CN107255717A - 喹诺酮类药物检测elisa试剂盒研制及检测方法 - Google Patents

喹诺酮类药物检测elisa试剂盒研制及检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107255717A
CN107255717A CN201710549763.5A CN201710549763A CN107255717A CN 107255717 A CN107255717 A CN 107255717A CN 201710549763 A CN201710549763 A CN 201710549763A CN 107255717 A CN107255717 A CN 107255717A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sample
solution
liquid
kit
elisa
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201710549763.5A
Other languages
English (en)
Inventor
姚世平
刘光中
姚洪涛
周轶
牛兰兰
李心乐
李兆青
周士友
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BEIJING BIOCHEM HENGYE TECHNOLOGY DEVELOPMENT Co Ltd
Original Assignee
BEIJING BIOCHEM HENGYE TECHNOLOGY DEVELOPMENT Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BEIJING BIOCHEM HENGYE TECHNOLOGY DEVELOPMENT Co Ltd filed Critical BEIJING BIOCHEM HENGYE TECHNOLOGY DEVELOPMENT Co Ltd
Priority to CN201710549763.5A priority Critical patent/CN107255717A/zh
Publication of CN107255717A publication Critical patent/CN107255717A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/64—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving ketones
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/535—Production of labelled immunochemicals with enzyme label or co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or enzyme substrates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Abstract

本发明公开了喹诺酮类药物检测ELISA试剂盒研制及检测方法。所述试剂盒研制方法在包被液中加入阴离子表面活性剂，检测方法用弱酸性缓冲液提取样本中的喹诺酮类药物残留。所述样本检测方法包括样本前处理和样本检测两个步骤。ELISA方法精密度良好，较仪器方法操作简单，较生物传感器、化学发光酶联免疫等其他免疫分析方法成本低，结果稳定，技术更加成熟，本发明在精密度上的改善，更进一步保证了不同技术水平人员、不同实验室操作的一致性，前处理方法简单，不涉及有机试剂，更加安全环保，检测结果准确可靠，能够满足市场检测需要，便于普及应用。

Description

喹诺酮类药物检测ELISA试剂盒研制及检测方法
技术领域
本发明属于食品安全快速检测技术领域，具体涉及喹诺酮类药物检测ELISA试剂盒研制及检测方法。
背景技术
1、术语解释：
ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)酶联免疫吸附分析方法。
2、现有技术
