CN103131771B

CN103131771B - C1q基因及其编码蛋白的用途

Info

Publication number: CN103131771B
Application number: CN201210589473.0A
Authority: CN
Inventors: 陈心春; 杨倩婷; 周伯平; 蔡毅; 张明霞; 汤跃强; 赵桅
Original assignee: Third Peoples Hospital of Shenzhen
Current assignee: Third Peoples Hospital of Shenzhen
Priority date: 2012-12-29
Filing date: 2012-12-29
Publication date: 2014-04-30
Anticipated expiration: 2032-12-29
Also published as: CN103131771A

Abstract

本发明提供了一种C1q基因及其编码蛋白的用途，用于制备判别结核潜伏感染和活动性结核的产品,所述判别结核潜伏感染和活动性结核的产品优选包括：用实时定量PCR、基因芯片检测或免疫检测判别结核潜伏感染和活动性结核的产品。经实验证明，本发明C1q基因在结核病人血液中的表达明显高于健康人群以及潜伏感染人群，因此C1q基因可作为诊断结核的特异标志基因，使结核诊断更加准确、快速。

Description

C1q基因及其编码蛋白的用途

技术领域:

本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及C1q基因及其编码蛋白的用途。

背景技术：

结核病（Tuberculosis,TB）是由结核分枝杆菌感染引起的慢性传染性疾病，结核分枝杆菌不仅可引起肺结核（85%），而且可引起肺外多种器官的结核病。尽管目前已有有效的抗结核药物，但结核病仍然是当前感染性疾病的头号杀手，全球每年约200万人死于结核病；全球约三分之一的人口感染结核分枝杆菌，在这些被称为结核菌潜伏感染（LTBI）的人群中，有约10%最终将进展为活动性结核病。

由于目前缺乏有效的结核病疫苗，结核病的预防控制主要依赖于早期发现、治疗、隔离活动性结核病人。然而，现今诊断活动性结核病的检测技术存在严重不足，不能满足临床和结核病预防控制的要求：1）痰结核分枝杆菌微生物检查特异性高，是当前诊断活动性肺结核的金标准，但存在敏感性低（不足40%），耗时长（结核菌培养耗时1-2个月），实验室生物安全要求高的缺点。2）结核分枝杆菌基因检测，虽然实现了快速诊断的目的（1天），但直接从痰标本进行的基因检测在敏感性方面没有显著提高，且存在假阴性，假阳性的问题。3）免疫学检测中抗体检测被世界卫生组织认定不适合结核病的诊断；细胞免疫学检测包括结核菌素皮试（TST）和结核菌干扰素释放试验（IGRA），不能有效判别活动性结核患者和结核菌潜伏感染者，虽然后者在活动性结核患者检测的敏感性显著高于其他检测。

C1q是补体经典途径中的启动蛋白，具有各种免疫细胞反应的能力，在调控炎症反应、维持自身免疫耐受等方面发挥重要作用。C1q是一个大分子蛋白复合物，由6个亚单位构成,每个亚单位又含A、B、C 3条肽链组成，其分子量约400kDa，包含两个功能域：具有识别功能的球状头部（gC1q）和胶原样结构的尾部（cC1q）。研究发现C1q的球状头部识别并结合IC中的IgG,从而激活C1,启动各种细胞反应，包括吞噬作用、促进吞噬细胞对微生物的杀伤、诱导趋化作用、刺激氧化作用等。机体内存C 1q受体主要有两种，gC1qR和cC1qR，gC1qR是一个高度酸性的蛋白,除了红细胞,几乎所有的哺乳动物细胞都有gC1qR。它除了结合Clq,还能够结合许多病毒蛋白,如EB病毒的EBNA-1、HIVgp120,细菌蛋白,如金黄色葡萄球菌蛋白A、凝血酶,透明质酸等。cC1qR存在于细胞内质网中，它最初的功能被认为是在内质网中作为新生蛋白的伴侣分子，并且调控胞内Ca²+的稳态。相关研究表明，多种疾病中血清的C1q含量不同，骨髓炎、类风湿性关节炎、SLE、血管炎、硬皮病、痛风、活动期过敏性紫癜病人血清C1q含量显著增加；活动性混合性结缔组织病患者血清C1q含量显著降低。

