧光辐射而起作用。从样品112、216发出的光可以透射通过一个或多个透镜，例如井镜、菲涅耳透镜、或场镜，且然后可以被导向至另外的光学部件，例如分色镜和发射滤波器。从样品112、216发出的不希望的光波长可以被分色镜反射或被发射滤波器阻断。透射通过分色镜和发射滤波器的发出的光的一部分可以被检测器或成像仪210接收。对于热循环仪系统100，检测器或成像仪可以在PCR测定完成时从来自样品的荧光辐射产生数据信号。对于热循环仪系统200，检测器或成像仪210可以随着时间从来自样品的荧光辐射产生数据信号，由此可以确定在PCR的特定阶段中的在样品中的目标DNA的浓度。
对于热循环仪器100和200的实施方案，控制系统120和224分别可以用于控制检测、加热盖和热块总成的功能。控制系统可以通过热循环仪器100的用户界面122和热循环仪器200的224为最终用户访问。如图3所描绘的计算机系统300可以用来提供对热循环仪器的功能以及用户界面功能的控制。另外，计算机系统300可以提供数据处理，以及与其他部件一起提供显示和报告准备功能。例如，被检测器或成像仪接收的信号可以通过各种算法例如光谱反卷积算法来处理，其然后可以向最终用户显示，以及提供报告。所有的这样的仪器控制功能可以局部上专门用于热循环仪器，或计算机系统300可以提供控制、分析和报告功能的一部分或全部的远程控制，如随后更详细讨论的。
图3是示出根据不同实施方案的计算机系统300的方框图，可以在计算机系统300上使用图1的热循环仪系统100或图2的热循环仪系统200的实施方案。计算机系统300包括总线302或用于传输信息的其他通信机构，以及与总线302耦合的用于处理信息的处理器304。计算机系统300还包括耦合于总线302的用于由处理器304执行的指令的存储器306，存储器306可以是随机存取存储器(RAM)或动态存储装置。存储器306还可以用于在执行由处理器304执行的指令期间存储临时变量或其他中间信息。计算机系统300还包括耦合于总线302的用于为处理器304存储静态信息和指令的只读存储器(ROM)308或其他静态存储装置。提供存储装置310例如磁盘或光盘，且其耦合于总线302，用于存储信息和指令。
计算机系统300可以经由总线302耦合到显示器312，例如阴极射线管(CRT)或液晶显示器(LCD)，用于把信息显示给计算机用户。包括字母数字键和其他键的输入装置314耦合于总线302，用于把信息和指令选择传输给处理器304。另一个类型的用户输入装置是光标控制器316，例如用于把方向信息和指令选择传输给处理器304且用于控制显示器312上的光标运动的鼠标、跟踪球或光标方向键。该输入装置通常具有两个轴即第一轴(例如，x)和第二轴(例如，y)上的两个自由度，这允许该装置在平面内的指定位置。计算机系统300提供数据处理并提供此类数据的置信度水平。与本教导的某些实施一致，由计算机系统300响应于执行存储器306中包含的一个或多个指令的一个或多个序列的处理器304提供数据处理和置信度值。可以把此类指令从另一个计算机可读的介质例如储存装置310读取到存储器306。存储器306中包含的指令序列的执行引起处理器304进行本文所描述的工艺状态。可选择地，硬布线电路可以用来代替软件指令或者与软件组合，以便实施本教导的方法和组合的各种实施方案。因此本教导的实现不限于硬件电路和软件的任何具体组合。
如本文使用的术语“计算机可读的介质”是指参与把指令提供给处理器304以供执行的任何介质。这样的介质可以采取多种形式，包括但不限于非易失性介质、易失性介质和传输介质。非易失性介质包括(例如)光盘或磁盘，例如储存装置310。易失性介质包括动态存储器，例如存储器306。传输介质包括同轴电缆、铜线和光纤，包括构成总线302的线。传输介质还可以采用例如在无线电波和红外数据通信器件发生的声波或广播的形式。计算机可读介质的常见形式包括(例如)软盘、柔性盘、硬盘、磁带或任何其他磁介质、CD-ROM、何其他光学介质、穿孔卡、纸带、带有孔的图案的任何其他物理介质、RAM、PROM和EPROM、闪速EPROM、任何其他存储器芯片或盒、本文后面描述的载波、或计算机可以从中读取的任何其他介质。
