CN107267601A - Osbpl1a基因及其编码蛋白的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了OSBPL1A基因及其编码蛋白的用途，用于制备判别结核潜伏感染和活动性结核的产品。所述判别结核潜伏感染和活动性结核的产品优选包括：用实时定量PCR或基因芯片检测判别结核结核潜伏感染和活动性结核的产品。经实验证明，本发明OSBPL1A基因在结核病人血液中的表达明显高于健康人群以及潜伏感染人群。因此，OSBPL1A基因可作为诊断结核的特异标志基因，使结核诊断更加准确、快速。

Description

OSBPL1A基因及其编码蛋白的用途

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及OSBPL1A基因及其编码蛋白的用途。

背景技术

结核病(Tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌感染引起的慢性传染性疾病。尽管目 前已有有效的抗结核药物，但结核病仍然是当前感染性疾病的头号杀手，全球每年约200 万人死于结核病；全球约三分之一的人口感染结核分枝杆菌，在这些被称为结核菌潜伏感 染(LTBI)的人群中，有约10％最终将进展为活动性结核病。

由于目前缺乏有效的结核病疫苗，结核病的预防控制主要依赖于早期发现、治疗、隔 离活动性结核病人。然而，现今诊断活动性结核病的检测技术存在严重不足，不能满足临 床和结核病预防控制的要求：1)痰结核分枝杆菌微生物检查特异性高，是当前诊断活动性 肺结核的金标准，但存在敏感性低(不足40％)，耗时长(结核菌培养耗时1－2个月)，实验室生物安全要求高的缺点。2)结核分枝杆菌基因检测，虽然实现了快速诊断的目的(1天)，但直接从痰标本进行的基因检测在敏感性方面没有显著提高，且存在假阴性，假阳 性的问题。3)免疫学检测中抗体检测被世界卫生组织认定不适合结核病的诊断；细胞免疫 学检测包括结核菌素皮试(TST)和结核菌干扰素释放试验(IGRA)，不能有效区分活动性 结核患者和结核菌潜伏感染者，虽然后者在活动性结核患者检测的敏感性显著高于其他检 测。

OSBPL1A(氧固醇结合蛋白样1A)是一种蛋白质，是由OSBPL1A基因编码。这个基因编码的氧化固醇结合蛋白家族成员(OSBP)是一组细胞内脂质受体。这个蛋白家族的大多数成员包含一个N端PH结构域和一个高度保守的C-末端OSBP样固醇结合域，但是有些成 员只包含甾醇结合域。目前发现结核病人可表达OSBPL1A，然而其在结核中的作用机制并 不清楚。尚没有关于OSBPL1A基因作为结核诊断标志物的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种OSBPL1A基因及其编码蛋白用于结核潜伏感染和活动性结 核的分子标志物的用途。

