CN107326001B - 一种光响应细胞外基质复合薄膜及其制备方法 - Google Patents

一种光响应细胞外基质复合薄膜及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种光响应细胞外基质复合薄膜及其制备方法，该方法如下：在可光致细胞脱附的细胞培养表面如(TiO2纳米点薄膜)上高密度培养细胞，在培养的过程中加入光响应纳米颗粒，如TiO2纳米颗粒、ZnO纳米颗粒等，这些纳米颗粒会被细胞内吞，分散在细胞内及细胞间，当细胞培养成片层后，通过光致细胞脱附，获得一层完整的细胞片层，将其清洗后再进行脱细胞处理进而获得光响应细胞外基质复合薄膜。本发明方法制得的光响应细胞外基质复合薄膜，可应用于生物医用材料等领域。此外本发明的制备方法，工艺简单，易于实现，有利于进行推广应用。

Description

一种光响应细胞外基质复合薄膜及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物医用材料领域，具体涉及一种光响应细胞外基质复合薄膜及其制备方法。
背景技术
细胞外基质是由细胞生长过程分泌的胶原、糖蛋白、蛋白聚糖以及多种生长因子等组成的复杂网络结构，可以为宿主细胞提供支持位点和生物学作用，对细胞的形状、生长、迁移和分化，胚胎的发育以及受损组织或器官的修复等有至关重要的作用。有研究表明，材料表面的润湿性影响不同功能蛋白在其表面的吸附，疏水性的表面更有利于白蛋白的吸附，而亲水性表面则更有利于粘附蛋白的吸附。[Arima,Y.and H.Iwata(2007)."Effect of wettability and surface functional groups on protein adsorption andcell adhesion using well-defined mixed self-assembled monolayers."Biomaterials 28(20):3074-3082.]。光响应材料能在光照前后有效调节材料表面的润湿性，因此，如能在体外获得光响应细胞外基质薄膜，有效调节复合薄膜的亲疏水性，从而调节不同功能蛋白在其表面的吸附具有很强的实际应用意义和研究价值。
细胞在体外培养过程中就可在与基板连接处分泌出一层细胞外基质。如果进行胰酶处理，在细胞脱离培养表面之前细胞外基质就会被消化掉，无法获得所需的细胞外基质层。而单纯的机械剥离，则会使细胞外基质超微结构发生一定改变，影响其后续对其它细胞的功能性作用。
本发明在近年来报道的光致细胞薄层获取技术基础上，开发了一种光响应细胞外基质复合薄膜。该方法利用光致细胞薄层脱附技术能够获得具有细胞外基质含量高、活性功能良好的细胞薄层的特点[Y.Hong,M.F.Yu,W.J.Weng,K.Cheng,H.M.Wang,J.Lin.Light-induced cell detachment for cell sheet technology.Biomaterials,2013,34(1):11-18]，在细胞培养过程中加入光响应颗粒，并经过一系列的处理获取了一种光响应细胞外基质复合薄膜。该方法获得的细胞外基质薄膜保持了原有的超微结构和组成成分，同时具有良好的机械性能，并且光响应颗粒均匀分布于复合薄膜中，能有效调控复合薄膜的亲疏水性，可应用于生物医用材料等领域。本发明的制备方法，工艺简单，易于实现，有利于进行推广应用，所得到的复合薄膜具有良好的光响应性、生物相容性及组织修复特性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种光响应细胞外基质复合薄膜及其制备方法，所述的光响应细胞外基质复合薄膜可通过控制纳米光响应颗粒的浓度及添加时间去调控细胞外基质的结构及光响应性能。