目前尚没有关于C1q基因作为结核诊断标志物的报道。

发明内容：

本发明要解决的技术问题是提供一种C1q基因的用途，C1q基因可用作判别结核潜伏感染和活动性结核的分子标志物。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:

本发明提供了一种C1q基因及其编码蛋白的用途，用于制备判别结核潜伏感染和活动性结核的产品。

所述判别结核潜伏感染和活动性结核的产品优选包括：用实时定量PCR、基因芯片检测或免疫检测判别结核潜伏感染和活动性结核的产品。

所述用实时定量PCR判别结核潜伏感染和活动性结核的产品优选至少包括三对特异扩增C1q基因的引物。

所述特异扩增Clq基因的引物，分别优选为：

C1qA-F：5’-TCTGCACTGTACCCGGCTA-3’，

C1qA-R：5’-CCCTGGTAAATGTGACCCTTTT’；

C1qB-F：5’-AGGTGAATCGGGAGACTACAA-3’，

C1qB-R：5’-CACTGCGGGGCTCATAATTG-3’；

C1qC-F：5’-CCAACCCGCAGGGAGATTATG-3’，

C1qC-R：5’-CCGAGTTGACCTGATTGGTTTT-3’。

所述用基因芯片检测判别结核潜伏感染和活动性结核的产品优选包括：与C1q基因的核酸序列杂交的探针。

免疫检测判别结核潜伏感染和活动性结核的产品优选包括：与C1q蛋白特异性结合的抗体以及用于界定C1q表达细胞的其他抗体CD3/CD14/CD16的组合。

免疫检测判别结核潜伏感染和活动性结核的产品优选包括：与C1q蛋白特异性结合的C1q-FITC以及用于界定C1q表达细胞的其他抗体CD3-APC/cy7、CD14-percp/cy5.5和CD16-PE。

利用本发明的试剂盒，可以检测病人C1q基因的表达情况，从而诊断病人是否患有活动性结核病。

在本发明中，术语“引物”是指一种寡核苷酸，可以是天然的也可以是合成的，它可以作为在一定条件下诱发DNA合成的起始点，在合适条件下诱发合成与核酸链互补的引物扩增产物，即在四种不同的三磷酸脱氧核糖核苷及一种聚合试剂（即DNA聚合酶或逆转录酶）存在下，在一种合适的缓冲液中并在合适的温度下进行扩增反应。优选的引物是单股寡脱氧核糖核苷酸。引物的合适长度取决于该引物的设计用途，但一般在15～25个核苷酸之间。

在本发明中，所述探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。

在本发明中，可以使用一系列本领域已知的蛋白特异抗体。例如，CD3-APC/cy7、CD16-PE、CD14-precp-cy5.5以及C1q-FITC。

经实验证明，本发明C1q基因在结核病人血液中的表达明显高于健康人群以及潜伏感染人群，因此C1q基因可作为诊断结核的特异标志基因，使结核诊断更加准确、快速。

附图说明：

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是本发明实施例1的C1q亚基基因C1qA在人外周血单个核细胞(PBMC)中差异表达的定量RT-PCR结果图。

图2是本发明实施例1的C1q亚基基因C1qB在人外周血单个核细胞(PBMC)中差异表达的定量RT-PCR结果图。

图3是本发明实施例1的C1q亚基基因C1qC在人外周血单个核细胞(PBMC)中差异表达的定量RT-PCR结果图。

图4是本发明实施例2的C1q基因在PBMC中差异表达的芯片结果图。

图5是本发明实施例3的C1q蛋白流式分选的结果图。

具体实施方式：

下面结合实施例和附图对本发明进行进一步描述：

实施例1

本实施例将人群分为三组：结核病患者、潜伏感染人群和健康人群（各20例），通过检测每例外周血单个核细胞(PBMC)中C1q基因mRNA变化，发现其在结核病患者中呈明显的上调表达趋势。

