CN107290523A - 抗体捕获蛋白及报告基因融合重组蛋白检测抗体的方法 - Google Patents

抗体捕获蛋白及报告基因融合重组蛋白检测抗体的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于抗体检测技术领域，公开了一种抗体捕获蛋白及报告基因融合重组蛋白检测抗体的方法，通过蛋白质工程的手段将报告基因的编码核酸序列直接与抗原编码核酸的序列融合后重组表达的方式获得报告基因或酶融合抗原；直接使用表达酶融合抗原的细胞或真核或原核裂解物作为抗原；使用抗体捕获蛋白包被聚苯乙烯板捕获待检测样本中的抗体。本发明无需化学偶联，对抗原的影响最少；可直接使用表达酶融合抗原的细胞(真核或原核)裂解物作为抗原，无需纯化步骤，降低生产成本；不同的试剂盒所使用的聚苯乙烯板包被可以完全一样；不使用酶标记二抗，同一个检测试剂盒对来源于不同物种源的样本均可适用。

Description

抗体捕获蛋白及报告基因融合重组蛋白检测抗体的方法
技术领域
本发明属于抗体检测技术领域，尤其涉及一种抗体捕获蛋白及报告基因融合重组蛋白检测抗体的方法。
背景技术
酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)是目前现有最常用的抗体检测技术，其基本方法是将已知的抗原吸附于固相载体(聚苯乙烯微量反应板)表面，通过固相载体表面的抗原与待检测抗体的结合；再加入酶标记的二抗(针对不同的种属，人，猴，小鼠)来进一步识别与抗原结合的抗体，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行；再加入底物后二抗上标记的酶基团介导一个颜色反应，通过分光光度计读取吸光度后即可获得读数，以此判断样品中是否存在识别吸附于固相载体表面抗原的抗体。通过酶联免疫法(ELISA)方法来进行抗体检测有以下几个缺点：1.用于检测用的重组抗原需要在细菌或其他重组蛋白表达系统中进行表达，然后进行纯化才可用于包被聚苯乙烯板的固相表面，因此难以应用于一些疏水性较强，或具有多次跨膜结构的抗原表达纯化，导致难以开发出相应抗体的检测方法2.需要通过化学偶联的方式，将报告基因蛋白(如辣根过氧化物酶)偶联标记至重组抗原或抗体上形成酶标抗原或者酶标抗体进行检测，而化学偶联的方式将增加额外的生产步骤和生产成本，同时可能由于所发生化学偶联反应而影响抗原与抗体的结合。3.酶联免疫吸附法一般需使用特定的抗原或者抗体来吸附于检测用的聚苯乙烯板的固相表面，针对不同抗原的检测试剂盒需要使用相应的抗原或者抗体来预先吸附聚苯乙烯板，不同试剂盒之间不能共用，因此包被聚丙乙烯板工作繁琐。4.针对不同物种来源的检测血清样本(如人，鼠，猴，猪，鸡)，需要针对性的使用不同物种抗体的二抗，导致所开发的试剂盒具有种属特异性无法无差别应针对同一抗原但来源于不同物种抗体的检测(如鸡的禽流感抗体检测试剂盒无法应用于人的禽流感抗体检测)。
综上所述，现有技术存在的问题是：针对同一种抗原的ELISA试剂盒无法应用与不同的动物(即种属特异性)，对于某些特定的跨膜抗原因无法表达纯化，因此无法开发出酶联免疫法的抗体检测试剂盒。现有的酶联免疫法所使用的重组抗原纯化过程及与酶进行偶联的过程繁琐，且可能对抗原或抗体存在影响。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种抗体捕获蛋白及报告基因融合重组蛋白检测抗体的方法。
