CN107213142B - 氧化白藜芦醇或氧化白藜芦醇联合抗生素在制备抗真菌感染产品中的应用 - Google Patents

氧化白藜芦醇或氧化白藜芦醇联合抗生素在制备抗真菌感染产品中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及氧化白藜芦醇或氧化白藜芦醇联合抗生素在制备抗真菌感染产品中的应用，属于医药技术领域，氧化白藜芦醇成分天然、安全性好，对红色毛癣菌和白色念珠菌均具有良好的抗菌能力。其中，当氧化白藜芦醇与抗生素硝酸益康唑联合作用于两种菌时，相同使用浓度下，对两种菌的抑菌效果均优于单独两种物质，因此，以天然的氧化白藜芦醇取代部分硝酸益康唑用于抑制真菌，可减少抗生素硝酸益康唑的使用量，有利于新型、高效、天然的抗真菌感染药物的研发。

Description

氧化白藜芦醇或氧化白藜芦醇联合抗生素在制备抗真菌感染 产品中的应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及氧化白藜芦醇或氧化白藜芦醇联合硝酸益康唑在制备抗真菌感染产品中的应用。
背景技术
随着生活水平的逐渐提高，人们的卫生防病意识也在不断的加强。真菌是细菌的一种，能引起动植物和人的各种疾病。不同真菌可以通过不同的方式致病，可以分为以下几种：(1) 致病性真菌感染：由外源性真菌引起，如皮肤癣病菌；(2)条件致病性真菌感染：由内源性真菌引起，如白色念珠菌等；(3)真菌超敏反应性疾病：吸入或食入菌丝或孢子引起荨麻疹、哮喘等；(4)真菌性中毒症：食用含真菌毒素的霉变粮食所致；(5)真菌毒素：与肿瘤发生有关。
人类感染的真菌主要来自外界环境，并通过接触、吸入或食入而感染。少数致病真菌可直接致病，但多数真菌需要在一定条件下才能致病，后者称为条件致病菌。其中，皮肤癣菌中的红色毛癣菌通过接触传染，感染指(趾)甲形成足癣，还可以感染而引起头癣、体癣、股癣、手癣等。而足癣，俗称脚气，具有传染性，其难以治愈、容易交叉传染，不及时治疗，久而久之会引发灰指甲的形成，同时抓挠后极易引发身体其他部位的真菌感染，严重影响人们的生活质量。用于临床的抗真菌药皆因不能渗透角质而对治疗灰指(趾)甲无效。从前的主要治疗方法为手术拔除指(趾)甲，多人畏其疼痛而为难，成为许多人特别是年轻人心头之烦恼。目前，用于治疗灰指甲的方法有口服药和外用药两大类。口服药主要是抗真菌药物类，如斯皮仁诺(别名：伊曲康唑、依康唑、伊康唑、依他康唑)，但口服药往往会给人体带来较大的伤害；久而久之，容易引起指(趾)甲对红色毛癣菌的耐药性等很多副作用，且安全性也不断受到质疑。外用药物，如硝酸咪康唑、复方苯甲酸软膏等西药类，通过涂抹患处，杀灭真菌治疗，但是此类药物往往具有很大的刺激性，使用时还可能会带来灼烧感和刺痛感，严重时难以忍受，且复发率较高。
同样，白色念珠菌为条件致病性真菌，常寄生于人的皮肤、口腔、阴道和肠道粘膜处。随着免疫功能低下或免疫缺陷的病人日益增多，其感染率不断增加。其可侵犯人体许多部位，如皮肤皱褶处(腑窝、腹股沟，乳房下，肛门周围及甲沟，指间)，引起皮肤潮红、潮湿、发亮，有时病变周围有小水泡等症状，同时还会引起鹅口疮、口角炎、阴道炎、浅表溃疡、肺炎、肠胃炎、心内膜炎、脑膜炎、脑炎等，偶尔也可发生败血症。近年来，由于广谱抗菌药物、激素、免疫抑制剂等药物的大量应用，介入手术的普及，恶性肿瘤、艾滋病等疾病发病率逐年上升等因素，使得念珠菌感染发病率逐年升高。目前，唑类药物是临床治疗和预防白色念珠菌感染的首选药物，唑类药物的大量应用，在治疗白色念珠菌感染的同时又使白色念珠菌的耐药性提高。