本实施例用定量RT-PCR方法检测每例C1q基因的表达变化。具体步骤如下：

步骤一：外周血单个核细胞（PBMC）悬液的制备

在离心管中加入淋巴细胞分离液（Fresenius Kabi NOrgeAs:LYS3773）5ml；取上述确诊的结核病患者，潜伏感染病人以及健康人群的肝素抗凝静脉血各2ml与等量1M的磷酸缓冲液（PBS）充分混匀得到混合液，用移液器将混合液沿管壁缓慢叠加于淋巴细胞分离液液面上，保持清晰的界面，2000转/分离心20分钟；用吸管吸取中间云雾层置入另一离心管后接着加入5倍体积的1M PBS，1500转/分离心10分钟洗涤细胞，弃上清，相同条件重复洗涤细胞一次，接着加入含小牛血清体积百分比为10％的的RPMI 1640（Thermo scientific：SH30807.01b）1ml，重悬细胞，得到三组人群的各20例PBMC悬液；每例取20μl的PBMC悬液于血球计数板上，计数细胞浓度。

步骤二：RNA抽提

采用Qiagene公司的RNeasy Mini Kit（货号74106）对上述得到的三组人群的各20例PBMC悬液进行RNA抽提。具体操作是：取上述含1×10⁶个细胞的PBMC悬液于去DNA酶和RNA酶的离心管中，3000转/分离心10分钟，弃上清；在细胞沉淀中加入350μl Buffer RLT，充分混匀裂解；加入250μl无水乙醇，混匀，把液体转移到RNeasy柱子中，8,000g离心30秒，弃废液；加入350μl Buffer RW1以8,000g离心30秒，弃废液；加入80μl DNase溶液（10μl DNase+70μl BufferRDD），柱上消化15min，8,000g离心30秒，弃废液；加入350μl BufferRW1，8,000g离心30秒，弃废液；加入500μl Buffer RPE，8,000g离心30秒，弃废液；空甩，8,000g离心1分钟；把柱子转移到一个去DNA酶和RNA酶的1.5ml离心管，加入40μl无RNase的ddH₂O，10,000g离心1分钟，收集三组人群的各20例的RNA于-80℃保存、待用。

步骤三：反转录

采用TAKARA公司的反转录试剂盒（DRR047），取步骤二得到的RNA0.5μg进行反转录，该试剂盒较传统反转录试剂盒增加了去除基因组DNA的步骤，可在最大程度上保证RNA的纯度和扩增的特异性。

分步如下:

（1）基因组DNA的去除反应

表1

按照表1配好反应体系后，在42℃温浴2min，于4℃下保存。

（2）反转录反应

反应体系配制均在冰上进行，具体体系如下：

表2

按照表2配好反应体系后，在37℃温浴15min，85℃放置5秒，反应完放4℃保存。

步骤四：荧光定量PCR反应

模板：上述反转录产物作为荧光定量PCR反应的模板，模板用量为1μl。利用C1qA基因（NM_018340.2）、C1qB基因（NM_000491.3）、C1qC基因（NM_001114101.1）和GADPH基因（NM_002046.4）序列，用Primer Premier 5软件每个基因各设计一对引物。

引物：由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成，设计如表3：

表3

PCR反应的体系：

PCR反应采用TAKARA公司的SYBR

Premix Ex TaqTMII（货号：DRR081D），此产品能够抑制非特异性反应，在宽广的范围内进行更加准确的定量。本Buffer和改良后的Hot Start法用DNA聚合酶TaKaRa Ex Taq HS组合使用，可以进行再现性好、可信度高的RealTime PCR解析。

表4

按照表4配制荧光定量的反应液，并使用仪器为ABI 7500实时荧光定量PCR仪进行实时定量PCR反应。

实时定量PCR反应采用两步法PCR，扩增标准程序：95℃30秒；95℃5秒，60℃40秒，40个循环。

根据实时定量PCR的结果，用ABI7500 software v2.0.6对结果进行处理分析，以GADPH基因为内参基因，利用2^-ΔΔCT的方法计算出结核患者和潜伏感染人群相对于健康人群的表达量，结果如图1、2和3所示，其中横坐标表示不同的人群，纵坐标表示相对表达量，纵坐标越大表明其表达水平越高。结果表明，C1q的三个亚基的基因C1qA,C1qB和C1qC在结核病人中的表达水平明显高于潜伏感染以及健康人群的表达水平（见图1、2、3），差异显著（P<0.05）。在图1、2和3中，“TB”指活动性结核感染者，“LTBI”指潜伏性结核感染者，“HC”指健康对照。

