CN107287231B - 一种植物种子休眠相关的rve1蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种植物种子休眠相关的RVE1蛋白及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白质，命名为RVE1蛋白，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与调控种子休眠与萌发相关的由序列1衍生的蛋白质。编码所述RVE1蛋白的基因(RVE1基因)也属于本发明的保护范围。本发明保护一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：将编码RVE1蛋白的基因导入出发植物，得到转基因植物；所述转基因植物种子萌发率低于所述出发植物和/或种子休眠程度高于所述出发植物。本发明在农业生产上具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物种子休眠相关的RVE1蛋白及其编码基因与应用。
背景技术
种子休眠是指种子在适宜的条件下不能萌发的现象。休眠是种子植物的一种适应机制，是种子植物长期进化的结果，对于其自身发展和种族延续都起着至关重要的作用。种子休眠是在种子成熟过程中逐渐建立起来的，其程度受多种外界环境因素和自身因素的影响。其中GA和ABA是一对在调控种子萌发和休眠方面起拮抗功能的激素：ABA促进种子休眠、抑制种子萌发，而GA抑制种子休眠、促进种子萌发。除了激素依赖的途径外，组蛋白甲基化、乙酰化等引起的染色质重塑、小干扰RNA、长的非编码RNA以及其他功能未知的因子(如DOG1)也参与种子休眠的调控。
处于休眠状态的种子必须经过长时间储存(即后熟作用)、或低温处理打破休眠，种子才能够正常的萌发，从而避免了胎萌和穗发芽现象的发生。所以种子休眠现象在农业生产上也具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种植物种子休眠相关的RVE1蛋白及其编码基因与应用。
本发明保护一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：将编码RVE1蛋白的基因导入出发植物，得到转基因植物；所述转基因植物满足如下(a1)或(a2)中的至少一种表型：
(a1)种子萌发率低于所述出发植物；
(a2)种子休眠程度高于所述出发植物。
所述RVE1蛋白是如下(b1)或(b2)：
(b1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b2)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与调控种子休眠与萌发相关的由序列1衍生的蛋白质。
所述“编码RVE1蛋白的基因”为如下(1)或(2)或(3)或(4)：
(1)其编码区如序列表的序列2自5’末端第1-1161位核苷酸所示的DNA分子；
(2)序列表中序列2所示的DNA分子；
(3)在严格条件下与(1)或(2)限定的DNA序列杂交且编码具有调控种子休眠与萌发功能的蛋白质的DNA分子；
(4)与(1)或(2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码具有调控种子休眠与萌发功能的蛋白质的DNA分子。
所述方法中，所述编码RVE1蛋白的基因可以通过重组表达载体导入出发植物。所述重组表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。
所述出发植物为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物可为山柑目植物。所述山柑目植物可为十字花科植物。所述十字花科植物可为南芥族植物。所述南芥族植物可为拟南芥属植物。所述所述拟南芥属植物具体可为拟南芥，例如哥伦比亚生态型拟南芥。
所述方法中，所述“种子萌发率低于所述出发植物”指的是“低温破除休眠前种子萌发率低于所述出发植物”。所述“低温破除休眠”的方法具体可为“4℃放置72小时”。
本发明还保护一种蛋白质，获自拟南芥，命名为RVE1蛋白，是如下(b1)或(b2)：
(b1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b2)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与调控种子休眠与萌发相关的由序列1衍生的蛋白质。
为了使(b1)中的RVE1蛋白便于纯化和检测，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1标签的序列
| 标签 | 残基 | 序列 |
| Poly-Arg | 5-6(通常为5个) | RRRRR |
| Poly-His | 2-10(通常为6个) | HHHHHH |
| FLAG | 8 | DYKDDDDK |
| Strep-tag II | 8 | WSHPQFEK |
| c-myc | 10 | EQKLISEEDL |
上述(b2)中的RVE1蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b2)中的RVE1蛋白的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
编码所述RVE1蛋白的基因(RVE1基因)也属于本发明的保护范围。
