CN107190057A - Naprt1基因及其编码蛋白的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了NAPRT1基因及其编码蛋白的用途，用于制备判别结核潜伏感染和活动性结核的产品。所述判别结核潜伏感染和活动性结核的产品优选包括：用实时定量PCR或基因芯片检测判别结核结核潜伏感染和活动性结核的产品。经实验证明，本发明NAPRT1基因在结核病人血液中的表达明显高于健康人群以及潜伏感染人群。因此，因此NAPRT1基因可作为诊断结核的特异标志基因，使结核诊断更加准确、快速。

Description

NAPRT1基因及其编码蛋白的用途

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及NAPRT1基因及其编码蛋白的用途。

背景技术

结核病(Tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌感染引起的慢性传染性疾病。结核病 仍然是当前危害人类健康最严重的传染病之一。中国现有超过500万名结核病活动性患者， 而感染结核病菌的人数则超过5亿人，占全国总人口的45％。；全球约三分之一的人口感染 结核分枝杆菌，在这些被称为结核菌潜伏感染(LTBI)的人群中，有约10％最终将进展为活 动性结核病。

造成结核病流行的现状有多个方面的原因，其中缺乏特异、有效的结核感染诊断技术 是重要的原因之一。由于不能早期发现和诊断结核菌感染/结核病，导致延误病人治疗机会， 增加治疗费用和死亡率，而对于社区结核病的预防控制来说，没有能够有效的控制传染源， 造成结核病的扩散。因此，研制特异有效的结核菌感染诊断试剂对结核病防治具有十分重 要的意义。

目前国内临床采用的结核菌感染实验室诊断方法主要有两类：微生物学检查和免疫学 检测。前者包括痰或组织标本找抗酸菌，结核分枝杆菌培养和PCR核酸检测；后者有抗体和 细胞免疫检测，细胞免疫检查包括PPD皮试和IGRA技术。细菌学检查是诊断结核病的金标准， 但临床上相当部分的病人没有办法留取痰标本，在能获得痰标本的病例中，即便是水平最 高的医院，抗酸染色和细菌培养检查的阳性率约为40％。采用PCR可以适当提高敏感性至70％ 左右，但同样受限于痰标本的有无。使用血清抗体检测简便易行，阳性率在50％－80％，但 特异性低，一般不超过70％。PPD皮试是目前检测结核菌感染最常用的细胞免疫检查方法， 虽然操作简单，但病人需要在皮试后72小时查验，最主要的是PPD皮试所用抗原与BCG有交 叉反应，无法区分BCG免疫反应和现症结核菌感染。利用免疫学检测目前最好的检测方法是 IGRA技术，其敏感性是现有的诊断技术中最高的。然而，IGRA检测无法有效区分活动性结 核和结核菌潜伏感染。对于我国这样的结核菌感染高发的地区，IGRA的诊断效率更为有限。

NAPRT1(nicotinate phosphoribosyltransferase domain containing 1，烟酸酯磷 酸核糖转移酶域1)是细胞代谢中的重要酶，其底物烟酸(NA)在NAD生物合成中的重要前体。NAPRT1能增强胞内NAD水平以及抑制氧化应激。目前发现结核病人可表达NAPRT1， 然而其在结核中的作用机制并不清楚。尚没有关于NAPRT1基因作为结核诊断标志物的报 道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种NAPRT1基因及其编码蛋白的用途，NAPRT1基因 及其编码蛋白可作为判别结核潜伏感染和活动性结核的分子标志物。