喹诺酮类药物是人工合成抗菌剂，根据其结构及抗菌谱的不同经历了四代喹诺酮类药物，目前使用的主要为第三代、第四代喹诺酮，其抗菌谱广，抗菌活性强，兽医临床主要用于敏感菌所致的呼吸道、消化道、尿道感染，同时可提高动物日增重和饲料转化率。随着喹诺酮类药物应用增加，也出现了不少滥用的情况，药物使用不当会引起耐药菌的产生以及食品安全问题。为了保障动物源性食品的安全，欧盟、美国及我国等很多国家都对喹诺酮类药物在动物源性食品中的残留制定了最大残留限量(MRL，Maximum Residue Limit)。我国农业部第235号公告规定恩诺沙星动物性食品肌肉中的最高残留限量为100μg/kg，沙拉沙星在肌肉中的最高残留限量为10μg/kg。
目前喹诺酮类药物残留检测方法常用的为仪器检测方法和免疫检测方法，仪器检测方法操作复杂，要求仪器使用者的技术水平较高，价格昂贵，不易普及。免疫检测方法是根据抗原抗体的特异性反应进行检测，定量检测技术平台主要有生物传感器、化学发光酶联免疫方法、酶联免疫分析方法(ELISA)，目前，成熟且普遍应用的定量检测方法是酶联免疫分析方法。喹诺酮类残留检测ELISA方法易推广，操作相对简单，但是也存在一些缺点，比如酶标板精密度较差、样品基质干扰回收率不均一、提取方法为氮吹法耗时长、提取溶剂大部分含有有机溶剂存在安全隐患等多个问题。
ELISA所用的聚苯乙烯酶标板与蛋白质主要通过疏水作用吸附，存在吸附不均一，边缘效应等情况，使得产品精密度差，从而影响试剂盒检测结果。
河南工业大学申请专利《一种氟喹诺酮类药物人工免疫抗原、制备方法、酶标抗原、竞争ELISA试剂盒及应用》(申请号201610406844.5)，所用样本提取液为有机试剂50％甲醇，给环境和操作人员造成了一定的安全隐患；北京勤邦生物技术有限公司申请专利《一种检测水产品中喹诺酮类药物的酶联免疫试剂盒及其应用》(申请号201210077420.0)，水产(鱼肉、虾肉)中喹诺酮类药物残留检测的前处理方法为乙腈提取，正己烷净化，采用氮吹方法，该方法用到有机试剂，存在安全隐患，并且氮吹法耗时较长。
发明内容
为了解决现有的喹诺酮类残留检测ELISA方法中存在的酶标板精密度较差、样品基质干扰回收率不均一、提取方法为氮吹法耗时长、提取溶剂大部分含有有机溶剂存在安全隐患等问题，本发明提供喹诺酮类药物检测ELISA试剂盒研制及检测方法。通过所述方法，可以研制一种精密度高的喹诺酮类药物残留检测ELISA试剂盒，并提供一种应用于ELISA试剂盒的安全环保，操作简单可重复的样本前处理方法。
为实现上述目标，本发明采用以下技术方案：
一种喹诺酮类药物检测ELISA试剂盒研制方法，所述方法在包被液中加入阴离子表面活性剂，用弱酸性缓冲液提取样本中的喹诺酮类药物残留。
优选的，所述阴离子表面活性剂为十二烷基磺酸钠。
优选的，所述弱酸性缓冲液为邻苯二甲酸氢钾-氢氧化钠缓冲液。
一种喹诺酮类药物检测ELISA试剂盒研制方法，所述方法包括以下步骤：
1)酶标板的制备：
1.1)配制1#包被液：pH值为9.6，0.05mol/L的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液；
1.2)配制2#包被液：称取十二烷基磺酸钠1g加入到100mL1#包被液中，溶解，用1#包被液进行倍比稀释2×105倍至所含十二烷基磺酸钠浓度为50pg/mL，将此溶液作为恩诺沙星-BSA包被液。
1.3)用2#包被液将恩诺沙星-BSA稀释至工作浓度2mg/L，混匀，并静置15分钟；
1.4)取标记好的酶标板，用8孔道排枪点板，100μL/孔，盖上盖板膜；
1.5)置于4℃冰箱，过夜包被16小时；
1.6)从冰箱取出酶标板并抛掉板内液体，洗板1次，抛掉板内液体，拍干，加入封闭液200μL/孔，放入37℃恒温培养箱内封闭2小时；
1.7)从37℃恒温培养箱取出酶标板，抛掉板内液体，拍干，置于37℃鼓风干燥箱中封闭2小时以上，取出酶标板放入带有干燥剂的铝箔袋中，抽真空保存，备用；
2)试剂盒溶液的配制：
2.1)基础溶液的配制
抗体稀释液：pH为7.0，0.05M磷酸盐缓冲液，含有氯化钠0.9％，含有0.5‰proclin-300防腐剂；
底物显色溶液：A液配方为每1L去离子水中加入过氧化脲1.4g，柠檬酸10.2g，十二水合磷酸氢二钠36.0g，吐温-20 50μL，调至pH＝5；B液配方为每1L去离子水中加入四甲基联苯胺650mg，10.2g柠檬酸，调至pH＝3.0；
封闭液：pH值为9.2，0.02mol/L的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，含5％BSA、0.5％吐温-20、0.5‰proclin-300防腐剂；
浓缩洗涤液：pH值为7.4，0.01mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，含0.5％吐温-20、0.5‰proclin-300防腐剂；
