CN107257852B - 生成动脉内皮细胞群 - Google Patents

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Abstract

描述了在没有胰岛素的情况下在限定条件下生成人动脉内皮细胞的方法。

Description

生成动脉内皮细胞群
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年2月20日提交的美国临时申请第62/118,553号的优先权，其通过引用全文纳入本文。
关于联邦资助研究或开发的声明
本发明在国立卫生院(先进转化科学国家中心)授予的UH2-TR000506的政府资助下完成。政府对本发明拥有一定的权利。
背景技术
心血管疾病在美国是头号死因，并且大部分血管疾病，如动脉粥样硬化，发生在动脉中。动脉粥样硬化是一种慢性炎性疾病，其由内皮细胞的活化、功能障碍和结构变化引发，导致增加的白细胞-内皮粘附。
从多潜能干细胞生成动脉内皮细胞对于开发针对疾病或病症的疗法而言前景巨大，该疗法将治疗心血管疾病。然而，动脉内皮发育是充满挑战的，因为原代动脉内皮细胞在培养中经过去分化。例如，Prosper等的美国公开专利申请号2009/0104159描述了培养和使用证明有动脉分化“潜力”的血管内皮细胞的方法(第[0136]段)。另外，McCloskey等的美国公开的专利申请号2012/0064040描述了化学限定的培养条件以从胚胎干细胞衍生内皮细胞。然而，同样，该公开似乎仅仅证明了从胚胎干细胞分化动脉内皮细胞的潜力，并且获得非常低的结果。
从人胚胎干细胞衍生动脉内皮细胞的现有方案在很大程度上已经失败。因此，本领域仍然需要用于从人多潜能干细胞生成人动脉内皮细胞的高效、限定和可放大规模的方法。
发明内容
在第一方面，本文提供了获得动脉内皮细胞的方法。该方法可包括或基本由以下组成：在无血清、无白蛋白、化学限定的培养基中培养中胚层细胞，该培养基基本没有胰岛素并且包含成纤维细胞生长因子(FGF)，血管内皮生长因子(VEGF)，和以下的至少一种：Notch激动剂、TGF-β抑制剂、和肌醇单磷酸酶的抑制剂，从而获得包含动脉内皮细胞的细胞群。该群的动脉内皮细胞可表达选自下组的一种或多种标志物：肝配蛋白2、神经毡蛋白1(NRP-1)、Δ-样4(DLL4)、肝配蛋白-B2(EFNB2)、CD44、CXCR4/CD184、间隙连接蛋白α-4(GJA4)、Hey1、Jagged-1(JAG1)、Notch1、和Notch4。该细胞群可包含至少80％动脉内皮细胞。
无血清、无白蛋白、化学限定的培养基可包含FGF、VEGF、Notch激动剂、TGF-β抑制剂、和肌醇单磷酸酯抑制剂。中胚层细胞可表达选自下组的一种或多种中胚层标志物：短尾基因(Brachyury)(T)、EMOS、FOXA2、MIXL1、MSX1、和MSX2。
在一些情况中，通过在包含骨形态发生蛋白(BMP)、激活素A、和Wnt/β-联蛋白信号转导的激活剂的无血清、无白蛋白、化学限定的细胞培养基中培养人多潜能干细胞持续约2天的时间以获得包含中胚层细胞的细胞群来获得中胚层细胞。中胚层细胞可表达选自下组的一种或多种中胚层标志物：短尾基因(Brachyury)(T)、EMOS、FOXA2、MIXL1、MSX1、和MSX2。多潜能干细胞可以是人胚胎干细胞或人诱导型多潜能干细胞。Wnt/β-联蛋白信号转导的激活剂可以是Gsk3抑制剂。Gsk3抑制剂可选自下组：CHIR 99021、CHIR 98014、BIO-丙酮肟、BIO、LiCl、SB 216763、SB 415286、AR A014418、1-氮杂坎帕罗酮(1-Azakenpaullone)、和双-7-吲哚基马来酰亚胺。Notch激动剂可选自下组：白藜芦醇(3,4',5-三羟基茋)、丙戊酸、和辛二酰二羟肟酸。TGF-β抑制剂可以是SB431542。肌醇单磷酸酯的抑制剂可以是L-690,330。
在另一个方面，本文提供了按照本文提供的方法获得的基本纯的，动脉内皮细胞的分离群。分离群可包含至少90％动脉内皮细胞或至少99％动脉内皮细胞。
在另一个方面，本文提供了按照本文提供的方法获得的基本纯的，多潜能干细胞衍生的动脉内皮细胞的分离群。分离群可包含至少90％动脉内皮细胞或至少99％动脉内皮细胞。
在另一个方面中，提供了一种体外筛选试剂的方法。该方法可包括使测试试剂与按照本文提供的方法获得的动脉内皮细胞接触；并且检测该试剂对接触的动脉内皮细胞的效果。检测可包括进行选自下组的方法：RNA测序、基因表达概况分析、转录组分析、代谢组分析、检测报告物或感测物、蛋白质表达概况分析、福斯特共振能量转移(FRET)、代谢概况分析、和微量透析。
在另一个方面中，本文提供了用于获得动脉内皮细胞的试剂盒，该试剂盒包含：(i)适于将中胚层细胞分化成动脉内皮细胞的无血清、无白蛋白、化学限定的培养基，其中该培养基基本不含胰岛素并且包含成纤维细胞生长因子(FGF)，血管内皮生长因子(VEGF)，和以下的至少一种：Notch激动剂、TGF-β抑制剂、和肌醇单磷酸酶的抑制剂；和(ii)描述用于将中胚层细胞分化成动脉内皮细胞的方法的说明，该方法采用所述培养基。该试剂盒还可包含(a)适于将人多潜能干细胞分化成中胚层细胞的无血清、无白蛋白、化学限定的培养基，其中该培养基包含BMP、激活素A、和Wnt/β-联蛋白信号转导的激活剂；(b)描述用于将人多潜能干细胞分化成动脉内皮细胞的方法的说明，该方法采用(a)的培养基。
通过下文描述将能够更好地理解本发明的这些和其它特征、方面和益处。在以下说明书中，参照构成说明书的一部分的附图，其中以说明性方式显示，但不限于，本发明的优选实施方式。关于优选实施方式的描述并不意在限制本发明以覆盖全部修改形式、等同形式和替代形式。因此应当参考用于对本发明的全部范围进行解释的所附的权利要求。
附图的简要说明
以下附图形成本发明说明书的部分并且包括以进一步证明本文提供的方法和组合物的某些方面。可参照这些附图中的一幅或者多幅并结合本文所示具体实施方式的详细描述来更好地理解本发明。
图1A-1D证明了单细胞RNA-seq。(A)对单细胞的动脉和静脉基因的分级聚类分析。(B)5个细胞亚群的平均动脉和静脉基因表达。在各亚群中，各基因的平均TPM(转录本/百万)经计算并标准化至群P1(动脉基因)或P3(静脉基因)。所有动脉基因或静脉基因的标准化的表达被进一步平均并显示在柱形图中。数据表示为平均值±SD。*:P<0.05，P1中，n＝13个细胞，P3中n＝10个细胞。(C)P1和P3的主成分分析。由SingularTMAnalysis Toolset 2.1生成图。(D)动脉富集基因。P1的各基因的平均TPM与P3比较以计算倍数变化。也通过比较P1-P3来计算P-值。动脉富集基因以倍数变化>2，P值<0.1，并且P1的平均TPM>10来鉴定。P<0.1被用作截止值，因为之前报道的动脉基因VEGFa、Fzd4、Fzd7、Fzd10、Dll4、和Notch4的P值为0.01-0.1。
图2A提供了使用表1中列出的化学限定的培养基从人多潜能干细胞生成动脉内皮细胞的方案的示意图。首先使用E8BAC培养基将人胚胎干细胞(ES)分化成中胚层细胞。然后，用补充生长因子或小分子(E6FVB)的E6培养基诱导中胚层细胞以分化成内皮细胞。图2B是在第0天(未分化的多潜能状态)和第5天(分化的状态)的CD31和CD34表达的流式细胞数据。图2C是在第0天和第5天的KDR、NANOG、和OCT4表达的流式细胞数据。图2D通过免疫染色显示了纯化的内皮细胞上的CD144表达。图2E显示了LDL(低密度脂蛋白)摄取试验。图2F显示了体外
Figure BDA0001384547860000041
(BD生命科学公司(BD Biosciences)，
Figure BDA0001384547860000042
)包封试验。图2G显示了用于分析迁移和血管生成的体内
Figure BDA0001384547860000043
凝胶塞试验的结果。抗-人CD31-特异性抗体用于免疫染色以检测回收的凝胶塞中的血管形成。图2H显示了在所述的生长因子和小分子的组合中5天分化后对CD31和CD34表达的流式细胞分析。在各种组合中包含胰岛素。当分化培养基包含TGF抑制剂时，包含10μM的SB431542。
图3A-3F表示对于动静脉特异化关键的候选途径。(A)对在CD31和CD144门选的内皮细胞上的EFNB2-tdTomato和EPHB4-EGFP表达的流式细胞分析。EFNB2-tdTomato/EPHB4-EGFP双报告细胞(在H1细胞中对于各基因杂敲入)首先通过E8BAC培养基(补充了BMP4、激活素-A、和CHIR99021的E8培养基)分化成中胚层细胞。使用补充了100ng/ml FGF2、50ng/mlVEGFA、和50ng/ml BMP4的E5(E8培养基减去FGF2、TGFβ1、和胰岛素)培养基来诱导中胚层细胞从第2天到第6天分化成内皮细胞。从第2天到第6天向所示培养基中添加胰岛素(20μg/ml)或Ly294002(16μM，PI3K抑制剂)。(B)EFNB2-tdTommato高/EPHB4-EGFP低细胞的统计学。数据表示为平均值±SD。*:P<0.05，n＝5。(C)显示AKT活性的Western印迹。在第3天收获蛋白质。(D)对在CD31和CD144门选的内皮细胞上的EFNB2-tdTomato和EPHB4-EGFP表达的流式细胞分析。使用补充了50ng/ml VEGFA，50ng/ml BMP4或10μM SB431542的E5培养基来诱导中胚层细胞以在第2天至第6天分化成内皮细胞。(E)对在CD31和CD144门选的内皮细胞上的EFNB2-tdTomato和EPHB4-EGFP表达的流式细胞分析。ES细胞首先如上所述分化成中胚层细胞。使用补充了50ng/ml VEGFA和10μM SB431542的E5培养基作为基础培养基来诱导中胚层细胞以在第2天至第6天分化成内皮细胞。向所示的基础培养基添加其他因子。(F)EFNB2-tdTomato高/EPHB4-EGFP低细胞的统计。使用5μM L690，5μg/ml LDL，和100ng/ml PDGF-BB。*:P<0.05，n＝3。
如本文所述，图4A-4H显示了在各种培养基中分化后获得的CD31-和CD144-门选的内皮细胞上的肝配蛋白B2和肝配蛋白B型受体4报告构建体(EFNB2-tdTomato和EPHB4-EGFP)的表达的流式细胞分析。图4B显示了在图4A的各种培养基条件下分化后获得的动脉内皮细胞(AEC)(EFNB2-tdTomato高/EPHB4-EGFP低)的百分比。数据表示为平均值±SD。图4C通过在图4A的条件下分化3天后从细胞中收获的蛋白质的Western印迹显示AKT(蛋白激酶B)活性。如本文所述，图4D显示了在各种培养基中分化后获得的CD31-和CD144-门选的内皮细胞上的EFNB2-tdTomato和EPHB4-EGFP表达的流式细胞分析。图4E显示了在图4D的各种培养基条件下分化后获得的AEC(EFNB2-tdTomato高/EPHB4-EGFP低)的百分比。使用5μM L-690,330(肌醇单磷酸酶的双膦酸盐抑制剂)和100ng/ml PDGF-BB(血小板衍生的生长因子BB)。图4F显示了按照所述分化方案分选AEC(EFNB2-tdTomato高/EPHB4-EGFP低)和内皮细胞(EC)(EFNB2-tdTomato低/EPHB4-EGFP高)。图4G显示RT-qPCR动脉和静脉基因表达，归一化至β-肌动蛋白，并显示在通过如图4F所述的分选获得的AEC和EC的对数标度上。数据表示为平均值±SD。*:p<0.05。图4H表示动脉内皮细胞分化的工作模型。
