CN107281494A - 一种氧化石墨烯‑鱼精蛋白/海藻酸钠复合物的制备方法及应用 - Google Patents

一种氧化石墨烯‑鱼精蛋白/海藻酸钠复合物的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种氧化石墨烯‑鱼精蛋白/海藻酸钠复合物的制备方法及应用，属于材料合成和生物医药技术领域。以可负载药物的小尺寸氧化石墨烯（GO）为内核，采用层层自组装技术，依次由鱼精蛋白硫酸盐和海藻酸钠通过非共价吸附而形成壳层。本发明的层层自组装纳米载体水中分散性能和稳定性良好。其利用天然的鱼精蛋白硫酸盐和海藻酸钠作为聚电解质，以小尺寸氧化石墨烯为核心，所有的材料都具有良好的生物相容性；将抗肿瘤药物负载于核心内部，载药量大，稳定性好，并且赋予药物长效释放性能，降低了单纯使用药物的毒副作用。

Description

一种氧化石墨烯-鱼精蛋白/海藻酸钠复合物的制备方法及 应用
技术领域
本发明涉及一种基于层层自组装技术的氧化石墨烯-鱼精蛋白/海藻酸钠复合材料的制备方法及其在抗肿瘤药物载体方面的应用，属于材料合成和生物医药技术领域。
背景技术
肿瘤是威胁人类健康的最主要疾病之一。传统的肿瘤治疗如化疗、放疗虽然对原发肿瘤有较好的治疗效果，但是往往毒副作用较大，因此迫切需要寻求新型且更为智能安全的肿瘤治疗方法。随着科学技术的发展，纳米科技受到越来越广泛的关注。大量研究表明，纳米粒子能将治疗药物有效地传递到靶组织或靶细胞，增加药物的体内循环时间，避免药物的降解失活。纳米粒子表面修饰后，能进行靶向功能化，防止巨噬细胞摄取，减少不良反应。因此，纳米给药系统已经成为研究者们关注的热点。
氧化石墨烯（graphene oxide, GO）因结构稳定，比表面积巨大，易修饰改性，生物相容性好，今年来逐渐受到研究者的关注。GO可通过吸附法大量携载各类药物及基因，包括喜树碱、阿霉素、质粒DNA、siRNA等，对阿霉素的负载超过200 %。除此之外，氧化石墨烯还具有近红外区的高效光吸收及产热性能。小鼠体内分布研究结果表明，氧化石墨烯主要积累于肝脏和脾脏，且具有肿瘤组织的被动靶向性，可经尿液和粪便排泄清除，体内蓄积毒性小。因此，利用GO作为抗肿瘤药物载体，不仅能够实现光热疗和药物化疗的联合应用，提升治疗效果。
然而，未经修饰的GO溶液对溶质、酸碱度、离子强度等溶液环境较敏感，在生理环境下易发生片层堆叠，影响其生物应用。本发明利用超声破碎法制备得到小尺寸氧化石墨烯纳米片，同时利用层层自组装技术，通过静电作用交替吸附鱼精蛋白硫酸盐和海藻酸钠，利用聚电解质稳定GO片层结构，制备得到在水中稳定分散的氧化石墨烯-鱼精蛋白/海藻酸钠复合材料。同时，聚合物的包覆还能够控制药物释放，使其在药物控释中发挥重要作用。
发明内容
本发明目的是针对GO材料对环境敏感，在生理环境下易发生片层堆叠及团聚的缺点，提供一种氧化石墨烯-鱼精蛋白/海藻酸钠复合材料的制备方法，该载体材料亲水性强，水中分散性好，稳定性佳，药物载药量大，可降低药物对正常组织的毒副作用，具有广阔的应用前景。
本发明所要解决的技术问题是：提供一种氧化石墨烯-鱼精蛋白/海藻酸钠复合材料的制备方法，所述复合材料以小尺寸氧化石墨烯为内核，鱼精蛋白硫酸盐和海藻酸钠为囊材，基于层层自组装技术制备。鱼精蛋白硫酸盐和海藻酸钠的包覆能够有效改善氧化石墨烯在生理条件下的团聚现象，并起到调节药物释放率的作用。
本发明采用以下技术方案解决其技术问题：