终止液：以常规方法配制浓度为2mol/L的硫酸溶液；
标准品缓冲溶液：以常规方法配制1.0mmol/L，pH＝7.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，含氯化钠0.9％；
2.2)按照棋盘法测定抗原抗体效价、酶标二抗效价及抗体灵敏度，从而选择标准曲线各点，其中：
包被原工作浓度为2mg/L，稀释液为2#包被液；
抗体工作效价为1:12000，稀释液为抗体稀释液；
酶标二抗工作效价为1:400，稀释液为抗体稀释液；
标准曲线各点浓度分别是0μg/L，0.2μg/L，0.4μg/L，0.8μg/L和1.6μg/L，稀释液为标准品缓冲液；
3)ELISA试剂盒的精密度和准确性验证：通过比较1#和2#两种包被液精密度测定结果，验证试剂盒的精密度得到提高；试剂盒的准确性从试剂盒的样本回收率和ELISA方法与HPLC方法检测样本结果对比两方面进行验证；
4)试剂盒特异性的测定：测试恩诺沙星及其竞争物的交叉反应率。
一种喹诺酮类药物检测ELISA试剂盒检测方法，所述方法包括样本前处理和样本检测两个步骤。
所述样本前处理包括以下步骤：
1)样本制备：挑选样本，用匀浆机将所选样本匀浆，冰箱冻存；
2)配制提取液：按常规方法配制pH 5.6，0.05M邻苯二甲酸氢钾-氢氧化钠缓冲液；
3)涡旋：准确称取1.0±0.01g均质样本至10mL离心管中，加入3mL提取液，高速涡旋1分钟；
4)离心：室温(20-25℃)下，10000rpm，离心10分钟；
5)提取待测液：取上清液50μL用于分析。
备注：如样品喹诺酮含量过高，将样品提取液用标准品缓冲液稀释到检测范围。
所述样本检测包括以下步骤：
1)加样：加标准品/样品50μL到对应的微孔中，加入酶标二抗50μL/孔，再加入抗体工作液50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温(20-25℃)、避光环境反应30分钟；
2)洗涤：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液250μL/孔，洗涤5次，拍干；
3)显色：加入预混好的底物显色液100μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温(20-25℃)、避光环境反应10分钟；
4)测定：加入终止液50μL/孔，轻轻振荡混匀，5分钟内读取数据。设定酶标仪双波长450/630nm检测，测定每孔450nm处的OD值。
本发明中检测结果分析过程为：用所获得的每个浓度的标准品溶液的吸光度平均值(B)除以第一个标准溶液(0标准)的吸光度值(B0)再乘以100％，即百分吸光度值。计算公式为：
百分吸光度值(％)＝(B/B0)×100％
以恩诺沙星标准品溶液浓度(μg/L)的对数值为横坐标，百分吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线图。用同样的办法计算样品溶液的百分吸光度值，相对应每一个样品的恩诺沙星含量则可从标准曲线上读出。
本发明十二烷基磺酸钠阴离子表面活性剂的引入，也可以用其他合适浓度的阴离子表面活性剂代替，十二烷基磺酸钠在其在他项目中也可以选择合适浓度使用。
本发明所用提取液为邻苯二甲酸氢钾-氢氧化钠缓冲液，该缓冲液用于提取四种类样本中的喹诺酮类药物，也可以用来提取与喹诺酮药物性质相似的磺胺类药物等。所使用的pH值，浓度都可以在不同的项目上寻找到合适的值，以实现提取检测。
本发明的优点和有益效果为：
1)在包被液中加入阴离子表面活性剂，利用其润湿作用为蛋白质与聚苯乙烯酶标板提供无障碍的接触机会，使得在包被过程中位于不同条件下(通风、温度)各孔中蛋白质与酶标板的吸附量均等化，有效降低了边缘效应，从而明显改善了包被酶标板的精密度。十二烷基磺酸钠的加入使批间精密度由13.74％提高到5.25％。
2)样本中喹诺酮类药物残留用弱酸性缓冲液提取，与其它试剂比较提升了回收率。
3)使用弱酸性的缓冲溶液提取，不需要进行氮吹的操作，不需要在点板前调节pH，缩短了检测时间，提升了快检的高通量水平。
4)弱酸性缓冲溶液既可以提取出喹诺酮类药物，又能避免使用有机试剂，建立了一种安全环保的前处理方法。
具体实施方式
实施例
本实施例制备喹诺酮类药物残留检测ELISA试剂盒，用制得的试剂盒对猪肉、鸡肉、鱼肉、虾肉样本进行检测，并验证试剂盒的精密度、准确性和特异性。包括以下步骤：酶标板的制备，试剂盒溶液的配制，对猪肉、鸡肉、鱼肉、虾肉样本进行前处理，用试剂盒实施检测，试剂盒的精密度和准确性验证和试剂盒特异性的测定。
