CN107266583A - 一种基于格氏嗜盐碱杆菌Argonaute靶向激活基因转录的方法 - Google Patents

一种基于格氏嗜盐碱杆菌Argonaute靶向激活基因转录的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种NgAGO‑VP64融合蛋白和导向DNA（gDNA），以及一种基于格氏嗜盐碱杆菌Argonaute (NgAGO) 靶向激活内源基因转录的方法。所述NgAGO‑VP64融合蛋白的序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。所述导向DNA为SEQ ID NO.3～12所示序列片段中的任一种或几种的混合物。利用所述NgAGO‑VP64融合蛋白和导向DNA与转染试剂共转染细胞，可靶向激活内源基因转录。本发明证明了NgAGO具有结合导向DNA，并具有识别靶点基因组DNA的能力。首次发现NgAGO与VP64构建成的融合蛋白在细胞内具有激活内源基因的能力。本发明解决了近期大家对NgAGO应用的怀疑观望问题，并为后期开发为靶向基因组编辑工具和其它工具提供了支撑。

Description

一种基于格氏嗜盐碱杆菌Argonaute靶向激活基因转录的 方法
技术领域
本发明属于生物技术领域。更具体地，涉及一种基于格氏嗜盐碱杆菌Argonaute(NgAGO)靶向激活基因转录的方法。
背景技术
基因编辑技术指能够让人类对目标基因进行“编辑”，实现对特定DNA片段的敲除、加入等。在基础研究、基因治疗和遗传改良等方面展示出了巨大的潜力。因此，基因组编辑工具具有极大的理论和临床应用价值。
目前，基于ZFN和CAS9基因编辑工具的针对艾滋病和肿瘤的治疗新手段已经进入临床实验。并且，初期临床实验结果证明了其有效性。相对于ZFN的基于蛋白与DNA识别的基因组编辑工具，CAS9作为基于RNA与DNA碱基配对识别机制，具有易于操作、利于大批量构建等优点。但由于CAS9需要RNA具有特定二级结构并且识别DNA位点必须具有PAM结构，因此对识别位点具有一定选择性，在一定程度上限制了其应用的范围。
另外，基于DNA与DNA识别的、无二级结构需求的格氏嗜盐碱杆菌(Natronobacterium gregoryi)Argonaute(NgAGO)基因组编辑工具，具有更加广泛的应用前景。但是，目前对于NgAGO的基因组编辑功能，大家仍持有怀疑态度，因为国内国际上的众多科学家都无法重复这个发现。鉴于基于NgAGO的基因组编辑工具具有更加广泛的潜在应用前景，国内国际上众多科学家都试图开发这款工具，但都以失败告终。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有NgAGO基因组编辑工具技术和应用的缺陷及不足，我们的研究发现，格氏嗜盐碱杆菌(Natronobacterium gregoryi)Argonaute(NgAGO)具有结合导向DNA的能力，并具有识别靶点DNA的能力，但缺乏DNA切割能力。因此，本发明将NgAGO与VP64构建成融合蛋白，该蛋白在细胞内具有激活内源基因的能力。本发明解决了近期大家对NgAGO应用的问题，并为后期开发为靶向基因组编辑工具和其它工具提供了支撑。
本发明的目的是提供一种NgAGO-VP64融合蛋白及其在基因编辑或在制备NgAGO基因组编辑工具方面的应用。
本发明另一目的是提供一种基于格氏嗜盐碱杆菌Argonaute(NgAGO)靶向激活基因转录的方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种NgAGO-VP64融合蛋白，是由VP64与NgAGO融合表达获得。具体是将VP64融合到NgAGO的C末端(记为NgC)或N末端(记为NgN)，并进行人源化密码子优化所得。
所述融合蛋白的序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
基于所述NgAGO-VP64融合蛋白的结构进行的类似蛋白序列改变且具有相同功能的蛋白，也应在本发明范围之内。
一种表达NgAGO-VP64融合蛋白的质粒，是将NgAGO-VP64融合蛋白基因克隆到表达载体获得。
所述表达载体包括，但不局限于瞬时表达载体、病毒载体，真核表达载体和原核表达载体，具体如表达载体pCDNA3.1。
一种导向DNA(gDNA)，为SEQ ID NO.3～12所示序列片段中的任一种或几种的混合物。
优选地，所述导向DNA为SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.12任一所示序列片段，或SEQ ID NO.3～7所示序列片段的混合物，或SEQ ID NO.8～12所示序列片段的混合物。
上述NgAGO-VP64融合蛋白、质粒或导向DNA在基因编辑方面的应用，以及在制备NgAGO基因编辑工具方面的应用，都应在本发明的保护范围之内。
具体地，所述基因编辑是指激活内源基因的表达。其应用物种，不仅仅限制于人类细胞，还包括其他物种。
一种基于格氏嗜盐碱杆菌Argonaute靶向激活基因转录的NgAGO基因编辑工具，包括上述NgAGO-VP64融合蛋白或质粒，还包括上述导向DNA(gDNA)。
一种基于格氏嗜盐碱杆菌Argonaute靶向激活内源基因转录的方法，是上述NgAGO基因编辑工具与转染试剂共转染细胞。
具体地，该方法包括如下步骤：
