CN107254469B - 一个植物维管束特异表达的启动子SmP的克隆和应用 - Google Patents

一个植物维管束特异表达的启动子SmP的克隆和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN107254469B
CN107254469B CN201710420136.1A CN201710420136A CN107254469B CN 107254469 B CN107254469 B CN 107254469B CN 201710420136 A CN201710420136 A CN 201710420136A CN 107254469 B CN107254469 B CN 107254469B
Authority
CN
China
Prior art keywords
promoter
smp
plant
vascular bundle
salicylic acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201710420136.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107254469A (zh
Inventor
谭艳平
王春台
刘学群
徐鑫
卢卫
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
South Central Minzu University
Original Assignee
South Central University for Nationalities
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by South Central University for Nationalities filed Critical South Central University for Nationalities
Priority to CN201710420136.1A priority Critical patent/CN107254469B/zh
Publication of CN107254469A publication Critical patent/CN107254469A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107254469B publication Critical patent/CN107254469B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
    • C12N15/8223—Vegetative tissue-specific promoters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8237—Externally regulated expression systems
    • C12N15/8238—Externally regulated expression systems chemically inducible, e.g. tetracycline

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本发明涉及一个植物维管束特异表达的启动子SmP的分离克隆及其实际应用，该启动子SmP受甲基茉莉酸(MeJA)和水杨酸(SA)双重诱导，利用该启动子构建诱导型真核表达载体pCAMBIA1301‑SmP‑GUS并遗传转化植物受体，可应用于植物基因维管束定位表达、诱导目的基因的高效表达及其基因功能研究。