此外，应明白，图3的计算机300可以多种形式中的任一种来实现，例如机架式计算机、台式计算机、膝上型计算机、或平板计算机。根据图3的计算机300的不同实施方案，计算机可以被嵌入到通常不被认为是计算机但具有合适的处理能力的任何数量的移动且基于网络的装置。此类装置的实例可以包括(但不限于)个人数字助理(PDA)、智能电话和笔记本或任何其他合适的电子装置。另外，计算机系统可以包括常规网络系统，该常规网络系统包括客户机/服务器环境和一个或多个数据库服务器。本领域中已知包括局域网(LAN)或广域网(WAN)且包括无线部分和有线部分的多种常规网络系统。另外，客户机/服务器环境、数据库服务器和网络在本领域中是广泛记载的。
如先前所讨论的，选自由下面的式(I)表示的染料的家族的成员的参比染料具有使它们成为可用作参比染料的候选物的许多所需属性：
其中：
R1至R3和R6至R8中的每个独立地是-H、卤素、-CO2H、-CO2R、-SO3H、-SO3R、-CH2CO2H、-CH2CO2R、-CH2SO3H、-CH2SO3R、-CH2NH2、-CH2NHR、-NO2、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、和取代的C1-C6烷氧基，其中R是C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、和取代的C1-C6烷氧基；
单独使用的R4和R5独立地选自C1-C6烷基和C1-C6取代的烷基，或合在一起的R4和R5是C3-C7环烷基、C4-C7不饱和的环烷基、C3-C7取代的环烷基、或C4-C7取代的不饱和的环烷基。
在一些实施方案中，参比染料是7-羟基-9H-1,3-二氯代-9,9-二甲基吖啶-2-酮(DDAO)的同源物。示例性的参比染料包括(但不限于)：
1,3-二氯代-7-羟基-9,9-二甲基吖啶-2(9H)-酮(DDAO)，和
6,8-二氯代-2-羟基-9,9-二甲基-7-氧代-7,9-二氢吖啶-3-磺酸(磺基-DDAO)。
例如，图4和图5分别示出DDAO和磺基-DDAO的归一化发射和激发光谱。光谱通过在绘图之前设置每个光谱的以100单位的最大值而被归一化。尽管分别在图4和图5中例示DDAO和磺基-DDAO，但应理解，式(I)的参比染料中的任一种可以用于本方法中，包括(例如)DDAO的其他同源物。如图4和图5所示的，DDAO和磺基-DDAO的激发和发射光谱示出参比染料吸收非常长的波长，且峰值吸收在约640nm。在该点上，DDAO和磺基-DDAO还以非常长的波长发射，且峰值发射在约650至660nm。在该点上，DDAO和其同源物例如磺基-DDAO违反镜像规则，且在激发和发射光谱中具有独特的特征。因为激发光谱是宽的且发射光谱是紧凑的，DDAO和其同源物(例如诸如式(I)的化合物)适合于在例如以较短的波长吸收和发射的报告染料的存在下用作具有宽范围的激发源波长的参比染料。此外，当式(I)的染料用作参比染料时，DDAO的同源物具有允许所关心的报告染料的选择更宽以在光谱上被分辨的发射带。
此外，如随后更详细讨论的，式(I)的化合物具有高的水溶解度，容易地允许在水基溶液和试剂中的一系列浓度。另外，式(I)的化合物具有高的化学稳定性和光化学稳定性、在宽范围的温度下的稳定的荧光发射，且不会干扰各种生物化学测定，例如PCR。因此，式(I)的化合物特别充分适合用作生物分析中的参比染料。
图6描绘相比于报告染料6-FAM以及参比染料ROX，磺基-DDAO的作为温度的函数的归一化荧光发射的图表。给定示出的染料的亮度的差异，每个曲线的每个数据点使用从该数据集的94℃数据点取得的内部参考点来调节。在该点上，荧光信号被归一化以产生在94C下的相等强度，使得可以容易地比较它们随着温度的相对变化。如可以从数据看出的，对于磺基-DDAO，在整个宽范围的温度下荧光发射是相当稳定的。该属性在(例如)染料校准可以在与运行温度不同的温度下进行时可以是有用的，或可以用于归一化如先前所讨论的实验波动。