所述基因具体可为如下(1)或(2)或(3)或(4)的DNA分子：
(1)其编码区如序列表的序列2自5’末端第1-1161位核苷酸所示的DNA分子；
(2)序列表中序列2所示的DNA分子；
(3)在严格条件下与(1)或(2)限定的DNA序列杂交且编码调控种子休眠与萌发功能的蛋白质的DNA分子；
(4)与(1)或(2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码具有调控种子休眠与萌发功能的蛋白质的DNA分子。
上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。
含有所述RVE1基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。
所述重组表达载体具体可为将双元载体pRI101AN-6myc的EcoR I和Sal I酶切位点之间的小片段取代为了序列表的序列1的自5′端第1-1161位核苷酸所示的DNA分子得到的重组质粒。
本发明还保护所述RVE1蛋白或其编码基因的应用，为如下(c1)至(c5)中的至少一种：
(c1)调控植物种子萌发；
(c2)抑制植物种子萌发；
(c3)降低植物种子的萌发率；
(c4)调控植物种子休眠；
(c5)促进植物种子休眠；
所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物可为山柑目植物。所述山柑目植物可为十字花科植物。所述十字花科植物可为南芥族植物。所述南芥族植物可为拟南芥属植物。所述所述拟南芥属植物具体可为拟南芥，例如哥伦比亚生态型拟南芥。
所述应用中，所述“抑制植物种子萌发”指的是“抑制植物种子低温破除休眠前的萌发”。所述“低温破除休眠”的方法具体可为“4℃放置72小时”。
本发明还保护所述RVE1蛋白、所述RVE1基因、所述重组表达载体、所述表达盒、所述转基因细胞系、所述重组菌或以上任一所述方法在植物育种中的应用。
所述育种的目的为培育种子萌发率低和/或种子休眠程度高的植物。
所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物可为山柑目植物。所述山柑目植物可为十字花科植物。所述十字花科植物可为南芥族植物。所述南芥族植物可为拟南芥属植物。所述所述拟南芥属植物具体可为拟南芥，例如哥伦比亚生态型拟南芥。
所述种子萌发率低指的是“低温破除休眠前种子萌发率低”。所述“低温破除休眠”的方法具体可为“4℃放置72小时”。
本发明从拟南芥中获得一个调节种子休眠和萌发的基因RVE1，其编码的蛋白可以调控种子的萌发过程和种子的休眠程度，在农业生产上具有重要的意义。
附图说明
图1为各株系种子萌发情况观察及统计结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
双元载体pRI101AN-6myc：参考文献：Xu G，Guo H，Zhang D，etal.REVEILLE1promotes NADPH：protochlorophyllideoxidoreductase A expression andseedling greening in Arabidopsis[J].Photosynthesis Research，2015，126(2-3)：1-10.；公众可以从中国科学院植物研究所获得。
根癌农杆菌GV3101：参考文献：Clough S J，Bent A F.Floral dip：a simplifiedmethod for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.[J].Plant Journal，1998，16(6)：735-743.；公众可以从中国科学院植物研究所获得。
哥伦比亚生态型拟南芥：参考文献：Swarup K，Alonso-Blanco C，Lynn JR，Michaels SD，Amasino RM，Koornneef M，Millar AJ.Natural allelic variationidentifies new genes in the Arabidopsis circadian system.PlantJournal.1999，20(1)：67-77.；公众可以从中国科学院植物研究所获得。
RVE1功能缺失突变植株：以哥伦比亚生态型拟南芥为出发植株，使用T-DNA插入的方法得到的突变植株；经测序验证，与哥伦比亚生态型拟南芥相比该突变植株的区别仅在于在序列表的序列2所示RVE1基因中插入了T-DNA从而引起了RVE1基因失活。
实施例1、RVE1蛋白及其编码基因的获得
提取哥伦比亚生态型拟南芥的总RNA，并反转录为cDNA。经过大量序列分析、表达量分析与功能验证，从cDNA中发现了一个DNA编码序列，如序列表的序列2所示，其编码的蛋白质如序列表的序列1所示。
将序列表的序列1所示的蛋白质命名为RVE1蛋白，由387个氨基酸残基组成。将编码RVE1蛋白的基因命名为RVE1基因，其开放阅读框如序列表的序列2所示。
实施例2、重组表达载体构建
1、提取哥伦比亚生态型拟南芥的总RNA并反转录为cDNA，以cDNA为模板，采用F和R组成的引物对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物。
F：5’-GAATTCATGGCGTCGTCTCCGTTGACTG-3’；
R：5’-GTCGACTAAGTGGAGATGAATCTCATGC-3’。
F和R中，下划线分别标注EcoR I和Sal I酶切位点。