一种光响应细胞外基质复合薄膜，由细胞外基质与光响应纳米颗粒组成，其中光响应纳米颗粒的含量为1～100μg/cm3，所述的复合薄膜具有均匀致密的纤维网状结构。
其制备方法，包括如下步骤：
(1)对可光致细胞脱附的细胞培养表面进行灭菌处理；
(2)将事先培养在培养瓶中的细胞进行脱壁处理，以800～1300r/min离心2～6min后，用培养基混悬，并用计数板计数，以1×105～1×106细胞密度将细胞接种于上述细胞培养表面上，置于二氧化碳培养箱内进行单层高密度培养，2～4天后进行第一次换液，之后每1～3天换液一次，整个培养周期5～10天，在细胞脱附前1～3天加入1～100μg/mL光致响应纳米颗粒，最终在细胞培养表面上形成完整的细胞片层；
(3)将经上述培养后的培养表面移入PBS中，通过波长365nm的紫外光光照5～30min，使细胞片层从细胞培养表面上完整脱附，获得一层完整的细胞片层，用PBS缓冲液以及去离子水对脱附后的细胞片层反复清洗，用固定剂对细胞片层进行固定，避光处理30～60min，再用PBS缓冲液以及去离子水对细胞片层反复清洗；
(4).将细胞片层浸泡于去离子水中，置于-80℃冷冻30～60min，取出后在25～37℃解冻20～45min，冷冻-解冻循环重复3～10次，之后用去离子水清洗，获得光致响应细胞外基质复合薄膜。
所述的可光致细胞脱附的细胞培养表面是指具有TiO2纳米点薄膜的表面。
所述的固定剂为甲醛、多聚甲醛、戊二醇、乙醇、丙醇或丁醇。
所述的光响应纳米颗粒为TiO2纳米颗粒、ZnO纳米颗粒、ZrO2纳米颗粒、SnO2纳米颗粒、Fe2O3纳米颗粒、MnO2纳米颗粒中的一种或多种。
所述的TiO2纳米颗粒的直径为10～50nm、ZnO纳米颗粒的直径为10～50nm、ZrO2纳米颗粒的直径为10～100nm、SnO2纳米颗粒的直径为10～100nm、Fe2O3纳米颗粒的直径为10～50nm、MnO2纳米颗粒的直径为10～100nm。
经上述方法制备获得的一种光响应细胞外基质复合薄膜，为典型的均匀且致密的纤维网状结构。
本发明的薄膜及制备方法具有如下特点：
1)采用光致细胞脱附的方法，使含有光响应颗粒的细胞片层从基板上脱附下来，减少细胞片层的机械损伤，从而获得完整的细胞片层。
2)光响应颗粒不仅存在于细胞内而且存在于细胞连接处，最终获取的是光响应颗粒均匀分布的光响应细胞外基质复合薄膜。
3)所获取的光响应细胞外基质复合薄膜不仅保存了细胞外基质的重要组成成分，而且具有良好的光响应性。
本发明所涉及的光响应细胞外基质复合薄膜的制备过程，无论是细胞的体外培养，光响应纳米颗粒与细胞的复合，还是细胞片层的脱附，都是比较简洁易行的，对设备没有过高的要求。
本发明的光响应细胞外基质复合薄膜，保持了细胞外基质的原有结构形貌，具有良好的生物相容性及光响应性，为培养同种或异种细胞提供了有利的微环境，有利于细胞的粘附及增值，对细胞的分化也产生影响，光响应纳米颗粒的存在，可有效调细胞外基质的亲疏水性，进一步调节不同功能蛋白在材料表面吸附，可应用于生物医用工程等领域。此外本发明的制备方法，工艺简单，易于实现，有利于进行推广应用。
附图说明
图1是光响应细胞外基质复合薄膜的表面形貌图。
图2是光响应细胞外基质元素分布图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
(1)对涂有TiO2的纳米点薄膜的表面进行灭菌处理；
(2)将事先培养在培养瓶中的细胞进行脱壁处理，以800r/min离心6min后，用培养基混悬，并用计数板计数，以1×105细胞密度将细胞接种于上述细胞培养表面上，置于二氧化碳培养箱内进行单层高密度培养，4天后进行第一次换液，之后每3天换液一次，整个培养周期10天，在细胞脱附前1天加入100μg/mLTiO2纳米颗粒，最终在细胞培养表面上形成完整的细胞片层；