关于化学稳定性，DDAO同源物似乎在各种条件(例如氧化、光降解等)具有恢复力。例如，关于对苛刻氧化的恢复力，DDAO、磺基-DDAO和ROX各自作为自由染料以约1μM的浓度悬浮于1：4的Tris-EDTA缓冲剂(1X储备浓度)在MeOH中的溶液中。将5μl的在乙腈中的0.5M过氧化苯甲酰加入到荧光计比色皿中的1ml染料组合物中。立即和然后以5分钟间隔测量在每种染料的发射最大值下的荧光发射强度。将一阶指数曲线拟合成数据以计算每种染料的衰变率。图7是示出该实验的结果的图表。如该图所示的，相比于ROX，DDAO和磺基-DDAO两者示出对氧化的恢复力。因而，式(I)的参比染料可以用于其中测定组分可能与氧化剂接触的测定中。
图8中示出的阵列用于测试磺基-DDAO是否可以作为参比染料用于基因分型测定而不会干扰多重测定(在该实例中为双重测定)的所有的可能的基因分型信号的光谱分离。四种报告染料(即，FAM、VIC、TED和SID)用于具有作为参比染料的磺基-DDAO的各种混合物中。虽然没有样品用于测定中，但报告染料的浓度被控制为模拟基因分型信号的16种不同的组合，如将由热循环设备收集、处理和显示的。对于其中特定的报告染料用作背景的混合物，当与磺基-DDAO参比染料组合时报告染料以低的水平用作非猝灭染料，以模拟未分开的探针信号。对于其中报告染料用于产生信号(SIGNAL)的混合物，浓度10倍高于当用作背景时的浓度，以模拟分开的探针信号。信号(SIGNAL)浓度意为模拟特异性基因型的阳性测试。
图9A和图9B中以散布图示出由从图8示出的各种混合物产生的反卷积信号生成的数据。数据示出所有混合物的良好的光谱分离，且由簇表示的每个正信号的充分分辨的信号在左上部和右下部，且表示非模板对照(NTC)的负背景信号在左下部簇。在每个反应孔中，模拟的基因型可以准确地要求FAM/VIC基因分型对和要求TED/SID基因分型对，当它们一起用于使用磺基-DDAO作为钝态参考的同一测定中时。同样地，图8的阵列中概述的实验使用另一种参比染料ROX来进行。图10B示出在TED/SID背景信号的存在下(类似于图10A)，但使用ROX钝态参考对FAM/VIC基因分型检测的信号。观察到差的光谱分离，导致假阳性信号。与图10B相比，图9A和图9B表明适当的参比染料的选择的影响；特别地是比在使用单一探针的测定中反应阵列更复杂的多重测定中。应特别地注意，磺基-DDAO发射的红移位置使得能够选择四种在光谱上分离的报告染料；提供了一组五种在光谱上不同的染料。
另外，各种物理-化学力(例如但不限于，Lifschitz-范德华力、伦敦分散力、氢力和离子力)可以用来促进染料-染料相互作用，例如环堆叠。对于各种测定(例如基于PCR和相关反应的各种测定)，这样的染料-染料相互作用可以产生不适当的结果。模型研究中产生的数据另外表明DDAO同源物不会促进与各种报告染料的不适当的相互作用。
如本领域普通技术人员明白的，主要混合物是可以包含除了样品之外扩增反应所需要的几乎所有成分的组合物。主要混合物的使用在样品支撑装置的多个样品区域上进行多个扩增反应方面提供了效率和一致性两者。在不同实施方案中，主要混合物可以包含缓冲剂、核苷酸的选择物、引物和至少一个蛋白部分，核苷酸的选择物例如(但不限于)脱氧核苷酸(dNTPS，即，dATP、dGTP、dCTP和TTP)。在不同实施方案中，主要混合物可以包含缓冲剂、核苷酸的选择物、引物、至少一个蛋白部分和参比染料，核苷酸的选择物例如(但不限于)dNTPS(即，dATP、dGTP、dCTP和TTP)。在不同实施方案中，主要混合物可以包含缓冲剂、核苷酸的选择物和至少一个蛋白部分，核苷酸的选择物例如(但不限于)dNTPS(即，dATP、dGTP、dCTP和TTP)。在不同实施方案中，主要混合物可以包含缓冲剂、核苷酸的选择物、至少一个蛋白部分和参比染料，核苷酸的选择物例如(但不限于)dNTPS(即，dATP、dGTP、dCTP和TTP)。在不同实施方案中，主要混合物可以冻干或悬浮在缓冲溶液中而被供应。