图5A-5G表示动脉内皮细胞的表征。所有动脉内皮细胞均由“五因子”培养基衍生。(A)显示了大量RNA-seq的TPM。将EFNB2-tdTomato高/EPHB4-EGFP低(AEC)针对RNA-seq分选。计算AEC(AEC1和AEC2的平均TPM)与HUVEC的比例。AoEC，培养的主动脉内皮细胞。(B)单细胞RNA-seq的PCA。AEC：分选的EFNB2-tdTomato高/EPHB4-EGFP低细胞，pAEC：来自新鲜分离的人胎儿背侧主动脉的原代动脉内皮细胞，H1：H1ES细胞。(C)LDL摄取。比例尺＝100μm。使用源自野生型H1细胞的动脉内皮细胞(第2代)。传代后的纯度为约93％，因此，C-H组中使用的细胞未经纯化。(D)基质胶包封试验。使用源自报告细胞系的动脉内皮细胞(第3代)。比例尺＝100μm。(E)纤维蛋白凝胶中的血管形成。组E-F使用源自野生型H1细胞的动脉内皮细胞(第2代)。比例尺＝100μm。(F)在纤维蛋白凝胶中共培养的内皮细胞和周细胞的腔形成。为了观察腔，细胞用CMFDA(绿色)染色。显示了y-z和x-z投影。比例尺＝100μm。(G)内皮细胞在体内形成功能性血管。将野生型H1衍生的动脉内皮细胞(第2代，通过CD144微珠纯化)与基质胶混合并注射到SCID小鼠中。四周后，罗丹明-葡聚糖经眼球后注射以突出灌注血管。比例尺＝100μm。CD31：抗人和小鼠CD31抗体，圣克鲁兹公司(Santa Cruz)，目录号SC-1506。hCD144：抗-人CD144-647抗体，BD生物科学公司(BD biosciences)，目录号561567。
图6A-6F表明动脉内皮细胞改善血管功能。(A)平面固定的氧诱导视网膜病变的视网膜。内皮细胞用CD31抗体染色。显示了血管闭塞区。比例尺＝0.5mm。(B)血管闭塞统计。**:P<0.01。通过与载剂组比较来计算P值。载剂组：n＝12，来自三次独立实验，使用PBS。AEC组：n＝16，来自两个独立实验。HUVEC组：n＝5。成纤维细胞组：n＝5。(C)箭头表示新生血管簇。内皮细胞用CD31抗体染色。比例尺＝0.5mm。(D)代表性的激光多普勒灌注成像显示缺血无胸腺小鼠的血流。(E)显示术后第40天的生理状态的堆积柱形图。载剂组：n＝10，使用DF12培养基。0.3M AEC组：n＝11，每只小鼠注射3×105AEC。1M AEC组：n＝10，每只小鼠注射1×106AEC。1MCB-ECFC组：n＝10，每只小鼠注射1×106CB-ECFC。动物死亡是由缺血相关感染引起的。**，P<0.001(卡方检验，与载剂组比较)。(F)AEC在小鼠肢体中形成血管并招募平滑肌细胞。AEC用人特异性CD31抗体染色。比例尺＝100μm。hCD31：抗-人CD31抗体，BD生物科学公司(BD biosciences)，目录号550274。
图7A-7F显示内皮细胞的动脉特异性功能表征。(A)DAF-FM的强度显示产生一氧化氮。动脉内皮细胞(AEC)通过“五因子”培养基衍生自野生型H1细胞，并在第2代或第4代用于实验。DAF-FM直到其与NO反应形成荧光苯并三唑才是荧光的。通过流式细胞术测量荧光强度。进行三次实验，显示典型结果之一。(B)在XF24分析仪(海马生物科学公司(SeahorseBioscience))上测量氧消耗率。寡霉素用于消除氧消耗。FCCP用于将电子传递链从氧化磷酸化解偶联，从而测量最大呼吸能力。同时应用抗霉素A和鱼藤酮以完全阻断电子传递链。*:P<0.05，n＝3。通过与HUVEC比较来计算P值。HCAEC，人冠状动脉内皮细胞。(C)在ibidi泵系统上进行剪切应力响应(红色灌注组，μ-Slide VI 0.4。(D)剪切应力响应的统计数据。细胞长度与宽度之比用于证明细胞响应剪切力的伸长。对于每种细胞类型，测量100个细胞以进行统计。数据表示为平均值±SD。*:P<0.05；***：P<0.001，n＝100个细胞，来自三个独立实验。(E)白细胞(圆细胞)粘附试验。比例尺＝200μm。在第1代或第4代时使用AEC。(F)白细胞粘附试验的统计。计算每个图像的白细胞数。数据表示为平均值±SD。*:P<0.05，n＝3个图像，来自三个独立实验。通过用TNFα处理与HUVEC比较来计算P值。
图8A-8J显示了报告细胞系的产生和表征的数据。(A)野生型和靶向的EFNB2-tdTomato等位基因的示意图。H1ES细胞用于基因靶向。Tom：tdTomato。(B)野生型和靶向的EPHB4-EGFP等位基因的示意图。(C)EFNB2-tdTomato等位基因的5'臂和3'臂的连接PCR。WT：野生型，C14：靶向的细胞的克隆14。(D)EFNB2野生型和敲入(EFNB2-tdTomato)等位基因的Southern印迹。(E)EPHB4-EGFP等位基因的5'臂和3'臂的连接PCR。C29：靶向的细胞的克隆29。(F)EPHB4-EGFP等位基因的Southern印迹。(G)EFNB2-tdTomato细胞系(克隆14)的tdTomato拷贝数的qPCR分析。数据表示为平均值±SD。n＝3。Con：用tdTomato的一个拷贝的对照样品。(H)EFNB2-tdTomato/EPHB4-EGFP细胞系(克隆29)的EGFP拷贝数的qPCR分析。数据表示为平均值±SD。n＝3。Con：用EGFP的一个拷贝的对照样品。(I)通过RT-qPCR比较野生型和报告细胞系的内源性EFNB2和EPHB4基因表达。第5天，分化5天。数据表示为平均值±SD。n＝3。(J)EFNB2-tdTomato/EPHB4-EGFP细胞系的核型分析(克隆29)。
图9显示了EFNB2-tdTomato和EPHB4-EGFP表达的流式细胞分析。纯化的AEC在补充有生长因子或小分子的E5培养基中培养3天。F：100ng/ml，V：50ng/ml VEGFA，I：10μMSB431542，W：100ng/ml WNT3A，L：10μM L-690,330，R：5μM RESV。Ins：10μg/ml胰岛素。在FVIR，FVIR+Ins和FVIRLW培养基中发现较低的EPHB4-EGFP和较高的EFNB2-tdTomato表达。
图10给出了使用单细胞RNA-seq获得的表达的热图。对于通过本文所述的“五因子”方案得到的EFNB2-tdTomato高/EPHB4-EGFP低AEC的动脉和静脉基因进行分级聚类分析。
图11A-11C显示动脉内皮细胞分化数据。(A)动脉内皮细胞分化方案示意图。首先通过E8BAC培养基(补充有5ng/ml BMP4，25ng/ml激活素A和1μM CHIR99021的E8培养基)将ES细胞分化成中胚层细胞。然后使用补充有100ng/ml FGF2和10μM SB431542的E5(E8培养基减去FGF2、TGFβ1和胰岛素)培养基诱导中胚层细胞分化成内皮细胞。(B)CD31和CD34表达的流式细胞分析。用补充有50ng/ml VEGF，5μM RESV(白藜芦醇，Notch激活剂)或50ng/mlWNT3A的E5+100ng/ml FGF2+10μM SB431542培养基(“对照”)诱导中胚层细胞分化成动脉内皮细胞。(C)EFNB2-tdTomato和EPHB4-EGFP表达的流式细胞分析。
图12显示小鼠心脏、肢体和肠中的MYH11-阳性血管平滑肌。在小鼠心脏和肢体中，MYH11-阳性血管平滑肌被招募到血管。在肠中，平滑肌细胞表达MYH11和CD31(箭头表示)，表明MYH11+CD31-细胞是血管平滑肌细胞，而MYH11+CD31+细胞是肠平滑肌细胞。
发明详述
说明书中所引用的所有出版物，包括但不限于专利和专利申请通过引用纳入本文，如同它们完全示于本申请中那样。
本发明至少部分地基于发明人的发现，即与单因子相比，通过组合几个特定因子大大改善了动脉内皮细胞分化。如本文所述，本发明人还发现某些因子(胰岛素、TGFβ和PDGF)抑制动脉内皮分化。
方法
在示例性实施方式中，本文提供的方法包括将中胚层干细胞分化成动脉内皮细胞。本文所用术语“动脉内皮细胞”(AEC)是指根据本文提供的方法获得的动脉血管内皮谱系的细胞。本发明的AEC的特征在于高水平的动脉内皮标志物表达，如肝配蛋白B2、DLL4、Hey-2、jagged-1和jagged-2。AEC的特征还在于低白细胞粘附，较高NO产量和氧消耗，对剪切应力的响应，以及在体外和体内形成血管网络同时维持动脉标志物在这种网络中的表达的能力。基于如本文所述的体外细胞的特征表达概况和功能属性，AEC可与其它细胞类型，包括内皮细胞(EC)、静脉内皮细胞和内皮祖细胞区分开。
在第一方面，本文提供了获得动脉内皮细胞的方法。在示例性实施方式中，该方法包括引导中胚层细胞分化成动脉内皮细胞谱系的细胞。本文所用的术语“中胚层细胞”和“中层细胞”可互换使用，并且是指具有中胚层特异性基因表达并能够分化成中胚层谱系，例如骨骼，肌肉如心肌，骨骼肌和平滑肌(例如肠)，结缔组织如真皮和软骨，肾脏，泌尿生殖系统，血液或造血细胞，心脏和脉管系统的细胞。中胚层特异性生物标志物包括短尾基因(T)。
在本文提供的整个AEC分化步骤中，中胚层细胞通常在不含、基本上不含或基本不含胰岛素、白蛋白或源自非人动物的任何组分(即，不含异种材料)的培养基中培养。本文所用术语“基本上不含”是指基本上没有某种成分或试剂的细胞培养条件。基本上不含胰岛素表示培养基含有小于1％的原始浓度的胰岛素，或小于2×10-5重量％的胰岛素，并且优选包含小于1×10-5％，小于0.5×10-5％，小于0.2×10-5％或小于0.1×10-5％的胰岛素。
此外，培养基包含，或基本由以下组成：成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、TGF-β信号传导抑制剂(例如SB431542)，白藜芦醇(RESV)、和肌醇单磷酸酶的抑制剂，其中培养持续足以使培养的中胚层细胞分化成动脉内皮细胞的时间长度。在一些实施方式中，用于本文所述的AEC分化方法的细胞培养基包含这些组分中的每一种。在其他情况下，培养基基本上不含这些成分中的一种或多种。培养可以在任何合适的表面上进行(例如，以二维或三维培养形式进行)。
