CN107217015A - 一种假单胞菌及其微生物制剂、制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)Daoduo 2及其筛选方法，还公开了包含该菌株的微生物制剂及该微生物制剂的制备方法与应用。本发明的微生物制剂用于去除环境中的臭气和挥发性有机化合物(VOC)，组成成分稳定可控，无毒无害无二次污染，将其用于垃圾中转站、垃圾填埋场、新装修的房屋等场所，可明显改善被污染环境感官，能够有效降低臭气和挥发性有机化合物(VOC)的浓度，并能持续控制臭气和VOC浓度。

Description

一种假单胞菌及其微生物制剂、制备方法和应用
相关申请的交叉引用
本申请基于2017年2月24日提交的申请号为2017101046932的在先中国专利 申请，并且要求该申请的优先权，通过引用将该申请的全部内容合并于此。
技术领域
本发明属于环境环保技术领域，特别涉及一种假单胞菌，其筛选方法，以及 含有该假单胞菌的微生物制剂、该微生物制剂的制备方法和应用。
背景技术
随着我国社会的快速发展，城市生活垃圾所产生的一系列环境问题已经引 起人们的重视，特别是在城市垃圾填埋场和中转站，由于垃圾堆积产生的恶臭 和异味，会使人产生不愉快感觉，严重影响附近居民的生产和生活。城市生活 垃圾产生的臭气成分复杂，包含的硫化氢、硫醇、胺类对人身体健康产生危害， 对周围空气造成污染。此外关于垃圾填埋场恶臭问题的群众举报，常年在各类 环保举报案件中维持较高水平，可见垃圾填埋场恶臭问题不仅仅是环境保护领 域问题，也是一个民生问题。
另一方面，近年来，随着人们生活水平的日益提高，以及城市化进程的加 快，出现了越来越多装修高档的写字楼和豪华的居室，室内环境发生了巨大变 化。许多居室的封闭式装修和室内所用的装饰材料引起了严重的室内空气污染 问题。其中，挥发性有机化合物(VOC)对人体健康有巨大影响。当居室中的VOC 达到一定浓度时，短时间内人们会感到头痛、恶心、呕吐、乏力等，严重时会 出现抽搐、昏迷，并会伤害到人的肝脏、肾脏、大脑和神经系统，造成记忆力 减退等严重后果。据报道，家庭装饰装修过程中使用的涂料是室内VOC的主 要来源之一。所以，各国都对涂料等装饰装修材料中的VOC含量作了限制。
目前，对于垃圾中转站、填埋场等的臭气控制方式依赖于喷洒各类除臭剂， 主要有植物除臭剂和化学除臭剂。其中，植物除臭剂提取工艺复杂，生产成本 较高，处理方式依赖于用一种气味来掩盖臭气和异味，无法从根本解决臭气产 生问题；化学除臭剂生产成本较高，还可能会产生二次污染。利用微生物菌剂 作为除臭剂，有生产成本低，不会产生二次污染，有益微生物能够从源头对臭 气进行分解，可针对氨气、胺、硫化物、芳香族、二甲基硫、脂肪胺、硫化氢、 硫醇等恶臭气体进行氧化脱臭净化处理，可实现标本兼治的效果。目前市场存 在的微生物除臭制剂几乎没有可以对挥发性有机化物VOC发挥分解作用的， 因此，本领域的技术人员致力于开发一种环境除臭微生物制剂，以期有效降低臭气 和挥发性有机化合物VOC的浓度，减少不良环境对居住质量和人体健康的影响。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足，提供了一种去除环境臭气及挥发性 有机化合物的微生物菌剂及制备方法，以解决垃圾填埋场、垃圾中转站、新装 修的房屋等场所臭气问题及挥发性有机化合物污染问题。具体技术方案如下：
本发明在第一方面提供了一株假单胞菌，为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)Daoduo 2，于2017年2月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址： 中国武汉武汉大学，保藏号为CCTCC NO:M 2017053。
优选地，上述恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)Daoduo 2的筛选方法包括：