本发明是这样实现的，一种抗体捕获蛋白及报告基因融合重组蛋白检测抗体的方法，所述抗体捕获蛋白及报告基因融合重组蛋白检测抗体的方法通过蛋白质工程的手段将报告基因的编码核酸序列直接与抗原编码核酸的序列通过基因工程改造的方式连接为一个单一的重组基因，再通过化学转染或电转染等方式导入真核或原核细胞并表达为一个重组蛋白(即酶融合抗原)；直接使用表达酶融合抗原的细胞或真核或原核裂解物作为检测用抗原；使用抗体捕获蛋白包被聚苯乙烯板。
进一步，所述抗体捕获蛋白包括：链球菌蛋白A，蛋白G，重组蛋白A/G，蛋白L或以抗体作为免疫原刺激动物产生针对抗体的普通二抗。
进一步，所述抗体捕获蛋白及报告基因融合重组蛋白检测抗体的方法包括以下步骤：
步骤一，使用抗体捕获蛋白包被检测板的固象表面(聚苯乙烯板或具有蛋白吸附能力的材料)；
步骤二，使用抗体捕获蛋白吸附与载体固相表面后，使用无关蛋白进行封闭，将检测板固相表面上未吸附抗体捕获蛋白的表面进行封闭从而避免非特异性吸附的产生；
步骤三，将报告基因的核酸序列与抗原(或抗原表位)编码基因的核酸序列通过分子克隆的方式连接为一个单一的核酸序列，使报告基因和抗原(抗原表位)表达为一个单一的融合重组蛋白(即酶融合重组抗原)作为检测用抗原使用；
步骤四，将表达报告基因融合重组抗原(酶融合抗原)的细胞使用适当的方法破碎裂解，部分原核细胞难以表达的蛋白可使用真核细胞表达系统进行表达；
步骤五，将待检测样本以1:20的比例加入含有重组抗原的裂解液中混合后，加入抗体捕获蛋白包被，无关蛋白封闭的检测板的孔中进行孵育；
步骤六，样本中所有抗体首先被抗体捕获蛋白所捕获吸附与检测板的固象表面，吸附于固相表面的抗体中若含有可识别重组酶融合抗原的抗体，则可捕获细胞裂解液中携带报告基因的重组酶融合抗原；
步骤七，通过洗涤法去除液相中未被抗体识别的重组酶融合抗原及细胞裂解物，加入酶融合抗原上的报告基因(即酶活性基团)所识别的底物进行反应，通过检测报告基因的活性，确认样本中是否含有针对重组蛋白的抗体。
进一步，所述步骤二中无关蛋白包括但不限于：牛血清蛋白，鸡卵清蛋白，冷水鱼皮明胶或脱脂牛奶。
进一步，所述步骤七中底物包括但不限于：荧光素酶底物或辣根过氧化物酶底物。
进一步，所述抗体捕获蛋白及报告基因融合重组蛋白检测抗体的方法还包括：使用琼脂糖微球或者磁珠微球作为固象的表面，以化学法偶联的方式来结合抗体捕获蛋白，以抗体捕获蛋白偶联微球和抗体反应将抗体吸附于微球的表面，通过离心或者磁力吸附的方式来分离包含有抗体的微球。
本发明的另一目的在于提供一种由所述抗体捕获蛋白及报告基因融合重组蛋白检测抗体的方法制备的抗体检测试剂盒。
本发明的优点及积极效果为：通过蛋白质工程的手段将报告基因的编码核酸序列直接与抗原编码核酸的序列融合后重组表达的方式获得报告基因(酶)融合抗原，即酶融合抗原，而非酶标记抗原，无需化学偶联，对抗原的影响最少；可直接使用表达酶融合抗原的细胞(真核或原核)裂解物作为抗原，无需纯化步骤，降低生产成本；不使用重组抗原或者抗体来包被吸附孔聚苯乙烯板的固相表面，而使用抗体捕获蛋白(链球菌蛋白A，蛋白G，重组蛋白A/G，蛋白L，以抗体作为免疫原刺激动物产生针对抗体的二抗)等具备和抗体发生无差别结合的蛋白来包被聚苯乙烯板，不同的试剂盒所使用的聚苯乙烯板包被完全一样。不使用二抗，同一个检测试剂盒对来源于不同物种源的样本均可适用，不需要考虑种属差异性。
附图说明