Description

一个植物维管束特异表达的启动子SmP的克隆和应用
技术领域
本发明涉及一个新的植物维管束特异表达的启动子的分离克隆及其实际应用，该启动子受甲基茉莉酸(MeJA)和水杨酸(SA)双重诱导，可应用于植物基因维管束定位表达、目的基因的诱导表达及其功能研究，属于植物基因工程技术领域。
背景技术
随着分子生物学的不断发展，转基因已经成为研究功能基因组学的有效手段，近年来通过转基因途径改良植物农艺性状正逐步得到可行性论证和普遍应用。启动子是基因5’端与RNA聚合酶及一些反式作用因子结合的DNA序列。真核生物中有三种RNA聚合酶，各与不同类型的启动子结合。RNA聚合酶Ⅰ只转录rRNA，RNA聚合酶Ⅲ负责转录tRNA和5S rRNA。RNA聚合酶Ⅱ负责蛋白质基因和部分snRNA的转录，其启动子结构最为复杂。从功能上可将这类启动子的结构分为两部分：核心启动子区和特异启动子区。启动子含有一系列与特异蛋白结合的位点，通常称这些位点为顺式作用元件(cis-element)；这些特异蛋白则称为反式作用因子(trans-factor)。转录起始位点、TATA盒等属于核心启动子区，调控基因表达活性的顺式作用元件则归为特异启动子区。
茉莉酸(Jasmonic Acid,JA)及甲基茉莉酸(methyl jasmonate,MeJA)是亚麻酸衍生的具有环戊酮基团的化合物。随着20世纪80年代分子生物学的兴起，人们对它们的生物合成和代谢的分子调控机理作了详尽的研究，发现茉莉酸调控许多基因的表达。归纳起来有两方面：一部分基因与植物发育有关；另一部分基因与自身防御系统有关。目前通过对茉莉酸诱导基因启动子的分析，已经发现了不少茉莉酸诱导的响应元件，但这些研究多集中在与植物自身防御系统有关的基因启动子上。T/G-box(AACGTG)，是一个bHLH-亮氨酸拉链JAMYC2和JAMYC10蛋白的结合位点，JAMYC2和JAMYC10的表达受JAs的诱导。JAMYC超表达能增强马铃薯中JAs诱导的防卫基因的表达，但并不导致这类基因转录产物的累积。JERE(jasmonate-and elicitor-responsive element)，是一类最早在长春花属植物负责次级代谢产物合成的一个基因Str(strictosidine synthase)启动子中证实的MeJA和乙烯响应的元件。JERE跟别的MeJA响应元件不同的是包含一个GCC-box-like元件。JASE1(CGTCAATGAA)和JASE2(CATACGTCGTCAA)，发现于拟南芥12-O-植物二烯酸-10,11-还原酶(OPR1)基因的启动子的-179和-170间。启动子连接GUS报告基因的研究和RNA杂交分析表明，OPR1基因受衰老和JA的上调控。启动子缺失和衔接扫描突变分析表明JASE1和JASE2是衰老和SA应答的顺式作用元件。胁迫响应元件(Stress responsive element,SRE)是一个长13bp的顺式作用元件。Takeda等证实烟草长末端重复序列反转录转座子Tto1启动子中的SRE是响应MeJA诱导的顺式调控元件。
水杨酸(salicylic acid，SA)是植物体内含量较低的一种内源酚类小分子化合物。SA能诱导多种植物对病毒、真菌及细菌病害产生抗性。SA是诱发系统获得性抗性的信号分子之一，涉及并参与植物的过敏反应和SAR反应，在植物的SAR信号转导中起着关键作用。SA作为植物激素和信号分子，直接或间接调控植物体发育过程中相关基因的表达。目前已经分离出几个受SA间接调控的顺式作用元件。as-1(Activation Sequence-1)类型水杨酸响应元件。SA诱导检测几个源自花椰菜花叶病毒CaMV 35S启动子的调控元件，证实SA响应元件为位于-90和-46两处的as-1元件。用水杨酸处理烟草后，证实SA的诱导因子ASF-1(Activation Sequence Factor-1)与as-1元件结合于两个TGACG。LS7元件(TCTACGTCAC)和LS5元件(ACGTCATAGA)是从拟南芥PR-1(病程相关基因1)基因启动子分离的SA诱导元件。SA通过激活路径中的NPR1，活化了的NPR1激活转录因子TGA2以促进TGA2转录因子与LS7、LS5元件结合，从而激活下游PR-1基因表达。W-box(TTGAC)发现于拟南芥NPR1基因启动子，是WRKY DNA结合蛋白的特异识别位点，WRKY基因的表达受SA的正调控。W-box突变会阻断WRKYDNA结合蛋白的特异识别，致使启动子无法激活下游NPR1基因的表达，从而影响SA通过NPR1诱导的防卫基因的表达。TCA-1(tobacco nuclear protein 1)结合位点是一个由水杨酸诱导TCA-1结合的10bp序列(TCATCTTCTT)。该元件在大麦β-1-3-葡聚糖酶基因5’端非编码区重复数次，现已知有超过30个受各种胁迫诱导基因的启动子含有这一元件。
发明内容
本发明分离克隆了一个烟草维管束特异表达，并受甲基茉莉酸和水杨酸双重诱导的启动子。利用该启动子构建诱导型表达载体，利用合适浓度甲基茉莉酸和水杨酸处理转基因植株，诱导各类目的基因的表达。
实现本发明上述目的所采用的技术方案为：
该启动子SmP分离于烟草维管束发育相关基因，启动子序列长约1399bp，-1239--1126区段具有水杨酸诱导元件，-580--535区段具有维管束特异表达元件，-173--168区段具有茉莉酸甲酯诱导元件，-96--46区段属于核心启动子元件，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
本发明还提供了一种利用植物细胞诱导目的基因表达的方法，包括以下步骤：用含有启动子SmP的真核诱导表达载体pCAMBIA1301-SmP-GUS转化植物细胞，采用甲基茉莉酸和水杨酸诱导植物细胞表达目的基因；所述植物包括谷类植物如水稻、小麦、玉米等；经济类植物如棉花、烟草、油菜等。
附图说明
图1为本发明提供的启动子SmP的核苷酸序列图；
图2为本发明构建的表达载体pCAMBIA1301-SmP-GUS。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做详细具体的说明，但是本发明的保护范围并不局限于以下实施例。
本实施例从烟草维管束发育关联基因中分离出受甲基茉莉酸和水杨酸双重诱导的启动子，命名为SmP，该启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和图1所示，在图1中，启动子核心元件用加粗阴影显示，茉莉酸诱导元件用加粗波浪线表示，水杨酸诱导元件用加粗双波浪线表示，维管束特异表达元件用加粗双下划线显示。
本发明构建的表达载体pCAMBIA1301-SmP-GUS如图2所示。该载体含潮霉素抗性筛选基因(HRG)，启动子SmP核酸序列被融合到GUS基因5’端非翻译区。该表达载体遗传转化W38型烟草，获得阳性转化植株。通过对阳性植株进行甲基茉莉酸和水杨酸的诱导处理，结果表明该启动子的活性受甲基茉莉酸和水杨酸双重诱导。
具体操作如下：
1、载体构建
以pCAMBIA1301双元载体为主骨架，利用启动子SmP代替载体中CaMV 35S启动子连接报告基因gus，构建诱导表达载体pCAMBIA1301-SmP-GUS(如图2所示)。
2、遗传转化
以烟草为转化受体，利用农杆菌叶盘转化法将所构建的诱导表达载体pCAMBIA1301-SmP-GUS导入植物受体材料W38烟草，经过共培养、筛选培养、生根培养、植株移栽、阳性检测等步骤，最终获取阳性植株。
3、甲基茉莉酸、水杨酸处理烟草阳性植株
30天苗龄的转基因烟草阳性植株叶片分别用SA(1mmol·L-1)、MeJA(1mmol·L-1)进行诱导处理，并设对照组(蒸馏水)。
4、GUS活性测定
GUS活性的荧光检测参照Jefferson方法。检测水杨酸(SA)、甲基茉莉酸(MeJA)诱导处理的植株和对照组植株中GUS的表达活性，结果表明本发明的启动子是受甲基茉莉酸和水杨酸双诱导型启动子，能够在植物个体内诱导表达目的基因。
以上实施例仅为本发明在烟草中的运用，本领域的技术人员能够利用本发明所提供的SmP启动子构建受甲基茉莉酸(MeJA)和水杨酸(SA)双重诱导的表达载体转化植物受体以提高目的基因的诱导表达。受体植物包括水稻、小麦、玉米等在内的禾谷类作物以及一些重要经济作物如棉花、烟草、油菜等。
<110>：中南民族大学
<120>：一个植物维管束特异表达的启动子SmP的克隆和应用
<160>：1
<210>：1
<211>：1399
<212>：DNA
<213>：人工序列
<400>：1
gatatcaaaa gggttgatag atatagggaa accattttta tgggtaataa aagaaaatga 60
aaaaggcaaa gaagacgaga aaaaaattgg tcgtattgaa gagttggaaa aaataggaaa 120
aatagtgtcg tggtgttcac aacttgaagt gttaaaacat ccatctttgg gatgttttgt 180
ttctcactgt ggatgaaatt cgattctgaa gagcttagct tgtggagtgc cagtcgtcgc 240
atttcctcaa tggactgatc aaatgacaaa tgctaaacaa attgaagatg tgcggaaaag 300
tggagtgagg gtaaatgtga atgaagatgg gttttgtgga aagtgaagaa atgaaaaaat 360
gcattgaatt ggtaatgaat ggaggagaaa aaggggaaga attacgaaag aatgctgaga 420
aatggaaaga attggctagg gaagctgtga aggaagggtg gatcttcaca caagaatttg 480
aaggctttta ttgatgaagg ttgctaaagg ttattaatat gttttaaaac ttagtcttta 540
atctatggag ctttcttttc tctttttttg gtccttctct tcttcctttt tatctcttga 600
gaataaaacg attatcgctt ccgagagtct ttcagaagca gtctctctat ctgcacaaga 660
tagggttaag gtttgcgtat gaactaccct ccctagactc tacttgtagg ataacattgg 720
gtattgttat tgttgttttt cttgtaataa aatgaacata gcttagtggt cttggtatct 780
ctgtcttacc aagtacaaga ttctacttat gtttcgcctt taagttttta cttaataaaa 840
tccaagttga aaaagtacaa aaagatcatg acaagttata gtccagtttg tgagttttac 900
acctcatatg ctcgggagat atggttttat aatccgttac aaatgttatt ttagctatat 960
gaaccttttc acatgatcaa atcagtaaat aaaatacaag agatatgtgt atgatcattt 1020
tcttcaaatg aaatgaaccg ggttaataga tttttaacca caacaaaagc aattctctct 1080
gtttcctact ctctctatcg tttgtgggcc caactgtctc tctctcagat ctttcacctt 1140
caaaatttaa tgtctaattg caggaaattg agataacttg tacttgtggg aaatttgtgg 1200
ctacatttgc aaattgaaag ataatagagt acataagtga atgtgtatgg atgttatctg 1260
gattaggtca gtgattacaa atattctcca cttattgatt atcttctcta tataacatct 1320
aaaatctact aacaaacata accaacattt ccagggaaag aaaaaatatt tacaacagta 1380
accaactctt acttcaaaa 1399