因此，开发研究一种新型、高效、天然的抗真菌感染产品是目前所急需的，也是现代医学研究的热点。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于：(1)提供氧化白藜芦醇在制备抗真菌感染产品中的应用； (2)氧化白藜芦醇联合抗生素在制备抗真菌感染产品中的应用。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、氧化白藜芦醇在制备抗真菌感染产品中的应用。
进一步，所述真菌为红色毛癣菌或白色念珠菌。
进一步，所述氧化白藜芦醇的制备方法为：
(1)取桑枝烘干粉碎后过100目筛，获得桑枝粉末；
(2)将步骤(1)中制得的桑枝粉末加入无水乙醇或甲醇中，经提取获得提取液，将所述提取液浓缩至浸膏，即得桑枝提取物；将所述桑枝提取物溶于水中，获得桑枝提取物水溶液，将所述桑枝提取物水溶液经石油醚萃取后再加入乙酸乙酯、氯仿或丙酮中，再次萃取获得萃取液，将所述萃取液浓缩至浸膏，即得桑枝的乙酸乙酯、氯仿或丙酮的萃取物；
(3)利用聚酰胺柱色谱，依次以体积分数为30％、60％、80％的乙醇溶液对步骤(2)中制得的乙酸乙酯、氯仿或丙酮的萃取物进行洗脱，收集80％的乙醇溶液洗脱液，再利用硅胶柱色谱，以氯仿和甲醇的混合液对所述80％的乙醇溶液洗脱液进行洗脱，收集氯仿和甲醇的混合液洗脱液，对所述氯仿和甲醇的混合液洗脱液进行浓缩，获得浓缩液，向所述浓缩液加入体积分数为50％的乙醇溶液，混匀至氧化白藜芦醇晶体析出，制得氧化白藜芦醇。
进一步，步骤(2)中，所述桑枝粉末与无水乙醇或甲醇的质量体积比为1mg：20mL。
进一步，步骤(2)中，所述桑枝提取物水溶液与石油醚的体积比为1：1；经石油醚萃取后的桑枝提取物水溶液与所述乙酸乙酯、氯仿或丙酮的体积比为1：1。
进一步，步骤(2)中，所述提取具体为在350W下微波提取三次，每次30min。
进一步，步骤(3)中，所述聚酰胺柱色谱中聚酰胺颗粒大小为80-100目。
进一步，步骤(3)中，所述氯仿和甲醇的体积比为14:1。
2、氧化白藜芦醇联合抗生素在制备抗真菌感染产品中的应用。
进一步，所述抗生素为硝酸益康唑。
本发明的有益效果在于：本发明的有益效果在于：本发明公开了氧化白藜芦醇及氧化白藜芦醇联合抗生素在抗真菌感染疾病药物中的应用，氧化白藜芦醇成分天然、安全性好，对红色毛癣菌和白色念珠菌均具有良好的抗菌能力，对两种菌的最小抑菌浓度分别为0.5mg/mL 和1mg/mL。当氧化白藜芦醇与抗生素硝酸益康唑联合运用时，相同使用浓度下，对红色毛癣菌和白色念珠菌的抑菌效果均优于单独使用两种物质，其中，硝酸益康唑单独作用红色毛癣菌和白色念珠菌时的最小抑菌浓度分别为1μg/mL和1mg/mL，当两者联合作用于红色毛癣菌时，氧化白藜芦醇浓度为0.250mg/mL、硝酸益康唑浓度为0.500μg/mL，对红色毛癣菌的抑菌率可到99.38％；当两者联合作用于白色念珠菌时，氧化白藜芦醇浓度为0.250mg/mL、硝酸益康唑浓度为0.25mg/mL，可见，以天然的氧化白藜芦醇取代部分硝酸益康唑用于抑制真菌，可减少硝酸益康唑的使用量，有利于新型、高效、天然的抗真菌感染药物的研发。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为实施例2中不同浓度的氧化白藜芦醇对红色毛癣菌的抑菌率图；