图1是本发明实施例提供的抗体捕获蛋白及报告基因融合重组蛋白检测抗体的方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
本发明实施例提供的抗体捕获蛋白及报告基因融合重组蛋白检测抗体的方法名称为重组酶融合蛋白免疫吸附实验(Recombinant enzyme fused antigen immunosorbentassay，REFAISA)。同被广泛使用的酶联免疫吸附实验(ELISA)类似是一种以抗原检测抗体的检测技术。
如图1所示，本发明实施例提供的抗体捕获蛋白及报告基因融合重组蛋白检测抗体的方法包括以下步骤：
S101：使用来源于链球菌的重组A蛋白，重组G蛋白，或重组AG蛋白，或重组L蛋白，或来源于其他动物的识别待检测免疫球蛋白的二抗体等具有结合抗体能力的蛋白(统一定义为抗体捕获蛋白)来包被聚苯乙烯板的固象表面，抗体捕获蛋白发挥从待检测样本中无差别性的捕获所有抗体的作用；
S102：使用抗体捕获蛋白吸附与载体(如聚苯乙烯板)固相表面后，使用无关蛋白(牛血清蛋白，鸡卵清蛋白，冷水鱼皮明胶，或脱脂牛奶等)来进行封闭，将聚苯乙烯固相上未吸附抗体捕获蛋白的表面进行封闭从而避免非特异性吸附的产生；
S103：将报告基因的核酸序列与抗原(或者抗原表位)编码基因的核酸序列通过分子克隆的方式连接为一个单一的核酸序列，使报告基因和抗原能够通过多种表达系统(细菌，真核细胞等)表达为一个单一的融合重组蛋白作为抗原使用；
S104：将表达报告基因融合重组抗原的细胞使用适当的方法破碎裂解，含有重组抗原的裂解液无需纯化即作为抗原使用，部分原核细胞难以表达的蛋白可使用真核表达系统来进行表达；
S105：将待检测样本以1:20的比例加入含有重组抗原的裂解液中混合后，加入已经使用抗体捕获蛋白包被，无关蛋白封闭的聚苯乙烯孔中进行孵育；
S106：在孵育的过程中，样本中所有抗体首先被抗体捕获蛋白所捕获吸附与固象的表面，吸附于固相表面抗体中若含有可识别重组蛋白的抗体则会进一步捕获细胞裂解液中携带报告基因的重组抗原；
S107：孵育完成后，通过洗涤法去除液相中未被抗体识别的所识别的重组蛋白及与细胞裂解物，加入重组蛋白上的报告基因所识别的底物(如荧光素酶底物，辣根过氧化物酶底物等)进行反应，使用特定的仪器来检测报告基因的活性，从而确认样本中是否含有针对重组蛋白的抗体。
本发明实施例提供的抗体捕获蛋白及报告基因融合重组蛋白检测抗体的方法可以使用琼脂糖微球或者磁珠微球作为固象的表面，以化学法偶联的方式来结合抗体捕获蛋白，然后以“抗体捕获蛋白偶联微球”和抗体反应的方式，将抗体吸附于微球的表面，进一步通过离心或者磁力吸附的方式来分离包含有抗体的微球。
本发明实施例提供的抗体捕获蛋白及报告基因融合重组蛋白检测抗体的方法不再使用重组抗原来包被聚苯乙烯板，使用抗体捕获蛋白(A蛋白，G蛋白，A/G蛋白，L蛋白，或识别抗体的二抗)来包被聚苯乙烯板，从而对待检样本中的所有抗体无差别的捕获吸附于聚苯乙烯板固象表面；因此，针对不同抗体的检测试剂盒所使用的检测板可以进行统一包被(只使用抗体捕获蛋白，不需使用不同的抗原分别包被)，从而节约生产成本。
本发明实施例提供的抗体捕获蛋白及报告基因融合重组蛋白检测抗体的方法检测过程中使用的抗原不再通过化学偶联的方法将酶活性(即报告基因)基团偶联于抗原的方式来进行酶标记，而是直接通过蛋白质工程的手段，将报告基因与抗原基因融合为一个单一的蛋白直接表达。
