CN107254533A - 一种四倍体北沙柳无性系品种的est‑ssr鉴定引物、指纹图谱及其构建方法和应用 - Google Patents

一种四倍体北沙柳无性系品种的est‑ssr鉴定引物、指纹图谱及其构建方法和应用 Download PDF

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杨海峰
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Abstract

一种四倍体北沙柳无性系品种的EST‑SSR鉴定引物、指纹图谱及其构建方法和应用。提供了一种快速、准确鉴别北沙柳无性系的EST‑SSR鉴定引物、指纹图谱及其构建方法和应用。包括核苷酸序列号为SEQ ID No.1所示的正向引物和SEQ ID No.2所示的反向引物。本发明采用位点的峰面积比对读取峰图的方法，借助四倍体带型组合的特性，构建了仅用1对多态性好、稳定性高、特异性强的引物区分48个北沙柳无性系的指纹图谱，具有有效、简捷、快速、经济的优点，可用于我国四倍体北沙柳无性系、良种及新品种鉴定、鉴别与保护等方面。

Description

一种四倍体北沙柳无性系品种的EST-SSR鉴定引物、指纹图谱 及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及分子生物学和植物品种鉴别领域，具体涉及一种四倍体北沙柳无性系品种的EST-SSR鉴定引物、指纹图谱及其构建方法和应用。
背景技术
北沙柳(Salix psammophila)又称沙柳，分布在中国大陆的宁夏、山西、陕西、内蒙古等地。北沙柳枝稠叶茂，且柔嫩，营养价值高，富含较高的蛋白质和脂肪，纤维素含量较低，所含必需氨基酸也较一般禾谷类饲料多，大约与小麦麸含量相近，是牛、羊、驼的好饲料，在冬季饲料缺乏时，各类家畜都喜吃，为牲畜度荒年的主要饲料之一。在毛乌素沙地，每亩可产风干枝叶饲料120—155公斤。此外，北沙柳具有耐旱、耐寒、耐高温、耐沙埋压、抗风蚀、易繁殖、速生等特性，现已成为中国西北地区生态修复、园林绿化的主要造林树种，不仅是碳纤维、生物质资源、强化复合板等的原料，也是沙产业开发的主要灌木树种。随着北沙柳利用价值和方式的不断研发，为了实现高效利用北沙柳的目的，需要从现有资源中筛选和培育满足于不同利用目的的品种或类型。但是目前鉴别北沙柳种质及无性系主要技术是表型性状鉴别，表型性状是基因与环境共同作用的结果，致使表型性状鉴定法存在局限性，不仅耗时长，稳定性和一致性都很差。例如，目前在新品种权申请时采用的是表型性状鉴别方法，但是北沙柳的培育引种情况很多，受环境的影响，每个品种在不同地方的表型性状可能不同，这就很有可能造成同一无性系品种重复申请新品种权的问题。
发明内容
本发明针对以上问题，提供了一种快速、准确鉴别北沙柳无性系的EST-SSR(Experssed sequenee Tags-simplese quenee Reapts)鉴定引物、指纹图谱及其构建方法和应用。
本发明的技术方案是：
一种四倍体北沙柳无性系品种的SSR鉴定引物，包括核苷酸序列号为SEQ ID No.1所示的正向引物和SEQ ID No.2所示的反向引物。
一种四倍体北沙柳无性系品种的SSR指纹图谱，所述指纹图谱如下表所示：
一种四倍体北沙柳无性系品种的SSR指纹图谱的构建方法，包括如下步骤：
1)、DNA提取
采用天根植物DNA试剂盒提取北沙柳基因组DNA，提取后加入200μL TE缓冲液进行稀释，用琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop2000对其含量和纯度进行检测，将浓度调至50ng·μL-1，合格样品置于-20℃冰箱保存备用；
2)、PCR扩增及毛细管电泳
以步骤1)提取的DNA为模板，以EST-SSR鉴定引物为扩增引物，建立PCR反应体系并进行PCR扩增，扩增产物用DNA分析仪进行毛细管电泳；
3)、数据统计与分析
用Gene Marker v2.2.0软件参照MAC-PR的方法对步骤2)中每个位点的峰面积进行比对读取峰图，建立原始数据矩阵，得到北沙柳无性系指纹图谱。
所述步骤2)中的EST-SSR鉴定引物包括核苷酸序列号为SEQ ID No.1所示的正向引物和SEQ ID No.2所示的反向引物。