S1.细胞传代培养至指数增长期，转染前0.5～2小时(优选1小时)，将细胞培养基换为无血清培养基，孵育0.5～2小时(优选1小时)；
S2.将NgAGO-VP64融合蛋白质粒和导向DNA稀释到无血清培养基中，转染试剂稀释到无血清培养基中，然后将两者混合，室温静置20～30分钟(优选25分钟)后，加入细胞中，2～4小时(优选3小时)后加入血清至终浓度为8～15％(优选10％)；
S3.第二天重复转染，但只需转染导向DNA(gDNA)。
其中，步骤S2所述NgAGO-VP64融合蛋白的序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
优选地，步骤S2所述导向DNA为SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.12任一所示序列片段，或SEQ ID NO.3～7所示序列片段的混合物，或SEQ ID NO.8～12所示序列片段的混合物。
优选地，步骤S2中NgAGO-VP64融合蛋白：导向DNA：无血清培养基＝0.5～2μg：0.5～2μl：100μl。
更优选地，步骤S2中NgAGO-VP64融合蛋白：导向DNA：无血清培养基＝1μg：1μl：100μl。
基于现有技术的研究结果以及我们自己前期的探索研究，我们推测目前无法将细菌AGO开发为基因组编辑工具的可能原因为两点：(1)NgAGO在哺乳动物细胞内不具有结合导向DNA并具有识别靶点基因组DNA的能力；(2)NgAGO在哺乳动物细胞内具有结合导向DNA并具有识别靶点基因组DNA的能力，但不具有DNA切割活性。
为了验证原因(2)，我们将NgAGO与转录激活蛋白VP64进行融合表达，并在哺乳细胞内表达。研究结果发现，NgAGO与VP64的融合蛋白可以激活细胞内基因Nanog，进而证实NgAGO在哺乳动物细胞内具有结合导向DNA并具有识别靶点基因组DNA的能力，但不具有DNA切割活性。
本发明具有以下有益效果：
本发明证明了NgAGO具有结合导向DNA，并具有识别靶点基因组DNA的能力。首次发现NgAGO与VP64构建成的融合蛋白，在细胞内具有激活内源基因的能力。在基于该发明的基础上，可以进一步将NgAGO与DNA切割酶融合(例如IsecI和FokI)并开发为靶向基因组编辑工具或其它工具。
本发明解决了近期大家对NgAGO应用的怀疑观望问题，并为后期开发为靶向基因组编辑工具和其它工具提供了支撑。
附图说明
图1为NgC和NgN的基因结构示意图。
图2为NgAGO-VP64(NgC)的序列组成；黑色非加粗部分为NgAGO蛋白序列，加粗且下划线部分为核定位信号，灰色阴影部分为VP64序列。
图3为VP64-NgAGO(NgN)的序列组成；黑色非加粗部分为NgAGO蛋白序列；加粗且下划线部分为核定位信号，灰色阴影部分为VP64序列。
图4为NgAGO与VP64融合蛋白可激活细胞内Nanog基因转录；(A)qPCR分析NgC激活细胞内Nanog基因转录水平，(B)qPCR分析NgN激活细胞内Nanog基因转录水平；NgC代表VP64融合到NgAGO的C端；NgN代表VP64融合到NgAGO的N端；N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、N10代表针对Nanog的不同导向DNA。N1-5代表N1、N2、N3、N4和N5的等体积混合物；N6-10代表N6、N7、N8、N9和N10的等体积混合物；Blank代表转染时不加入NgC、NgN或者导向DNA。*代表显著性差异P值小于0.01。
图5为NgC和NgN都可以激活细胞Nanog基因转录；NgC代表VP64融合到NgAGO的C端；NgN代表VP64融合到NgAGO的N端；N10代表针对Nanog的导向DNA；Ng代表没有融合VP64的NgAGO基因；Blank代表转染时不加入NgC、NgN或者导向DNA。*代表显著性差异P值小于0.01。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
以下实施例以Nanog基因为例，进行利用NgC(将VP64融合到NgAGO的C末端)和NgN(将VP64融合到NgAGO的N末端)激活细胞内基因研究。实施例1构建NgAGO-VP64融合蛋白
1、将VP64与NgAGO融合表达
为了防止蛋白相对位置对蛋白活性的影响，分别将VP64融合到NgAGO的C末端(NgC)和N末端(NgN)，蛋白序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示(基因结构示意图如图1所示，序列组成分别如图2和图3所示)。
2、将该蛋白序列进行人源化密码子优化后，分别克隆到哺乳动物表达载体pCDNA3.1上。质粒经测序验证正确后，质粒大提后用于后续实验。
实施例2导向DNA合成与磷酸化
1、设计导向DNA序列，如表1所示：
表1
导向DNA(gDNA)长度为24bp，合成后用1XT4PNK缓冲液(NEB)溶解至100μM。每1nmolgDNA用5单位T4PNK进行磷酸化，37℃孵育过夜。然后储存至-20℃，备用。
实施例3由NgAGO-VP64融合蛋白和导向DNA构成的NgAGO基因组编辑工具及其应用
1、一种基于格氏嗜盐碱杆菌Argonaute靶向激活基因转录的NgAGO基因组编辑工具，包括实施例1所述的NgAGO-VP64融合蛋白和实施例2所述的导向DNA。
2、NgAGO基因组编辑工具激活基因转录实验
(1)细胞培养与转染