本发明实施例提供的抗体捕获蛋白及报告基因融合重组蛋白检测抗体的方法使用的酶融合重组抗原不需要纯化，只需要将表达重组蛋白的细胞使用适当的方法裂解即可使用。节约生产过程中纯化抗原的成本。同时真核表达系统可以表达一些无法在细菌中实现表达的抗原，可以开发出一些针对全新抗原的抗体检测试剂盒。
本发明实施例提供的抗体捕获蛋白及报告基因融合重组蛋白检测抗体的方法不使用酶标记的二抗，节省成本。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种抗体捕获蛋白及报告基因融合重组蛋白检测抗体的方法，其特征在于，所述的抗体捕获蛋白及报告基因融合重组蛋白检测抗体的方法通过蛋白质工程的手段将报告基因的编码核酸序列直接与抗原编码核酸的序列融合后以重组表达的方式获得报告基因或酶融合抗原；直接使用表达酶融合抗原的真核或原核细胞裂解物作为检测用重组抗原；使用抗体捕获蛋白包被吸附于固相表面。
2.如权利要求1所述的抗体捕获蛋白及报告基因融合重组蛋白检测抗体的方法，其特征在于，所述抗体捕获蛋白包括：链球菌蛋白A，蛋白G，重组蛋白A/G，蛋白L或以抗体作为免疫原刺激动物产生针对抗体的普通二抗。
3.如权利要求1所述的抗体捕获蛋白及报告基因融合重组蛋白检测抗体的方法，其特征在于，所述抗体捕获蛋白及报告基因融合重组蛋白检测抗体的方法包括以下步骤：
步骤一，使用抗体捕获蛋白包被检测板的固象表面；
步骤二，使用抗体捕获蛋白吸附与载体固相表面后，使用无关蛋白进行封闭，将检测板固相表面上未吸附抗体捕获蛋白的表面进行封闭；
步骤三，将报告基因的核酸序列与抗原或抗原表位编码基因的核酸序列通过分子克隆的方式连接为一个单一的核酸序列，使报告基因和抗原表达为一个单一的融合重组蛋白作为检测用抗原使用；
步骤四，将表达报告基因融合重组抗原的细胞使用适当的方法破碎裂解，部分原核细胞难以表达的蛋白可使用真核细胞表达系统进行表达；
步骤五，将待检测样本以1:20的比例加入含有重组抗原的裂解液中混合后，加入抗体捕获蛋白包被，无关蛋白封闭的检测板的孔中进行孵育；
步骤六，样本中所有抗体首先被抗体捕获蛋白所捕获吸附与检测板的固象表面，吸附于固相表面的抗体中若含有可识别重组酶融合抗原的抗体，则可捕获细胞裂解液中携带报告基因的重组酶融合抗原；
步骤七，通过洗涤法去除液相中未被抗体识别的重组酶融合抗原及细胞裂解物，加入酶融合抗原上的报告基因所识别的底物进行反应，通过检测报告基因的活性，确认样本中是否含有针对重组蛋白的抗体。
4.如权利要求3所述的抗体捕获蛋白及报告基因融合重组蛋白检测抗体的方法，其特征在于，所述步骤二中无关蛋白包括：牛血清蛋白，鸡卵清蛋白，冷水鱼皮明胶或脱脂牛奶。
5.如权利要求3所述的抗体捕获蛋白及报告基因融合重组蛋白检测抗体的方法，其特征在于，所述步骤七中底物包括：荧光素酶底物或辣根过氧化物酶底物。
6.如权利要求1所述的抗体捕获蛋白及报告基因融合重组蛋白检测抗体的方法，其特征在于，所述抗体捕获蛋白及报告基因融合重组蛋白检测抗体的方法还包括：使用琼脂糖微球或者磁珠微球作为固象的表面，以化学法偶联的方式来结合抗体捕获蛋白，以抗体捕获蛋白偶联微球和抗体反应将抗体吸附于微球的表面，通过离心或者磁力吸附的方式来分离包含有抗体的微球。
7.一种由权利要求1～6任意一项所述抗体捕获蛋白及报告基因融合重组蛋白检测抗体的方法制备的抗体检测试剂盒。
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