为实现上述目的，本发明提供NAPRT1基因及其编码蛋白的用途，其特征在于，用于制 备判别结核潜伏感染和活动性结核的产品的用途。

进一步，所述判别结核潜伏感染和活动性结核的产品包括：用实时定量PCR或基因芯 片检测判别结核潜伏感染和活动性结核的产品。

进一步，所述用实时定量PCR判别结核潜伏感染和活动性结核的产品至少包括一对特 异扩增NAPRT1基因的引物。

进一步，所述特异扩增NAPRT1基因的引物序列如SEQ ID NO:1和2所示。

SEQ ID NO:1为(5'—3')GCAGTAGTGGCTCCACCTG；记为NAPRT1F：

SEQ ID NO:2为(5'—3')TGGACATGCTGCAGTTAGC；记为NAPRT1R。

进一步，所述用基因芯片检测判别结核潜伏感染和活动性结核的产品包括：与NAPRT1 基因的核酸序列杂交的探针。

本发明的NAPRT1基因及其编码蛋白的用途即可作为判别结核潜伏感染和活动性结核的 分子标志物。

利用本发明可以检测NAPRT1基因的表达情况，从而判别是否患有活动性结核病。

在本发明中，术语“引物”是指一种寡核苷酸，可以是天然的也可以是合成的，它可以作为在一定条件下诱发DNA合成的起始点，在合适条件下诱发合成与核酸链互补的引物扩增产物，即在四种不同的三磷酸脱氧核糖核苷及一种聚合试剂(即DNA聚合酶或逆转录酶)存在下，在一种合适的缓冲液中并在合适的温度下进行扩增反应。优选的引物是单股寡脱氧核糖核苷酸。引物的合适长度取决于该引物的设计用途，但一般在15～25个核苷酸之间。

在本发明中，所述探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。

经实验证明，本发明NAPRT1基因在结核病人血液中的表达明显低于健康人群以及潜伏 感染人群，因此NAPRT1基因可作为诊断结核的特异标志基因，使结核诊断更加准确、快速。

附图说明

图1是本发明实施例1的NAPRT1基因在人外周血单个核细胞(PBMC)中差异表达的定量 RT-PCR结果图。

图2是本发明实施例2的NAPRT1基因在PBMC中差异表达的芯片结果图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同 或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描 述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中 未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书 进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：

将人群分为三组：结核病患者、潜伏感染人群和健康人群(各20例)，通过检测每例外周血单个核细胞(PBMC)中NAPRT1基因mRNA变化，发现其在治愈结核病人中呈明显的下调表达趋势。

本实施例用定量RT-PCR方法检测每例NAPRT1基因的表达变化。具体步骤如下：

步骤一：外周血单个核细胞(PBMC)悬液的制备

在离心管中加入淋巴细胞分离液(Fresenius Kabi NOrge As:LYS3773)5ml；取上述 确诊的结核病患者，潜伏感染病人以及健康人群的肝素抗凝静脉血各2ml与等体积量1M的 磷酸缓冲液(PBS)充分混匀得到混合液，用移液器将混合液沿管壁缓慢叠加于淋巴细胞分 离液液面上，保持清晰的界面，2000转/分离心20分钟；用吸管吸取中间云雾层置入另一离心管后接着加入5倍体积的1M PBS，1500转/分离心10分钟洗涤细胞，弃上清，相同条件重复洗涤细胞一次，接着加入含小牛血清体积百分比为10％的的RPMI1640(Thermoscientific：SH30807.01b)1ml，重悬细胞，得到三组人群的各20例PBMC悬液；每例取20 μl的PBMC悬液于血球计数板上，计数细胞浓度。

步骤二：RNA抽提

采用Qiagene公司的RNeasy Mini Kit(货号74106)对上述得到的三组人群的各20例 PBMC悬液进行RNA抽提。具体操作是：取上述含1×106个细胞的PBMC悬液于去DNA酶和RNA 酶的离心管中，3000转/分离心10分钟，弃上清；在细胞沉淀中加入350μl Buffer RLT，充分混匀裂解；加入250μl无水乙醇，混匀，把液体转移到RNeasy柱子中，8,000g离心30秒，弃废液；加入350μl Buffer RW1以8,000g离心30秒，弃废液；加入80μl DNase 溶液(10μlDNase+70μl Buffer RDD)，柱上消化15min，8,000g离心30秒，弃废 液；加入350μl BufferRW1，8,000g离心30秒，弃废液；加入500μl Buffer RPE，8,000 g离心30秒，弃废液；空甩，8,000g离心1分钟；把柱子转移到一个去DNA酶和RNA酶的1.5 ml离心管，加入40μl无RNase的ddH2O，10,000g离心1分钟，收集三组人群的各20例的 RNA于-80℃保存、待用。