所述步骤2)中PCR扩增反应体系包括DNA模板2体积份，10×buffer 2体积份，dNTP1.6体积份，Mg1.2体积份，rTaq0.2体积份，正向引物0.2体积份，反向引物0.8体积份，M13引物0.8体积份，ddH2O 11.2体积份；PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，8个循环；最后72℃再延伸10min，4℃保存。
所述步骤3)中读取峰图的方法为：
a)根据每个引物总体的峰趋势进行判读主峰和副峰，对主峰进行判读。
b)判读主峰时考虑每个引物的基序，读取相隔碱基数大小符合基序的主峰值，荧光量小于500的不读取峰值。
c)根据北沙柳为四倍体的特性进行统计记录峰值：
如出现一个主峰将主峰值读取四次；
如出现两个主峰，按照峰面积进行读取记录，峰面积大的读三次峰值面积小的读一次，若两个主峰面积一样大，则两个主峰值分别读取两次；
如出现三个主峰，读取方式参照出现两个主峰的方式进行读取，峰面积最大的主峰读取两次；
如出现四个主峰，每个主峰值读取一次。
一种四倍体北沙柳无性系品种的SSR指纹图谱在鉴定四倍体北沙柳无性系品种方面的应用。
本发明的有益效果是：(1)采用位点的峰面积比对读取峰图的方法，借助四倍体带型组合的特性，构建了仅用1对多态性好、稳定性高、特异性强的引物区分48个北沙柳无性系的指纹图谱，具有有效、简捷、快速、经济的优点，可用于我国四倍体北沙柳无性系、良种及新品种鉴定、鉴别与保护等方面；(2)EST-SSR分子标记技术扩增中，使用具有操作简便、高分辨率(可达到1bp)和便于多倍体共显性统计等优点的毛细管电泳检测法，相比之前相关研究利用非变性聚丙酰胺技术，毛细管电泳检测技术构建指纹图谱更准确、更清晰。
附图说明
图1是北沙柳9居群48份无性系采样地理位置示意；
图2是无性系1-22指纹图谱毛细管电泳峰图；
图3是无性系2-1指纹图谱毛细管电泳峰图；
图4是无性系2-3指纹图谱毛细管电泳峰图；
图5是无性系2-10指纹图谱毛细管电泳峰图；
图6是无性系2-11指纹图谱毛细管电泳峰图；
图7是无性系2-16指纹图谱毛细管电泳峰图；
图8是无性系2-17指纹图谱毛细管电泳峰图；
图9是无性系2-18指纹图谱毛细管电泳峰图；
图10是无性系2-25指纹图谱毛细管电泳峰图；
图11是无性系3-7指纹图谱毛细管电泳峰图；
图12是无性系3-9指纹图谱毛细管电泳峰图；
图13是无性系3-11指纹图谱毛细管电泳峰图；
图14是无性系3-16指纹图谱毛细管电泳峰图；
图15是无性系3-24指纹图谱毛细管电泳峰图；
图16是无性系3-25指纹图谱毛细管电泳峰图；
图17是无性系3-36指纹图谱毛细管电泳峰图；
图18是无性系3-27指纹图谱毛细管电泳峰图；
图19是无性系4-5指纹图谱毛细管电泳峰图；
图20是无性系4-6指纹图谱毛细管电泳峰图；
图21是无性系4-8指纹图谱毛细管电泳峰图；
图22是无性系4-11指纹图谱毛细管电泳峰图；
图23是无性系4-15指纹图谱毛细管电泳峰图；
图24是无性系4-18指纹图谱毛细管电泳峰图；
图25是无性系4-22指纹图谱毛细管电泳峰图；
图26是无性系4-28指纹图谱毛细管电泳峰图；
图27是无性系4-29指纹图谱毛细管电泳峰图；
图28是无性系4-30指纹图谱毛细管电泳峰图；
图29是无性系5-4指纹图谱毛细管电泳峰图；
图30是无性系5-12指纹图谱毛细管电泳峰图；
图31是无性系5-13指纹图谱毛细管电泳峰图；
图32是无性系5-21指纹图谱毛细管电泳峰图；
图33是无性系6-5指纹图谱毛细管电泳峰图；
图34是无性系6-7指纹图谱毛细管电泳峰图；
图35是无性系6-11指纹图谱毛细管电泳峰图；
图36是无性系6-36指纹图谱毛细管电泳峰图；
图37是无性系7-3指纹图谱毛细管电泳峰图；
图38是无性系7-13指纹图谱毛细管电泳峰图；
图39是无性系7-17指纹图谱毛细管电泳峰图；
图40是无性系7-19指纹图谱毛细管电泳峰图；
图41是无性系7-21指纹图谱毛细管电泳峰图；
图42是无性系8-21指纹图谱毛细管电泳峰图；
图43是无性系8-33指纹图谱毛细管电泳峰图；
图44是无性系8-34指纹图谱毛细管电泳峰图；
图45是无性系9-7指纹图谱毛细管电泳峰图；