1)将使用联苯的化工厂内污染的土壤样品加入到基础培养基中，加入固体联 苯富集培养；
2)培养8-12天后开始传代培养，每2-5天转接1次，转接8-12次后将培养液 稀释后用无机盐固体培养基培养，筛选能够生长的菌株；优选地，培养10天后开 始传代培养，每3天转接1次，转接10次后将培养液稀释后用无机盐固体培养基 培养，筛选能够生长的菌株；
3)经过连续富集培养后，取稀释后的菌液涂布基础固体培养基平板，挑取生 长迅速的菌株，利用LB平板培养后该菌株的菌落圆滑，呈暗白色。
本发明在第二方面提供了一种微生物制剂，其包括如上所述的恶臭假单胞菌Daoduo 2。
优选地，该微生物制剂中的有效活菌总数≥1.0×109CFU/mL。
本发明在第三方面提供了上述假单胞菌或微生物制剂在除臭和除挥发性有机 化合物中的应用。
本发明在第四方面提供了上述微生物制剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、平板培养：使用固体富营养培养基，平板培养恶臭假单胞菌Daoduo 2， 形成单菌落；
步骤2、摇瓶种子液制作：在摇瓶中使用液体糖蜜培养基，培养步骤1中的恶 臭假单胞菌Daoduo 2，形成摇瓶种子液；其中糖蜜为蔗糖糖蜜，为制糖工业副产 品。
步骤3、放大培养：使用液体糖蜜培养基，放大培养步骤2中的摇瓶种子液， 获得放大培养种子液；
步骤4、发酵培养：使用发酵罐，培养步骤3中获得的放大培养种子液，制备 获得微生物菌剂。
优选地，上述平板培养的程序为：采用平板划线方法将恶臭假单胞菌Daoduo 2 接种到固体LB培养基上，于25℃～35℃培养箱中孵育12～24h，形成单菌落。
优选地，上述摇瓶种子液制作的程序为：用灭菌处理过的接种环将步骤1中长 势良好的单菌落接种到液体糖蜜培养基中，在温度25℃～35℃、150～250rpm转 速下振荡培养12～24h，获得摇瓶种子液。
优选地，上述放大培养的程序为：将步骤2获得的摇瓶种子液按照1％～5％接 种量接种到液体糖蜜培养基中放大培养，在温度25℃～35℃、150～250rpm转速 下振荡培养12～24h，获得放大培养种子液。
优选地，上述发酵培养的程序为：在发酵罐中加入水，加入糖蜜，接入泵气装 置，接入步骤3中的放大种子培养液，持续发酵48～72h。
优选地，上述液体糖蜜培养基含有2～4％的糖蜜。
优选地，上述微生物制剂的使用方法包括将该微生物制剂按1:10～1:50的比 例稀释，均匀喷洒待除臭对象，每天喷洒一次，连续喷洒3天～5天。
本发明还提供了一种除臭剂，优选为垃圾除臭剂，以及一种装修污染物处理剂，它们分别含有上述恶臭假单胞菌Daoduo 2。
本发明的微生物制剂，组成成分清晰，安全稳定，无毒无害无二次污染，能够 有效控制臭气和挥发性有机污染物产生源，改善环境，并且生产工艺简单，成本低。 将其用于垃圾中转站、垃圾填埋场、新装修的房屋等场所，可明显改善被污染环境 感官，能够有效降低臭气和挥发性有机化合物VOC的浓度，并能持续控制臭气和 VOC浓度，减小不良环境对人体健康带来的危害。
附图说明
图1是本发明较优实施例中喷洒微生物制剂前后臭气浓度变化对比检测图谱 (左侧为含有恶臭假单胞菌Daoduo 2的微生物制剂；右侧为对照微生物制剂B)；
图2是本发明较优实施例中喷洒微生物制剂前后挥发性有机化合物浓度变化 对比检测图谱(左侧为含有恶臭假单胞菌Daoduo 2的微生物制剂；右侧为对照微 生物制剂B)；
图3是本发明的恶臭假单胞菌Daoduo 2的gyrB基因序列测定结果；
图4是本发明的恶臭假单胞菌Daoduo 2的16S rRNA基因序列测定结果。
具体实施方式
实施例1恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)Daoduo 2的筛选及鉴定