1.酶标板的制备：
1.1配制1#包被液：pH值为9.6，0.05mol/L的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液；
1.2配制2#包被液，称取十二烷基磺酸钠1g加入到100mL1#包被液中，溶解，用1#包被液进行倍比稀释2×105倍至所含十二烷基磺酸钠50pg/mL，将此溶液作为恩诺沙星-BSA包被液。
1.3用2#包被液将恩诺沙星-BSA稀释至工作浓度2mg/L，混匀，并静置15分钟；
1.4取标记好的酶标板，用8孔道排枪点板，100μL/孔，盖上盖板膜；
1.5置于4℃冰箱，过夜包被16小时；
1.6从冰箱取出酶标板并抛掉板内液体，洗板1次，抛掉板内液体，拍干，加入封闭液200μL/孔，放入37℃恒温培养箱，封闭2小时；
1.7从37℃恒温培养箱取出酶标板，抛掉板内液体，拍干，置于37℃鼓风干燥箱中封闭2小时以上，取出酶标板放入带有干燥剂的铝箔袋中，抽真空保存，备用。
本实施例采用的包被液是2#包被液，即在1#包被液中加入适量的十二烷基磺酸钠。在包被液中加入阴离子表面活性剂，主要是利用其润湿作用为蛋白质与聚苯乙烯酶标板提供无障碍的接触机会，使得在包被过程中位于不同条件下(通风、温度)各孔中蛋白质与酶标板的吸附量均等化，有效降低了边缘效应，从而明显改善了包被酶标板的精密度。十二烷基磺酸钠的加入使批间精密度由13.74％提高到5.25％。
2.试剂盒溶液的配制
2.1基础溶液的配制
抗体稀释液：pH为7.0，0.05M磷酸盐缓冲液，含有氯化钠0.9％，0.5‰proclin-300防腐剂；
底物显色溶液：A液配方为每1L去离子水中加入过氧化脲1.4g、柠檬酸10.2g、十二水合磷酸氢二钠36.0g、吐温-20 50μL，调至pH＝5；B液配方为每1L去离子水中加入四甲基联苯胺650mg、10.2g柠檬酸，调至pH＝3.0；
封闭液：pH值为9.2，0.02mol/L的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，含5％BSA、0.5％吐温-20、0.5‰proclin-300防腐剂；
浓缩洗涤液：pH值为7.4，0.01mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，含0.5％吐温-20、0.5‰proclin-300防腐剂；
终止液：以常规方法配制浓度为2mol/L的硫酸溶液；
标准品缓冲溶液：以常规方法配制1.0mmol/L，pH＝7.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，含氯化钠0.9％。
2.2按照棋盘法测定抗原抗体效价、酶标二抗效价及抗体灵敏度，从而选择标准曲线各点：
包被原工作浓度为2mg/L，稀释液为2#包被液；
抗体工作效价为1:12000，稀释液为抗体稀释液；
酶标二抗工作效价为1:400，稀释液为抗体稀释液；
标准曲线各点浓度分别是0μg/L，0.2μg/L，0.4μg/L，0.8μg/L和1.6μg/L，稀释液为标准品缓冲液。
3.猪肉、鸡肉、鱼肉、虾肉样本前处理方法
3.1样本制备：挑选猪肉瘦肉，鸡肉去掉筋膜，鱼肉剔骨，虾肉去皮及消化道，用匀浆机将所选样本匀浆，放入冰箱冻存。
3.2提取液的配制：按常规方法配制pH5.6，0.05M邻苯二甲酸氢钾-氢氧化钠缓冲液；
3.3涡旋：准确称取1.0±0.01g均质样本至10mL离心管中，加入3mL提取液，高速涡旋1分钟；
3.4离心：室温(20-25℃)下，10000rpm，离心10分钟；
3.5取上清液50μL用于分析。
如果样品中喹诺酮含量过高，将样品提取液用标准品缓冲液稀释到检测范围。
4.试剂盒的检测步骤
4.1加样：加样品50μL到对应的微孔中，加入酶标二抗50μL/孔，再加入抗体工作液50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温(20-25℃)、避光环境反应30分钟；
4.2洗涤：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液250μL/孔，洗涤5次，拍干；
4.3显色：加入预混好的底物显色液100μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温(20-25℃)、避光环境反应10分钟；
4.4测定：加入终止液50μL/孔，轻轻振荡混匀，5分钟内读取数据。设定酶标仪双波长450/630nm检测，测定每孔450nm处的OD值。