图46是无性系9-15指纹图谱毛细管电泳峰图；
图47是无性系9-22指纹图谱毛细管电泳峰图；
图48是无性系9-24指纹图谱毛细管电泳峰图；
图49是无性系9-34指纹图谱毛细管电泳峰图；
图1中P1表示种源区达拉特旗保绍圪堵，P2表示种源区伊金霍洛旗扎萨克镇，P3表示种源区乌审旗查汗淖尔，P4表示种源区乌审旗乌兰陶勒盖镇高勒，P5表示种源区乌审旗乌兰陶勒盖镇敖包，P6表示种源区鄂托克前旗城川镇，P7表示种源区马季沟，P8表示种源区蔡马场，P9表示种源区骆驼井。
具体实施方式
定义：
居群：即北沙柳的采样种源区，本发明对北沙柳的9个采样种源区达拉特旗保绍圪堵、伊金霍洛旗扎萨克镇、乌审旗查汗淖尔、乌审旗乌兰陶勒盖镇高勒、乌审旗乌兰陶勒盖镇敖包、鄂托克前旗城川镇、马季沟、蔡马场、骆驼井依次用阿拉伯数字编号，分别为1,2,3,4,5,6,7,8,9，各种源区的具体地理信息见表1；
居群内无性系编号：在每个居群中取50个无性系样本，依次用阿拉伯数字编号，分别为1,2,3…48,49,50；
无性系编号表示方法：居群编号–居群内无性系编号，如无性系1-22表示达拉特旗保绍圪堵种源区中的第22个无性系样本。
宋祥硕等(2014)采用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测技术，报道了基于SSR分子(SimpleSequence Repeats)标记(通用引物)的沙柳遗传多样性，JiaHuixia等(2016)首次报道北沙柳的染色体核型为四倍体。
下面结合实施例对本发明作具体说明。
实施例1表型性状
国家沙柳种质资源保存库位于内蒙古鄂尔多斯达拉特旗，采集保存库内9个种源区各48个无性系样品，各收集地编号、地理分布和采样量如图1和表1所示。对其中48个(48个无性系编号如表2中所示)三年生无性系进行株高，地径测量，每个无性系测定5个分枝角度，同时每个无性系上选取当年生长良好的成熟叶片8-13片，集中照相后，利用MAPGIS67软件(MapGIS是中地数码集团的产品名称，是中国具有完全自主知识版权的地理信息系统，是全球唯一的搭建式GIS数据中心集成开发平台，实现遥感处理与GIS完全融合，支持空中、地上、地表、地下全空间真三维一体化的GIS开发平台)矢量化处理后，测量叶片表型性状，表型性状统计结果见表2所示。试验地地势平坦，生长环境条件一致，釆样时选取生长良好、无病虫害的幼嫩叶片，用塑封袋装好并放入带冰的保温箱中带回实验室，-80℃低温冰箱中保存待用。
表1:群体采样信息
表2:无性系表型性状调查表
实施例2建立指纹图谱
1)、DNA提取
采用天根植物DNA试剂盒提取表2中各无性系的基因组DNA，提取后加入200μL TE缓冲液(Tris和EDTA配制而成，主要用于溶解核酸，能稳定储存DNA和RNA)进行稀释，用琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop2000(超微量分光光度计)对其含量和纯度进行检测，将浓度调至50ng·μL-1，合格样品置于-20℃冰箱保存备用。
2)、EST-SSR引物筛选
取北沙柳同一株不同部位(根、茎、叶、雌花和雄花)的RNA进行提取，使用等量mRNA将五种组织混合并合成cDNA，建立cDNA文库并在lllumina平台进行测序，使用MicroSAtellite(MISA)软件分析查找所有的SSR(simplese quenee Reapts，是一种以特异引物PCR为基础的分子标记技术，也称为微卫星DNA)，最终保留前后序列均不小于125bp的SSR用于引物设计，最后确定168对SSR引物，通过PCR反应、毛细管电泳检测(方法同步骤3)、PCR扩增及毛细管电泳)，筛选出22对多态性丰富、重复性高，稳定性好的EST-SSR引物用作图谱构建的基本引物。
然后用Gene Marker v2.2.0软件参照MAC-PR(Esselink et al.,2004)的方法对每位点的峰面积进行比对读取峰图，建立原始数据矩阵。通过MATLAB编程软件筛选特异条带，对每个引物在不同无性系的四倍体带型组合分别进行筛选，筛选出仅出现一次的带型组合数，再与峰图进行比对，挑选出仅出现一次带型组合数最多，能够将48份无性系区分开的引物。最后确定1对引物可将48份无性系完全区分开。该对引物包括核苷酸序列号为SEQID No.1所示的正向引物和SEQ ID No.2所示的反向引物。