步骤三：反转录

采用TAKARA公司的反转录试剂盒(DRR047)，取步骤二得到的RNA 0.5μg进行反转录，该试剂盒较传统反转录试剂盒增加了去除基因组DNA的步骤，可在最大程度上保证RNA的纯度和扩增的特异性。

分步如下:

(1)基因组DNA的去除反应

42℃温浴2min，于4℃下保存。

(2)反转录反应

反应体系配制均在冰上进行，具体体系如下：

37℃温浴15min，85℃放置5秒，反应完放4℃保存。

步骤四：荧光定量PCR反应

模板：上述反转录产物作为荧光定量PCR反应的模板，模板用量为1μl。利用NAPRT1基因(NM_145201.4)和GADPH基因(NM_002046.4)序列，设计两对引物。由英潍捷基(上 海)贸易有限公司合成，引物序列如下：

通过上述NAPRT1上下游引物，得到的PCR产物长度为120bp；通过GADPH上下游引物，得 到的PCR产物长度为243bp。

PCR反应的体系：

PCR反应采用TAKARA公司的 Premix Ex TaqTMII(货号：DRR081D)，此产品能够抑制非特异性反应，在宽广的范围内进行更加准确的定量。本Buffer和改良后的HotStart法用DNA聚合酶TaKaRa Ex Taq HS组合使用，可以进行再现性好、可信度高的RealTime PCR解析。

使用仪器为ABI 7500实时荧光定量PCR仪进行实时定量PCR反应。

实时定量PCR反应采用两步法PCR，扩增标准程序：95℃30秒；95℃5秒，60℃30 秒，40个循环。

根据实时定量PCR的结果，用ABI7500 software v2.0.6对结果进行处理分析，以GADPH 基因为内参基因，利用2^-ΔΔCT的方法计算出结核患者和潜伏感染人群相对于健康人群的表达 量，结果如图1、2所示，其中横坐标表示不同的人群，纵坐标表示相对表达量(RQ)，纵 坐标越大表明其表达水平越高，结果表明，NAPRT1在结核病人中的表达水平明显高于潜伏 感染以及健康人群的表达水平(见图1)，差异显著(P＜0.05)。在图1中，“TB”指活动性结核感染者，“LTBI”指潜伏性结核感染者，“HC”指健康对照。

根据上述实验结果，可通过定量RT-PCR诊断结核潜伏感染和活动性结核：设计NAPRT1 基因的PCR引物，检测结核组织中NAPRT1基因的表达量，如果NAPRT1的表达量显著升高， 则说明患结核的可能性高，反之则低，以更好的区分活动性结核感染者与潜伏性结核感染 者。

实施例2

本实施例将人群分为三组：结核病患者9例，潜伏感染人群和健康人群均6例，通过基因芯片检测每例外周血单个核细胞(PBMC)中NAPRT1基因mRNA变化，发现其在结核病患者中呈明显的上调表达趋势。

本实施例用基因芯片检测结核样本中NAPRT1基因在TB、LTBI、和HC中基因表达水平 的差异，包括如下四个步骤：

步骤一：芯片制备

目前制备芯片主要以玻璃片或硅片为载体，通过点样法将靶基因作为探针按顺序排列 在载体上，靶基因可分为基因组DNA、cDNA(或人工合成DNA)。

步骤二：样品制备

待测样品中总RNA的抽提步骤如下：分别分离结核病患者、潜伏感染者以及健康人群 的PBMC，再用Qiagene RNA提取试剂盒提取总RNA(其具体方法参照实施例1)，提取的 总RNA进一步用于样品cDNA探针制备，其过程包括荧光Cy3和Cy5探针的制备(cDNA第 一链标记)、纯化和定量，定量后的Cy3和Cy5标记的探针吸回至1.5ml离心管中，加热 抽干，保存于-20℃，待杂交。

所述定量后的Cy3和Cy5标记的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物，探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任 何长度都可以。