本实施例中检测结果分析过程为：用所获得的每个浓度的标准品溶液的吸光度平均值(B)除以第一个标准溶液(0标准)的吸光度值(B0)再乘以100％，即百分吸光度值。计算公式为：
百分吸光度值(％)＝(B/B0)×100％
以恩诺沙星标准品溶液的浓度(μg/L)的对数值为横坐标，百分吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线图。用同样的办法计算样品溶液的百分吸光度值，相对应每一个样品的恩诺沙星含量则可从标准曲线上读出。
5.ELISA试剂盒的精密度和准确性验证
5.1精密度
对两种包被液进行精密度测定过程如下：
分别取两种包被液的各三批酶标板，每批各抽出8*4个微孔，组合成一块酶标板，测定0.4μg/L标准溶液的吸光度值，计算变异系数，结果见表1、表2。
表1 1#包被液包被酶标板标准可重复性试验(CV％)
表2 2#包被液包被酶标板标准可重复性试验(CV％)
通过上述试验结果可以得出，1#包被液包被的酶标板，每批酶标板的批内变异系数在8.55％～10.67％，批间变异系数为13.74％；2#包被液包被的酶标板，每批酶标板批内变异系数在4.67％～4.89％之间，批间变异系数为5.25％，精密度较1#包被液有明显提高，增加了试剂盒检测结果的可重复性。
5.2试剂盒准确性验证
试剂盒的准确性从试剂盒的样本回收率和ELISA方法与HPLC方法检测样本结果对比两方面进行验证。
5.2.1样本回收率的测定
按照步骤3所述前处理方法，称取平行样本各三份；
取高浓度标准品60μg/L(甲醇溶解)，10μL、20μL、40μL分别添加到1g样本中，使得样本所含恩诺沙星终浓度分别为0.6μg/kg、1.2μg/kg和2.4μg/kg；
加入提取液按照步骤3所述前处理方法进行喹诺酮提取，按照步骤4的检测方法对步骤3处理好的样本提取液进行检测，检测结果结果见表3。
表3各样本添加回收率
结果表明，猪肉的回收率在83.2％～96.4％之间，平均回收率在88.79％，鸡肉的回收率在84.4％～93.8％之间，平均回收率在89.02％、鱼肉回收率在83.8％～102.1％之间，平均回收率在93.01％、虾肉回收率在86.0％～98.0％之间，平均回收率在92.04％，说明该方法具有较好的回收率。
5.2.2 ELISA方法与HPLC方法检测样本结果对比
参考农业部1025号公告-14-2008方法《动物性食品中氟喹诺酮类药物检测高效液相色谱法》。
本试剂盒检测方法检测结果与农业部检测结果对比：
参考农业部方法检测猪肉、鸡肉、鱼肉、虾肉样本各一份，添加浓度为20μg/kg、40μg/kg和60μg/kg，分别检测三次；取相同的四类样本各一份，添加同样浓度，用本试剂盒的前处理方法提取，因为标准曲线范围为0.2μg/L～1.6μg/L，所以样品稀释39倍，点板时样本浓度落到本发明ELISA方法的检测范围内，检测结果见表4所示。
表4 HPLC与ELISA检测样本结果对比
由表4可知，本发明所研发的喹诺酮类药物检测ELISA试剂盒检测样本回收率与农业部高效液相色谱方法的检测样本回收率基本一致，两种方法检测猪肉标准偏差在1.96％～3.17％之间、鸡肉标准偏差在3.20％～3.35％之间、鱼肉标准偏差在1.92％～3.10％之间、虾肉标准偏差在2.32％～3.24％之间；农业部HPLC方法四类样本的平均回收率在96.06％～100.49％之间，本发明ELISA检测方法四类样本的平均回收率96.91％～100.88.％之间，本试剂盒检测结果准确性可靠。
6.试剂盒特异性的测定
以恩诺沙星作为标准，设恩诺沙星的交叉反应率为100％，用于抗体交叉反应性研究的药物为恩诺沙星结构或者功能相似的喹诺酮类药物：环丙沙星、诺氟沙星、培氟沙星、司帕沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、双氟沙星、单诺沙星。将不同的药物用标准品缓冲溶液按照恩诺沙星的浓度配制标准曲线，按照试剂盒的检测步骤，点包括恩诺沙星在内9条标准曲线，测定各竞争物50％抑制浓度(IC50)。交叉反应率(CR％)即为抗体对恩诺沙星的IC50与抗体对氟喹诺酮类竞争物的IC50之比的百分数，按下式进行计算：
测定结果见表5，本试剂盒除对单诺沙星的交叉反应率＜1％外，对其他7种喹诺酮类药物的交叉反应率在34～115％之间，半数抑制浓度IC50在0.498～1.685μg/L之间，可实现对多种喹诺酮类药物残留的检测。
表5喹诺酮类试剂盒特异性的测定
最后应说明的是：显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

Claims (8)