3)、PCR扩增及毛细管电泳
核苷酸序列号为SEQ ID No.1所示的正向引物和SEQ ID No.2所示的反向引物在上海ThermoFisher公司合成并进行IPAGR纯化。荧光引物M13(5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3'，带有荧光标记的通用引物)在上海捷瑞生物工程有限公司合成并进行PAG纯化。Buffer、DNTP、Mg、rTaq等PCR材料构自天根生化科技有限公司。
参照TP-M13-SSR毛细管电泳荧光检测法进行PCR扩增。分别设计带有荧光标记的M13引物、5'接有M13序列的EST-SSR正向F引物(即正向F引物的前端接M13引物，目的是为了和M13反应产生荧光)和EST-SSR反向R引物。PCR反应体系总体积为20体积份：DNA模板2体积份，10×buffer 2体积份，dNTP(脱氧核糖核苷三磷酸)1.6体积份，Mg1.2体积份，rTaq(聚合酶)0.2体积份，接了M13的正向引物0.2体积份，反向引物0.8体积份，M13引物0.8体积份，ddH2O 11.2体积份。扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，8个循环；最后72℃再延伸10min，4℃保存。用DNA分析仪(ABI，3730XL，Applied Biosystems，USA)检测带有荧光标记的EST-SSR扩增产物，进行毛细管电泳。
4)、建立指纹图谱
用Gene Marker v2.2.0(基因标记)软件参照MAC-PR(Esselink et al.,2004)的方法对每位点的峰面积进行比对读取峰图(如图2-49所示)，建立原始数据矩阵，得到48份无性系指纹图谱，如表3所示。
读峰具体方法：
a)根据每个引物总体的峰趋势进行判读主峰和副峰，对主峰进行判读。
b)判读主峰时考虑每个引物的基序，读取相隔碱基数大小符合基序的主峰值(如本发明中EST-SSR引物的基序为(GA)8,读取峰值时应间隔2bp的整数倍，目的是防止峰值偏移造成误差)，荧光量小于500的不读取峰值。
c)根据沙柳为四倍体的特性进行统计记录峰值，如出现一个主峰将其主峰值读取四次；(例：主峰值为210bp，读取为210:210:210:210)
如出现两个主峰，按照峰面积进行读取记录，峰面积大的重复读两次，若两个主峰面积一样大，则分别读取两次。(例：主峰值为210bp和212bp，210bp峰面积大于212bp，读取为210:210:210:212，若主峰值面积一样大，读取为210:210:212:212。)
如出现三个主峰，读取方式参照出现两个主峰的方式进行读取，峰面积大的主峰读取两次。
如出现四个主峰，每个主峰值读取一次。
表3 EST-SSR引物扩增48个北沙柳无性系的不同大小片段构建的指纹图谱
序号 无性系编号 四倍体带型组合 序号 无性系编号 四倍体带型组合
1 1-22 290:294：294:296 25 4-28 288:288：288:290
2 2-1 288:288：294:300 26 4-29 288:288：298:300
3 2-3 282:288：288:300 27 4-30 274:276：288:290
4 2-10 288:288：288:298 28 5-4 274:274：288:290
5 2-11 274:288：296:300 29 5-12 274:290：290:294
6 2-16 290:290：296:300 30 5-13 288:290：290:302
7 2-17 284:284：288:288 31 5-21 282:288：288:290
8 2-18 288:288：306:306 32 6-5 304:304：304:304
9 2-25 290:290：292:292 33 6-7 288:288：296:298
10 3-7 284:288：294:296 34 6-11 276:284：288:288
11 3-9 282:288：290:296 35 6-36 288:288：290:296