Claims (3)

1.一个植物维管束特异表达的启动子SmP，其特征在于：该启动子SmP受甲基茉莉酸和水杨酸双重诱导，该启动子SmP分离于烟草维管束发育相关基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，序列长1399bp，其中-1239--1126区段具有水杨酸诱导元件，-580--535区段具有维管束特异表达元件，-173--168区段具有茉莉酸甲酯诱导元件，-96--46区段属于核心启动子元件。
2.基于权利要求1所述启动子SmP所构建的真核诱导表达载体pCAMBIA1301-SmP-GUS。
3.一种利用权利要求1所述启动子SmP诱导植物表达目的基因的方法，其特征在于：用权利要求2所述的真核诱导表达载体pCAMBIA1301-SmP-GUS遗传转化植物细胞，再利用甲基茉莉酸和水杨酸处理，可诱导植物细胞表达目的基因；所述植物为烟草。
CN201710420136.1A 2017-06-06 2017-06-06 一个植物维管束特异表达的启动子SmP的克隆和应用 Expired - Fee Related CN107254469B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710420136.1A CN107254469B (zh) 2017-06-06 2017-06-06 一个植物维管束特异表达的启动子SmP的克隆和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710420136.1A CN107254469B (zh) 2017-06-06 2017-06-06 一个植物维管束特异表达的启动子SmP的克隆和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107254469A CN107254469A (zh) 2017-10-17
CN107254469B true CN107254469B (zh) 2020-10-16