(3)将经上述培养后的培养表面移入PBS中，通过波长为365nm的紫外光光照5min，使细胞片层从细胞培养表面上完整脱附，获得一层完整的细胞片层，用PBS缓冲液以及去离子水对脱附后的细胞片层反复清洗，用甲醛对细胞片层进行固定，避光处理30min，再用PBS缓冲液以及去离子水对细胞片层反复清洗；
(4).将细胞片层浸泡于去离子水中，置于-80℃冷冻30min，取出后在25℃解冻45min，冷冻-解冻循环重复3次，之后用去离子水清洗，获得光致响应细胞外基质复合薄膜。
本例制得的细胞外基质薄膜的表面形貌图如图1所示，光响应纳米颗粒被包覆在细胞外基质中，图2显示光响应颗粒在复合薄膜中均匀分布。
实施例2
(1)对涂有TiO2的纳米点薄膜的表面进行灭菌处理；
(2)将事先培养在培养瓶中的细胞进行脱壁处理，以900r/min离心5min后，用培养基混悬，并用计数板计数，以2×105细胞密度将细胞接种于上述细胞培养表面上，置于二氧化碳培养箱内进行单层高密度培养，4天后进行第一次换液，之后每3天换液一次，整个培养周期9天，在细胞脱附前2天加入80μg/mL ZnO纳米颗粒，最终在细胞培养表面上形成完整的细胞片层；
(3)将经上述培养后的培养表面移入PBS中，通过波长为365nm的紫外光光照15min，使细胞片层从细胞培养表面上完整脱附，获得一层完整的细胞片层，用PBS缓冲液以及去离子水对脱附后的细胞片层反复清洗，用多聚甲醛对细胞片层进行固定，避光处理35min，再用PBS缓冲液以及去离子水对细胞片层反复清洗；
(4).将细胞片层浸泡于去离子水中，置于-80℃冷冻35min，取出后在25℃解冻45min，冷冻-解冻循环重复4次，之后用去离子水清洗，获得光响应细胞外基质复合薄膜。
实施例3
(1)对涂有TiO2的纳米点薄膜的表面进行灭菌处理；
(2)将事先培养在培养瓶中的细胞进行脱壁处理，以1000r/min离心4min后，用培养基混悬，并用计数板计数，以4×105细胞密度将细胞接种于上述细胞培养表面上，置于二氧化碳培养箱内进行单层高密度培养，3天后进行第一次换液，之后每2天换液一次，整个培养周期8天，在细胞脱附前3天加入60μg/mL ZrO2纳米颗粒，最终在细胞培养表面上形成完整的细胞片层；
(3)将经上述培养后的培养表面移入PBS中，通过波长为365nm的紫外光光照20min，使细胞片层从细胞培养表面上完整脱附，获得一层完整的细胞片层，用PBS缓冲液以及去离子水对脱附后的细胞片层反复清洗，用戊二醛对细胞片层进行固定，避光处理40min，再用PBS缓冲液以及去离子水对细胞片层反复清洗；
(4).将细胞片层浸泡于去离子水中，置于-80℃冷冻40min，取出后在30℃解冻30min，冷冻-解冻循环重复5次，之后用去离子水清洗，获得光响应细胞外基质复合薄膜。
实施例4
(1)对涂有TiO2的纳米点薄膜的表面进行灭菌处理；
(2)将事先培养在培养瓶中的细胞进行脱壁处理，以1100r/min离心3min后，用培养基混悬，并用计数板计数，以6×105细胞密度将细胞接种于上述细胞培养表面上，置于二氧化碳培养箱内进行单层高密度培养，3天后进行第一次换液，之后每2天换液一次，整个培养周期7天，在细胞脱附前3天加入40μg/mL SnO2纳米颗粒，最终在细胞培养表面上形成完整的细胞片层；
(3)将经上述培养后的培养表面移入PBS中，通过波长为365nm的紫外光光照25min，使细胞片层从细胞培养表面上完整脱附，获得一层完整的细胞片层，用PBS缓冲液以及去离子水对脱附后的细胞片层反复清洗，用乙醇对细胞片层进行固定，避光处理45min，再用PBS缓冲液以及去离子水对细胞片层反复清洗；
(4).将细胞片层浸泡于去离子水中，置于-80℃冷冻45min，取出后在30℃解冻30min，冷冻-解冻循环重复6次，之后用去离子水清洗，获得光响应细胞外基质复合薄膜。
实施例5