根据上述实验结果，可通过定量RT-PCR判定结核潜伏感染和活动性结核：设计C1qA、C1qB和C1qC基因的PCR引物，检测结核组织中C1qA、C1qB和C1qC基因的表达量，如果C1q三个组分的表达量显著升高，则说明患结核的可能性高，反之则低，以更好的判别活动性结核感染者与潜伏性结核感染者。

实施例2

本实施例将人群分为三组：结核病患者9例，潜伏感染人群和健康人群均6例，通过基因芯片检测每例外周血单个核细胞(PBMC)中C1q基因mRNA变化，发现其在结核病患者中呈明显的上调表达趋势。

本实施例用基因芯片检测结核样本中C1q基因在TB、LTBI、和HC中基因表达水平的差异，包括如下四个步骤：

步骤一：芯片制备

目前制备芯片主要以玻璃片或硅片为载体，通过点样法将靶基因作为探针按顺序排列在载体上，靶基因可分为基因组DNA、cDNA（或人工合成DNA）。

步骤二：样品制备

待测样品中总RNA的抽提步骤如下：分别分离结核病患者、潜伏感染者以及健康人群的PBMC，再用Qiagene RNA提取试剂盒提取总RNA（其具体方法参照实施例1），提取的总RNA进一步用于样品cDNA探针制备，其过程包括荧光Cy3和Cy5探针的制备（cDNA第一链标记）、纯化和定量，定量后的Cy3和Cy5标记的探针吸回至1.5ml离心管中，加热抽干，保存于-20℃，待杂交。

所述探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。

步骤三：芯片杂交

1)准备：（1）洗涤盖玻片，将盖玻片依次放入ddH₂O、95%乙醇、ddH₂O，各3min，最后放入干燥的50ml离心管中1000转/分，离心3min，去除残留的水渍，放置待用；（2）配制0.1M的PBS溶液；（3）平衡杂交炉，用水平仪校准杂交炉，保持水平；（4）配制如下洗片液：20×SSC溶液、10%（M/V）SDS溶液、洗液I（2×SSC/0.5%（M/V）SDS）、洗液II（1×SSC/0.1%（M/V）SDS）、洗片溶液III（0.1×SSC）。

2)预杂交配制预杂交液30μl（由9μl的20×SSPE缓冲液、3μl的50×Denhandts缓冲液和18μl ddH₂O组成），取出芯片，将30μl预杂交液滴加于芯片上，盖上盖玻片，然后将芯片放入加有0.1MPBS的杂交盒，置于42℃杂交炉中预杂交1小时，预杂交完成之后取出芯片用ddH₂O浸洗片刻，待盖玻片脱落后将芯片放入干燥的离心管中离心，去除残留的水渍，即得到预杂交的芯片。

3)杂交取出经定量的Cy3和Cy5标记的探针1～5μl，各用9～15μl ddH₂O充分溶解混合于1.5ml离心管内，然后在此离心管继续加入Cy3/Cy5荧光标记探针的杂交液（由9μl的20×SSPE缓冲液、3μl的50×Denhandts缓冲液和18μl ddH₂O组成）得到杂交混合液，接着取杂交液滴加在预杂交的芯片上，并盖上盖玻片得到杂交芯片，最后将该杂交芯片放入加有0.1M PBS的杂交盒，置于42℃杂交箱中杂交12～20小时。

步骤四：信号检测

芯片杂交反应结束后，进行芯片洗涤，再通过扫描仪如激光共聚焦扫描仪进行扫描，扫描后将图像转化为基于荧光强度的数字信号，用GenPix pro 6.0软件读取芯片数据，GenePix pro 6.0通过芯片的背景噪音以及杂交点的光强度分析，对每个点的光强度值校准，并将每个杂交点的光强度转化为数据值。

为了研究C1q三个亚基基因三个不同人群中的变化情况，我们采取了one way ANOVA结合Bonferroni相关系数的分析方法，阈值设置为P<0.05，最终经分析，由基因芯片检测结核中C1q基因的表达差异，结果如图4所示，红色代表基因表达上调，绿色代表基因表达下调（图中标识A代表红色，标识B代表绿色）。结果显示在结核病人中C1q基因的3个组分C1qA、C1qB、C1qC的表达显著上调，而在LTBI和HC中，C1qA、C1qB、C1qC的表达量都是下调的。