Family

ID=60022915

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710420136.1A Expired - Fee Related CN107254469B (zh) 2017-06-06 2017-06-06 一个植物维管束特异表达的启动子SmP的克隆和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107254469B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108251426B (zh) * 2018-03-23 2021-07-13 南京林业大学 一种受植物激素诱导的杨树启动子pPsTMM及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103589731A (zh) * 2013-11-18 2014-02-19 西南大学 能同时响应水杨酸sa和茉莉酸ja诱导的诱导启动子及其应用
CN103952414A (zh) * 2014-05-22 2014-07-30 中南民族大学 一种烟草糖基转移酶诱导型启动子及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103589731A (zh) * 2013-11-18 2014-02-19 西南大学 能同时响应水杨酸sa和茉莉酸ja诱导的诱导启动子及其应用
CN103952414A (zh) * 2014-05-22 2014-07-30 中南民族大学 一种烟草糖基转移酶诱导型启动子及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
一个新的烟草糖基转移酶基因sm-Ngt1在转基因烟草中的功能研究;王雪;《中国优秀硕士学位论文全文数据库（农业科技辑）》;20120315(第3期);D047-195 *
烟草糖基转移酶基因启动子片段B的克隆与诱导表达;李勇等;《湖北农业科学》;20090930;第48卷(第9期);第2058-2060页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN107254469A (zh) 2017-10-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Archacki et al. Arabidopsis SWI/SNF chromatin remodeling complex binds both promoters and terminators to regulate gene expression
JP5655947B2 (ja) 成葉特異的プロモーター
Zhang et al. Isolation and characterization of “GmScream” promoters that regulate highly expressing soybean (Glycine max Merr.) genes
Suttipanta et al. Promoter analysis of the Catharanthus roseus geraniol 10-hydroxylase gene involved in terpenoid indole alkaloid biosynthesis
Mitra et al. The intergenic region of Arabidopsis thaliana cab 1 and cab 2 divergent genes functions as a bidirectional promoter
JP7438253B2 (ja) 植物調節エレメント及びその使用法
JP6607616B2 (ja) 植物において組み換えタンパク質の高発現を可能にする５’ｕｔｒをコードするｄｎａ分子
Imai et al. The promoter of the carotenoid cleavage dioxygenase 4a-5 gene of Chrysanthemum morifolium (CmCCD4a-5) drives petal-specific transcription of a conjugated gene in the developing flower
CN107254469B (zh) 一个植物维管束特异表达的启动子SmP的克隆和应用
JP5828302B2 (ja) サトウキビ花成制御技術
Che et al. Efficient LEC2 activation of OLEOSIN expression requires two neighboring RY elements on its promoter
CN103952414A (zh) 一种烟草糖基转移酶诱导型启动子及其应用
CN108504681B (zh) 水稻OsLOL3基因的5’UTR内含子在转基因植物中增强目的基因表达的用途
Pelissier et al. Synthesis and processing of tRNA-related SINE transcripts in Arabidopsis thaliana
Chang et al. The 5′ untranslated region of potato SBgLR gene contributes to pollen-specific expression
CN111690652A (zh) 玉米基因来源的启动子pgrmzm2g323925及其应用
JP5472089B2 (ja) 光合成組織における遺伝子発現制御に関わるｄｎａ
US9243257B2 (en) Transcriptional repressor peptides and genes for the same
Masood et al. Cloning and expression analysis of dhordein hybrid promoter isolated from barley (Hordeum vulgare L.)
Bhalothia et al. AACA element negatively regulates expression of protein phosphatase 2C (PP2C) like promoter in Arabidopsis thaliana
JP7290338B2 (ja) 単子葉植物において組み換えタンパク質の高発現を可能にする５’ｕｔｒをコードするｄｎａ分子
CN109486818B (zh) 狗尾草u6启动子基因及应用
CN114561387B (zh) 花生启动子及其应用
Jenny et al. Molecular cloning and characterisation of root-specific SlREO promoter of the Indian tomato (Solanum lycopersicum L.) cultivar
Evangelene Christy et al. Isolation of actin regulatory region from medicinal plants by thermal asymmetric interlaced PCR (TAIL PCR) and its bioinformatic analysis

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20201016

Termination date: 20210606