转染前一天，对细胞进行传代培养，使转染时细胞为指数增长期。以细胞Hela为例，12孔板中每孔可铺细胞10万。转染前一小时，将细胞培养基换为无血清培养基孵育1小时。利用Lipofactamine2000转染试剂进行转染。
以12孔板中每孔的量为例，将1μg融合蛋白质粒与1μl gDNA稀释到100μl opti-MEM中；将2μl Lipofactamine2000稀释到100μl opti-MEM中，室温静置5分钟。然后将两者混合，室温静置25分钟后，加入细胞中，3小时后加入血清至终浓度为10％。
第二天重复转染过程，但只需转染gDNA即可。转染后48小时，细胞用于后续分析。
(2)RNA提取、cDNA反转录以及实时定量PCR检测
转染48小时后，细胞用Trizol(Thermo Scientific)进行裂解，经氯仿进一步裂解后，12000rpm离心15分钟，取上清并于等体积异丙醇混合。12000rpm离心15分钟，去上清，并用75％乙醇清洗沉淀，得RNA沉淀。RNA沉淀用DEPC水溶解后定量。
取2μg RNA进行cDNA反转录，反应体系为MMLV逆转录酶和随机引物(ThermoScientific)，共20μl。反转录完成后，将cDNA稀释4倍，用于实时定量PCR分析。所用试剂为Takara SYBG试剂盒，仪器为Biorad CFX 96。基因表达分析利用2-ΔΔct方法。
其中，用于qPCR的引物如表2所示：
表2 qPCR引物
(3)实验结果
图4中A图所示结果显示，位点N2、N5、N7、N10、N1-5、N6-10可以显著激活Nanog基因转录；B图所示结果显示，位点N9、N10可以显著激活Nanog基因转录。图5所示结果显示，NgC和NgN都可以激活细胞Nanog基因转录。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳大学
<120> 一种基于格氏嗜盐碱杆菌Argonaute靶向激活基因转录的方法
<130>
<160> 16
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1009
<212> PRT
<213> NgAGO-VP64 (NgC)
<400> 1
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1 5 10 15
Ile Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg
20 25 30
Lys Val Gly Ile His Gly Val Pro Ala Ala Met Thr Val Ile Asp Leu
35 40 45
Asp Ser Thr Thr Thr Ala Asp Glu Leu Thr Ser Gly His Thr Tyr Asp
50 55 60
Ile Ser Val Thr Leu Thr Gly Val Tyr Asp Asn Thr Asp Glu Gln His
65 70 75 80
Pro Arg Met Ser Leu Ala Phe Glu Gln Asp Asn Gly Glu Arg Arg Tyr
85 90 95
Ile Thr Leu Trp Lys Asn Thr Thr Pro Lys Asp Val Phe Thr Tyr Asp
100 105 110
Tyr Ala Thr Gly Ser Thr Tyr Ile Phe Thr Asn Ile Asp Tyr Glu Val
115 120 125
Lys Asp Gly Tyr Glu Asn Leu Thr Ala Thr Tyr Gln Thr Thr Val Glu
130 135 140
Asn Ala Thr Ala Gln Glu Val Gly Thr Thr Asp Glu Asp Glu Thr Phe
145 150 155 160
Ala Gly Gly Glu Pro Leu Asp His His Leu Asp Asp Ala Leu Asn Glu
165 170 175
Thr Pro Asp Asp Ala Glu Thr Glu Ser Asp Ser Gly His Val Met Thr
180 185 190
Ser Phe Ala Ser Arg Asp Gln Leu Pro Glu Trp Thr Leu His Thr Tyr
195 200 205
Thr Leu Thr Ala Thr Asp Gly Ala Lys Thr Asp Thr Glu Tyr Ala Arg
210 215 220
Arg Thr Leu Ala Tyr Thr Val Arg Gln Glu Leu Tyr Thr Asp His Asp
225 230 235 240
Ala Ala Pro Val Ala Thr Asp Gly Leu Met Leu Leu Thr Pro Glu Pro
245 250 255
Leu Gly Glu Thr Pro Leu Asp Leu Asp Cys Gly Val Arg Val Glu Ala
260 265 270
Asp Glu Thr Arg Thr Leu Asp Tyr Thr Thr Ala Lys Asp Arg Leu Leu
275 280 285