在一些情况下，在包含有效地引导中胚层细胞分化成动脉内皮谱系的量的FGF、VEGF、Notch激动剂、TGFβ受体抑制剂和肌醇单磷酸酶的抑制剂的培养基中培养中胚层细胞(在一些情况下，包括多潜能干细胞衍生的中胚层细胞)。一些情况中，FGF是FGF2。VEGF是作为特异性内皮细胞促分裂原的肝素结合糖蛋白。在一些情况下，VEGF是VEGF-A(血管内皮生长因子A)或其同种型(例如，VEGF-165)。示例性的人VEGF-A蛋白序列包含Genbank：AAH65522.2和GenBank：AAH1 1177.2，并且包含编码其全部或编码其非前体部分的核酸。
适用于本发明方法的TGFβ受体抑制剂包括但不限于SB-431542，SB-525334，A83-01，LY2157299，LY210976，GW788388，RepSox，SB-505124，D4476，GW788388，SD208和EW-7197。优选地，TGF-β信号转导的抑制剂是SB431542，一种内源性激活素和I型受体(TGFβ受体I)的小分子抑制剂(Inman等，Mol Pharmacol.62(1):65-74(2002))。
Notch是单次跨膜细胞表面受体，其结合到包括Δ-样和Jagged家族的细胞表面配体家族。如本文所用，术语“Notch激动剂”和“Notch激活剂”是指结合Notch受体并且启动或调整与Notch激活相关的信号转导事件的分子(例如，生物分子，小分子，化学品)。白藜芦醇(3,4',5-三羟基茋)属于一类称为二苯乙烯的多酚化合物并且是Notch信号转导的激活剂(激动剂)。适用于根据本文提供的用于促进动脉分化的方法的其它Notch激动剂包括丙戊酸和辛二酰二羟肟酸。此外，固定化或多聚化的可溶性Notch配体如固定化的DLL4和固定化的Jagged-1肽也可用作Notch激活剂。
肌醇单磷酸酶(IMPase)催化肌醇单磷酸酯水解成肌醇，这是磷酸肌醇细胞信号转导通路所必需的。在一些情况下，IMPase的抑制剂是双膦酸酯L-690,330([1-(4-羟基苯氧基)亚乙基]双膦酸)。锂也抑制IMPase减弱磷酸肌醇信号(Berridge等，Cell 59:411-419(1989))。磷酸肌醇信号转导通路的其它抑制剂包括但不限于磷酸肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂Ly294002，Pictilisib，HS-173，GSK2636771，Duvelisib，TG100-115，GSK1059615，PF-04691502，PIK-93，BGT226，AZD6482，SAR245409，BYL719，CUDC-907，IC-87114，TG100713，Gedatolisib，CH5132799，PKI-402，BAY 80-6946，XL147，PIK-90，PIK-293，PIK-294，槲皮素，渥曼青霉素，ZSTK474，AS-252424，AS-604850和Apitolisib。
如本文所述那些的化学抑制剂的合适的工作浓度范围为约0.1μM至约100μM，例如约2μM，5μM，7μM，10μM，12μM，15μM，18μM，或者一种或多种前述化学抑制剂的其它工作浓度在约0.1μM至约100μM之间。
优选地，在AEC分化培养基中培养中胚层细胞，直到所得细胞群的至少约80％(例如，至少80％，85％，90％，95％，99％)为动脉内皮细胞。动脉内皮细胞具有以下表达谱：CD31+/CD144+/CD41-/CD45-。
对于本文描述的几种生物标志物，表达水平将低或中间。将细胞称为对于特定标志物“阳性”或“阴性”是常见的，实际表达水平是定量性状。细胞表面上的分子数可以变化几个对数单位，但仍被表征为“阳性”。因此，染色水平的表征允许细胞群之间的细微区分。可以通过流式细胞术检测或监测表达水平，其中激光检测荧光染料的定量水平(其与由抗体结合的细胞表面抗原的量成比例)。流式细胞术或荧光激活细胞分选(FACS)可用于根据抗体染色的强度以及其他参数(如细胞大小和光散射)分离细胞群。尽管染色的绝对水平可由于具体荧光团和抗体制备而不同，但数据可根据对照标准化。
可以使用任何适当的方法来检测本文所述的细胞类型特征性的生物标志物的表达。例如，可以使用，例如，RNA测序(例如，RNA-seq)，免疫组织化学，聚合酶链反应，定量实时PCR(qRT-PCR)或检测或测量基因表达的其他技术检测一种或多种生物标志物的存在或不存在。RNA-seq是一种高通量测序技术，可以对生物体、组织或细胞的RNA含量进行全基因组评估。或者或另外，可以使用，例如，通过荧光原位杂交；(FISH；参见1998年10月公开的WO98/45479)，Southern印迹，Northern印迹或聚合酶链反应(PCR)技术，例如qRT-PCR来检测AEC的一种或多种生物标志物的存在或不存在或测量其水平。在示例性实施方式中，评估根据本文提供的方法获得的细胞群的表达(或不存在)动脉内皮细胞的生物学标志物，例如EFNB2、Cxcr4、Δ-样4(DLL4)、Gja4、Hey1、Jag1、Notch1、Notch4和Nrp1。优选地，AEC表达以下动脉内皮细胞标志物中的一种或多种：肝配蛋白B2(EFNB2)，神经毡蛋白-1(NRP-1)/CD304，Δ-样4(DLL4)和CD184(分化簇184)。肝配蛋白B2(EFNB2)基因编码与EPHB4和EPHA3受体结合的EFNB类肝配蛋白。也被称为血管内皮细胞生长因子165受体(VEGF165R)的神经毡蛋白-1(NRP1)主要在动脉内皮细胞中表达。DLL4是在动脉内皮细胞中表达的Notch配体(Shutter等，Genes&Dev.14：1313-18(2000))。CD184也称为CXCR4(C-X-C趋化因子受体4型)或融合素。用于在蛋白质水平上评估细胞群中的标志物的表达的定量方法也是本领域已知的。例如，流式细胞术用于确定表达或不表达感兴趣的生物标志物的给定细胞群中细胞的分数。
如本文所用的术语“限定的培养基”，“限定培养基”等表明每种培养基成分的种类和量是已知的。本文所用的术语“化学限定的培养条件”，“完全限定的，不含生长因子的培养条件”和“完全限定的条件”表示每种培养基成分的种类和量是已知的，并且支持性表面的种类和量是已知的。如本文所用，术语“无白蛋白条件”表示所用培养基不含任何形式的添加的白蛋白，包括但不限于牛血清白蛋白(BSA)，任何形式的重组白蛋白或任何其它动物组分。
胚胎或诱导型人多潜能干细胞(hPSC)可以进入人类发育的最早阶段，并提供一个平台，用于导出大量用于细胞治疗和组织工程改造的血管生成细胞。因此，在示例性实施方式中，本文提供的方法还包括在促进中胚层干细胞分化成动脉内皮细胞的条件下分化人多潜能干细胞。在这种情况下，产生动脉内皮细胞的方法包括在促进中胚层分化的无血清、无白蛋白、化学限定的培养基中培养人多潜能干细胞。以这种方式，根据本文提供的AEC分化方法分化多潜能干细胞衍生的中胚层细胞，从而产生多潜能干细胞衍生的AEC。在示例性实施方式中，促进中胚层分化的无血清、无白蛋白、化学限定的培养基包含活化素A，骨形态发生蛋白4(BMP4)，FGF2和Wnt/β-联蛋白信号转导的激活剂。
用于培养如本文所述的方法中所使用的多潜能干细胞的限定的培养基和基质条件是本领域熟知的。本文使用的培养基仅限于它们是无白蛋白的。在一些情况下，待根据本文公开的方法分化的多潜能干细胞在无血清、无白蛋白的培养基中培养。
如本领域普通技术人员将理解，可以通过调节参与Wnt/β-联蛋白信号转导途径的一种或多种蛋白质的功能以增加β-联蛋白表达水平或活性，TCF和LEF表达水平，或β-联蛋白/TCF/LEF诱导的转录活性来激活Wnt/β-联蛋白信号转导。
在一些实施方式中，通过抑制Gsk3磷酸转移酶活性或Gsk3结合相互作用来实现Wnt/β-联蛋白信号转导的激活。虽然不希望被理论约束，但据信抑制β-联蛋白的Gsk3磷酸化将抑制β-联蛋白的强直性降解，从而增加β-联蛋白的水平和活性，以促进多潜能干细胞向内胚层/中胚层谱系分化。Gsk3抑制可以以多种方式实现，包括但不限于提供抑制Gsk3磷酸转移酶活性的小分子、Gsk3的RNA干扰敲减以及Gsk3显性阴性形式的过表达。Gsk3的显性阴性形式是本领域已知的，例如在Hagen,T.等，J Biol Chem,277:23330-5(2002)中所述，其描述了包含R96A突变的Gsk3。
在一些实施方式中，通过使多潜能干细胞与抑制Gsk3磷酸转移酶活性或Gsk3结合相互作用的小分子接触，通过抑制多潜能干细胞中的Gsk3来激活Wnt/β-联蛋白信号转导通路。合适的小分子Gsk3抑制剂包括但不限于CHIR99021，CHIR 98014，BIO-丙酮肟，BIO，LiCl，SB 216763，SB 415286，ARA014418，1-氮杂坎帕罗酮，双-7-吲哚基马来酰亚胺及其任何组合。在一些实施方式中，在本文所述的分化方法中，使用CHIR 99021，CHIR 98014和BIO-丙酮肟中的任何一种来抑制多潜能干细胞中的Gsk3。在一个实施方式中，待使用的小分子Gsk3抑制剂为CHIR99021，浓度范围为约1μM至约9μM，例如，约1μM，2μM，3μM，4μM，5μM，6μM，7μM，8μM，9μM或约1μM至约9μM的另一浓度的CHIR99021。在另一个实施方式中，待使用的小分子Gsk3抑制剂为CHIR 98014，浓度范围为约0.1μM至约1μM，例如，约0.1μM，0.2μM，0.3μM，0.4μM，0.5μM，0.6μM，0.7μM，0.8μM，0.9μM，1.0μM或约0.1μM至约1μM的其它浓度的CHIR-98014。在另一个实施方式中，待使用的小分子Gsk3抑制剂是BIO-丙酮肟，浓度范围为约0.1μM至约1μM，例如，约0.1μM，0.2μM，0.3μM，0.4μM，0.5μM，0.6μM，0.7μM，0.8μM，0.9μM，1.0μM或约0.1μM至约1μM的其它浓度的BIO-丙酮肟。
在其他实施方式中，Gsk3活性受到Gsk3的RNA干扰敲减的抑制。例如，Gsk3表达水平可以使用针对Gsk3的市售siRNA，例如
Figure BDA0001384547860000141
GSK-3α/βsiRNA(来自马萨诸塞州丹佛的Cell Signaling
Figure BDA0001384547860000142
的目录号6301)或具有针对Gsk3的诱导型表达盒的逆转录病毒载体，例如，来自克隆泰克实验室公司(Clontech)(加利福尼亚州山景城)的市售的Tet诱导型逆转录病毒RNAi系统，目录号630926或来自系统生物科学公司(SystemsBiosciences，Inc.)(加利福尼亚州山景城)的二甲氨基二硫代甲酸铜诱导系统，例如
Figure BDA0001384547860000143
系统，目录号QM200PA-2。
在其它实施方式中，通过过表达β-联蛋白本身，例如人β-联蛋白(核苷酸和蛋白质序列的GenBank登录号分别为：X87838和CAA61107.1)活化Wnt/β-联蛋白信号转导通路。在一个实施方式中，β-联蛋白过表达是使用，例如任何刚提及的诱导表达系统实现的诱导型β-联蛋白过表达。或者，使用包含点突变S33A、S37A、T41A和S45A的组成型活性、稳定化的β-联蛋白同种型，如Baba,Y.等，组成型活性β-联蛋白赋予淋巴和骨髓祖细胞多谱系分化潜能(Constitutively activeβ-catenin confers multi-lineage differentiationpotential on lymphoid and myeloid progenitors).Immunity23:599-609(2005)所述。