将使用联苯的化工厂内污染的土壤样品加入到基础培养基中，加入固体联苯富集培养，在30℃摇床上200rpm/min培养8-12天后开始传代培养，培养条件同上， 每2-5天转接一次，转接8-12次后将培养液适当稀释后用无机盐固体培养基培养， 筛选能够生长的菌株。经过连续富集培养后，取适当稀释的菌液涂布基础固体培养 基平板，其中一株菌生长迅速。挑取该菌株，利用LB平板培养后这株菌的菌落圆 滑，成暗白色。
将该菌株送中国科学院微生物研究所进行菌株鉴定，根据菌株的细胞形态、生 理生化实验，gyrB基因序列、16S rRNA基因序列等实验数据综合分析，参考《伯 杰氏系统细菌学手册》以及International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology有关研究论文，鉴定结果为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。
1、细胞形态和理化实验结果如表1所示：
表1筛选菌株的细胞形态和理化实验结果
2、gyrB基因序列测定结果，如图3所示。
3、16S rRNA基因序列测定结果，如图4所示。
4、抗生素敏感实验结果，如表2所示。
表2筛选菌株的抗生素敏感实验结果
将筛选获得的上述菌株命名为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)Daoduo 2，于2017年2月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M 2017053。
该菌株的培养方法为：将菌株在LB培养基中(1L)进行富集培养，作为种子 液，转接至含糖蜜2～4％的培养基(其余成分为水)在常温下进行大规模培养 (800L)，约72～96h有效活菌总数≥1.0×109CFU/mL。相比于其他培养方法，该 方法具有极强的经济效益，成本低廉，菌株生长状况不亚于富集培养基，同时菌株 不容易老化变性，从而最大程度的实现其除臭的功能。
实施例2除臭微生物制剂及其制备方法
除臭微生物菌剂，包含恶臭假单胞菌Daoduo 2，能用于解决臭气和挥发性有 机化合物污染问题。
该微生物制剂由恶臭假单胞菌Daoduo 2经过发酵制备而成，所用发酵培养基 为糖蜜培养基，菌剂中活菌数不低于1×109CFU/mL。
该除臭微生物制剂的制备方法如下：
(1)平板培养
采用平板划线方法将恶臭假单胞菌Daoduo 2接种到固体LB培养基上，于 25℃～35℃培养箱中孵育12～24h，形成单菌落。
其中固体LB培养基中含有50～100μg/mL的氨苄青霉素。
其中固体LB培养基按照下述重量百分比配制：酵母粉0.5％、蛋白胨1％、 氯化钠1％、琼脂粉1.5％和余量的蒸馏水，121℃灭菌处理20min，冷却备用。
(2)摇瓶种子液制作
用灭菌处理过的接种环将步骤(1)中的长势良好的单菌落接种到液体糖蜜 培养基中，使用250mL锥形瓶在温度25℃～35℃、150～250rpm转速下振荡 培养12～24h，获得摇瓶种子液。
其中液体糖蜜培养基按照下述重量百分比配制：2％～4％糖蜜、0.1～1％酵母 粉及余量的蒸馏水，121℃灭菌处理20min，冷却备用。值得注意的是，摇瓶种 子液中加入酵母粉是为了在短时间内在种子液中获得状态更好的、数量更多的活菌 数，以便于后期放大培养。
(3)放大培养
将步骤(2)获得的摇瓶种子液按照1％～5％接种量接种到1L的液体糖蜜 培养基中放大培养，在温度25℃～35℃、150～250rpm转速下振荡培养12～ 24h，获得放大培养种子液。
(4)发酵罐培养
在1吨发酵罐中加入800L水，加入糖蜜重量百分比为2％～4％的糖蜜， 接入泵气装置，接入步骤(3)中的放大培养种子液，持续发酵48～72h，检测 活菌数在1×109CFU/mL时，收集发酵液，分装后阴凉处储藏，得到用于去除 环境中臭气和挥发性有机化合物的微生物制剂。
实施例3利用上述微生物制剂在天津一垃圾中转站进行除臭应用
将本发明除臭菌剂按照1:50比例用自来水进行稀释，配成工作浓度的除臭 菌剂。均匀的喷洒到新旧垃圾表面，通过检测臭气浓度和挥发性有机化合物浓 度，同时通过感官来判断处理效果。