氧化石墨烯-鱼精蛋白/海藻酸钠复合材料的制备方法，按照以下步骤进行：（1）将市售氧化石墨烯水分散液用超声波细胞破碎仪破碎成小尺寸氧化石墨烯水分散液；
（2）鱼精蛋白硫酸盐溶解于去离子水中；
（3）在磁力搅拌状态下，将GO水分散液缓慢加入到该溶液并搅拌30分钟；随后将混合物用微孔滤膜抽滤洗涤三次，分散于纯水，得GO-鱼精蛋白水分散液；（4）海藻酸钠溶解于去离子水中；
（5）在磁力搅拌状态下，将GO-鱼精蛋白水分散液缓慢加入到海藻酸钠溶液并搅拌30分钟。随后将混合物用微孔滤膜抽滤洗涤三次，分散于纯水，得GO-鱼精蛋白/海藻酸钠水分散液。冷冻干燥，即得。
所述步骤(1)中超声波细胞破碎仪破碎中，超声功率250W-400W，超声时间0.5 h-2h，冰水浴。
步骤(3)中GO与鱼精蛋白硫酸盐质量比为1:1-1:10
步骤(5)中鱼精蛋白硫酸盐与海藻酸钠质量比为1:1。
所述步骤(3)中，GO水分散液浓度为0.2 mg/ml-1mg/ml。
所述步骤(2)中，鱼精蛋白硫酸盐浓度为0.2 mg/ml-2mg/ml。
所述步骤(4)中，海藻酸钠的浓度为0.2 mg/ml-2mg/ml。
所述氧化石墨烯-鱼精蛋白-海藻酸钠复合材料的应用，用于载药和药物控制释放领域。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：
1) 本发明制得的氧化石墨烯-鱼精蛋白/海藻酸钠复合材料，粒径分布均匀，载药量大，水中分散性好，无明显生理条件下的团聚现象。在低pH下释放快，降低了药物的毒副作用，具有广阔的应用前景；本发明操作简单，成本低，易于大规模生产，可以广泛应用于催化、传感器与生物医药等领域，特别是应用于载药和药物控制释放领域。
2) 本发明所述氧化石墨烯-鱼精蛋白/海藻酸钠复合材料的制备方法，通过非共价修饰改善氧化石墨烯的片层堆叠团聚，不涉及有机溶剂的使用，生物相容性好。
（四）附图说明
图1是实施例1所制备氧化石墨烯（A）、氧化石墨烯-鱼精蛋白/海藻酸钠（B）材料的原子力显微镜图谱；
图2是实施例1所制备的氧化石墨烯、氧化石墨烯-鱼精蛋白、氧化石墨烯-鱼精蛋白/海藻酸钠在纯水（左）、pH为7.4的PBS缓冲液（中）和含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液（右）中稳定性考察图；
图3是实施例4中盐酸阿霉素（a）、氧化石墨烯-盐酸阿霉素（b）、氧化石墨烯-鱼精蛋白-盐酸阿霉素（c）、氧化石墨烯-鱼精蛋白/海藻酸钠-盐酸阿霉素（d）材料在PBS介质中的分散图；
图4是实施例5所制备的氧化石墨烯-鱼精蛋白/海藻酸钠-盐酸阿霉素材料的体外释药图。
（五）具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：
（1）将氧化石墨烯水分散液用细胞破碎仪破碎成小尺寸氧化石墨烯水分散液，功率400w，超声时间半小时，冰水浴进行；（2）鱼精蛋白硫酸盐溶解于去离子水中，配成1 mg/ml溶液；（3）在磁力搅拌状态下，将1 mg/ml GO水分散液缓慢加入到该溶液并搅拌30分钟。GO与鱼精蛋白硫酸盐质量比为1:4。随后将混合物用微孔滤膜抽滤洗涤三次，分散于纯水，得GO-鱼精蛋白水分散液；（4）海藻酸钠溶解于去离子水中，配成1 mg/ml溶液；（5）在磁力搅拌状态下，将GO-鱼精蛋白水分散液缓慢加入到海藻酸钠溶液并搅拌30分钟。鱼精蛋白硫酸盐与海藻酸钠质量比为1:1。随后将混合物用0.22 μm微孔滤膜抽滤洗涤三次，分散于纯水，得GO-鱼精蛋白/海藻酸钠水分散液。冷冻干燥，即得。