2、用限制性内切酶EcoR I和Sal I双酶切步骤1的PCR扩增产物，回收酶切产物。
3、用限制性内切酶EcoR I和Sal I双酶切双元载体pRI101AN-6myc，回收约10.4kb的载体骨架。
4、将步骤2得到的酶切产物和步骤3得到的载体骨架连接，得到重组表达载体pRI101-RVE1-6myc。根据测序结果，对重组表达载体pRI101-RVE1-6myc进行结构描述如下：将双元载体pRI101AN-6myc载体的EcoR I和Sal I酶切位点之间的小片段取代为了序列表的序列1的自5′端第1-1161位核苷酸所示的双链DNA分子。
实施例3、RVE1蛋白的功能验证
一、培育转基因植物
1、将重组表达载体pRI101-RVE1-6myc导入根癌农杆菌GV3101，得到重组农杆菌。
2、采用花芽浸泡法(Clough and Bent，Floral dip：a simplified method forAgrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.PlantJournal1998，16：735-743.)，用步骤1得到的重组农杆菌侵染哥伦比亚生态型拟南芥，收获T1代种子。T2代表示T1代自交产生的种子及由它所长成的植株，T3代表示T2代自交产生的种子及由它所长成的植株。在含50mg/L卡那霉素的MS固体培养基平板上筛选T1代植株并进行T2代和T3代的分离比统计，在T3代得到单拷贝插入的纯合转RVE1基因拟南芥株系。
3、将双元载体pRI101AN-6myc导入农杆菌菌株GV3101，得到重组农杆菌。
4、采用花芽浸泡法(Clough and Bent，Floral dip：a simplified method forAgrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.PlantJournal1998，16：735-743.)，用步骤3得到的重组农杆菌哥伦比亚生态型拟南芥，收获T1代种子。T2代表示T1代自交产生的种子及由它所长成的植株，T3代表示T2代自交产生的种子及由它所长成的植株。在含50mg/L卡那霉素的MS固体培养基平板上筛选T1代植株并进行T2代和T3代的分离比统计，在T3代得到转空载体拟南芥株系。
二、表型检测
待测植物分别为：哥伦比亚生态型拟南芥(COL)、RVE1功能缺失突变植株(rve1-2)、纯合转RVE1基因拟南芥株系的T3代植株(RVE1-OE)、转空载体拟南芥株系的T3代植株。
(1)将待测植株的种子用1％次氯酸钠消毒5min，用无菌水洗五次。
(2)完成步骤(1)后，将种子播种在0.6％Agar(pH 5.7)上，在23℃、长日照条件(16小时光照/8小时黑暗)下培养5天，观察种子萌发情况并统计种子萌发率。
(3)完成步骤(1)后，将种子播种在0.6％Agar(pH 5.7)培养基上，在23℃、黑暗条件(24小时黑暗)培养5天，观察种子萌发情况并统计种子萌发率。
进行三次重复试验，每次重复试验中每个株系100粒种子，结果取平均值。
结果如图1所示。图1A为步骤(2)或步骤(3)中培养5天后种子萌发表型观察结果，图1B为步骤(2)中日照条件下培养5天后种子萌发率统计结果，图1C为步骤(3)中黑暗条件下培养5天后种子萌发率统计结果。结果表明，在长日照和黑暗条件下，转RVE1基因拟南芥的萌发率均显著低于哥伦比亚生态型拟南芥，几乎全不萌发，在黑暗条件下，RVE1功能缺失突变植株的萌发率显著高于哥伦比亚生态型拟南芥，转空载体拟南芥种子萌发率与哥伦比亚生态型拟南芥无显著差异。说明RVE1在调控种子休眠方面起着非常重要的作用。
(4)完成步骤(2)或步骤(3)后，将未萌发的种子4℃放置72小时(目的是打破休眠)，然后再次置于在0.6％Agar(pH 5.7)上，23℃、长日照条件(16小时光照/8小时黑暗)下培养5天，均正常萌发。因此RVE1过表达可以增强种子休眠，但不影响在农业生产上的种子萌发。
Claims (5)
1.一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：将编码RVE1蛋白的基因导入出发植物，得到转基因植物；所述转基因植物满足如下（a1）或（a2）中的至少一种表型：
（a1）种子萌发率低于所述出发植物；
（a2）种子休眠程度高于所述出发植物；
所述RVE1蛋白是由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述“编码RVE1蛋白的基因”为如下（1）或（2）：
（1）其编码区如序列表的序列2自5’末端第1-1161位核苷酸所示的DNA分子；
（2）序列表中序列2所示的DNA分子。
3.RVE1蛋白的应用，为如下（c2）、（c3）和（c5）中的至少一种：
（c2）抑制植物种子萌发；
（c3）降低植物种子的萌发率；
（c5）促进植物种子休眠；
所述RVE1蛋白的氨基酸序列如的序列表中序列1所示。
4.编码RVE1蛋白的基因的应用，为如下（c2）、（c3）和（c5）中的至少一种：
（c2）抑制植物种子萌发；
（c3）降低植物种子的萌发率；
（c5）促进植物种子休眠；
所述编码RVE1蛋白的基因为如下（1）或（2）：
（1）其编码区如序列表的序列2自5’末端第1-1161位核苷酸所示的DNA分子；
（2）序列表中序列2所示的DNA分子。
5.如权利要求3或4所述的应用，其特征在于：所述植物为双子叶植物。
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