在其它实施方式中，通过使细胞与破坏β-联蛋白与轴蛋白(一种β-连环蛋白破坏复合物的成员)的相互作用的试剂接触来实现多潜能干细胞中的Wnt/β-联蛋白信号转导通路活化。轴蛋白-β-联蛋白相互作用的破坏使β-联蛋白通过破坏复合物逃避降解，从而增加β-联蛋白的净含量以驱动β-联蛋白信号转导。例如，可通过使它们与化合物5-(呋喃-2-基)-N-(3-(1H-咪唑-1-基)丙基)-1,2-噁唑-3-甲酰胺(”SKL2001”)接触在多潜能细胞中破坏轴蛋白-β-联蛋白相互作用，其可购自，例如来自EMD4Biosciences的目录号681667。激活Wnt/β-联蛋白信号转导的SKL2001的有效浓度范围为约10μM至约100μM，约20μM，30μM，40μM，50μM，60μM，70μM，80μM，90μM或约10μM至约100μM的另一浓度的SKL2001。在一些实施方式中，Wnt/β-联蛋白信号转导的激活剂是Gsk3抑制剂。在一些实施方式中，Gsk3抑制剂选自CHIR99021、CHIR98014、BIO-丙酮肟、BIO、LiCl、SB216763、SB415286、AR A014418、1-氮杂坎帕罗酮、和双-7-吲哚基马来酰亚胺。在一些实施方式中，培养基中Gsk3抑制剂为浓度为约0.1μM至约10μM的CHIR99021或CHIR98014。在一个实施方式中，待使用的小分子Gsk3抑制剂为CHIR99021，浓度范围为约1μM至约9μM，例如，约1μM，2μM，3μM，4μM，5μM，6μM，7μM，8μM，9μM或约1μM至约9μM的其它浓度的CHIR99021。在另一个实施方式中，待使用的小分子Gsk3抑制剂是CHIR98014，浓度范围为约0.1μM至约1μM，例如，约0.1μM，0.2μM，0.3μM，0.4μM，0.5μM，0.6μM，0.7μM，0.8μM，0.9μM，1.0μM或约0.1μM至约1μM的其它浓度的CHIR98014。
在示例性实施方式中，多潜能干细胞在包含或基本上由DMEM/F12培养基、L-抗坏血酸-2-磷酸镁、亚硒酸钠、人FGF2、胰岛素、NaHCO3、转铁蛋白、TGFβ1、BMP4、激活素-A和CHIR99021组成的化学限定的培养基(“E8BAC培养基”)中培养两天。优选地，培养基包含或基本上由DMEM/F12培养基；L-抗坏血酸-2-磷酸镁(64mg/l)；亚硒酸钠(14μg/l)；人FGF2(100μg/l)；胰岛素(20mg/l)；NaHCO3(543mg/l)；转铁蛋白(10.7mg/l)；TGFβ1(2μg/l)；BMP4(5μg/l)；活化素A(25μg/l)；和CHIR99021(1μM)组成。将人多潜能干细胞在培养基中培养约2天。约两天后，所得细胞群的至少约80％(例如，至少约80％，85％，90％，95％，99％)是中胚层细胞。本文所用的术语“中胚层细胞”是指具有中胚层特异性基因表达，能够分化成中胚层谱系，例如骨骼，肌肉如心肌，骨骼肌和平滑肌(例如肠)，结缔组织如真皮和软骨，肾脏，泌尿生殖系统，血液或造血细胞，心脏和脉管系统的细胞。中胚层特异性生物标志物包括短尾基因(T)。培养可以在任何合适的表面上进行(例如，在二维或三维培养中)。
如本文所用，适于根据本发明方法使用的“多潜能干细胞”是具有分化成所有三个胚层的细胞的能力的细胞。用于本文的合适的多潜能细胞包括人胚胎干细胞(hESC)和人诱导型多潜能干细胞(iPS)。本文所用的“胚胎干细胞”或“ESC”是指源自囊胚内细胞团的多潜能细胞或多潜能细胞群。参见Thomson等，Science 282:1145-1147(1998)。这些细胞表达Oct-4，SSEA-3，SSEA-4，TRA-1-60和TRA-1-81。多潜能干细胞显示为紧密的集落，其包含具有高核浆比和明显核仁的细胞。ESC可从诸如WiCell研究所(威斯康星州麦迪逊)的来源购得。如本文所用，“诱导型多潜能干细胞”或“iPS细胞”是指多潜能细胞或多潜能细胞群，其可以相对于其原始分化的体细胞细胞变化，其可以相对于特定组的效力决定因素变化，并且可以相对于用于分离它们的培养条件变化，但是仍然与它们各自的原始分化的体细胞基本相同，并且显示与如本文所述的更高效能细胞(例如ESC)相似的特征。参见例如，Yu等，Science 318:1917-1920(2007)。
诱导型多潜能干细胞表现出与ESC类似的形态特征(例如，圆形，大核仁和少细胞质)和生长特性(例如，约17至18小时的倍增时间)。另外，iPS细胞表达多潜能细胞特异性标志物(例如，Oct-4、SSEA-3、SSEA-4、Tra-1-60或Tra-1-81，但不是SSEA-1)。然而，诱导型多潜能干细胞不是从胚胎直接衍生的。如本文所用，“不是从胚胎直接衍生的”是指用于产生iPS细胞的起始细胞类型是非多潜能细胞，例如，多能细胞或终末分化的细胞，例如从产后个体获得的体细胞。
可以根据本文所述的方法使用人iPS细胞以获得具有特定人对象的遗传互补的AEC。例如，获得显示与特定哺乳动物对象的特定疾病或病症相关或由特定哺乳动物对象的特定疾病或病症产生的一种或多种特异性表型的AEC可能是有利的。在这种情况下，通过根据本领域已知的方法重新编程特定人类对象的体细胞获得iPS细胞。参见，例如，Yu等，Science 324(5928):797-801(2009)；Chen等，Nat.Methods 8(5):424-9(2011)；Ebert等，Nature 457(7227):277-80(2009)；Howden等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.108(16):6537-42(2011)。诱导型多潜能干细胞衍生的AEC允许在具有，例如，特定疾病的个体中重塑血管组织的组织构建体中对药物反应建模。即使是最安全的药物也可能在具有特定遗传背景或环境史的某些个体中引起不良反应。因此，人对象特异性iPS细胞衍生的AEC可用于鉴定导致可变药物反应的遗传因素和表观遗传学影响。
通过活组织检查或其他组织取样方法可以从感兴趣的靶组织获得或分离用于重编程成iPS细胞的对象特异性体细胞。在一些情况下，在使用本发明的基于三维水凝胶的组织构建体之前，在体外处理对象特异性细胞。例如，对象特异性细胞可以在引入三维组织构建体之前被扩增，分化，遗传修饰，与多肽、核酸或其它因子接触，被冷冻保存或以其它方式修饰。
用于培养如本文所述的方法中所使用的多潜能干细胞的限定的培养基和底物条件是本领域熟知的。在一些情况下，待根据本文公开的方法分化的多潜能干细胞在MATRIGELTM基材(新泽西州的BD生物科学公司(BD Biosciences))上在mTESR-
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培养基(英属哥伦比亚温哥华的干细胞技术公司(StemCell Technologies,Inc.))或Essential
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培养基(生命技术公司(Life Technologies,Inc.))中按照生产商的方案或在
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Synthemax表面上培养。
优选地，在不存在饲养层(例如，成纤维细胞饲养层)，条件培养基或包含不明确或未限定组分的培养基的情况下培养人多潜能干细胞(例如，人ESC或iPS细胞)。如本文所用，术语“化学限定的培养基”和“化学限定的基”还指含有完全公开或可识别成分的制剂的培养基，其精确量已知或可识别并且可以单独控制。因此，如果(1)所有培养基成分的化学和结构特性未知，(2)培养基含有未知量的任何成分，或(3)两者，则培养基不是化学限定的。通过使用化学限定的培养基来标准化培养条件使细胞在细胞培养期间接触的材料的批次间或批料间差异的可能性最小化。因此，当加入到在化学限定的条件下培养的细胞和组织中时，各种分化因子的作用更可预测。如本文所用术语“无血清”是指不含血清或血清替代物，或基本上不含血清或血清替代物的细胞培养物质。例如，基本上不含血清的培养基可以含有小于约1％，0.9％，0.8％，0.7％，0.6％，0.5％，0.4％，0.3％，0.2％或0.1％的血清。“无血清”还指不含从动物(例如，胎牛)血液或动物来源的材料获得的血清的培养组分，这对于减少或消除种间病毒或朊病毒传播的可能性而言是重要的。为了避免怀疑，含血清培养基不是化学限定的。
本文提供的方法产生多潜能干细胞衍生的AEC的分离群，其中分离群是基本纯的AEC群。如本文所用，“分离”和“分离的”是指从周围、相邻或污染细胞或另一类型的细胞中分离、选择或富集感兴趣细胞类型的细胞或细胞亚群。本文所用术语“基本纯的”是指相对于构成总细胞群的AEC至少约80％(例如，至少约80％，82％，83％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或更高)纯。换句话说，术语“基本纯的”是指含有至少约80％(例如，至少约80％，82％，83％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或更多)的AEC的本发明的AEC群，当引导分化以获得动脉内皮细胞谱系时。术语“基本纯的”还指在任何富集、扩增步骤、或分化步骤之前，在分离群中含有少于约20％、约10％或约5％的非AEC的本发明的AEC群。在一些情况下，根据本文提供的方法产生的基本纯的AEC的分离群相对于构成总细胞群的AEC是至少约95％(例如，至少约95％，96％，97％，98％，99％)纯。
从特定个体的iPS细胞产生的动脉内皮细胞和从相同个体分离的原代动脉内皮细胞之间的重要差异在于，iPS细胞衍生的细胞是无限放大的并且能够超过Hayflick极限(一定次数的细胞分裂)。本文所用术语“海弗利克极限(Hayflick limit)”是指在细胞不再增殖并进入衰老期之前体外群体倍增的有限数量(Hayflick L.Exp Cell Res 37：614-36,1965)。虽然原代培养的动脉内皮细胞的固有的自我更新能力是有限的，但是可以根据本文提供的方法从单一来源(例如，个体的体细胞)获得几乎无穷尽供应的动脉内皮细胞。因此，在本发明的一个实施方式中，AEC能够在组织培养实验室内增殖，使得获得的细胞数量足以治疗超过一个患者，并且在优选实施方式中，能够形成细胞库。
在一些实施方式中，使用细胞分离、细胞分选或富集方法(例如，荧光激活细胞分选(FACS))、酶联免疫吸附试验(FACS)、磁珠、磁激活细胞分选(MACS)、非内皮细胞的激光靶向消融及其组合富集在所述方法中获得的细胞群中的动脉内皮细胞的部分。优选地，FACS用于基于细胞表面抗原表达鉴定并分离细胞。