如原子力显微镜图像结果所示（图1A），氧化石墨烯的平均尺寸在300 nm左右，厚度在2 nm左右，表明通过细胞破碎超声成功制备小尺寸氧化石墨烯。经鱼精蛋白硫酸盐和海藻酸钠层层自组装修饰以后，其厚度增加到40 nm，尺寸增加到400 nm左右（图1B），这表明两种电解质成功地聚合到了GO的表面。动态光散射粒径分析结果表明，氧化石墨烯的平均尺寸327nm±2 nm，表明通过细胞破碎超声成功制备小尺寸氧化石墨烯。经鱼精蛋白硫酸盐和海藻酸钠层层自组装修饰以后，粒径变为451 nm±5 nm，这表明两种电解质成功地聚合到了GO的表面。GO的Zeta电位为－33.25 mV，鱼精蛋白硫酸盐包裹以后，Zeta电位变为＋30.13 mV。海藻酸钠包裹以后，Zeta电位转为－24.47 mV，表明两种带相反电荷的聚电解质经由层层自组装的方法已经成功地包裹到了GO表面。稳定性结果（图2）表明，氧化石墨烯-鱼精蛋白/海藻酸钠复合材料在三种分散介质中分散良好，说明GO被鱼精蛋白硫酸盐和海藻酸钠层层自组装包裹可以有效地改善其分散性和稳定性。
实施例2：
（1）将氧化石墨烯水分散液用细胞破碎仪破碎成小尺寸氧化石墨烯水分散液，功率250w，超声时间2小时，冰水浴进行；（2）鱼精蛋白硫酸盐溶解于去离子水中，配成0.2 mg/ml溶液；（3）在磁力搅拌状态下，将0.2 mg/ml GO水分散液缓慢加入到该溶液并搅拌30分钟。GO与鱼精蛋白硫酸盐质量比为1:10。随后将混合物用微孔滤膜抽滤洗涤三次，分散于纯水，得GO-鱼精蛋白水分散液；（4）海藻酸钠溶解于去离子水中，，配成0.2 mg/ml溶液；（5）在磁力搅拌状态下，将GO-鱼精蛋白水分散液缓慢加入到海藻酸钠溶液并搅拌30分钟。鱼精蛋白硫酸盐与海藻酸钠质量比为1:1。随后将混合物用0.22 μm微孔滤膜抽滤洗涤三次，分散于纯水，得GO-鱼精蛋白/海藻酸钠水分散液。冷冻干燥，即得。
动态光散射粒径分析结果表明，GO粒径315 nm±3 nm，经鱼精蛋白硫酸盐和海藻酸钠层层自组装修饰以后粒径变为428 nm±4 nm。GO的Zeta电位为－33.78 mV，鱼精蛋白硫酸盐包裹以后，Zeta电位变为＋36.58 mV。稳定性结果表明，氧化石墨烯-鱼精蛋白/海藻酸钠复合材料在三种分散介质中分散良好。
实施例3：
（1）将氧化石墨烯水分散液用细胞破碎仪破碎成小尺寸氧化石墨烯水分散液，功率300w，超声时间1小时，冰水浴进行；（2）鱼精蛋白硫酸盐溶解于去离子水中，配成0.5 mg/ml溶液；（3）在磁力搅拌状态下，将0.5 mg/ml GO水分散液缓慢加入到该溶液并搅拌30分钟。GO与鱼精蛋白硫酸盐质量比为1:1。随后将混合物用微孔滤膜抽滤洗涤三次，分散于纯水，得GO-鱼精蛋白水分散液；（4）海藻酸钠溶解于去离子水中，配成0.5 mg/ml溶液；（5）在磁力搅拌状态下，将GO-鱼精蛋白水分散液缓慢加入到海藻酸钠溶液并搅拌30分钟。鱼精蛋白硫酸盐与海藻酸钠质量比为1:1。随后将混合物用0.22 μm微孔滤膜抽滤洗涤三次，分散于纯水，得GO-鱼精蛋白/海藻酸钠水分散液。冷冻干燥，即得。
动态光散射粒径分析结果表明，GO粒径327 nm±2 nm，经鱼精蛋白硫酸盐和海藻酸钠层层自组装修饰以后粒径变为405 nm± 5 nm。GO的Zeta电位为－28.23 mV，鱼精蛋白硫酸盐包裹以后，Zeta电位变为＋26.16 mV。稳定性结果表明，氧化石墨烯-鱼精蛋白/海藻酸钠复合材料在三种分散介质中分散良好。