1.一种喹诺酮类药物检测ELISA试剂盒研制方法，其特征在于：所述方法在包被液中加入阴离子表面活性剂，用弱酸性缓冲液提取样本中的喹诺酮类药物残留。
2.如权利要求1所述的一种喹诺酮类药物检测ELISA试剂盒研制方法，其特征在于：所述阴离子表面活性剂为十二烷基磺酸钠。
3.如权利要求1所述的一种喹诺酮类药物检测ELISA试剂盒研制方法，其特征在于：所述弱酸性缓冲液为邻苯二甲酸氢钾-氢氧化钠缓冲液。
4.如权利要求1、2、3所述的一种喹诺酮类药物检测EL ISA试剂盒研制方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)酶标板的制备：
1.1)配制1#包被液：pH值为9.6，0.05mol/L的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液；
1.2)配制2#包被液：称取十二烷基磺酸钠1g加入到100mL1#包被液中，溶解，用1#包被液进行倍比稀释2×105倍至所含十二烷基磺酸钠浓度为50pg/mL，将此溶液作为恩诺沙星-BSA包被液；
1.3)用2#包被液将恩诺沙星-BSA稀释至工作浓度2mg/L，混匀，并静置15分钟；
1.4)取标记好的酶标板，用8孔道排枪点板，100μL/孔，盖上盖板膜；
1.5)置于4℃冰箱，过夜包被16小时；
1.6)从冰箱取出酶标板并抛掉板内液体，洗板1次，抛掉板内液体，拍干，加入封闭液200μL/孔，放入37℃恒温培养箱内封闭2小时；
1.7)从37℃恒温培养箱取出酶标板，抛掉板内液体，拍干，置于37℃鼓风干燥箱中封闭2小时以上，取出酶标板放入带有干燥剂的铝箔袋中，抽真空保存，备用；
2)试剂盒溶液的配制：
2.1)基础溶液的配制
抗体稀释液：pH为7.0，0.05M磷酸盐缓冲液，含有氯化钠0.9％，含有0.5‰proclin-300防腐剂；
底物显色溶液：A液配方为每1L去离子水中加入过氧化脲1.4g，柠檬酸10.2g，十二水合磷酸氢二钠36.0g，吐温-20 50μL，调至pH＝5；B液配方为每1L去离子水中加入四甲基联苯胺650mg，10.2g柠檬酸，调至pH＝3.0；
封闭液：pH值为9.2，0.02mol/L的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，含5％BSA、0.5％吐温-20、0.5‰proclin-300防腐剂；
浓缩洗涤液：pH值为7.4，0.01mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，含0.5％吐温-20、0.5‰proclin-300防腐剂；
终止液：以常规方法配制浓度为2mol/L的硫酸溶液；
标准品缓冲溶液：以常规方法配制1.0mmol/L，pH＝7.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，含氯化钠0.9％；
2.2)按照棋盘法测定抗原抗体效价、酶标二抗效价及抗体灵敏度，从而选择标准曲线各点，其中：
包被原工作浓度为2mg/L，稀释液为2#包被液；
抗体工作效价为1:12000，稀释液为抗体稀释液；
酶标二抗工作效价为1:400，稀释液为抗体稀释液；
标准曲线各点浓度分别是0μg/L，0.2μg/L，0.4μg/L，0.8μg/L和1.6μg/L，稀释液为标准品缓冲液；
3)ELISA试剂盒的精密度和准确性验证：通过比较1#和2#两种包被液的精密度测定结果，验证试剂盒的精密度得到提高；试剂盒的准确性从试剂盒的样本回收率和ELISA方法与HPLC方法检测样本结果对比两方面进行验证；
4)试剂盒特异性的测定：测试恩诺沙星及其竞争物的交叉反应率。
5.如权利要求1或2所述的一种喹诺酮类药物检测ELISA试剂盒研制方法，其特征在于：所述十二烷基磺酸钠阴离子表面活性剂，也可以用其他合适浓度的阴离子表面活性剂代替，十二烷基磺酸钠在其在他项目中也可以选择合适浓度使用。
6.如权利要求1或3所述的一种喹诺酮类药物检测ELISA试剂盒研制方法，其特征在于：所述提取液邻苯二甲酸氢钾-氢氧化钠缓冲液用于提取四种类样本中的喹诺酮药物，也可以用来提取与喹诺酮药物性质相似的磺胺类药物等；所使用的pH值、浓度都可以在不同的项目上寻找到合适的值，以实现提取检测。
7.一种喹诺酮类药物检测ELI SA试剂盒检测方法，其特征在于：所述方法包括样本前处理和样本检测两个步骤：
所述样本前处理包括以下步骤：
1)样本制备：挑选样本，用匀浆机将所选样本匀浆，冰箱冻存；
2)配制提取液：按常规方法配制pH 5.6，0.05M邻苯二甲酸氢钾-氢氧化钠缓冲液；