为实现上述目的，本发明提供一种OSBPL1A基因及其编码蛋白的用途，其特征在于， 用于制备判别结核潜伏感染和活动性结核的产品的用途。

进一步，所述判别结核潜伏感染和活动性结核的产品包括：用实时定量PCR或基因芯 片检测判别结核潜伏感染和活动性结核的产品。

进一步，所述用实时定量PCR判别结核潜伏感染和活动性结核的产品至少包括一对特 异扩增OSBPL1A基因的引物。

进一步，所述特异扩增OSBPL1A基因的引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。

SEQ ID NO:1为(5'—3')CTGCCA CGTTTGACGCTTAC；记为OSBPL1AF；

SEQ ID NO:2为:(5'—3')CACTTTCAGAATCCGGCACT；记为OSBPL1AR。

进一步，所述用基因芯片检测判别结核潜伏感染和活动性结核的产品包括：与OSBPL1A 基因的核酸序列杂交的探针。

本发明的OSBPL1A基因及其编码蛋白的用途即可作为判别结核潜伏感染和活动性结核 的分子标志物。

利用本发明可以检测OSBPL1A基因的表达情况，从而判别是否患有活动性结核病。

在本发明中，术语“引物”是指一种寡核苷酸，可以是天然的也可以是合成的，它可以作为在一定条件下诱发DNA合成的起始点，在合适条件下诱发合成与核酸链互补的引物扩增产物，即在四种不同的三磷酸脱氧核糖核苷及一种聚合试剂(即DNA聚合酶或逆转录酶)存在下，在一种合适的缓冲液中并在合适的温度下进行扩增反应。优选的引物是单股寡脱氧核糖核苷酸。引物的合适长度取决于该引物的设计用途，但一般在15～25个核苷酸之间。

在本发明中，所述探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。

经实验证明，本发明OSBPL1A基因在结核病人血液中的表达明显高于健康人群以及潜 伏感染人群，因此OSBPL1A基因可作为诊断结核的特异标志基因，使结核诊断更加准确、 快速。

附图说明

图1是本发明实施例1的OSBPL1A基因在人外周血单个核细胞(PBMC)中差异表达的定量 RT-PCR结果图。

图2是OSBPL1A基因在PBMC中差异表达的芯片结果图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同 或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描 述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中 未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书 进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：

本实施例将人群分为三组：本实施例将人群分为三组：结核病患者、潜伏感染人群和 健康人群(各20例)，通过检测每例外周血单个核细胞(PBMC)中OSBPL1A基因mRNA变化，发现其在治愈结核病人中呈明显的下调表达趋势。

本实施例用定量RT-PCR方法检测每例OSBPL1A基因的表达变化。具体步骤如下：

步骤一：外周血单个核细胞(PBMC)悬液的制备

在离心管中加入淋巴细胞分离液(Fresenius Kabi NOrge As:LYS3773)5ml；取上述 确诊的结核病患者，潜伏感染病人以及健康人群的肝素抗凝静脉血各2ml与等体积量1M的 磷酸缓冲液(PBS)充分混匀得到混合液，用移液器将混合液沿管壁缓慢叠加于淋巴细胞分 离液液面上，保持清晰的界面，2000转/分离心20分钟；用吸管吸取中间云雾层置入另一离心管后接着加入5倍体积的1M PBS，1500转/分离心10分钟洗涤细胞，弃上清，相同条件重复洗涤细胞一次，接着加入含小牛血清体积百分比为10％的的RPMI1640(Thermo

scientific：SH30807.01b)1ml，重悬细胞，得到三组人群的各20例PBMC悬液；每例取20 μl的PBMC悬液于血球计数板上，计数细胞浓度。

步骤二：RNA抽提

采用Qiagene公司的RNeasy Mini Kit(货号74106)对上述得到的三组人群的各20例 PBMC悬液进行RNA抽提。具体操作是：取上述含1×106个细胞的PBMC悬液于去DNA酶和RNA 酶的离心管中，3000转/分离心10分钟，弃上清；在细胞沉淀中加入350μl Buffer RLT，充分混匀裂解；加入250μl无水乙醇，混匀，把液体转移到RNeasy柱子中，8,000g离心 30秒，弃废液；加入350μl Buffer RW1以8,000g离心30秒，弃废液；加入80μl DNase 溶液(10μlDNase+70μl Buffer RDD)，柱上消化15min，8,000g离心30秒，弃废 液；加入350μl BufferRW1，8,000g离心30秒，弃废液；加入500μl Buffer RPE，8,000 g离心30秒，弃废液；空甩，8,000g离心1分钟；把柱子转移到一个去DNA酶和RNA酶的1.5 ml离心管，加入40μl无RNase的ddH2O，10,000g离心1分钟，收集三组人群的各20例的 RNA于-80℃保存、待用。

步骤三：反转录

采用TAKARA公司的反转录试剂盒(DRR047)，取步骤二得到的RNA 0.5μg进行反转录，该试剂盒较传统反转录试剂盒增加了去除基因组DNA的步骤，可在最大程度上保证RNA的纯度和扩增的特异性。