实施例4：负载阿霉素的GO-鱼精蛋白/海藻酸钠复合材料的制备
将0.5 g GO-鱼精蛋白-海藻酸钠复合材料分散于纯水，加入 1 ml 盐酸阿霉素（DOX）的磷酸盐缓冲溶液（PBS，0.5 mg/ml，pH 7.4）混合均匀，37 ℃恒温振荡24 h，然后在13000rpm下用PBS缓冲液离心洗涤两次以除去未负载的盐酸阿霉素分子。上清液用紫外分光光度计于480 nm波长处测定吸光度，然后根据标准曲线求得未负载的DOX的量，从而可计算出DOX的负载率。结果表明，复合材料对盐酸阿霉素的负载量为110.64%。从负载之后材料的分散情况可以看出，经鱼精蛋白硫酸盐和海藻酸钠层层自组装修饰以后载药体系的稳定性得到明显改善（图3）。
实施例5：负载阿霉素的GO-鱼精蛋白/海藻酸钠复合材料的体外释放
将负载了DOX的样品分别加入到透析袋中，将其浸没在20 ml pH为5.0和7.4的PBS缓冲溶液中，放置在37 ℃恒温振荡箱中振荡并计时，在不同时间点依次将溶出介质全部取出并补充进新的20 ml PBS缓冲液继续振荡。将取出的溶出介质用荧光光度计（激发波长为488nm，测定波长为591 nm）测定荧光光谱，然后根据标准曲线求得阿霉素的释放量。每组三个平行样，计算后取平均值，结果如图4所示。从图3看出，粒子具有明显的pH敏感性，在pH 7.4的环境中释放较缓慢且不完全，而在弱酸性条件下，随着pH值的增加，释放逐渐加快。

Claims (8)

1.氧化石墨烯-鱼精蛋白/海藻酸钠复合材料的制备方法，其特征在于按照以下步骤进行：（1）将市售氧化石墨烯水分散液用超声波细胞破碎仪破碎成小尺寸氧化石墨烯水分散液；
（2）鱼精蛋白硫酸盐溶解于去离子水中；
（3）在磁力搅拌状态下，将GO水分散液缓慢加入到该溶液并搅拌30分钟；随后将混合物用微孔滤膜抽滤洗涤三次，分散于纯水，得GO-鱼精蛋白水分散液；
（4）海藻酸钠溶解于去离子水中；
（5）在磁力搅拌状态下，将GO-鱼精蛋白水分散液缓慢加入到海藻酸钠溶液并搅拌30分钟；
随后将混合物用微孔滤膜抽滤洗涤三次，分散于纯水，得GO-鱼精蛋白/海藻酸钠水分散液；
冷冻干燥，即得。
2.根据权利要求1所述的氧化石墨烯-鱼精蛋白/海藻酸钠复合材料的制备方法，其特征在于所述步骤(1)中超声波细胞破碎仪破碎中，超声功率250W-400W，超声时间0.5 h-2h，冰水浴。
3.根据权利要求1所述的氧化石墨烯-鱼精蛋白/海藻酸钠复合材料的制备方法，其特征在于步骤(3)中GO与鱼精蛋白硫酸盐质量比为1:1-1:10。
4.根据权利要求1所述的氧化石墨烯-鱼精蛋白/海藻酸钠复合材料的制备方法，其特征在于步骤(5)中鱼精蛋白硫酸盐与海藻酸钠质量比为1:1。
5.根据权利要求1所述的氧化石墨烯-鱼精蛋白/海藻酸钠复合材料的制备方法，其特征在于所述步骤(3)中，GO水分散液浓度为0.2 mg/ml-1mg/ml。
6.根据权利要求1所述的氧化石墨烯-鱼精蛋白/海藻酸钠复合材料的制备方法，其特征在于所述步骤(2)中，鱼精蛋白硫酸盐浓度为0.2 mg/ml-2 mg/ml。
7.根据权利要求1所述的氧化石墨烯-鱼精蛋白/海藻酸钠复合材料的制备方法，其特征在于所述步骤(4)中，海藻酸钠的浓度为0.2 mg/ml-2 mg/ml。
8.权利要求1所述的氧化石墨烯-鱼精蛋白/海藻酸钠复合材料的应用，其特征在于用于载药和药物控制释放领域。
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