3)涡旋：准确称取1.0±0.01g均质样本至10mL离心管中，加入3mL提取液，高速涡旋1分钟；
4)离心：室温下，10000rpm，离心10分钟，所述室温是指20-25℃；
5)提取待测液：取上清液50μL用于分析；
所述样本检测包括以下步骤：
1)加样：加标准品/样品50μL到对应的微孔中，加入酶标二抗50μL/孔，再加入抗体工作液50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温、避光环境中反应30分钟，所述室温是指20-25℃；
2)洗涤：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液250μL/孔，洗涤5次，拍干；
3)显色：加入预混好的底物显色液100μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温、避光环境中反应10分钟，所述室温是指20-25℃；
4)测定：加入终止液50μL/孔，轻轻振荡混匀，5分钟内读取数据，设定酶标仪双波长450/630nm检测，测定每孔450nm处的OD值。
8.如权利要求7所述的一种喹诺酮类药物检测ELISA试剂盒检测方法，其特征在于，检测结果分析过程为：用所获得的每个浓度的标准品溶液的吸光度平均值B除以第一个标准溶液的吸光度值B0再乘以100％，即百分吸光度值，计算公式为：
百分吸光度值(％)＝(B/B0)×100％
以恩诺沙星标准品溶液浓度的对数值为横坐标，百分吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线图；用同样的办法计算样品溶液的百分吸光度值，相对应每一个样品的恩诺沙星含量则可从标准曲线上读出。
CN201710549763.5A 2017-07-07 2017-07-07 喹诺酮类药物检测elisa试剂盒研制及检测方法 Pending CN107255717A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710549763.5A CN107255717A (zh) 2017-07-07 2017-07-07 喹诺酮类药物检测elisa试剂盒研制及检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710549763.5A CN107255717A (zh) 2017-07-07 2017-07-07 喹诺酮类药物检测elisa试剂盒研制及检测方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107255717A true CN107255717A (zh) 2017-10-17

Family

ID=60025138

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710549763.5A Pending CN107255717A (zh) 2017-07-07 2017-07-07 喹诺酮类药物检测elisa试剂盒研制及检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107255717A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107976539A (zh) * 2017-11-07 2018-05-01 成都赛普克生物科技股份有限公司 一种降低酶联免疫法包被后本底的方法
CN108398551A (zh) * 2018-03-07 2018-08-14 深圳市伯劳特生物制品有限公司 一种用于酶联免疫试剂盒的组合物以及抗核抗体谱检测试剂盒及其制备方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1514246A (zh) * 2003-08-18 2004-07-21 成都夸常科技有限公司 平面基质包被聚合物组成及其应用
CN103323594A (zh) * 2012-03-22 2013-09-25 北京勤邦生物技术有限公司 一种检测水产品中喹诺酮类药物的酶联免疫试剂盒及其应用
CN106008700A (zh) * 2016-06-08 2016-10-12 河南工业大学 一种氟喹诺酮类药物人工免疫抗原、制备方法、酶标抗原、竞争elisa试剂盒及应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1514246A (zh) * 2003-08-18 2004-07-21 成都夸常科技有限公司 平面基质包被聚合物组成及其应用