臭气浓度是反映人对恶臭的主观感受程度的指标，采用三点比较式臭袋法 测定，无量纲。氨气采用溶液吸收-分光光度法测定，挥发性有机化合物采用气 相色谱法测定，单位均为mg/m3，从定量的角度反映致环境气体恶臭变化。分 别对垃圾桶及垃圾车上进行喷洒，持续监测数据，具体效果如表3-6所示：
表3垃圾桶喷洒后检测结果-旧垃圾
时间 臭气浓度 挥发性有机化合物
0min 1300 49
10min 832 5.0
30min 560 1.4
3.5h 308 0.2
表4垃圾桶喷洒后检测结果–新垃圾
时间 臭气浓度 挥发性有机化合物
0min 800 5
10min 667 2.9
30min 570 1.3
3.5h 258 0.3
表5垃圾车(6吨垃圾)喷洒后检测结果-旧垃圾(3吨垃圾)
时间 臭气浓度 挥发性有机化合物
0min 1470 11
30min 820 1.5
1.0h 559 0.8
表6垃圾车(6吨垃圾)喷洒后检测结果–新垃圾(3吨垃圾)
时间 臭气浓度 挥发性有机化合物
0min 1190 5
30min 633 1.0
1.0h 451 0.2
结论：现场环境感官得到明显的改善，臭气浓度和挥发性有机化合物浓度 明显降低。
实施例4利用上述微生物制剂在南京一垃圾填埋场进行除臭应用
南京一垃圾填埋场，利用上述微生物菌剂与对照微生物制剂(由江苏某公 司生产的银叶微生物除臭剂)进行除臭效果对比。
将实施例2中制备的含有恶臭假单胞菌Daoduo 2的微生物制剂与对照微生 物制剂都按照1:30相同比例用自来水进行稀释，配成工作浓度的除臭菌剂。垃 圾场作业面均匀喷雾喷洒，喷洒面(无量纲)，随机取点4处，进行采样测试， 结果如表7-9所示以及图1和图2所示。
表7含有恶臭假单胞菌Daoduo 2的微生物制剂测试数据
表8对照微生物制剂测试数据
表9两种产品平均处理效率比较
通过平均处理效率比较，可见本发明菌剂能有效降低恶臭污染，对挥发性 有机化合物更是有近100％的清除效果。
实施例5含有恶臭假单胞菌Daoduo 2的垃圾除臭剂在去除厨余垃圾中的应用
厨余垃圾是指居民日常生活及食品加工、饮食服务、单位供餐等活动中产生的 垃圾，包括丢弃不用的菜叶、剩菜、剩饭、果皮、蛋壳、茶渣、骨头等，其主要来 源为家庭厨房、餐厅、饭店、食堂、市场及其他与食品加工有关的行业。厨余垃圾 不同于普通垃圾，具有组分复杂、水分和有机物含量高等特点，很容易腐坏，产生 恶臭。其臭气的主要成分有硫化氢、甲硫醇、1,3-二甲基苯、邻二甲苯、二甲二硫 和对二甲苯等。由于厨余类垃圾的臭气成分比较特殊，处理时需要的除臭剂浓度较 高，需要稀释10～20倍左右使用。
在本实施例中，以南京一垃圾中转站经分类的厨余垃圾为对象，利用上述 垃圾除臭剂与对照微生物制剂(由江苏某公司生产的银叶微生物除臭剂)进行 除臭效果对比。将两种除臭剂按照1:15的比例用自来水进行稀释，配成工作浓 度的除臭菌剂，平均处理效果如表10所示
表10两种产品平均处理效率比较
通过平均处理效率比较，可见本发明菌剂能有效降低厨余垃圾的恶臭污 染，对挥发性有机化合物更是有近100％的清除效果。
实施例6含有恶臭假单胞菌Daoduo 2的装修污染物处理剂去除挥发性有机化合物的应用
本实施例中采用以下方法进行室内空气净化效果的测定：
1、将空白对照试剂(水)和用水稀释40倍的装修污染物处理剂以喷雾形式分 别均匀喷洒在空白试验舱A和样品试验舱B中，喷洒量相同。
2、将装有配好的VOC污染物释放源的容器分别放置于空白试验舱A和样品 试验舱B中，立即关闭舱门。
3、开启空白试验舱A及样品试验舱B的风扇，搅拌1min，使舱内空气与释 放源释放的污染物混匀后，同时关闭风扇，对空白舱内进行空气采样，测定空白舱 内空气中污染物浓度为初始浓度，记作C0。
3、0.5h、1h、2h、4h、12h、72h后分别对两舱内空气污染物的浓度进行采样， 分析测试，即为某一时间段内A、B舱的浓度值，记作CA与CB。
去除率可按下式计算：
Y＝(CA CB)/CA×100
式中：
Y去除率，％；