Ala Arg Glu Leu Val Glu Glu Gly Leu Lys Arg Ser Leu Trp Asp Asp
290 295 300
Tyr Leu Val Arg Gly Ile Asp Glu Val Leu Ser Lys Glu Pro Val Leu
305 310 315 320
Thr Cys Asp Glu Phe Asp Leu His Glu Arg Tyr Asp Leu Ser Val Glu
325 330 335
Val Gly His Ser Gly Arg Ala Tyr Leu His Ile Asn Phe Arg His Arg
340 345 350
Phe Val Pro Lys Leu Thr Leu Ala Asp Ile Asp Asp Asp Asn Ile Tyr
355 360 365
Pro Gly Leu Arg Val Lys Thr Thr Tyr Arg Pro Arg Arg Gly His Ile
370 375 380
Val Trp Gly Leu Arg Asp Glu Cys Ala Thr Asp Ser Leu Asn Thr Leu
385 390 395 400
Gly Asn Gln Ser Val Val Ala Tyr His Arg Asn Asn Gln Thr Pro Ile
405 410 415
Asn Thr Asp Leu Leu Asp Ala Ile Glu Ala Ala Asp Arg Arg Val Val
420 425 430
Glu Thr Arg Arg Gln Gly His Gly Asp Asp Ala Val Ser Phe Pro Gln
435 440 445
Glu Leu Leu Ala Val Glu Pro Asn Thr His Gln Ile Lys Gln Phe Ala
450 455 460
Ser Asp Gly Phe His Gln Gln Ala Arg Ser Lys Thr Arg Leu Ser Ala
465 470 475 480
Ser Arg Cys Ser Glu Lys Ala Gln Ala Phe Ala Glu Arg Leu Asp Pro
485 490 495
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500 505 510
Gly Asn Asn Glu Gln Gln Leu Arg Leu Leu Tyr Glu Asn Gly Glu Ser
515 520 525
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530 535 540
Phe Ser Lys Gly Ile Val Asn Pro Pro Glu Ser Phe Glu Val Ala Val
545 550 555 560
Val Leu Pro Glu Gln Gln Ala Asp Thr Cys Lys Ala Gln Trp Asp Thr
565 570 575
Met Ala Asp Leu Leu Asn Gln Ala Gly Ala Pro Pro Thr Arg Ser Glu
580 585 590
Thr Val Gln Tyr Asp Ala Phe Ser Ser Pro Glu Ser Ile Ser Leu Asn
595 600 605
Val Ala Gly Ala Ile Asp Pro Ser Glu Val Asp Ala Ala Phe Val Val
610 615 620
Leu Pro Pro Asp Gln Glu Gly Phe Ala Asp Leu Ala Ser Pro Thr Glu
625 630 635 640
Thr Tyr Asp Glu Leu Lys Lys Ala Leu Ala Asn Met Gly Ile Tyr Ser
645 650 655
Gln Met Ala Tyr Phe Asp Arg Phe Arg Asp Ala Lys Ile Phe Tyr Thr
660 665 670
Arg Asn Val Ala Leu Gly Leu Leu Ala Ala Ala Gly Gly Val Ala Phe
675 680 685
Thr Thr Glu His Ala Met Pro Gly Asp Ala Asp Met Phe Ile Gly Ile
690 695 700
Asp Val Ser Arg Ser Tyr Pro Glu Asp Gly Ala Ser Gly Gln Ile Asn
705 710 715 720
Ile Ala Ala Thr Ala Thr Ala Val Tyr Lys Asp Gly Thr Ile Leu Gly
725 730 735
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755 760 765
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820 825 830
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850 855 860
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885 890 895