12 3-11 274:288：288:298 36 7-3 296:296：296:296
13 3-16 272:272：290:296 37 7-13 288:290：296:296
14 3-24 282:288：288:294 38 7-17 290:290：290:292
15 3-25 274:276：284:294 39 7-19 284:288：288:296
16 3-26 290:290：298:298 40 7-21 290:296：296:296
17 3-27 298:298：298:298 41 8-21 290:294：294:294
18 4-5 272:290：290:296 42 8-33 294:294：294:294
19 4-6 274:296：296:296 43 8-34 274:284：288:288
20 4-8 276:276：296:302 44 9-15 272:288：288:294
21 4-11 282:290：290:296 45 9-22 276:288：288:288
22 4-15 298:298：300:300 46 9-7 278:288：288:290
23 4-18 276:288：290:298 47 9-34 282:282：290:298
24 4-22 288:288：288:302 48 9-24 288:294：296:298
应用实施例
获得未知北沙柳无性系的叶片材料，根据实施例2的方法和步骤，用核苷酸序列号为SEQ ID No.1所示的正向引物和SEQ ID No.2所示的反向引物进行PCR扩增，读取引物对应的片段大小为287.9:287.9:294.2:299.8，对该未知北沙柳无性系在北沙柳无性系指纹图谱(表3)中进行鉴定，可知，该未知北沙柳无性系为北沙柳无性系2-1。
SEQUENCE LISTING
<110> 内蒙古农业大学
<120> 一种四倍体北沙柳无性系品种的EST-SSR鉴定引物、指纹图谱及其构建方法
和应用
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<160> 3
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
accgtttcat taaccgctcc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
agaaatcacg cctctctcca 20
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tgtaaaacga cggccagt 18

Claims (6)

1.一种四倍体北沙柳无性系品种的SSR鉴定引物，其特征在于，包括核苷酸序列号为SEQ ID No.1所示的正向引物和SEQ ID No.2所示的反向引物。
2.一种四倍体北沙柳无性系品种的SSR指纹图谱，其特征在于，所述指纹图谱如下表所示：
序号 无性系编号 四倍体带型组合 序号 无性系编号 四倍体带型组合 1 1-22 290:294：294:296 25 4-28 288:288：288:290 2 2-1 288:288：294:300 26 4-29 288:288：298:300 3 2-3 282:288：288:300 27 4-30 274:276：288:290 4 2-10 288:288：288:298 28 5-4 274:274：288:290 5 2-11 274:288：296:300 29 5-12 274:290：290:294 6 2-16 290:290：296:300 30 5-13 288:290：290:302 7 2-17 284:284：288:288 31 5-21 282:288：288:290 8 2-18 288:288：306:306 32 6-5 304:304：304:304 9 2-25 290:290：292:292 33 6-7 288:288：296:298 10 3-7 284:288：294:296 34 6-11 276:284：288:288 11 3-9 282:288：290:296 35 6-36 288:288：290:296 