本发明的方法提供可放大规模的，便宜的且可重现的人AEC的产生。例如，在根据本文所述的方法获得包含人AEC的细胞群后，可以在适于增殖人AEC的培养基中扩增人AEC群，包括但不限于，人内皮细胞无血清培养基(生命技术公司(Life Technologies)，目录号11111-044)、EGM-2(隆萨公司(Lonza)，目录号CC 3162)和内皮细胞培养基(BD生物科学公司，目录号355054)。
表1.化学限定的培养基组分
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在另一方面，本文提供了包括根据本文提供的方法获得的动脉内皮细胞的治疗组合物和使用它们治疗对象的方法。
因此，在另一方面，本发明提供了用于细胞移植、细胞补充、和细胞或组织替换和增强血管生成的方法和组合物。该方法可包括向有需要的对象提供治疗有效量的根据本文提供的方法衍生的动脉内皮细胞，由此提供动脉内皮细胞治疗对象。需要细胞或组织替换和改善血管发生的疾病包括但不限于心肌和外周血管缺血，其他外周动脉疾病，心肌梗塞(MI)，中风和糖尿病性神经病，以及受伤个体将受益于血管生成再生医学的任何其他病症或疾病。根据本发明的优选的个体对象是哺乳动物，包括但不限于，人和非人灵长类，以及犬，猫，羊，猪，马和牛。在一些情况下，使用需要治疗的对象的多潜能细胞(例如，诱导型多潜能干细胞)获得基本纯的动脉内皮细胞群。然而，也可以使用优选同源或同种异体供体的多潜能干细胞获得基本纯的动脉内皮细胞群。较不优选地，使用异种供体。
在另一方面，本文提供了改善血管灌注的方法。具体地，本文提供了一种用于治疗患者的外周动脉疾病的方法，其中所述方法包括向患者给予治疗剂量的如本文所述获得的动脉内皮细胞。本文所用术语“外周动脉疾病”是指急性和慢性临床肢体缺血和与影响对组织的血液供应的病症诸如糖尿病或动脉硬化相关的缺血。在一些情况下，根据本文提供的方法获得的动脉内皮细胞被直接注射到患者对象中以治疗外周动脉疾病。不受任何特定理论的约束，预期这样的动脉内皮细胞将治疗肢体缺血(例如，与糖尿病或心脏梗死相关的缺血)，并且比用非动脉内皮细胞治疗更有利。在示例性实施方式中，体外衍生的AEC是用于移植给患者以治疗缺血的患者特异性或HLA匹配的细胞。例如，AEC可以衍生自通过将患者的体细胞重新编程成多潜能性，然后根据本文提供的方法使用iPS细胞获得包含患者特异性AEC的群而获得的iPS细胞。从患者衍生的iPS细胞获得的AEC可以在任何药学上可接受的运载体、缓冲液或赋形剂中给予患者。将细胞给予患者的途径可以是静脉内或肌内注射。在某些情况下，例如，将衍生自人多潜能干细胞的AEC重新悬浮于盐水溶液中并在肢体缺血的一个或多个部位肌内注射。
任何合适的剂量可用于本文提供的治疗方法。细胞剂量将取决于缺血的程度和严重性，但优选的范围是每剂量约1×108个细胞/患者至约1×1010个细胞/患者。在一些情况下，如本文所述获得的AEC与包括，例如，平滑肌细胞(例如，血管平滑肌细胞)的其它细胞类型共同给予对象。
在将细胞给予对象后，如果需要，可以使用本领域技术人员已知的任何适当方法来评估治疗方法的效果。治疗可以根据需要或需求重复。根据本文提供的方法进行治疗后，可以监测治疗的对象的肢体缺血的任何积极或消极的变化。在优选的实施方式中，对缺血组织的血液供应的治疗性增加是植入所述细胞后血管形成(血管生成)增加的结果。本文提供的方法提供在移植后是促血管生成的细胞。在某些情况下，积极的变化包括但不限于，向缺血组织的血液供应增加，无截肢存活增加，肢体截肢需要降低，对象休息时肢体疼痛减轻，和无痛步行改善(例如，无痛步行更远的距离)。
另一方面，根据本文提供的方法获得的AEC可用于其中一氧化氮(NO)的产生对对象具有治疗或预防益处的方法。例如，本文提供了将AEC给予对象的方法，作为向对象提供NO的方法，由此给予AEC治疗或预防动脉粥样硬化，减少DNA损伤和/或松弛平滑肌细胞以改善血管功能。
通常使用本领域熟知的方法将治疗有效量的AEC给予受体对象，并且通常涉及使用本领域技术人员已知的临床工具直接注射或以其它方式将治疗有效的AEC导入对象(例如，美国专利号6,447,765；6,383,481；6,143,292；和6,326,198)。例如，本发明的AEC的导入可以通过血管内给予，如静脉内，肌内或动脉内给予，腹膜内给予等局部或全身实现。可以使用无菌注射器或其他无菌转移机制将细胞注射到输注袋(例如，Fenwal输注袋(Fenwal公司))中。然后可以通过一段时间(例如15分钟)上的IV给药将细胞立即输注到进入患者的自由流IV线。在一些实施方式中，同时向对象提供另外的试剂，如缓冲液或盐，与细胞。
在示例性实施方式中，本发明的AEC作为包含细胞和一种或多种药学上可接受的运载体、缓冲剂或赋形剂的药物组合物提供给对象。用于给药的药物组合物必须根据提供适当的无菌性和稳定性的标准方法配制、生产和储存。本发明的药物组合物还可以包含一种或多种促进移植细胞的存活或移植，促进血管生成，调节细胞外或间质基质组成和/或招募其他细胞类型到移植部位的生长因子或细胞因子(例如，血管生成细胞因子)。
在另一方面，本文提供了使用根据本文提供的方法获得的动脉内皮细胞来生产工程改造的血管的方法。AEC还可以用作原料，任选地与另外的细胞群组合，用于在体外或体内产生血管。这样的血管将是有用的，例如，用于损伤组织的血管重建和治疗外周动脉疾病中。通过体内动物研究已经显示外部注射的细胞的移植和血管生成。参见，例如，Kim等，J.Am.Coll.Cardiol.56:593-607(2010)。
本文还提供了使用体外衍生的AEC用于体外血管形成和缺乏血管网络的工程改造的组织，诸如工程心脏肌肉组织或心脏的血管化的方法。例如，AEC可用于生产用于临床应用，例如替换患病血管的组织工程改造的血管移植物的方法。在某些情况下，将患者特异性或HLA匹配的AEC用于治疗具有组织工程改造的血管移植物、体外产生的血管或其它血管化的工程改造的组织的患者的方法将是有利的。如上所述，AEC可以衍生自通过将患者的体细胞重新编程成多潜能性，然后根据本文提供的方法使用iPS细胞获得包含患者特异性AEC的群而获得的iPS细胞。在一些情况下，将AEC与其它细胞类型如血管平滑肌细胞(VSMC)共培养以获得血管化的工程改造的组织构建体，例如用于临床应用例如旁路手术的工程改造的血管将是有利的。优选地，AEC与用于这些方法的患者特异性体外衍生的血管平滑肌细胞组合。血管平滑肌细胞对ACTA2、TAGLN、MYH11和ELN的表达呈阳性，但对CD31呈阴性。在其他情况下，AEC可与心肌细胞共培养以形成可用于改善心脏功能的血管化的心脏组织贴片。
在另一个方面中，提供了一种体外筛选试剂的方法。例如，本文提供了使用体外衍生的动脉内皮细胞用于候选物的高通量筛选的方法。例如，可以筛选如本文所述获得的AEC，以鉴定作为降低白细胞粘附的动脉粥样硬化的潜在治疗或预防剂的试剂。筛选方法可以包括或基本上由(a)使测试试剂接触如本文所述获得的动脉内皮细胞或动脉内皮细胞群；和(b)检测试剂对一个或多个细胞的作用(例如，降低白细胞对AEC的粘附)。在一些情况下，筛选方法包括筛选候选化合物以鉴定促进血管组织发育的测试试剂。在其他情况下，可以针对对人动脉内皮细胞或血管组织的毒性筛选候选化合物。在一些情况下，检测包括检测试剂对细胞的形态或寿命的至少一种积极或消极影响，由此增加或减少细胞寿命或对细胞的形态具有积极或消极影响的试剂被鉴定为对人动脉内皮细胞或血管组织有影响。在一些情况下，检测包括进行选自下组的方法：粘附试验、RNA测序、基因表达概况分析、转录组分析、代谢组分析、检测报告物或感测物、蛋白质表达概况分析、福斯特共振能量转移(FRET)、代谢概况分析、和微量透析。可以筛选试剂对基因表达的影响，并且检测可包括相对于未接触的细胞或细胞群测定差异基因表达。
在示例性实施方式中，检测和/或测量测试化合物暴露于(例如，接触)动脉内皮细胞后至少一种基因的表达水平的积极或消极的变化包括使用，例如RNA测序的全转录组分析。在这种情况下，使用例如Light Cycle、RSEM(期望最大化的RNA-seq)、Excel和Prism等数据处理软件程序计算基因表达。参见Stewart等，PLoS Comput.Biol.9:e1002936(2013)。在适当的情况下，可以使用ANOVA分析，Bonferroni校正方差分析或双尾斯氏t检验进行统计学比较，其中P<0.05的值被确定为显著。任何适当的方法都可用于从神经结构中分离RNA或蛋白质。例如，可以分离并逆转录总RNA以获得用于测序的cDNA。
在与本文提供的AEC接触之前，可以将测试化合物溶解在溶剂如二甲基亚砜(DMSO)中。在一些情况下，鉴定试剂包括分析接触的AEC的生物活性的积极或消极的变化，包括但不限于，基因表达，蛋白质表达，细胞活力和细胞增殖。例如，微阵列方法可用于在使多种测试化合物接触AEC之前、期间或之后分析基因表达概况。在一些情况下，本发明的方法还包括额外的分析，例如代谢试验和蛋白质表达概况分析。
组合物
在另一方面，本文提供了AEC的制备物。例如，本文提供的是AEC，基本纯的AEC群体，包含AEC的药物制备物，和AEC的冷冻保存制备物。本文所述的AEC可以基本上不含在其天然环境中发现的至少一种蛋白质、分子或其它杂质(例如，“分离的”)。AEC可以是哺乳动物的，包括人AEC。本发明还提供人AEC，基本纯的人AEC群，包含人AEC的药物制备物，和人AEC的冷冻保存制备物。该制备物可以是包含人胚胎干细胞衍生的AEC、人iPS细胞衍生的AEC和基本纯的(相对于非AEC)包含分化的多潜能干细胞衍生的AEC的制备物的制备物。
本文提供的细胞制备物可用于各种体外和体内应用，例如工程改造新血管，内皮细胞移植到心脏中用于心肌再生，诱导血管生成用于治疗局部缺血，以及筛选影响血管的药物，例如抑制血管生成以减缓癌症进展。由于大多数血管疾病发生在动脉中(Go等，2014)，动脉细胞对疾病建模非常有价值，因为它们可用于研究动脉内皮细胞如何被激活，并用于筛选药物以防止活化，其将促进理解和治愈动脉粥样硬化。由于非常难以获得AEC，所以这些细胞已在组织工程改造的血管移植物和组织移植物的血管化前期(Bae等，2012；Campbell和Campbell，2007)被很大程度地省略了，其可能导致不良临床结果。所公开的方法有助于生产和使用AEC群。
必须根据美国食品和药物管理局等政府机构的规定，获得包含可用于临床应用的AEC细胞的制备物。因此，在示例性实施方式中，本文提供的方法根据良好生产规范(GMP)、良好组织规范(GTP)和良好实验室规范(GLP)进行。不使用包含动物衍生组分的试剂，并且所有试剂均购自符合GMP标准的来源。在临床制造细胞治疗产品(例如人动脉内皮细胞的体外群)的情况中，GTP支配供体同意，可追溯性和感染性疾病筛查，而GMP与设施、过程、测试和实践相关为人类使用产生一贯安全有效的产品。参见Lu等，Stem Cells 27:2126-2135(2009)。在适当情况下，设想机构和机构小组监督患者方案，以确保获得知情同意书；阶段性研究了产品的安全性、生物活性、合适用量和功效；结果具有统计学意义；并遵循伦理准则。