根据主要混合物的不同实施方案，缓冲剂可以选自(例如但不限于)tris以及各种Good的缓冲剂，例如，tricene、bicene、HEPES和MOPS。在不同实施方案中，缓冲剂还可以包含必需的非缓冲成分，例如各种盐、表面活性剂以及其他。必需的非缓冲成分的实例可以包括(但不限于)钠、钾、锂、镁和锰的氯盐，以及表面活性剂，例如(但不限于)聚山梨醇酯表面活性剂(例如吐温20和吐温80)、聚氧乙烯表面活性剂(例如Brij 56和Brij 58)、聚乙氧基化苯酚表面活性剂(例如NP-40和Triton X100)和两性离子表面活性剂(例如CHAPS、CHAPSO、Big-CHAP)。另外的缓冲剂成分可以包括(例如但不限于)甘油、乙二醇、丙二醇、和各种分子重量的聚乙二醇。根据主要混合物的不同实施方案，核苷酸可以选自(例如但不限于)dNTP(即，dATP、dGTP、dCTP和TTP)、二脱氧核苷酸(didNTP)、去氮-GTP、去氮-dGTP和2'-脱氧肌苷5'-三磷酸盐(dITP)。对于主要混合物的各种实施方案，蛋白部分可以选自(例如但不限于)DNA聚合酶、连接酶、逆转录酶、核糖核酸酶(例如RNase H)、糖基化酶(例如尿嘧啶-N-糖基化酶)、单链结合蛋白(例如GP32)、焦磷酸酶(例如来自嗜酸热原体(Thermoplasma acidophilum))、白蛋白和明胶。
图11描绘在主要混合物中且用各种另外的添加剂温育的磺基-DDAO的稳定性。将磺基-DDAO在Universal PCR Master Mix中在室温下温育1天、1个星期、2个星期或4个星期。在每个指定的时间点，加入固定量的各种不同的目标多核苷酸和各种染料标记的探针。使用磺基-DDAO作为参比染料，将目标/探针混合物在96孔板中PCR扩增，且在每个扩增循环之后记录信号以产生扩增曲线，从扩增曲线确定每个目标/探针混合物的Ct值。图11是示出该实验的结果的图表，将Ct值对每个时间点绘图。磺基-DDAO信号在室温下在Universal PCR Master Mix中稳定多达4个星期，如使用磺基-DDAO作为参比染料由在不同的温育时间下对不同目标/探针混合物获得的一致的Ct值所证明的。此外，磺基-DDAO不会干扰各种目标多核苷酸的扩增。
可以在不同实施方案中用于本方法和试剂盒中的非限制性的示例性的报告染料包括在(例如)以下中所描述的那些中的任一种：Menchen等人，美国专利第5,188,934号；Benson等人，美国专利第6,020,481号；Lee等人，美国专利第5,847,162号；Benson等人，美国专利第6,008,379号；Benson等人，美国专利第5,936,087号；Upadhya等人，美国专利第6,221,604号；Lee等人，美国专利第6,191,278号；Yan等人，美国专利第6,140,500号；Mao等人，美国专利第6,130,101号；Glazer等人，美国专利第5,853,992号；Brush等人，美国专利第5,986,086号；Hamilton等人，美国专利第6,140,494号；Hermann等人，美国专利第5,750,409号；Haugland等人，美国专利第5,248,782号；和Karolin等人，JACS 116：7801-6(1994)，它们中的每个通过引用以其整体关于荧光染料结构、荧光染料合成、荧光染料与生物聚合物共轭、荧光染料在能量转移染料中的应用和荧光染料光谱性质被并入。
示例性的报告染料还包括(但不限于)荧光素染料例如5-羧基荧光素和6-羧基荧光素(5-FAM和6-FAM)、5-羧基-2',4',5',7',-4,7-六氯荧光素和6-羧基-2',4',5',7',-4,7-六氯荧光素和)、5-羧基-2',4',5',7'-四氯荧光素和6-羧基-2',4',5',7'-四氯荧光素和)、1',2'-苯并-4'-氟代-7',4,7-三氯代-6-羧基-荧光素、1',2',7',8'-二苯并-4,7-二氯代-5-羧基荧光素。示例性的报告染料还包括(但不限于)若丹明染料例如若丹明绿(若丹明R110)、5-羧基若丹明、6-羧基若丹明、N,N'-二乙基-2',7'-二甲基-5-羧基-若丹明(5-R6G)、N,N'-二乙基-2',7'-二甲基-6-羧基若丹明(6-R6G)、N,N,N',N'-四甲基-5-羧基若丹明(5-TAMRA)、N,N,N',N'-四甲基-6-羧基若丹明(6-TAMRA)、5-羧基-X-若丹明(5-ROX)和6-羧基-X-若丹明(6-ROX)。示例性的报告染料包括(但不限于)Alexa染料例如Alexa488、Alexa514、Alexa555、Alexa568、Alexa594和Alexa610。示例性的报告染料包括(但不限于)BODIPY染料例如BODIPY FI、BODIPY R6G和BODIPY TMR。示例性的报告染料还包括(但不限于)量子点、荧光球(FluoroSphere)和荧光微球。