分步如下:

(1)基因组DNA的去除反应

42℃温浴2min，于4℃下保存。

(2)反转录反应

反应体系配制均在冰上进行，具体体系如下：

37℃温浴15min，85℃放置5秒，反应完放4℃保存。

步骤四：荧光定量PCR反应

模板：上述反转录产物作为荧光定量PCR反应的模板，模板用量为1μl。利用OSBPL1A 基因(NM_080597.2)和GADPH基因(NM_002046.4)序列，设计两对引物。由英潍捷基(上 海)贸易有限公司合成，序列如下：

通过上述OSBPL1A上下游引物，得到的PCR产物长度为120bp；通过GADPH上下游引物，得到的PCR产物长度为243bp。

PCR反应的体系：

PCR反应采用TAKARA公司的Premix Ex TaqTMII(货号：DRR081D)，此产品能够抑制非特异性反应，在宽广的范围内进行更加准确的定量。本Buffer和改良后的Hot

Start法用DNA聚合酶TaKaRa Ex Taq HS组合使用，可以进行再现性好、可信度高的Real Time PCR解析。

使用仪器为ABI 7500实时荧光定量PCR仪进行实时定量PCR反应。

实时定量PCR反应采用两步法PCR，扩增标准程序：95℃30秒；95℃5秒，60℃30 秒，40个循环。

根据实时定量PCR的结果，用ABI7500software v2.0.6对结果进行处理分析，以GADPH 基因为内参基因，利用2^-ΔΔCT的方法计算出结核患者和潜伏感染人群相对于健康人群的表达 量，结果如图1、2所示，其中横坐标表示不同的人群，纵坐标表示相对表达量(RQ)，纵 坐标越大表明其表达水平越高，结果表明，OSBPL1A在结核病人中的表达水平明显高于潜 伏感染以及健康人群的表达水平(见图1)，差异显著(P<0.05)。在图1中，“TB”指 活动性结核感染者，“LTBI”指潜伏性结核感染者，“HC”指健康对照。

根据上述实验结果，可通过定量RT-PCR诊断结核潜伏感染和活动性结核：设计OSBPL1A 基因的PCR引物，检测结核组织中OSBPL1A基因的表达量，如果OSBPL1A的表达量显著升 高，则说明患结核的可能性高，反之则低，以更好的区分活动性结核感染者与潜伏性结核 感染者。

实施例2

本实施例将人群分为三组：结核病患者9例，潜伏感染人群和健康人群均6例，通过基因芯片检测每例外周血单个核细胞(PBMC)中OSBPL1A基因mRNA变化，发现其在结核病患者中呈明显的上调表达趋势。

本实施例用基因芯片检测结核样本中OSBPL1A基因在TB、LTBI、和HC中基因表达水平的差异，包括如下四个步骤：

步骤一：芯片制备

目前制备芯片主要以玻璃片或硅片为载体，通过点样法将靶基因作为探针按顺序排列 在载体上，靶基因可分为基因组DNA、cDNA(或人工合成DNA)。

步骤二：样品制备

待测样品中总RNA的抽提步骤如下：分别分离结核病患者、潜伏感染者以及健康人群 的PBMC，再用Qiagene RNA提取试剂盒提取总RNA(其具体方法参照实施例1)，提取的 总RNA进一步用于样品cDNA探针制备，其过程包括荧光Cy3和Cy5探针的制备(cDNA第 一链标记)、纯化和定量，定量后的Cy3和Cy5标记的探针吸回至1.5ml离心管中，加热 抽干，保存于-20℃，待杂交。

所述定量后的Cy3和Cy5标记的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物，探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任 何长度都可以。