在另一方面，本文提供的是包含用于将人多潜能干细胞衍生的中胚层细胞分化成AEC的培养基的培养基或培养系统，其中所述培养基包含或基本上由成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、TGF-β信号转导的抑制剂(例如，SB431542)、Notch激动剂(例如，白藜芦醇(RESV)))和肌醇单磷酸酶的抑制剂组成。在示例性实施方式中，培养基包含或基本由补充有人FGF2(100μg/l)、VEGF-165(50μg/l)、SB431542(10μM)、RESV(5μM)和L-690,330(10μM)的E5培养基组成。这样的培养基不包含胰岛素。
制品
本发明还提供了用于将人多潜能干细胞分化成AEC的试剂盒，其包括(i)适于将人多潜能干细胞分化成中胚层细胞的第一培养基；(ii)适于将多潜能干细胞衍生的中胚层细胞分化成动脉内皮细胞的第二培养基；以及(iii)描述用于将人多潜能干细胞分化成CD31+/CD144+/CD41-/CD45-动脉内皮细胞的方法的说明书，该方法采用第一培养基和第二培养基。
除非另有限定，在此使用的所有技术和科学术语的含义均与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解一致。虽然可采用与本文所述类似或等同的任何方法和材料实施或测试本发明，但本文描述优选的方法和材料。
在说明书和权利要求书中，术语“包括”和“包含”是开放式术语，并且应被解释为表示“包括但不限于……”。这些术语包括更严格的术语“基本上由……组成”和“由……组成”。本文和所附权利要求书所用的单数的“一个”、“一种”和“该”包括复数含义，除非文中另有明确说明。同样，术语“一个”(或“一种”)、“一个或多个”和“至少一个”在本文中可互换使用。还应当注意，术语“包括”、“包含”、“特征是”、和“具有”可以互换使用。
如本文所用，“基本上由……组成的培养基”是指含有特定成分和不会对其基本特性产生实质影响的那些成分的培养基。
如本文所用，“有效量”是指足以引起根据本发明的特定细胞效应的试剂的量。
如本文所用，“约”表示在所述浓度范围、密度、温度或时间范围的5％以内。
在考虑以下非限制性实施例的基础上，能够更完整地理解本发明。应理解，本发明所述方法通常适用于多潜能干细胞。本发明所公开的所有文章和专利都通过引用全文纳入本文。
实施例
实施例1-用于将多潜能干细胞引导分化成AEC的方案
为了研究动脉分化，使用缺乏血清和牛血清白蛋白的限定的培养基开发内皮细胞分化方案。首先，在补充有BMP4、激活素-A和CHIR99021(E8BAC培养基)的培养基中将无异种多潜能干细胞分化成中胚层细胞持续两天。然后用FGF2、VEGFA和BMP4再处理中胚层细胞三天，产生70％的CD31+/CD34+内皮细胞群(图2A-B)。在该中胚层-内皮分化培养基中包括胰岛素。通过NANOG和OCT4的下调(图2C)，KDR/VEGFR2的上调，CD144(CDH5/VE-钙粘蛋白)的表达(图2D)，LDL的内化(图2E)以及体外和体内毛细血管网络的形成(图2F-G)进一步证实了内皮细胞命运。使用该方案，我们能够在完全限定的培养条件下研究单个培养基组分的影响(图2H)。
由于CD31+/CD34+内皮细胞群的细胞大部分未能表达AEC的标志物(数据未显示)，我们从E11.5天小鼠胚胎的中胚层的主动脉-性腺-中肾(AGM)区域分离出CD31+/CD144+/CD41-/CD45-内皮细胞群。从AGM分离这些细胞以鉴定具有诱导动脉分化能力的新因子。
对CD31+/CD144+/CD41-/CD45-内皮细胞进行单细胞RNA-Seq以表征单个内皮细胞的全局基因表达概况。为了区分动脉和静脉内皮细胞群，使用SINGuLARTM分析工具集分析一组动脉标志物(Efnb2，Cxcr4，Dll4，Gja4，Hey1，Jag1，Notch1，Notch4和Nrp1)和静脉标志物(Aplnr，Ephb4，Flt4，Nr2f2和Nrp2)。许多标志物聚类成动脉组或静脉组，但是Aplnr和Notch1没有与任一组聚类(图1A)。该结果与以前的研究结果一致，表明一些动静脉标志物是瞬时非特异性的(Chong等，2011)。基于标志物表达，将CD31+/CD144+/CD41-/CD45-内皮细胞聚类成5个亚群(图1A)。计算每个亚群内动脉和静脉基因组的平均标准化表达，以区分动脉和静脉细胞(图1B)。群1(P1)被鉴定为动脉内皮细胞，因为它具有最高的动脉和最低的静脉标志物表达(图1B)。相比之下，群3(P3)具有最低的动脉基因表达(图1B)。主成分分析显示P1和P3细胞之间有明显的分离(图1C)，并且与P3相比，确定918个基因在P1细胞(动脉内皮细胞)中富集(p<0.1，FC>2，TMP>1)(见表4)。
为了鉴定918个动脉富集基因内的生长因子相关基因，组合五个AmiGo基因本体数据“项”：生长因子结合(GO：0019838)，生长因子活性(GO：0008083)，生长因子受体结合(GO：0070851)，受体活性(GO：0004872)和受体结合(GO：0005102)。然后将组合列表与质膜基因(GO：0005886)相交以除去非细胞表面基因(图1D以及表2和表4)。所得到的42个基因中的一些不是生长因子或其受体，而是生长因子信号转导通路的上游或下游。这42个基因中存在一些众所周知的动静脉调节因子，包括VEGFA，Wnt信号转导(FZD4，FZD7，FZD10)和Notch信号转导(DLL4和Notch4)(表2)。
为了测试人动脉分化中的候选因子，我们使用聚类定期间隔短回文重复(CRISPR(聚类定期间隔短回文重复)-Cas9技术)用tdTomao和EPHB4(B型肝配蛋白受体4)以及EGFP靶向EFNB2(肝配蛋白B2)(图8A-8B)。参见，例如，Hou等，2013。EFNB2和EPHB4分别是最表征的胚胎动脉和静脉内皮细胞标志物(Wang等，1998)。通过连接PCR和Southern印迹证实了EFNB2和EPHB4基因座的特异性靶向(图8C-8F)。仅单拷贝的各报告基因整合到基因组中(图8G-8H)，并且报告细胞系中的EFNB2和EPHB4的内源性表达与野生型细胞中的相似(图8I)。双重靶向后核型是正常的(图8J)，并且DNA测序显示野生型等位基因中没有CRISPR诱导的插入或缺失。
我们使用EFNB2-tdTomato/EPHB4-EGFP双重报告细胞系来测试通过单细胞RNA-Seq分析鉴定的单个生长因子相关基因的功能。与之前描述的作用一致，VEGFA、WNT3A和RESV(Notch激动剂)都促进了动脉特异化的增加(图11)。
然后，我们通过添加或去除重组蛋白质/小分子(如胰岛素)研究内皮细胞分化过程中的其他生长因子/信号转导通路，因为其广泛用于内皮细胞分化方案。令人惊讶的是，中胚层形成后去除胰岛素引发AEC分化，如EFNB2-tdTomato高/EPHB4-EGFP低细胞数量增加所证明(图3A-B)。由于胰岛素能够激活AKT(Mackenzie和Elliott，2014)，异种动静脉特异化的负调节因子(Hong等，2006)，我们检验了AKT活性。磷酸化的AKT(pAKT)通过胰岛素的存在而增加，并且使用Ly294002(磷酸肌醇3-激酶(PI3K)的可逆抑制剂)抑制PI3K活性降低pAKT(图3C)并逆转胰岛素在动脉分化期间的抑制作用(图3A-3B)。这些结果表明，胰岛素-AKT通路在抑制动脉分化中发挥关键作用。
此外，我们发现以下因子增加动脉内皮细胞分化：FGF2、L-690,330(肌醇单磷酸酶抑制剂)和LDL(低密度脂蛋白)，如EFNB2-tdTomato高/EPHB4-EGFP低细胞的增加所证明(图3F)。相反，去除SB431542(TGF-β受体抑制剂)或加入PDGF-BB则抑制动脉分化(图3E-3F)。
为了进一步证实这些结果，通过FACS对EFNB2-tdTomato高/EPHB4-EGFP低推定的动脉内皮细胞和EFNB2-tdTomato低/EPHB4-EGFP高推定的静脉内皮细胞进行分选，并通过RT-qPCR进行分析。动脉基因在EFNB2-tdTomato高/EPHB4-EGFP低细胞中显著上调。这些数据表明FGF、L-690,330和LDL促进人多潜能干细胞的动脉内皮分化，而胰岛素、TGF-β和PDGF抑制动脉内皮分化。
为了进一步改善动脉分化，我们检验了个体因子的组合。与使用单因子时观察到的分化相比，通过在化学限定的培养基(表1中的“FVIRL培养基”；也参见图4A-4B)中组合FGF、VEGFA、SB431542、RESV和L-690,330(“五因子”)极大改善了动脉内皮细胞分化。单独去除FGF、VEGF、SB431542或RESV导致EFNB2-tdTomato高/EPHB4-EGFP低细胞减少(图4A-4B)。在除去FGF、VEGF、SB431542或RESV后，另外两个动脉标志物，CXCR4和DLL4也相似地降低(图4C-4F)。然而，当去除RESV或L-690,330时，或者当添加PDGF时，获得了较少的EFNB2-tdTomato高/EPHB4-EGFP低推定动脉内皮细胞，但没有观察到CD144+CXCR4+和CD144+DLL4+细胞的减少(图4C-4F)。尽管作为单因子，WNT3A促进动脉分化，外源性WNT3A在其他五个因子的情况中没有进一步增加动脉分化(图4A-4F，图9)。
用五因子方案产生的内皮细胞摄取LDL，形成血管网络，并维持这些网络中的EFNB2(肝配蛋白B2)表达(图5C-5D)。功能性AEC的另一个特征是相对于静脉内皮细胞降低的白细胞粘附(Hauser等，J Immunol 151,5172-5185(1993)；Kalogeris等，Am J Physiol276,L9-L19(1999))。因此，我们分析了TNFα(一种促炎细胞因子)在不同类型的内皮细胞中诱导白细胞粘附的能力(De Caterina等，1995)。
最后，我们检验了人ES细胞衍生的AEC是否表现出动脉特异性功能特征。首先，“五因子”AEC产生与原代冠状动脉内皮细胞(HCAEC)相当水平，并且高于HUVEC细胞的水平的NO(图7A)。其次，AEC以与原代主动脉内皮细胞相似的速率，并且以比HUVEC细胞更高的速率消耗氧(图7B)。第三，AEC响应剪切应力而伸长到与原代动脉内皮细胞相似的程度，并且比HUVEC细胞程度更大(图7C-7D)。AEC显示低水平的TNFα诱导的白细胞粘附(Hauser等，JImmunol 151,5172-5185(1993)；Kalogeris等，Am J Physiol276,L9-L19(1999))，其与原代动脉内皮细胞相当，并且远低于HUVEC细胞(图7E-7F)。总之，我们的组合结果表明，AEC的特征在于基因表达和功能特性，其与静脉内皮细胞不同，但与动脉内皮细胞一致。