表1中示出某些非限制的示例性的报告染料。
表1
如本领域技术人员将明白，一组染料可以配置成包括根据本教导的钝态参比染料和表1中列出的作为报告染料的许多染料中的一种或多种，以实现各自独立地在光谱上与该组的其他染料可区别的多种染料。本领域技术人员可以根据意图的应用来选择合适的一组报告染料和至少一种式(I)的参比染料。选择的报告染料中的一种或多种可以来自本文所讨论的列表和专利，或可以是本领域已知的任何其他报告染料。在一些实施方案中，选择在光谱上可区别的一组报告染料。在一些实施方案中，测定中的每种染料的峰值发射波长可以距测定中的其他染料中的任何的峰值发射波长至少5nm、至少10nm、至少15nm、至少20nm或至少30nm。如先前所讨论，染料的光谱分离，连同检测系统和允许数据处理的计算装置的各种实施方案可以一起提供各种分析，例如倍增。
根据本教导的方法和组合物的各种实施方案包括测量由参比染料发出的荧光。在一些实施方案中，方法包括测量由至少一种报告染料发出的荧光。在一些这样的实施方案中，荧光可以在适合于其荧光被测量的染料的激发条件下被发出。在一些实施方案中，方法还包括基于由参比染料发出的经测量的荧光，归一化由至少一种报告染料发出的经测量的荧光，以形成归一化测量结果。然后，每种报告染料的归一化测量结果可以与反应中的一种或多种其他报告染料的归一化测量结果进行比较。此外，在一些实施方案中，归一化测量结果中的一个或多个可以被打印出、显示、存储、或以其他方式操纵。
在一些实施方案中，用于测定的反应混合物可以包括各自在光谱上彼此分离的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、或至少六种不同的报告染料，以及参比染料。在一些实施方案中，反应混合物可以包括至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、或至少六种不同的探针。在不同实施方案中，混合物包括一种至六种、一种至五种、一种至四种、两种至六种、两种至五种、两种至四种、三种至六种、三种至五种、或三种至四种不同的探针。在一些实施方案中，探针是标记的寡核苷酸。在一些实施方案中，探针是标记的肽、标记的抗体、标记的抗原、标记的小分子或标记的多糖。
在一些实施方案中，方法包括用第一激发波长照射混合物和检测从至少第一报告染料发射的光。在一些实施方案中，方法包括用第二激发波长照射混合物和检测从至少第二报告染料发射的光。在一些实施方案中，第二激发波长不同于第一激发波长。在一些实施方案中，不同的激发波长用于混合物中的每种不同的报告染料，和用于参比染料。在一些实施方案中，相同的激发波长可以用于混合物中的多于一种报告染料和参比染料，但混合物中的多于一种报告染料和参比染料中的每种可以通过它们的发射来区别。即，在一些实施方案中，多种激发波长可以在相同的时间同时地用于激发多于一种报告染料和参比染料。此外，在一些实施方案中，在激发之后，尽管混合物中的多于一种报告染料的发射光谱可能重叠，但对于每种染料，存在至少一个波长，在该波长下染料是主要的发射体且因此该染料在光谱上是不同的，且可以在至少该波长下与其他染料分离分开地检测。
在一些实施方案中，一个或多个激发波长可以从电磁辐射源产生。在一些实施方案中，这样的电磁辐射源可以用于激发一种或多种报告染料和参比染料。在一些实施方案中，方法包括致动宽波长发射源和用光谱方法从光源分离激发束以形成至少两个不同的相应的激发波长范围的至少两个激发源。在一些实施方案中，对于两种或更多种染料的同时激发，方法可以包括同时形成至少两个不同的、非重叠的激发波长范围。