实施例3

以下实施例将人群分为三组：结核病患者、潜伏感染人群和健康人群（各20例），通过免疫检测每例外周血单个核细胞(PBMC)C1q阳性细胞的含量，发现其在结核病患者中呈明显的上升趋势。

本实施例用流式细胞技术检测TB、LTBI和HC中C1q蛋白的表达变化，其具体步骤如下：

1)分别吸取TB、LTBI和HC的每例的外周血300μL于流式管；

2)在每个流式管中分别加入以下荧光标记抗体[CD3-APC/cy7(美国BD公司，货号300318)、CD14-percp/cy5.5(Biolegend公司，货号550787)、CD16-PE(美国BD公司，货号347617)和C1q-FITC(Abcam公司，货号ab4223)各2μL]，震荡混匀，室温下避光15min；

3)按照体积比（溶血素：ddH₂O=1:9）（溶血素：BDIS CatalogNo.349202）配制溶血素溶液，将其继续加入各流式管中，每流式管加入2ml，震荡混匀，室温下避光5-10min。

4)待管内液体变清亮透明后,1500r/min离心5min，将上层液体倒掉，并在干净的吸水纸上扣干；

5)接着在每个流式管中各加入3ml灭菌1M PBS，震荡混匀，1500r/min离心5min，弃上清，加入4%(M/V)的多聚甲醛溶液100μL固定，弃上清，加入1ml 1M PBS洗一次；

6)用BD FACSCanto II流式细胞仪进行检测。

检测统计结果按照C1q阳性的细胞数目占CD14阳性的细胞的百分比进行统计，结果如图5所示，其中纵坐标代表C1q阳性CD14阳性的细胞占CD14阳性细胞的总数的百分比，横坐标表示不同人群。统计结果表明，C1q阳性的细胞含量在TB中高于LTBI和HC，差异显著（P<0.05）。

Claims

1.一种扩增C1q基因的引物的用途，其特征在于，用于制备区分结核潜伏感染和活动性结核的试剂盒。

2.根据权利要求1所述的扩增C1q基因的引物的用途，其特征在于，所述区分结核潜伏感染和活动性结核的试剂盒包括：用实时定量PCR检测区分结核潜伏感染和活动性结核的试剂盒。

3.根据权利要求2所述的扩增C1q基因的引物的用途，其特征在于，所述用实时定量PCR区分结核潜伏感染和活动性结核的试剂盒至少包括三对特异扩增C1q基因的引物。

4.根据权利要求3所述的扩增C1q基因的引物的用途，其特征在于，

所述特异扩增C1q基因的引物，分别为：

C1qA-F：5’-TCTGCACTGTACCCGGCTA-3’，

C1qA-R：5’-CCCTGGTAAATGTGACCCTTTT’；

C1qB-F：5’-AGGTGAATCGGGAGACTACAA-3’，

C1qB-R：5’-CACTGCGGGGCTCATAATTG-3’；

C1qC-F：5’-CCAACCCGCAGGGAGATTATG-3’，

C1qC-R：5’-CCGAGTTGACCTGATTGGTTTT-3’。

5.包括具有与C1q基因的核酸序列杂交的探针的基因芯片的用途，其特征在于，用于制备区分结核潜伏感染和活动性结核的试剂盒。

6.包括与C1q蛋白特异性结合的抗体以及用于界定C1q表达细胞的其他抗体CD3/CD14/CD16的组合的用途，其特征在于，用于制备区分结核潜伏感染和活动性结核的试剂盒。

7.根据权利要求6所述的包括与C1q蛋白特异性结合的抗体以及用于界定C1q表达细胞的其他抗体CD3/CD14/CD16的组合的用途，其特征在于，所述区分结核潜伏感染和活动性结核的试剂盒包括：与C1q蛋白特异性结合的C1q-FITC以及用于界定C1q表达细胞的其他抗体CD3-APC/cy7、CD14-percp/cy5.5和CD16-PE。