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930 935 940
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Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu
965 970 975
Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu
980 985 990
Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Ile Asn Ser
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Arg
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<211> 1034
<212> PRT
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<400> 2
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Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Arg Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp
20 25 30
Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met
35 40 45
Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser
50 55 60
Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Ile Asn Ser Arg Lys
65 70 75 80
Leu Gly Ser Leu Val Pro Ser Ser Asp Pro Leu Val Thr Ala Ala Ser
85 90 95
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100 105 110
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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225 230 235 240
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305 310 315 320
Ala Lys Thr Asp Thr Glu Tyr Ala Arg Arg Thr Leu Ala Tyr Thr Val
325 330 335
Arg Gln Glu Leu Tyr Thr Asp His Asp Ala Ala Pro Val Ala Thr Asp
340 345 350
Gly Leu Met Leu Leu Thr Pro Glu Pro Leu Gly Glu Thr Pro Leu Asp
355 360 365
Leu Asp Cys Gly Val Arg Val Glu Ala Asp Glu Thr Arg Thr Leu Asp
370 375 380
Tyr Thr Thr Ala Lys Asp Arg Leu Leu Ala Arg Glu Leu Val Glu Glu
385 390 395 400
Gly Leu Lys Arg Ser Leu Trp Asp Asp Tyr Leu Val Arg Gly Ile Asp
405 410 415
Glu Val Leu Ser Lys Glu Pro Val Leu Thr Cys Asp Glu Phe Asp Leu
420 425 430
His Glu Arg Tyr Asp Leu Ser Val Glu Val Gly His Ser Gly Arg Ala
435 440 445
Tyr Leu His Ile Asn Phe Arg His Arg Phe Val Pro Lys Leu Thr Leu
450 455 460
Ala Asp Ile Asp Asp Asp Asn Ile Tyr Pro Gly Leu Arg Val Lys Thr
465 470 475 480
Thr Tyr Arg Pro Arg Arg Gly His Ile Val Trp Gly Leu Arg Asp Glu
485 490 495
Cys Ala Thr Asp Ser Leu Asn Thr Leu Gly Asn Gln Ser Val Val Ala
500 505 510
Tyr His Arg Asn Asn Gln Thr Pro Ile Asn Thr Asp Leu Leu Asp Ala
515 520 525
Ile Glu Ala Ala Asp Arg Arg Val Val Glu Thr Arg Arg Gln Gly His
530 535 540