步骤三：芯片杂交

1)准备：(1)洗涤盖玻片，将盖玻片依次放入ddH2O、95％乙醇、ddH2O，各3min， 最后放入干燥的50ml离心管中1000转/分，离心3min，去除残留的水渍，放置待用； (2)配制0.1M的PBS溶液；(3)平衡杂交炉，用水平仪校准杂交炉，保持水平；(4) 配制如下洗片液：20×SSC溶液、10％(M/V)SDS溶液、洗液I(2×SSC/0.5％(M/V) SDS)、洗液II(1×SSC/0.1％(M/V)SDS)、洗片溶液III(0.1×SSC)。

2)预杂交配制预杂交液30μl(由9μl的20×SSPE缓冲液、3μl的50×Denhandts 缓冲液和18μl ddH2O组成)，取出芯片，将30μl预杂交液滴加于芯片上，盖上盖玻片， 然后将芯片放入加有0.1M PBS的杂交盒，置于42℃杂交炉中预杂交1小时，预杂交完成 之后取出芯片用ddH2O浸洗片刻，待盖玻片脱落后将芯片放入干燥的离心管中离心，去除 残留的水渍，即得到预杂交的芯片。

3)杂交取出经定量的Cy3和Cy5标记的探针1～5μl，各用9～15μl ddH2O充分溶 解混合于1.5ml离心管内，然后在此离心管继续加入Cy3/Cy5荧光标记探针的杂交液(由 9μl的20×SSPE缓冲液、3μl的50×Denhandts缓冲液和18μl ddH2O组成)得到杂 交混合液，接着取杂交混合液滴加在预杂交的芯片上，并盖上盖玻片得到杂交芯片，最后 将该杂交芯片放入加有0.1M PBS的杂交盒，置于42℃杂交箱中杂交12～20小时。

步骤四：信号检测

芯片杂交反应结束后，进行芯片洗涤，再通过扫描仪如激光共聚焦扫描仪进行扫描， 扫描后将图像转化为基于荧光强度的数字信号，用GenPix pro 6.0软件读取芯片数据， GenePix pro 6.0通过芯片的背景噪音以及杂交点的光强度分析，对每个点的光强度值校 准，并将每个杂交点的光强度转化为数据值。

为了研究NAPRT1在三个不同人群中的变化情况，我们采取了one way ANOVA结合Bonferroni相关系数的分析方法，阈值设置为p＜0.05，最终经分析，由基因芯片检测结 核中NAPRT1基因的表达差异，红色代表基因表达上调，绿色代表基因表达下调(图2中标 识A代表红色，标识B代表绿色；“TB”指活动性结核感染者，“LTBI”指潜伏性结核感 染者，“HC”指健康对照)。结果显示在结核病人中NAPRT1基因表达显著上调，而在LTBI 和HC中，NAPRT1的表达量都是下调的。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的， 不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况 下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 陈心春

<120> NAPRT1 基因的用途

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

gcagtagtgg ctccacctg 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

tggacatgct gcagttagc 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

gacagtcagc cgcatcttct 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

ttaaaagcag ccctggtgac 20

Claims (5)

1.一种NAPRT1基因及其编码蛋白的用途，其特征在于，用于制备判别结核潜伏感染和活动性结核的产品的用途。

2.根据权利要求1所述的NAPRT1基因及其编码蛋白的用途，其特征在于，所述判别结核潜伏感染和活动性结核的产品包括：用实时定量PCR或基因芯片检测判别结核潜伏感染和活动性结核的产品。

3.根据权利要求2所述的NAPRT1基因及其编码蛋白的用途，其特征在于，所述用实时定量PCR判别结核潜伏感染和活动性结核的产品至少包括一对特异扩增NAPRT1基因的引物。

4.根据权利要求3所述的NAPRT1基因及其编码蛋白的用途，其特征在于，所述特异扩增NAPRT1基因的引物序列如SEQ ID NO:1和2所示。

5.根据权利要求2所述的NAPRT1基因及其编码蛋白的用途，其特征在于，所述用基因芯片检测判别结核潜伏感染和活动性结核的产品包括：与NAPRT1基因的核酸序列杂交的探针。