图2为实施例5中不同浓度的氧化白藜芦醇对白色念珠菌生长曲线的影响图；
图3为实施例6中不同浓度的氧化白藜芦醇对白色念珠菌的时间-杀菌图。
具体实施方式
下面将对本发明的优选实施例进行详细的描述。
本发明实施例中使用的材料及主要试剂如下：RPM-1640培养基(含L-谷酰胺，不含碳酸氢钠，含pH指示剂)，购于上海士丰生物科技有限公司；二甲基亚砜(DMSO)、MTT、硝酸益康唑(miconazole nitrate，MN)，购于上海生工生物工程有限公司；无水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、甲醇、氯仿，均为分析纯，购于重庆川东化工集团有限公司；
桑枝(湖桑32号)，采自重庆市蚕业科学技术研究院桑树资源圃；
红色毛癣菌，编号为ATCC28188，购买于上海士丰生物科技有限公司；
白色念珠菌，编号为CMCC(F)98001，购买于中国兽药所。
实施例1
氧化白藜芦醇的制备
(1)取无病虫害桑枝，烘干粉碎后过100目筛，获得桑枝粉末；
(2)将步骤(1)中制得的桑枝粉末加入无水乙醇中，在350W下微波提取三次，每次30min，收集每次的提取液并混合，将提取液浓缩至浸膏，即得桑枝提取物，所述桑枝粉末与无水乙醇的质量体积比为1mg：20mL；将所述桑枝提取物溶于水中，获得桑枝提取物水溶液，将所述桑枝提取物水溶液经石油醚萃取后再加入乙酸乙酯中，再次萃取获得萃取液，将所述萃取液浓缩至浸膏，即得桑枝的乙酸乙酯萃取物，所述桑枝提取物水溶液与石油醚的体积比为1：1，经石油醚萃取后的桑枝提取物水溶液与乙酸乙酯的体积比为1：1；
(3)利用聚酰胺柱色谱，依次以体积分数为30％、60％、80％的乙醇溶液对步骤(2)中制得的乙酸乙酯萃取物进行洗脱，收集80％的乙醇溶液洗脱液，其中聚酰胺颗粒大小为80-100目；再利用硅胶柱色谱，将氯仿和甲醇按体积比14:1混合，以该混合液对所述80％的乙醇溶液洗脱液进行洗脱，收集氯仿和甲醇的混合液洗脱液，对所述氯仿和甲醇的混合液洗脱液进行浓缩，获得浓缩液，向所述浓缩液加入体积分数为50％的乙醇溶液，混匀至氧化白藜芦醇晶体析出，制得氧化白藜芦醇，将制得的氧化白藜芦醇溶于100％的二甲基亚砜(DMSO) 制得浓度为100mg/mL的氧化白藜芦醇样液，存于-20℃冰箱备用。
实施例2
1、氧化白藜芦醇对红色毛癣菌的最小抑菌浓度(MIC)检测
用二倍稀释法将实施例1中制备的氧化白藜芦醇样液加入RPM-1640培养基中至氧化白藜芦醇的浓度分别为2.000、1.000、0.500、0.250、0.125、0.063、0.031、0.015mg/mL。取96 孔细菌培养板，每孔加入100μL浓度为106CFU/mL的红色毛癣菌菌液及100μL各浓度的氧化白藜芦醇样液，并设置空白对照(不含氧化白藜芦醇样液的培养基+菌液)和溶剂对照(DMSO溶液+菌液)，同时设置对照培养板(不加菌液)。28℃恒温培养箱中培养93h，通过肉眼观察，得出氧化白藜芦醇对红色毛癣菌的最小抑菌浓度为0.5mg/mL。