(1)对涂有TiO2的纳米点薄膜的表面进行灭菌处理；
(2)将事先培养在培养瓶中的细胞进行脱壁处理，以1200r/min离心3min后，用培养基混悬，并用计数板计数，以8×105细胞密度将细胞接种于上述细胞培养表面上，置于二氧化碳培养箱内进行单层高密度培养，2天后进行第一次换液，之后每1天换液一次，整个培养周期6天，在细胞脱附前2天加入20μg/mL Fe2O3纳米颗粒，最终在细胞培养表面上形成完整的细胞片层；
(3)将经上述培养后的培养表面移入PBS中，通过波长为365nm的紫外光光照30min，使细胞片层从细胞培养表面上完整脱附，获得一层完整的细胞片层，用PBS缓冲液以及去离子水对脱附后的细胞片层反复清洗，用丙醇对细胞片层进行固定，避光处理50min，再用PBS缓冲液以及去离子水对细胞片层反复清洗；
(4).将细胞片层浸泡于去离子水中，置于-80℃冷冻50min，取出后在37℃解冻20min，冷冻-解冻循环重复7次，之后用去离子水清洗，获得光响应细胞外基质复合薄膜。
实施例6
(1)对涂有TiO2的纳米点薄膜的表面进行灭菌处理；
(2)将事先培养在培养瓶中的细胞进行脱壁处理，以1300r/min离心2min后，用培养基混悬，并用计数板计数，以1×106细胞密度将细胞接种于上述细胞培养表面上，置于二氧化碳培养箱内进行单层高密度培养，2天后进行第一次换液，之后每1天换液一次，整个培养周期5天，在细胞脱附前2天加入10μg/mL MnO2纳米颗粒，最终在细胞培养表面上形成完整的细胞片层；
(3)将经上述培养后的培养表面移入PBS中，通过可见光光照30min，使细胞片层从细胞培养表面上完整脱附，获得一层完整的细胞片层，用PBS缓冲液以及去离子水对脱附后的细胞片层反复清洗，用丁醇对细胞片层进行固定，避光处理60min，再用PBS缓冲液以及去离子水对细胞片层反复清洗；
(4).将细胞片层浸泡于去离子水中，置于-80℃冷冻60min，取出后在37℃解冻20min，冷冻-解冻循环重复10次，之后用去离子水清洗，获得光响应细胞外基质复合薄膜。

Claims (2)

1.一种光响应细胞外基质复合薄膜，其特征在于，该复合薄膜由细胞外基质与光响应纳米颗粒组成，其中光响应纳米颗粒的含量为1~100μg/cm3，所述的复合薄膜具有均匀致密的纤维网状结构；所述的光响应纳米颗粒为TiO2纳米颗粒，直径为10~50 nm；所述薄膜的制备方法包括如下步骤：
(1) 对具有TiO2纳米点薄膜的细胞培养表面进行灭菌处理；
(2) 将事先培养在培养瓶中的细胞进行脱壁处理，以800~1300r/min离心2~6min后，用培养基混悬，并用计数板计数，以1×105~1×106细胞密度将细胞接种于步骤（1）的细胞培养表面上，置于二氧化碳培养箱内进行单层高密度培养，2~4天后进行第一次换液，之后每1~3天换液一次，整个培养周期5~10天，在细胞脱附前1~3天加入1~100 μg/mL TiO2纳米颗粒，最终在细胞培养表面上形成完整的细胞片层；
(3) 将经步骤（2）培养后的细胞培养表面移入PBS中，通过波长365nm的紫外光光照5~30min，使细胞片层从细胞培养表面上完整脱附，获得一层完整的细胞片层，用PBS缓冲液以及去离子水对脱附后的细胞片层反复清洗，用固定剂对细胞片层进行固定，避光处理30~60min，再用PBS缓冲液以及去离子水对细胞片层反复清洗；
(4) 将细胞片层浸泡于去离子水中，置于-80℃冷冻30~60 min，取出后在25~37℃解冻20~45 min，冷冻-解冻过程循环重复3~10次，之后用去离子水清洗，获得光响应细胞外基质复合薄膜。
2.根据权利要求1所述的光响应细胞外基质薄膜，其特征在于，步骤（3）中所述的固定剂为甲醛、多聚甲醛、戊二醇、乙醇、丙醇或丁醇。
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