Gly Asp Asp Ala Val Ser Phe Pro Gln Glu Leu Leu Ala Val Glu Pro
545 550 555 560
Asn Thr His Gln Ile Lys Gln Phe Ala Ser Asp Gly Phe His Gln Gln
565 570 575
Ala Arg Ser Lys Thr Arg Leu Ser Ala Ser Arg Cys Ser Glu Lys Ala
580 585 590
Gln Ala Phe Ala Glu Arg Leu Asp Pro Val Arg Leu Asn Gly Ser Thr
595 600 605
Val Glu Phe Ser Ser Glu Phe Phe Thr Gly Asn Asn Glu Gln Gln Leu
610 615 620
Arg Leu Leu Tyr Glu Asn Gly Glu Ser Val Leu Thr Phe Arg Asp Gly
625 630 635 640
Ala Arg Gly Ala His Pro Asp Glu Thr Phe Ser Lys Gly Ile Val Asn
645 650 655
Pro Pro Glu Ser Phe Glu Val Ala Val Val Leu Pro Glu Gln Gln Ala
660 665 670
Asp Thr Cys Lys Ala Gln Trp Asp Thr Met Ala Asp Leu Leu Asn Gln
675 680 685
Ala Gly Ala Pro Pro Thr Arg Ser Glu Thr Val Gln Tyr Asp Ala Phe
690 695 700
Ser Ser Pro Glu Ser Ile Ser Leu Asn Val Ala Gly Ala Ile Asp Pro
705 710 715 720
Ser Glu Val Asp Ala Ala Phe Val Val Leu Pro Pro Asp Gln Glu Gly
725 730 735
Phe Ala Asp Leu Ala Ser Pro Thr Glu Thr Tyr Asp Glu Leu Lys Lys
740 745 750
Ala Leu Ala Asn Met Gly Ile Tyr Ser Gln Met Ala Tyr Phe Asp Arg
755 760 765
Phe Arg Asp Ala Lys Ile Phe Tyr Thr Arg Asn Val Ala Leu Gly Leu
770 775 780
Leu Ala Ala Ala Gly Gly Val Ala Phe Thr Thr Glu His Ala Met Pro
785 790 795 800
Gly Asp Ala Asp Met Phe Ile Gly Ile Asp Val Ser Arg Ser Tyr Pro
805 810 815
Glu Asp Gly Ala Ser Gly Gln Ile Asn Ile Ala Ala Thr Ala Thr Ala
820 825 830
Val Tyr Lys Asp Gly Thr Ile Leu Gly His Ser Ser Thr Arg Pro Gln
835 840 845
Leu Gly Glu Lys Leu Gln Ser Thr Asp Val Arg Asp Ile Met Lys Asn
850 855 860
Ala Ile Leu Gly Tyr Gln Gln Val Thr Gly Glu Ser Pro Thr His Ile
865 870 875 880
Val Ile His Arg Asp Gly Phe Met Asn Glu Asp Leu Asp Pro Ala Thr
885 890 895
Glu Phe Leu Asn Glu Gln Gly Val Glu Tyr Asp Ile Val Glu Ile Arg
900 905 910
Lys Gln Pro Gln Thr Arg Leu Leu Ala Val Ser Asp Val Gln Tyr Asp
915 920 925
Thr Pro Val Lys Ser Ile Ala Ala Ile Asn Gln Asn Glu Pro Arg Ala
930 935 940
Thr Val Ala Thr Phe Gly Ala Pro Glu Tyr Leu Ala Thr Arg Asp Gly
945 950 955 960
Gly Gly Leu Pro Arg Pro Ile Gln Ile Glu Arg Val Ala Gly Glu Thr
965 970 975
Asp Ile Glu Thr Leu Thr Arg Gln Val Tyr Leu Leu Ser Gln Ser His
980 985 990
Ile Gln Val His Asn Ser Thr Ala Arg Leu Pro Ile Thr Thr Ala Tyr
995 1000 1005
Ala Asp Gln Ala Ser Thr His Ala Thr Lys Gly Tyr Leu Val Gln
1010 1015 1020
Thr Gly Ala Phe Glu Ser Asn Val Gly Phe Leu