然后将96孔培养板取出，每孔加入20μL 5.0mg/mL的MTT试剂，28℃下恒温孵育3-4h后，取出96孔培养板，2500r/min离心5min，每孔吸出100μL上清液弃去，再加入100μL二甲亚砜，震荡30min 后再次离心，将上清液转移至新96孔板中，酶标仪530nm下检测吸光值，根据实验数据通过公式：抑制率(％)＝(1-测定孔OD530nm值/空白对照孔OD530nm值)×100％计算各浓度氧化白藜芦醇对红色毛癣菌的抑菌率，结果见表1，并绘制成图，如图1所示，由表1和图1 可知：氧化白藜芦醇对红色毛癣菌的抑制率具有浓度依赖性，随着浓度的升高，氧化白藜芦醇(OXY)对红色毛癣菌的抑制活性在逐渐增强，在浓度为0.5mg/mL时其对红色毛癣菌的抑制率达到98.69％，可得出其MIC值为0.500mg/mL。
表1不同浓度氧化白藜芦醇样液对红色毛癣菌的抑菌率
不同浓度组 浓度mg/mL 抑制率(％)
空白 0 0
1 0.0078 10.46±0.38<sup>g</sup>
2 0.0156 14.38±2.30<sup>f</sup>
3 0.03125 29.41±2.46<sup>e</sup>
4 0.0625 47.06±1.00<sup>d</sup>
5 0.125 68.63±2.10<sup>c</sup>
6 0.25 86.27±2.47<sup>b</sup>
7 0.5 98.69±0.38<sup>a</sup>
8 1 99.35±0.38<sup>a</sup>
注：肩字母相同表示差异不显著，肩字母不同表示差异显著(p<0.01)
2、硝酸益康唑(MN)对红色毛癣菌的最小抑菌浓度(MIC)检测
将硝酸益康唑溶于100％的二甲基亚砜(DMSO)中制得浓度为10mg/mL的硝酸益康唑样液，用二倍稀释法将硝酸益康唑样液加入RPM-1640培养基中至硝酸益康唑的浓度分别为 16.00、8.00、4.00、2.00、1.0、0.50、0.25、0.125μg/mL。取96孔细菌培养板，每孔加入100μL 浓度为106CFU/mL的红色毛癣菌菌液及100μL各浓度的硝酸益康唑样液，并设置空白对照 (不含硝酸益康唑样液的培养基+菌液)、溶剂对照(DMSO溶液+菌液)，同时设置对照培养板(不加菌液)。28℃恒温培养箱中培养93h，通过肉眼观察，得出硝酸益康唑对红色毛癣菌的最小抑菌浓度为1.0μg/mL。然后将96孔培养板取出，每孔加入20μL 5.0mg/mL的 MTT试剂，28℃下恒温孵育3-4h后，取出96孔培养板，2500r/min离心5min，每孔吸出100μL 上清液弃去，再加入100μL二甲亚砜，震荡30min后再次离心，将上清液转移至新96孔板中，酶标仪530nm下检测吸光值，根据实验数据通过公式：抑制率(％)＝(1-测定孔OD530nm 值/空白对照孔OD530nm值)×100％计算各浓度硝酸益康唑对红色毛癣菌的抑菌率，结果见表2。
表2不同浓度硝酸益康唑样液对红色毛癣菌的抑菌率
Figure BDA0001320732390000051
Figure BDA0001320732390000061
注：肩字母相同表示差异不显著，肩字母不同表示差异显著(p<0.01)
由表2可知，硝酸益康唑对红色毛癣菌的抑制率具有浓度依赖性，随着浓度的升高，其对红色毛癣菌的抑制活性在逐渐增强，有其抑制率可以得出，其MIC值为1.000μg/mL，IC50为0.223μg/mL。
3、氧化白藜芦醇联合硝酸益康唑对红色毛癣菌的抑菌作用研究