步骤三：芯片杂交

1)准备：(1)洗涤盖玻片，将盖玻片依次放入ddH2O、95％乙醇、ddH2O，各3min， 最后放入干燥的50ml离心管中1000转/分，离心3min，去除残留的水渍，放置待用； (2)配制0.1M的PBS溶液；(3)平衡杂交炉，用水平仪校准杂交炉，保持水平；(4) 配制如下洗片液：20×SSC溶液、10％(M/V)SDS溶液、洗液I(2×SSC/0.5％(M/V) SDS)、洗液II(1×SSC/0.1％(M/V)SDS)、洗片溶液III(0.1×SSC)。

2)预杂交配制预杂交液30μl(由9μl的20×SSPE缓冲液、3μl的50×Denhandts 缓冲液和18μl ddH2O组成)，取出芯片，将30μl预杂交液滴加于芯片上，盖上盖玻片， 然后将芯片放入加有0.1M PBS的杂交盒，置于42℃杂交炉中预杂交1小时，预杂交完成 之后取出芯片用ddH2O浸洗片刻，待盖玻片脱落后将芯片放入干燥的离心管中离心，去除 残留的水渍，即得到预杂交的芯片。

3)杂交取出经定量的Cy3和Cy5标记的探针1～5μl，各用9～15μl ddH2O充分溶 解混合于1.5ml离心管内，然后在此离心管继续加入Cy3/Cy5荧光标记探针的杂交液(由 9μl的20×SSPE缓冲液、3μl的50×Denhandts缓冲液和18μl ddH2O组成)得到杂 交混合液，接着取杂交混合液滴加在预杂交的芯片上，并盖上盖玻片得到杂交芯片，最后 将该杂交芯片放入加有0.1M PBS的杂交盒，置于42℃杂交箱中杂交12～20小时。

步骤四：信号检测

芯片杂交反应结束后，进行芯片洗涤，再通过扫描仪如激光共聚焦扫描仪进行扫描， 扫描后将图像转化为基于荧光强度的数字信号，用GenPix pro 6.0软件读取芯片数据， GenePix pro 6.0通过芯片的背景噪音以及杂交点的光强度分析，对每个点的光强度值校 准，并将每个杂交点的光强度转化为数据值。

为了研究OSBPL1A在三个不同人群中的变化情况，我们采取了one way ANOVA结合Bonferroni相关系数的分析方法，阈值设置为p<0.05，最终经分析，由基因芯片检测结 核中OSBPL1A基因的表达差异，红色代表基因表达上调，绿色代表基因表达下调(图2中 标识A代表红色，标识B代表绿色；“TB”指活动性结核感染者，“LTBI”指潜伏性结核 感染者，“HC”指健康对照)。结果显示在结核病人中OSBPL1A基因表达显著上调，而在 LTBI和HC中，OSBPL1A的表达量都是下调的。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的， 不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况 下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 陈心春

<120> OSBPL1A基因的用途

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

ctgccacgtt tgacgcttac 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

cactttcaga atccggcact 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

gacagtcagc cgcatcttct 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

ttaaaagcag ccctggtgac 20

Claims (5)

1.一种OSBPL1A基因及其编码蛋白的用途，其特征在于，用于制备判别结核潜伏感染和活动性结核的产品的用途。

2.根据权利要求1所述的OSBPL1A基因及其编码蛋白的用途，其特征在于，所述判别结核潜伏感染和活动性结核的产品包括：用实时定量PCR或基因芯片检测判别结核潜伏感染和活动性结核的产品。

3.根据权利要求2所述的OSBPL1A基因及其编码蛋白的用途，其特征在于，所述用实时定量PCR判别结核潜伏感染和活动性结核的产品至少包括一对特异扩增OSBPL1A基因的引物。

4.根据权利要求3所述的OSBPL1A基因及其编码蛋白的用途，其特征在于，所述特异扩增OSBPL1A基因的引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。

5.根据权利要求2所述的OSBPL1A基因及其编码蛋白的用途，其特征在于，所述用基因芯片检测判别结核潜伏感染和活动性结核的产品包括：与OSBPL1A基因的核酸序列杂交的探针。