以前的研究表明，血管平滑肌表达ACTA2(SMA)、TAGLN(SM22a)、MYH11和ELN(Owens等，Physiol Rev 84,767-801(2004))。我们进一步证明CD31可用于区分肠和血管平滑肌细胞。如图12所示，MYH11-阳性血管平滑肌被招募到血管。在肠中，平滑肌细胞同时表达MYH11和CD31(箭头表示)，表明MYH11+CD31-细胞是血管平滑肌细胞，而MYH11+CD31+细胞是肠平滑肌细胞。
表2.动脉富集的生长因子相关基因
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Figure BDA0001384547860000331
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材料和方法
分离用于单细胞RNA-seq的小鼠内皮细胞：收获24只E11.5小鼠(CD-1背景)胚胎。头，尾，肢体，内部器官和体节被去除。将主动脉-性腺-中肾(AGM)组织在2mg/ml IV型胶原酶(生命技术公司，目录号17104-019)和0.25mg/ml分散酶(生命技术公司，目录号17105-041)溶液中在冰上孵育15分钟以使酶渗入组织。然后，组织与酶在37℃下孵育10分钟。由2％FBS-HBSS中和该酶，并上下吹打以进一步解离细胞。细胞经免疫染色，并且通过流式细胞术分选CD31+CD144+CD41-CD45-内皮细胞。CD41和CD45用于消耗造血干细胞。
分离用于单细胞RNA-seq的人胎儿动脉内皮细胞：将人胎儿主动脉组织(14周妊娠)从主动脉弓解剖到腹部分叉。组织是从伊希瓦大学艾伯特爱因斯坦医学院(纽约布朗克斯克)的人胎儿组织库获得的。这项工作是在UW-麦迪逊健康科学IRB和爱因斯坦医学院IRB的批准下完成的。将人胎儿背主动脉的外膜层完全去除，将其余组织切成小片。然后将组织用300U/ml胶原酶/弹性蛋白酶(沃明顿生物化学公司(Worthington Biochem)，目录号LK002067)在37℃下消化1小时，并且每20分钟吹打组织。使用抗-CD31抗体通过流式细胞术分选内皮细胞。
单细胞RNA-测序。对于小鼠AGM细胞，将15μl细胞悬浮液(含有5×104个细胞)加载到Fluidigm C1 TM芯片中。在制造商建议下，在Fluidigm C1 TM单细胞自动制备系统上进行RNA分离，cDNA文库制备(Smarter-seq1方案)。通过Quant-iTTM
Figure BDA0001384547860000361
dsDNA试验试剂盒(生命技术公司，目录号P7589)测量cDNA浓度并稀释至0.1-0.3ng/μl。通过使用Nextera XTDNA样品制备试剂盒(亿明达公司(Illumina)，目录号FC-131-1024)对cDNA进行标记和条码化。对于测序(亿明达公司，HiSeq2500)，合并了18-24个样品。总共对84个细胞进行测序。在双重排除和异常去除后，使用70个细胞进行进一步分析。
对于通过“五因子”方案得出的AEC，CD144+/EFNB2-tdTomato高/EPHB4-EGFP低细胞经分选并加载到Fluidigm C1 TM芯片中。如上所述制备和测序cDNA。对总共96个细胞进行测序并将其用于进一步分析。
对于原代AEC(“pAEC”，从14周龄的人胎儿背侧主动脉新鲜分离)，将smarter-seq2方案应用于Fluidigm C1 TM单细胞自动制备系统用于cDNA制备。Smarter-seq2已被证明提高cDNA的产量和测序灵敏度41，因此适用于RNA质量较低的样品。对总共48个细胞进行测序并用于进一步分析。
H1ES和HUVEC细胞由适用smarter-seq2方案的Fluidigm C1 TM单细胞自动制备系统制备。对24个H1和48个HUVEC细胞进行测序，并用于进一步分析。
分级聚类：从RSEM生成单细胞RNA-seq数据(TPM)。对于每个基因，log2TPM被缩放到具有平均值0和方差1的z分数。在取对数之前，低于1的TPM被输入为1。使用细胞之间的欧几里得距离进行分层聚类(图1)。
SINGuLAR分析工具集2.1的数据分析：单细胞RNA-seq数据(TPM)被加载到SINGuLAR分析工具集2.1中。异常值被“identOutliers()”命令删除。通过“autoAnalysis()”命令分析样品的动脉和静脉标志物。结果，自动生成图1C的PCA图。AEC数据的热图(图10)也由SINGuLAR的“autoAnalysis()”产生。
通过R程序的主成分分析：对单细胞RNA-seq数据进行主成分分析(PCA)(图5B)。为了调整不同细胞间的测序深度变化，通过中值比标准化对预期计数标准化。为了减少潜在异常值的影响，对于每个基因，使用第95位分位数估算出大于基因特异性表达的第95位分位数的值。在PCA之前，将基因特异性标准化的表达重新定标为所有基因的平均值0和标准偏差1的值。PCA分析使用R中的prcomp()函数进行。
生成生长因子相关基因列表：组合五个Amigo Go项(版本1.8)生长因子结合(GO：0019838)，生长因子活性(GO：0008083)，生长因子受体结合(GO：0070851)，受体活性(GO：0004872)，和受体结合(GO：0005102)。然后将组合列表与质膜(GO：0005886)连接以产生生长因子相关基因列表。该列表进一步与表5中的“动脉富集基因”相结合，以产生表6的动脉富集生长因子相关基因列表。
H1ES细胞上的基因靶向：通过由IDT(gBlock)合成EFNB2靶向载体的5'和3'同源臂，引入Sal I和BamH I(5'臂)、Bmt I和Mlu I(3'臂)限制位点以促进亚克隆到靶向载体中。从BAC(细菌人工染色体)PCR扩增EPHB4靶向载体的5'和3'同源臂。
为了达到最佳的电穿孔效率，人ES细胞(H1)通过EDTA传代(1:4分开)，并在实验前两天培养达到80-90％汇合。在实验当天，通过Accutase解离ES细胞，用E8培养基洗涤一次，并在具有10mM Hepes缓冲液(pH 7.2-7.5)(生命技术公司)的E8培养基中以5×106个细胞/mL的密度重新悬浮。对于电穿孔，将400μL细胞悬浮液，7.5μg gRNA质粒，7.5μg spCas9质粒和10μg线性化DNA模板质粒在4-mm比色皿(伯乐公司(Bio-Rad))中混合，并立即用伯乐基因脉冲仪电穿孔。电穿孔参数为250V，500μF，和无限电阻。然后将细胞在E8培养基中涂布在基质胶包被的平板上(第一天加入10μMY27632)。对于EFNB2-tdTomatom细胞系，当细胞达到20％汇合(通常在电穿孔后3-4天)时，将100μg/ml遗传霉素加入到培养基中，并且药物选择持续5天。对于EPHB4-EGFP细胞系，当细胞达到20％汇合时，向培养基中加入0.5μg/ml嘌呤霉素。由于E8培养基中细胞的药物敏感性，8小时/天的嘌呤霉素处理进行5天。在药物选择后4-6天挑选存活的菌落，并在E8培养基中扩增。
核型分析：核型分析由WiCell研究所进行。
Southern印迹：使用PCR DIG探针合成试剂盒(罗氏公司(Roche)，目录号11 636090 910)合成探针。Southern印迹是按照在来自罗氏公司的DIG过滤杂交应用手册进行的。
表3.培养基组分
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Figure BDA0001384547860000391
人多潜能干细胞培养和分化：iPS细胞系005B23.1衍生自皮肤穿孔成纤维细胞，并维持在重组玻连蛋白包被的平板上。DF19.11衍生自包皮成纤维细胞。CD-3-1衍生自脐带血细胞。PBMC衍生自外周血单核细胞。H1和H9ES细胞分别衍生自雄性和雌性胚胎。
将人多潜能干细胞在E8培养基中在基质胶包被的平板(005B23.1除外)上培养。为了达到最佳的分化结果，ES细胞在分化前两天以1:4的比例被EDTA分裂。两天后细胞达到80-90％汇合。在分化的那一天，通过Accutase(英杰公司)将ES细胞在37℃下解离3分钟。将细胞以1:3的比例(1.1-1.5×105个细胞/cm2)接种在玻连蛋白包被的平板(重组玻连蛋白，50μg/10-cm皿)上。36小时后细胞达到100％汇合。为了提高细胞存活率，第一天使用10μMY27632。将细胞在E8BAC培养基(参见表3：补充有5ng/ml BMP4，25ng/ml激活素A和1μMCHIR99021的E8培养基)中培养两天。然后使用补充有生长因子或小分子的E6(E8培养基减去FGF2和TGFβ1)培养基再诱导内皮细胞分化三天。每天更换培养基。在第5天收获细胞。为了分离CD31+CD34+细胞，用CD34磁珠标记细胞并通过autoMACS(美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotec))进行处理。将纯化的细胞在含E7V(E6+100ng/ml FGF2+50ng/mlVEGFA)培养基的纤连蛋白包被的(生命技术公司，目录号33016-015)(100μg/10-cm皿)或玻连蛋白包被的(50μg/10-cm皿)皿上培养。
动脉内皮细胞分化和增殖：AEC分化需要六天时间。从第0天到第2天，如上所述，人ES/iPS细胞首先被分化成中胚层细胞。从第2天到第6天，使用E5培养基，并如图所示添加生长因子或小分子。对于“五因子”组合，从第2天至第6天，用补充有100ng/ml FGF，50ng/mlVEGF，10μM SB431542，5μM RESV和10μM L690的E5培养基诱导AEC。
通过CD144微珠(美天旎生物技术公司，目录号130-097-857)纯化AEC用于一些功能性试验。优化后(图9)，将AEC维持在纤维连接蛋白或玻连蛋白包被的培养皿上的FVIR(E5+100ng/ml FGF，50ng/ml VEGF，10μMSB431542，5μM RESV)或FVIR+Ins(FVIR培养基+10μg/ml胰岛素)培养基中。
LDL-摄取试验：为了进行LDL-摄取试验，将2μg/ml乙酰化-LDL-FITC加入到培养基中并培养4小时。在成像前10分钟，将2μg/ml Hoechst加入到培养基中。为了与CD144共染色，在成像前2小时将抗-CD144-647抗体加入到培养基中。去除培养基，并加入HBSS用于活细胞成像。重要的是对活动细胞进行成像，因为固定细胞会降低LDL-FITC信号。
Figure BDA0001384547860000401
包封试验：将1.5×103个内皮细胞/μl和0.75×103个周细胞/μl(ScienCell公司，目录号1200)包封在6.5mg/ml基质胶中。在24孔平板中间点样10μL基质胶/细胞溶液，并在37℃下孵育5分钟固化。然后施加E7V培养基。在第4天进行免疫染色，并使用尼康共焦显微镜对结构进行成像。
体内
Figure BDA0001384547860000402