在一些实施方案中，每种染料可以在激发之后发射在例如具有集中在染料的峰值发射波长的约10nm的宽度的相应的峰值发射波长范围内的光。在一些实施方案中，每种染料发射在具有集中在染料的峰值发射波长的约5nm-30nm的范围内的宽度的相应的峰值发射波长范围内的光。在一些实施方案中，染料可以被选择为使得每种染料的相应的峰值发射波长不会与混合物中的其他染料中的任何的峰值发射波长重叠。在一些实施方案中，染料可以被选择为使得每种染料的相应的发射衰变率不同于混合物中的其他染料中的任一种。在一些实施方案中，为了区别参比染料的发射与报告染料的发射，由参比染料产生的荧光可以使用第一光学滤波器来过滤，且由至少一种报告染料产生的荧光可以使用在通带方面不同于第一光学滤波器的第二光学滤波器来过滤。在一些实施方案中，第一光学滤波器和第二光学滤波器可以共同包括单一滤波器。
可以与式(I)的参比染料一起使用的示例性组的在光谱上可区别的报告染料包括(但不限于)6-FAMTM、和 和Dye 3.5；6-FAM、 Dye 3.5和和6-FAMTM、和在一些实施方案中，多种染料中的每种染料可以在激发之后发射在相应的峰值发射波长范围内的辐射。染料可以被选择为使得它们在光谱上被区别，以便每种染料的相应的峰值发射波长范围不会与多种染料中的其他染料中的任一种的峰值发射波长范围重叠。在一些实施方案中，报告染料中的一种或多种的峰值发射波长短于参比染料的峰值发射波长。在一些实施方案中，报告染料中的一种或多种的峰值发射波长长于参比染料的峰值发射波长。为了阐明的目的，图12-16中给出非限制性的实例。
图12示出非限制性的示例性组的四种报告染料以及作为参比染料的磺基-DDAO中的每种染料的示例性的归一化发射光谱。四种报告染料是6-FAMTM、和它们分别具有518、552、573和595nm的峰值发射。每种染料与寡核苷酸共轭，且以在Tris-EDTA缓冲剂中的1μM(1X储备浓度)采集光谱。参比染料是磺基-DDAO且不与寡核苷酸共轭。图12示出可以在合适组的报告染料和参比染料之间实现的示例性的峰值发射分离。其他组的报告染料可以从本文描述的和本领域已知的许多可能性中选择。
图13示出根据本教导的不同实施方案的一组染料中的每种染料的归一化发射强度，其中该组包括作为钝态参比染料的磺基-DDAO和具有较短的发射波长的四种报告染料。四种报告染料是6-FAMTM、和它们分别具有518、552、583和618nm的峰值发射。每种染料与寡核苷酸共轭，且以在Tris-EDTA缓冲剂中的1μM(1X储备浓度)采集光谱。参比染料是磺基-DDAO，是自由染料且不与寡核苷酸共轭。图13示出可以在合适组的报告染料和参比染料之间实现的示例性的峰值发射分离。同样地，图14示出根据本教导的不同实施方案的一组染料的归一化发射强度的图表，其中该组包括作为钝态参比染料的磺基-DDAO和具有较短波长的四种报告染料。示出的四种寡核苷酸结合的报告染料是6-FAMTM、 和它们分别具有518、552、583和618nm的峰值发射。其他组的报告染料可以从本文描述的和本领域已知的许多可能性中选择。
图15是显示根据本教导的不同实施方案的一组六种染料中的每种染料的归一化发射强度的图表，其中该组包括作为钝态参比染料的磺基-DDAO和具有较短波长的五种报告染料。在不同实施方案中，且如图12-14所示的，报告染料可以被选择为使得该组在光谱上是不同的且关于检测，容易地与该组的其他染料分辨开来。示出的五种报告染料是6-FAMTM、Dye 3.5和它们分别具有518、552、583、603和618nm的峰值发射。每种染料与寡核苷酸共轭，且以在Tris-EDTA缓冲剂中的1μM(1X储备浓度)采集光谱。参比染料是磺基-DDAO，是自由染料且不与寡核苷酸共轭。其他组的报告染料可以从本文描述的和本领域已知的许多可能性中选择。