12 3-11 274:288：288:298 36 7-3 296:296：296:296 13 3-16 272:272：290:296 37 7-13 288:290：296:296 14 3-24 282:288：288:294 38 7-17 290:290：290:292 15 3-25 274:276：284:294 39 7-19 284:288：288:296 16 3-26 290:290：298:298 40 7-21 290:296：296:296 17 3-27 298:298：298:298 41 8-21 290:294：294:294 18 4-5 272:290：290:296 42 8-33 294:294：294:294 19 4-6 274:296：296:296 43 8-34 274:284：288:288 20 4-8 276:276：296:302 44 9-15 272:288：288:294 21 4-11 282:290：290:296 45 9-22 276:288：288:288 22 4-15 298:298：300:300 46 9-7 278:288：288:290 23 4-18 276:288：290:298 47 9-34 282:282：290:298 24 4-22 288:288：288:302 48 9-24 288:294：296:298
3.一种权利要求2所述的一种四倍体北沙柳无性系品种的SSR指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)、DNA提取
采用天根植物DNA试剂盒提取北沙柳基因组DNA，提取后加入200μLTE缓冲液进行稀释，用琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop2000对其含量和纯度进行检测，将浓度调至50ng·μL-1，合格样品置于-20℃冰箱保存备用；
2)、PCR扩增及毛细管电泳
以步骤1)提取的DNA为模板，以EST-SSR鉴定引物为扩增引物，建立PCR反应体系并进行PCR扩增，扩增产物用DNA分析仪进行毛细管电泳；
3)、数据统计与分析
用Gene Marker v2.2.0软件参照MAC-PR的方法对步骤2)中每个位点的峰面积进行比对读取峰图，建立原始数据矩阵，得到北沙柳无性系指纹图谱。
所述步骤2)中的EST-SSR鉴定引物包括核苷酸序列号为SEQ ID No.1所示的正向引物和SEQ ID No.2所示的反向引物。
4.根据权利要求3所述的一种四倍体北沙柳无性系品种的SSR指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤2)中PCR扩增反应体系包括DNA模板2体积份，10×buffer 2体积份，dNTP1.6体积份，Mg1.2体积份，rTaq0.2体积份，正向引物0.2体积份，反向引物0.8体积份，M13引物0.8体积份，ddH2O 11.2体积份；PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，8个循环；最后72℃再延伸10min，4℃保存。
5.根据权利要求3所述的一种四倍体北沙柳无性系品种的SSR指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤3)中读取峰图的方法为：
a)根据每个引物总体的峰趋势进行判读主峰和副峰，对主峰进行判读。
b)判读主峰时考虑每个引物的基序，读取相隔碱基数大小符合基序的主峰值，荧光量小于500的不读取峰值。
c)根据北沙柳为四倍体的特性进行统计记录峰值：
如出现一个主峰将主峰值读取四次；
如出现两个主峰，按照峰面积进行读取记录，峰面积大的读三次峰值面积小的读一次，若两个主峰面积一样大，则两个主峰值分别读取两次；
如出现三个主峰，读取方式参照出现两个主峰的方式进行读取，峰面积最大的主峰读取两次；
如出现四个主峰，每个主峰值读取一次。
6.一种四倍体北沙柳无性系品种的SSR指纹图谱在鉴定四倍体北沙柳无性系品种方面的应用。
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