塞血管生成试验：将5×105个内皮细胞重新悬浮于100μlE7V培养基和200μL基质胶中，然后将300μL细胞/基质胶混合物皮下注射到裸鼠颈部。接种两周后，基质胶经收获、固定和免疫染色。对于葡聚糖注射，在接种四周后将100μg罗丹明偶联的葡聚糖眼球后注射到小鼠中。葡聚糖注射后十分钟，基质胶塞经收获、固定和免疫染色。
纤维蛋白凝胶包封试验：将1.5×103个内皮细胞/μl和/或0.75×103个周细胞/μl包封在纤维蛋白凝胶中。纤维蛋白凝胶由2.5mg/ml纤维蛋白原(EMD，目录号341578)和0.5U/ml凝血酶(西格玛公司(Sigma)，目录号T-9326)制备。在24孔平板中间点样10μL纤维蛋白凝胶/细胞溶液，并在37℃下孵育10分钟固化。然后施加E7V培养基。在第4天进行免疫染色，并使用共焦显微镜对结构进行成像。
氧-诱导的视网膜病模型：实验在UW-麦迪逊眼科和视觉科学IRB的批准下进行。在C57/BL6野生型小鼠中诱导氧诱导的视网膜病，如前所述21。简而言之，将出生后第七天的小鼠暴露于75％氧气中持续5天。在出生后12天，将其转移回室内空气，并接受1μl含5×104个细胞的玻璃体内注射。使用磷酸盐缓冲盐水(PBS)作为载剂并作为对照注射。五天后，收获视网膜并进行免疫染色。
后肢缺血模型：实验在UW-麦迪逊心血管生理学中心IRB的批准下进行。如前所述，产生后肢缺血模型22。简而言之，使用10-12周龄的雌性无胸腺裸鼠(Crl:NU(NCr)-Foxn1nu，伊利诺伊州芝加哥的查尔斯河实验室(Charles River Laboratroies))。使用10至20周龄而不是4至6周龄的小鼠，因为较老小鼠的恢复较慢，更类似于人类肢体缺血。将髂总动脉连接到腹腔，刚好在腹股沟韧带尾部，将股动脉在两个位置连接并去除。手术后将小鼠随机分为四组，并注射细胞或DF12培养基。将细胞(0.3×106、1×106或3×106个细胞/小鼠)悬浮于300μl DF12培养基中，并肌内注射到缺血性腿部的股薄肌的6个部位。每天进行7至8只小鼠的手术。
一氧化氮产生试验：将内皮细胞接种在玻连蛋白包被的24孔板(1×105个细胞/孔)上。AEC在FVIR+Ins培养基中培养。将HUVEC(隆萨公司(Lonza)，目录号CC-2519)在EGM2(隆萨公司，目录号CC-3202))培养基中培养。将HCAEC(隆萨公司，目录号CC-2585)在EGM2培养基中培养一天，然后在FVIR+Ins培养基中再培养一天。两天后，所有培养基都更换为含有1μM DAF-FM(生命技术公司，目录号D-23844)的新鲜FVIR+Ins培养基。培养细胞30分钟，然后收获用于流式细胞分析。DAF-FM直到其与NO反应形成荧光苯并三唑才是荧光的。为了达到一致的结果，在添加DAF-FM后，使用相同的细胞密度和相同的培养基是至关重要的。
氧消耗试验：将4×104个细胞/孔接种在XF24-孔板(海马生物科学公司)上过夜。AEC在FVIR培养基中培养，HCAEC和HUVEC在EGM2培养基中培养。一天之后，培养基被更换为Mito试验培养基(海马生物科学公司)，并且由XF24分析仪根据制造商的说明书(海马生物科学公司)测量氧消耗率。在时间点3注射寡霉素(0.5μM)以通过抑制ATP-合成酶来消除氧消耗。在时间点6注入FCCP(2μm，线粒体解偶联剂)以使电子传递链从氧化磷酸化解偶联，从而测量最大呼吸能力。为了测量非线粒体呼吸，在时间点9同时施加1μm的抗霉素A和1μm鱼藤酮，以分别完全阻断细胞色素bc1(复合物III)和NADH脱氢酶(复合物I)处的电子传递链。
剪切应力响应：使用ibidi泵系统(红色灌注组，μ-Slide VI 0.4)测定剪切应力响应。对于μ-载玻片的每个通道，加载30μl细胞悬液(5×105个细胞/ml，10μM Y27632)。细胞附着后，向每个通道加入130μl新鲜培养基。两天后，通过ibidi泵系统灌注μ-载玻片。灌注24小时后，收获细胞并免疫染色。
由于FVIR+Ins培养基促进了内皮细胞的伸长，E7V培养基用于在24小时剪切应力响应实验之前和期间培养“五因子”AEC。
白细胞粘附试验：将所有内皮细胞在纤连蛋白包被的24孔板上培养。AEC在FVIR培养基中培养；HCAEC和HUVEC在EGM2培养基(隆萨公司)中培养。当细胞达到100％汇合时，用或不用10ng/ml TNFα处理它们4小时。然后将1×106个U937细胞悬浮于0.5ml新鲜的RMPI1640+10％FBS中，并加入每个孔中。20-60分钟后，使用冷培养基(RMPI1640+10％FBS)温和洗去未附着的细胞。洗涤再重复两次。立即对细胞成像。
抗体试剂：抗-小鼠CD41-FITC(拜来及公司(Biolegend)，目录号133904)，抗-小鼠CD45-FITC(干细胞技术公司(STEMCELL technologies)，目录号10710)，抗-小鼠CD144-PE(BD公司，目录号562243)，抗-小鼠CD31-APC(BD公司，目录号551262)，抗-人CD31-FITC(BD公司，目录号555445)，抗-人CD31-V421(BD公司，目录号564089)，抗-人CD31-PE(BD公司，目录号555446)，抗-人CD34-647(BD公司，目录号555824)，抗-人CD144-647(BD公司，目录号561567)，抗-人DLL4-APC(美天旎公司，目录号130-096-560)，抗-人CXCR4-APC(BD公司，目录号560936)，抗-CD34微珠(美天旎公司，130-046-703)，抗-CD144微珠(美天旎公司，130-097-857)，抗-pAKT(ser473)(细胞信号公司(Cell signaling)，目录号4060)，抗-AKT(细胞信号公司，目录号4691)，抗-GAPDH(EMD密理博公司，目录号MAB374)。
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已经结合目前被认为是最有实践性且最优选的实施方式描述了本发明。然而，本发明通过示例性的方式显示而不旨在限于所公开的实施方式。因此，本领域技术人员将认识到本发明旨在包括所附权利要求所示的本发明的精神和范围内的所有修饰和其他设置。
表4.P1(动脉内皮细胞)对比P3(静脉细胞)中富集的基因
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Claims (21)

1.一种获得动脉内皮细胞的方法，所述方法包括
在无血清、无白蛋白、化学限定的培养基中培养中胚层细胞六天，直至获得包含至少80％人Ephrin B2以及少于20％EphB4+细胞的细胞群，从而获得包含动脉内皮细胞的细胞群，该培养基没有胰岛素并且包含成纤维细胞生长因子（FGF），血管内皮生长因子（VEGF）、Notch激动剂、TGF-β抑制剂、和肌醇单磷酸酶抑制剂，该人Ephrin B2即EFNB2阳性动脉内皮细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述中胚层细胞表达选自下组的一种或多种中胚层标志物：短尾基因(T)、EMOS、FOXA2、MIXL1、MSX1、和MSX2。
3.如权利要求1所述的方法，其中通过在包含骨形态发生蛋白（BMP）、激活素A、和Wnt/β-联蛋白信号转导的激活剂的无血清、无白蛋白、化学限定的细胞培养基中培养人多潜能干细胞持续2天的时间以获得包含中胚层细胞的细胞群来获得所述中胚层细胞，其中所述多潜能干细胞是人诱导型多潜能干细胞。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述中胚层细胞表达选自下组的一种或多种中胚层标志物：短尾基因(T)、EMOS、FOXA2、MIXL1、MSX1、和MSX2。
5.如权利要求3所述的方法，其中所述Wnt/β-联蛋白信号转导的激活剂是Gsk3抑制剂。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述Gsk3抑制剂选自下组：CHIR 99021、CHIR 98014、BIO-丙酮肟、BIO、LiCl、SB 216763、SB 415286、AR A014418、1-氮杂坎帕罗酮、和双-7-吲哚基马来酰亚胺。
7.如权利要求3所述的方法，其中所述Notch激动剂选自下组：白藜芦醇（3,4',5-三羟基茋）、丙戊酸、和辛二酰二羟肟酸。
8.如权利要求3所述的方法，其中所述TGF-β抑制剂是SB431542。
9.如权利要求3所述的方法，其中所述肌醇单磷酸酯的抑制剂是L-690,330。
10.一种按照权利要求1所述的方法获得的基本纯的、动脉内皮细胞的分离群。
11.如权利要求10所述的分离群，其包含至少90%动脉内皮细胞。
12.如权利要求10所述的分离群，其包含至少99%动脉内皮细胞。
13.一种按照权利要求3所述的方法获得的基本纯的、多潜能干细胞衍生的动脉内皮细胞的分离群。
14.如权利要求13所述的分离群，其包含至少90%动脉内皮细胞。
15.如权利要求13所述的分离群，其包含至少99%动脉内皮细胞。
16.一种体外筛选试剂的方法，包括
（a）使测试试剂接触按照权利要求1所述的方法获得的动脉内皮细胞；并且
（b）检测所述试剂对于白细胞对接触的动脉内皮细胞的粘附的作用。
17.如权利要求16所述的方法，其中检测包括进行选自下组的方法：白细胞粘附试验、RNA测序、基因表达概况分析、转录组分析、代谢组分析、检测报告物或感测物、蛋白质表达概况分析、福斯特共振能量转移（FRET）、代谢概况分析、和微量透析。
18.一种使工程改造的组织构建体血管化的方法，所述方法包括使按照权利要求1的方法获得的动脉内皮细胞接触工程改造的组织构建体。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述工程改造的组织构建体包括血管平滑肌细胞。
20.一种用于获得至少包含80％的动脉内皮细胞的细胞群的试剂盒，所述试剂盒包含：（i）适于将中胚层细胞分化成动脉内皮细胞的无血清、无白蛋白、化学限定的培养基，其中所述培养基基本不含胰岛素并且包含成纤维细胞生长因子（FGF），血管内皮生长因子（VEGF），和以下的至少一种：Notch激动剂、TGF-β抑制剂、和肌醇单磷酸酶的抑制剂；和（ii）描述用于将人中胚层细胞分化成至少包含80％的动脉内皮细胞的细胞群的方法的说明，所述方法包括在无血清、无白蛋白、化学限定的培养基中培养人中胚层细胞六天，直至细胞群包含至少80％EFNB2+人动脉内皮细胞且包含少于20％的EphB4 +细胞。
21.如权利要求20所述的试剂盒，还包含：
（a）适于将人多潜能干细胞分化成人中胚层细胞的无血清、无白蛋白、化学限定的培养基，所述培养基包含BMP、激活素A、和Wnt/β-联蛋白信号转导的激活剂；和
（b）描述将人多潜能干细胞分化成动脉内皮细胞的方法的说明，所述方法采用（a）的培养基；
其中所述多潜能干细胞是人诱导型多潜能干细胞。
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