图16是显示根据本教导的不同实施方案的一组七种染料中的每种染料的归一化发射强度的图表，其中该组包括作为钝态参比染料的磺基-DDAO和具有较短波长的六种活性染料。报告染料可以被选择为使得该组在光谱上是不同的且关于检测，容易地与该组的其他染料分辨开来。示出的六种报告染料是6-FAMTM、Dye 3.5和它们分别具有518、538、553、583、603和618nm的峰值发射。每种染料与寡核苷酸共轭，且以在Tris-EDTA缓冲剂中的1μM(1X储备浓度)采集光谱。参比染料是磺基-DDAO，是自由染料且不与寡核苷酸共轭。其他组的报告染料可以从本文描述的和本领域已知的许多可能性中选择。
图17是显示在四种报告子Duplex实验中使用磺基-DDAO作为参比染料在玉米中的12种不同基因座的SNP基因分型的结果的阵列。每个基因座的两种等位基因特异性探针用FAMTM和(a)或和(b)标记且一起被测定。将基因组DNA和四种探针悬浮在96孔板中的多重PCR主要混合物中并经历40次PCR循环，然后测量每个孔中的终点荧光信号。在该实验中，约98％的反应组产生良好的基因分型结果。即，对于98％的测定组合，两个基因座能够在相同的测定中被基因分型而不会干扰其他。仅以浅灰色示出的两个组合产生小于最佳的结果(10a/9b和11a/9b)。没有反应未能扩增目标，然而。因此，这些结果表明磺基-DDAO可以在多重系统例如该四种报告子系统中用作参比染料。
试剂盒组分的变化形式涵盖在根据本教导的试剂盒的各种实施方案中。在试剂盒的一些实施方案中，探针是标记的寡核苷酸，其包括寡核苷酸和报告染料。在一些实施方案中，报告染料是荧光染料。在一些实施方案中，报告染料可以选自表1中列出的荧光染料。在一些实施方案中，参比染料可以是试剂盒中的主要混合物中的成分。在一些实施方案中，参比染料和主要混合物可以在试剂盒中的单独的容器中。在一些实施方案中，参比染料以及至少一种探针中的每种可以在试剂盒中的单独的容器中。在一些实施方案中，参比染料可以在主要混合物中，且主要混合物以及至少一种探针中的每种在试剂盒中的单独的容器中。在一些实施方案中，参比染料、主要混合物以及至少一种探针中的每种可以在试剂盒中的单独的容器中。在一些实施方案中，参比染料以及至少一种探针可以在试剂盒中的相同的容器中。在一些实施方案中，探针中的至少两种可以在相同的容器中，而参比染料在试剂盒中的单独的容器中。在不同实施方案中，试剂盒组分可以被冻干或悬浮在缓冲溶液中而被供应。在一些实施方案中，试剂盒包括使用参比染料和探针的说明书。在一些实施方案中，这样的说明书可以是进行测定的说明书。
可以用在本教导中的报告染料不限于本文所讨论的那些且可以包括各种各样不同的染料，包括(但不限于)FRET染料、非FRET染料及其组合。如上所述，在一些实施方案中，报告染料可在光谱上与彼此且与参比染料区别。在一些实施方案中，报告染料可与彼此且与参比染料通过它们的发射衰变率区别。报告子可以选自本文所讨论和上面表1中的许多可能性。一起使用稳定的参比染料和如图16所示的一组六种其他染料的能力是本教导的磺基-DDAO参比染料可以可用于倍增测定的证据，该倍增测定可以检测(例如但不限于)同一测定中的至少六种不同的分析物。可以用于这样的方法中的不同的发射滤波器通带、滤光轮以及其他过滤和检测系统包括本文描述的那些和对已知本教导的本领域技术人员来说将变得明显的那些。
尽管已经结合各种实施方案和实施例来描述本教导，但不旨在本教导限于这样的实施方案或实施例。相反，本教导包括各种备选方案、修改和等效物，如本领域技术人员将明白的。除非陈述为带有这个意思，否则教导不应被阅读为限于所描述的顺序或元件。应理解，可以进行形式和细节的各种变化，而不偏离本教导的范围，包括所公开的方法步骤的顺序和布置。因此，要求落在本教导及其等效物的范围和精神内的所有实施方案。

Claims (15)

1.一种方法，包括：
(a)形成包括至少一种探针和参比染料的混合物，其中所述至少一种探针中的每种包括目标特异性部分和报告染料，其中每种目标特异性部分对不同的目标是特异性的，且每种报告染料与其他报告染料不同，且其中所述参比染料具有式(I)：
其中：
R1至R3和R6至R8中的每个独立地是-H、卤素、-CO2H、-CO2R、-SO3H、-SO3R、-CH2CO2H、-CH2CO2R、-CH2SO3H、-CH2SO3R、-CH2NH2、-CH2NHR、-NO2、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、和取代的C1-C6烷氧基，其中R是C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、和取代的C1-C6烷氧基；