CN103323594A (zh) * 2012-03-22 2013-09-25 北京勤邦生物技术有限公司 一种检测水产品中喹诺酮类药物的酶联免疫试剂盒及其应用
CN106008700A (zh) * 2016-06-08 2016-10-12 河南工业大学 一种氟喹诺酮类药物人工免疫抗原、制备方法、酶标抗原、竞争elisa试剂盒及应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
于成德 等: "SDS在HCV基因工程抗原包被中的应用研究", 《广西师范大学学报》 *
李桂芝 等: "柠檬酸水溶液生物亲和萃取-高效液相色谱法检测鱼肉样品中喹诺酮类药物残留", 《分析化学》 *
祝颖 等: "UPLC-MS/MS 法同时检测水产品中喹诺酮类药物残留", 《中国食品学报》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107976539A (zh) * 2017-11-07 2018-05-01 成都赛普克生物科技股份有限公司 一种降低酶联免疫法包被后本底的方法
CN108398551A (zh) * 2018-03-07 2018-08-14 深圳市伯劳特生物制品有限公司 一种用于酶联免疫试剂盒的组合物以及抗核抗体谱检测试剂盒及其制备方法
WO2019169797A1 (zh) * 2018-03-07 2019-09-12 深圳市伯劳特生物制品有限公司 一种用于酶联免疫试剂盒的组合物以及抗核抗体谱检测试剂盒及其制备方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102955031B (zh) 检测黄曲霉毒素b1药物的酶联免疫试剂盒及其应用
CN103018450B (zh) 一种氯霉素的化学发光酶联免疫检测试剂盒的制备方法
CN1963507B (zh) 3-甲基喹噁啉-2-羧酸残留的酶联免疫检测方法及试剂盒
CN106290889B (zh) 黄曲霉毒素b1的检测方法
CN104655847A (zh) 检测阿德呋啉的酶联免疫试剂盒及其检测方法
CN101788560B (zh) 检测残留的氯霉素的酶联免疫试剂盒及其检测方法
CN101639477B (zh) 多西环素残留的elisa检测方法及试剂盒与应用
CN104076154A (zh) 检测叶酸的酶联免疫试剂盒及其应用
CN106290890B (zh) 一种改良的人体液显色法真菌1,3-β-D-葡聚糖检测试剂盒及其应用方法
CN104977406B (zh) 检测氟喹诺酮类药物的酶联免疫试剂盒及其应用
CN107255717A (zh) 喹诺酮类药物检测elisa试剂盒研制及检测方法
CN103487575A (zh) 细交链孢菌酮酸的化学发光酶联免疫检测试剂盒及使用方法
CN101299045B (zh) 检测氟苯尼考及氟苯尼考胺的方法及其专用酶联免疫试剂盒
CN100501407C (zh) 检测阿维菌素类药物的酶联免疫试剂盒及方法
Zhou et al. A new sensitive method for the detection of chloramphenicol in food using time-resolved fluoroimmunoassay
CN102621322B (zh) 检测3-甲基喹噁啉-2-羧酸的试剂盒
CN107677807A (zh) 一种吉他霉素磁免疫化学发光检测试剂盒
CN103288661A (zh) 一种孔雀石绿半抗原制备方法及其应用
CN105758846A (zh) 检测克伦特罗的化学发光酶联免疫检测试剂盒
CN108059620A (zh) 甲氧苄啶类药物半抗原、检测甲氧苄啶类药物的单克隆抗体及其应用
CN107247135A (zh) 一种磺胺二甲基嘧啶的化学发光检测试剂盒及其制备方法
CN101162230A (zh) 定量检测食品中恩诺沙星含量的试剂盒及其检测方法
CN105301244B (zh) 检测酸性橙的酶联免疫试剂盒及其应用
CN103698519B (zh) 一种呋喃它酮代谢物的化学发光检测试剂盒及其应用
CN103304495A (zh) 一种喹乙醇代谢物半抗原制备方法及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20171017

RJ01 Rejection of invention patent application after publication