根据实施例2中分别测得的氧化白藜芦醇和硝酸益康唑对红色毛癣菌的MIC，用二倍稀释法分别将浓度为100mg/mL的氧化白藜芦醇样液和浓度为10mg/mL的硝酸益康唑样液加入 RPM-1640培养基中至各样液中氧化白藜芦醇和硝酸益康唑的浓度分别为各自的2MIC、1 MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC、1/16MIC、1/32MIC、1/64MIC。取96孔细菌培养板，每孔先各加入50μL经培养基稀释后的相同倍数MIC氧化白藜芦醇溶液和硝酸益康唑溶液，然后再向每孔加入100μL浓度为106CFU/mL的红色毛癣菌菌液，并设置空白对照(不含氧化白藜芦醇样液和硝酸益康唑样液的培养基+菌液)、溶剂对照(DMSO溶液+菌液)，同时设置对照培养板(不加菌液)。28℃恒温培养箱中培养93h，通过肉眼观察，当氧化白藜芦醇和硝酸益康唑浓度均各自1/2MIC时，对红色毛癣菌的作用最强。然后将96孔培养板取出，每孔加入20μL5.0mg/mL的MTT试剂，28℃下恒温孵育3-4h后，取出96孔培养板，2500r/min 离心5min，每孔吸出100μL上清液弃去，再加入100μL二甲亚砜，震荡30min后再次离心，将上清液转移至新96孔板中，酶标仪530nm下检测吸光值，根据实验数据通过公式：抑制率(％)＝(1-测定孔OD530nm值/空白对照孔OD530nm值)×100％计算各相同浓度氧化白藜芦醇联合硝酸益康唑对红色毛癣菌的抑菌率，结果见表3。
实验设置三个重复，氧化白藜芦醇和硝酸益康唑对红色毛癣菌的作用效果通过分级抑菌浓度(MIC)指数结合棋盘法来进行评估，氧化白藜芦醇和硝酸益康唑组合的FICI指数由以下公式计算得出：
FICI＝MICa联合/MICa单独+MICb联合/MICb单独
判定标准为：若FICI≤0.5，则为协同效应；
若FICI＝0.5-0.75，则为部分协同效应；
若FICI＝0.75-1.00，则为叠加效应；
若FICI＝1.0-4.0，则无相互作用；
若FICI>4.0，则为拮抗效应。
表3相同浓度氧化白藜芦醇和硝酸益康唑混合溶液对红色毛癣菌的抑菌率
不同浓度组 浓度 抑菌率(％)
空白 0 0
1 1/256MIC 3.7±3.44<sup>h</sup>
2 1/128MIC 8.64±2.57<sup>g</sup>
3 1/64MIC 17.28±0.36<sup>f</sup>
4 1/32MIC 38.27±1.63<sup>e</sup>
5 1/16MIC 62.96±1.78<sup>d</sup>
6 1/8MIC 87.65±3.62<sup>c</sup>
7 1/4MIC 91.98±1.98<sup>b</sup>
8 1/2MIC 99.38±0.62<sup>a</sup>
注：肩字母相同表示差异不显著，肩字母不同表示差异显著(p<0.01)
由表3可知，氧化白藜芦醇与硝酸益康唑的联合使用对红色毛癣菌的MIC值均显著降低，当各自浓度为1/2MIC，即氧化白藜芦醇浓度为0.250mg/mL、硝酸益康唑浓度为0.500μg/mL，联合运用时，对红色毛癣菌的抑菌率可到99.38％，说明氧化白藜芦醇与硝酸益康唑的联合使用对红色毛癣菌均有很好的抑菌作用，可以天然的氧化白藜芦醇取代部分硝酸益康唑用于抑制红色毛癣菌，以减少硝酸益康唑的使用量。氧化白藜芦醇和硝酸益康唑的FICI指数为： FICI(氧+抗)＝1/2+1/2＝1.0，即氧化白藜芦醇与硝酸益康唑联合使用对红色毛癣菌的抑制作用具有叠加效应。
实施例3
1、氧化白藜芦醇对白色念珠菌的最小抑菌浓度(MIC)检测