单独使用的R4和R5选自C1-C6烷基和C1-C6取代的烷基，或合在一起的R4和R5选自C3-C7环烷基、C4-C7不饱和的环烷基、C3-C7取代的环烷基、或C4-C7取代的不饱和的环烷基；和
(b)测量由所述参比染料发出的荧光；和
(c)测量由至少一种报告染料发出的荧光。
2.根据权利要求1所述的方法，还包括基于由所述参比染料发出的经测量的荧光来调节由所述至少一种报告染料发出的所述经测量的荧光，以形成经调节的测量结果。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述目标特异性部分是寡核苷酸。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述探针包括寡核苷酸、报告染料和淬灭染料。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括：
用第一激发波长范围照射所述混合物；
检测由至少第一报告染料发出的辐射；和
检测由至少第二报告染料发出的辐射；
其中由每种报告染料发出的所述辐射可以在所述混合物中的其他报告染料和所述参比染料的存在下被测量。
6.根据权利要求1所述的方法，其中R1选自氢、卤素、甲基和乙基；R2和R3各自独立地是卤素；R4和R5各自独立地选自甲基和乙基；R6选自氢、卤素、甲基和乙基；R7选自氢、卤素、甲基、乙基和SO3H；且R8选自氢、卤素、甲基和乙基。
7.根据权利要求7所述的方法，其中R2和R3各自是氯，且R7是氢或SO3H。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述参比染料选自：
9.一种组合物，包含：
具有式(I)的参比染料：
其中：
R1至R3和R6至R8中的每个独立地是-H、卤素、-CO2H、-CO2R、-SO3H、-SO3R、-CH2CO2H、-CH2CO2R、-CH2SO3H、-CH2SO3R、-CH2NH2、-CH2NHR、-NO2、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、和取代的C1-C6烷氧基，其中R是C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、和取代的C1-C6烷氧基；
单独使用的R4和R5选自C1-C6烷基和C1-C6取代的烷基，或R4和R5合在一起选自C3-C7环烷基、C4-C7不饱和的环烷基、C3-C7取代的环烷基、或C4-C7取代的不饱和的环烷基；和
缓冲剂、核苷酸的选择物、和蛋白。
10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述缓冲剂选自tris、tricene、bicene、HEPES和MOPS。
11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述缓冲剂还包括选自钾、锂、镁和锰的氯盐、以及表面活性剂。
12.根据权利要求12所述的组合物，其中所述表面活性剂选自聚山梨醇酯表面活性剂、聚氧乙烯表面活性剂、聚乙氧基化苯酚表面活性剂、和两性离子表面活性剂。
13.根据权利要求9所述的组合物，其中所述核苷酸的选择物来自脱氧核苷酸(dNPT)。
14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述核苷酸的选择物还来自二脱氧核苷酸(didNTP)、去氮-GTP、去氮-dGTP、和2'-脱氧肌苷5'-三磷酸盐(dITP)。
15.根据权利要求9所述的组合物，其中所述蛋白选自DNA聚合酶、连接酶、逆转录酶、核糖核酸酶、糖基化酶、单链结合蛋白、焦磷酸酶、白蛋白和明胶。
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