CA空白试验舱污染物浓度值，mg/m3；
CB样品试验舱污染物浓度值，mg/m3。
试验结果如表11所示：
表11装修污染物处理剂对VOC的去除率
时间 0.5h 1h 2h 4h 12h 72h
去除率 89.1％ 91.7％ 93.2％ 93.9％ 94.1％ 96.5％
从上述结果可以看出，本发明提供的含有恶臭假单胞菌Daoduo 2的装修污染 物处理剂对去除挥发性有机化合物VOC有显著效果，其起效快速，持续时间长， 去除率接近100％，效果远远好于市场上的同类产品，将其应用于新装修的房屋内， 可大大减轻乳胶漆等装修材料对人体带来的危害。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例及对比例。应当理解，本领域的普通 技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技 术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有 限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一株假单胞菌，其特征在于，所述假单胞菌为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)Daoduo 2，于2017年2月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2017053。
2.如权利要求1所述的假单胞菌的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法包括：
1)将使用联苯的化工厂内污染的土壤样品加入到基础培养基中，加入固体联苯富集培养；
2)培养8-12天后开始传代培养，每2-5天转接1次，转接8-12次后将培养液稀释后用无机盐固体培养基培养，筛选能够生长的菌株；
3)经过连续富集培养后，取稀释后的菌液涂布基础固体培养基平板，挑取生长迅速的菌株，利用LB平板培养后所述株菌的菌落圆滑，呈暗白色。
3.一种微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂包括如权利要求1所述的假单胞菌。
4.如权利要求3所述的微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂中的有效活菌总数≥1.0×109CFU/mL。
5.一种微生物制剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
步骤1、平板培养：使用固体富营养培养基，平板培养恶臭假单胞菌Daoduo 2，形成单菌落；
步骤2、摇瓶种子液制作：在摇瓶中使用液体糖蜜培养基，培养步骤1中的所述恶臭假单胞菌Daoduo 2，形成摇瓶种子液；
步骤3、放大培养：使用液体糖蜜培养基，放大培养步骤2中的所述摇瓶种子液，获得放大培养种子液；
步骤4、发酵培养：使用发酵罐，培养步骤3中获得的所述放大培养种子液，制备获得所述微生物菌剂。
6.如权利要求5所述的微生物制剂的制备方法，其特征在于，所述平板培养的程序为：采用平板划线方法将所述恶臭假单胞菌Daoduo 2接种到固体LB培养基上，于25℃～35℃培养箱中孵育12～24h，形成单菌落。
7.如权利要求5所述的微生物制剂的制备方法，其特征在于，所述液体糖蜜培养基含有2～4％的糖蜜。
8.如权利要求3或4所述的微生物制剂的使用方法，其特征在于，所述使用方法包括将所述微生物制剂按1:10～1:50的比例稀释，均匀喷洒待除臭对象，每天喷洒一次，连续喷洒3天～5天。
9.一种除臭剂，其特征在于，所述除臭剂包括如权利要求1所述的假单胞菌。
10.一种装修污染物处理剂，其特征在于，所述装修污染物处理剂包括如权利要求1所述的假单胞菌。
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