用二倍稀释法将实施例1中制备的氧化白藜芦醇样液加入RPM-1640培养基中至氧化白藜芦醇的浓度分别为2.000、1.000、0.500、0.250、0.125、0.063、0.031、0.015mg/mL。取96 孔细菌培养板，每孔加入100μL浓度为106CFU/mL的白色念珠菌菌液及100μL各浓度的氧化白藜芦醇溶液，并设置空白对照(不含氧化白藜芦醇样液的培养基+菌液)和溶剂对照(DMSO溶液+菌液)，同时设置对照培养板(不加菌液)。28℃恒温培养箱中培养48h，通过肉眼观察，得出氧化白藜芦醇对白色念珠菌的最小抑菌浓度为1mg/mL。
2、硝酸益康唑对白色念珠菌的最小抑菌浓度(MIC)检测
将硝酸益康唑溶于100％的二甲基亚砜(DMSO)中制得浓度为100mg/mL的硝酸益康唑样液，用二倍稀释法将硝酸益康唑样液加入RPM-1640培养基中至硝酸益康唑的浓度分别为 2.000、1.000、0.500、0.250、0.125、0.063、0.031、0.015mg/mL。取96孔细菌培养板，每孔加入100μL浓度为106CFU/mL的白色念珠菌菌液及100μL各浓度的硝酸益康唑样液，并设置空白对照(不含硝酸益康唑样液的培养基+菌液)和溶剂对照(DMSO溶液+菌液)，同时设置对照培养板(不加菌液)。28℃恒温培养箱中培养48h，通过肉眼观察，得出硝酸益康唑对白色念珠菌的最小抑菌浓度为1mg/mL。
3、氧化白藜芦醇联合硝酸益康唑对白色念珠菌的抑菌作用研究
根据实施例3中分别测得的氧化白藜芦醇和硝酸益康唑对白色念珠菌的MIC，用二倍稀释法分别将浓度为100mg/mL的氧化白藜芦醇样液和浓度为100mg/mL的硝酸益康唑样液加入RPM-1640培养基中至各样液中氧化白藜芦醇和硝酸益康唑的浓度分别为各自的2MIC、1 MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC、1/16MIC、1/32MIC、1/64MIC。取96孔细菌培养板，每孔先各加入50μL相同倍数MIC的氧化白藜芦醇溶液和硝酸益康唑溶液，然后再向每孔加入100μL浓度为106CFU/mL的白色念珠菌菌液，并设置空白对照(不含氧化白藜芦醇样液和硝酸益康唑样液的培养基+菌液)、溶剂对照(DMSO溶液+菌液)，同时设置对照培养板 (不加菌液)。28℃恒温培养箱中培养48h，通过肉眼观察，当氧化白藜芦醇和硝酸益康唑浓度均1/4MIC时，对白色念珠菌的抑制作用最强，即氧化白藜芦醇浓度为0.250mg/mL、硝酸益康唑浓度为0.25mg/mL，联合运用时，可以完全抑制白色念珠菌，说明氧化白藜芦醇与硝酸益康唑的联合使用对白色念珠菌均有很好的抑菌作用，可以天然的氧化白藜芦醇取代部分硝酸益康唑用于抑制白色念珠菌，以减少硝酸益康唑的使用量。
实验设置三个重复，氧化白藜芦醇和硝酸益康唑对白色念珠菌的作用效果通过分级抑菌浓度(MIC)指数结合棋盘法来进行评估，氧化白藜芦醇和硝酸益康唑组合的FICI指数由以下公式计算得出：
FICI＝MICa联合/MICa单独+MICb联合/MICb单独
判定标准为：若FICI≤0.5，则为协同效应；
若FICI＝0.5-0.75，则为部分协同效应；
若FICI＝0.75-1.00，则为叠加效应；
若FICI＝1.0-4.0，则无相互作用；
若FICI>4.0，则为拮抗效应。