1025 1030
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> gDNA 序列N1
<400> 3
cacacacacc cacacgagat gggc 24
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> gDNA 序列N2
<400> 4
ggaagaagct aaagagccag aggg 24
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> gDNA 序列N3
<400> 5
atgagaattt caataacctc agga 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> gDNA 序列N4
<400> 6
gtcccgctct gttgcccagg ctgg 24
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> gDNA 序列N5
<400> 7
cagacaccca ccaccatgcg tggc 24
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> gDNA 序列N6
<400> 8
tcccaattta ctgggattac aggg 24
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> gDNA 序列N7
<400> 9
ctgatttaaa agttggaaac gtgg 24
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> gDNA 序列N8
<400> 10
tctagttccc cacctagtct gggt 24
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> gDNA 序列N9
<400> 11
ggattaactg agaattcaca aggg 24
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> gDNA 序列N10
<400> 12
ccgccaggag gggtgggtct aagg 24
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 基因Nanog正向引物
<400> 13
tgaacctcag ctacaaacag 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 基因Nanog反向引物
<400> 14
tggtggtagg aagagtaaag 20
<210> 15
<211> 17
<212> DNA
<213> 内参β-actin正向引物
<400> 15
gttgtcgacg acgagcg 17
<210> 16
<211> 17
<212> DNA
<213> 内参β-actin反向引物
<400> 16
gcacagagcc tcgcctt 17

Claims (10)

1.一种NgAGO-VP64融合蛋白，其特征在于，是由VP64与NgAGO融合表达获得。
2.根据权利要求1所述的NgAGO-VP64融合蛋白，其特征在于，是将VP64融合到NgAGO的C末端或N末端，并进行人源化密码子优化所得。
3. 根据权利要求2所述的NgAGO-VP64融合蛋白，其特征在于，融合蛋白的序列如SEQID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
4.一种表达NgAGO-VP64融合蛋白的质粒，其特征在于，是将NgAGO-VP64融合蛋白基因克隆到表达载体获得。
5. 一种导向DNA，其特征在于，为SEQ ID NO.3～12所示序列片段中的任一种或几种的混合物。
6.权利要求1～3任一所述NgAGO-VP64融合蛋白、权利要求4所述质粒或权利要求5所述导向DNA在基因编辑方面的应用，或在制备NgAGO基因编辑工具方面的应用。
7.构建权利要求6所述的应用，其特征在于，所述基因编辑是指激活内源基因的表达。
8.一种基于格氏嗜盐碱杆菌Argonaute靶向激活内源基因转录的NgAGO基因编辑工具，其特征在于，包括权利要求1～3任一所述NgAGO-VP64融合蛋白或权利要求4所述质粒，还包括权利要求5所述导向DNA。
9.一种基于格氏嗜盐碱杆菌Argonaute靶向激活内源基因转录的方法，其特征在于，是利用权利要求8所述NgAGO基因编辑工具与转染试剂共转染细胞。
10.构建权利要求9所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.细胞传代培养至指数增长期，转染前0.5～2小时，将细胞培养基换为无血清培养基，孵育0.5～2小时；
S2.将NgAGO-VP64融合蛋白质粒和导向DNA稀释到无血清培养基中，转染试剂稀释到无血清培养基中，然后将两者混合，室温静置20～30分钟后，加入细胞中，2～4小时后加入血清至终浓度为8～15%；
S3.第二天重复转染，但只需转染导向DNA。
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