氧化白藜芦醇和硝酸益康唑的FICI指数为：FICI(氧+抗)＝1/4+1/4＝0.5，即氧化白藜芦醇与硝酸益康唑联合使用对白色念珠菌的抑制作用具有协同效应。
实施例4
氧化白藜芦醇对白色念珠菌的最小杀菌浓度(MBC)检测
在实施例3中最小抑菌浓度的基础上，按照MIC的试验方法，将实施例1中制备的氧化白藜芦醇样液加入RPM-1640培养基中至氧化白藜芦醇的浓度分别为2MIC、4MIC、8MIC、16MIC，取96孔细菌培养板，每孔加入100μL浓度为106CFU/mL的白色念珠菌菌液，再加入100μL将培养基稀释后的各浓度的氧化白藜芦醇溶液，并设置空白对照(不含样液的培养基+菌液)和溶剂对照(DMSO溶液+菌液)。28℃培养箱中培养48h，然后每孔取20μL菌液接种在新鲜的营养琼脂培养基上，过夜培养，无活菌生长的最小浓度即为最小杀菌浓度，经测试得到氧化白藜芦醇对白色念珠菌的最小杀菌浓度4mg/mL。
实施例5
氧化白藜芦醇对白色念珠菌生长曲线的影响
将培养至对数期的白色念珠菌用RPM-1640培养基稀释至107CFU/mL，取1mL稀释好的菌液分别加入三组含实施1中制备的氧化白藜芦醇样液的新鲜RPM-1640培养基中，各组培养基体积为20mL，其中氧化白藜芦醇浓度分别为1MIC、1/2MIC、1/4MIC，同时设置溶剂对照组(DMSO溶液+菌液)。在28℃，120rpm条件下培养，每隔两小时用酶标仪在600nm 下测其吸光值，绘制生长曲线，结果如图2，由图2可知，与溶剂对照组相比，氧化白藜芦醇浓度为MIC值时，其完全抑制了白色念珠菌的生长，浓度为1/2MIC值时，其对白色念珠菌的生长起到了延迟作用，在24h之后白色念珠菌才开始生长，浓度为1/4MIC值时，其对白色念珠菌的生长起到了一定的抑制作用，在该浓度下，白色念珠菌的生长速度始终低于溶剂对照组。
实施例6
氧化白藜芦醇对白色念珠菌的时间-杀菌曲线
培养至对数期的菌液稀释至107CFU/mL，取1mL稀释好的菌液分别加入三组含实施1 中制备的氧化白藜芦醇样液的新鲜RPM-1640培养基中，各组培养基体积为20mL，其中氧化白藜芦醇浓度分别为1MIC、2MIC、4MIC，同时设置溶剂对照组(DMSO溶液+菌液)。摇匀后在28℃，150rpm条件下培养，每隔0、2、4、8、12、16、20、24和48h取样，用无菌水稀释成10倍和100倍，在28℃下于固体培养基上培养48h，并进行观察与计数，绘制其时间-杀菌曲线，结果如图3所示，由图3可知，氧化白藜芦醇对白色念珠菌的时间-杀菌作用具有时间和浓度依赖性，既随着时间的延长和浓度的增加其对白色念珠菌的杀伤作用在逐渐增强，在浓度达到4MIC时，其作用48h之后可以将白色念珠菌完全杀死。
本发明中，除了用无水乙醇制备桑枝提取物，还可用甲醇；除了用乙酸乙酯制备桑枝萃取物，还可用氯仿或丙酮。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (7)

1.氧化白藜芦醇联合抗生素在制备抗真菌感染产品中的应用，其特征在于，所述抗生素为硝酸益康唑；所述真菌为红色毛癣菌或白色念珠菌。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述氧化白藜芦醇的制备方法为：
（1）取桑枝烘干粉碎后过100目筛，获得桑枝粉末；
（2）将步骤（1）中制得的桑枝粉末加入无水乙醇或甲醇中，经提取获得提取液，将所述提取液浓缩至浸膏，即得桑枝提取物；将所述桑枝提取物溶于水中，获得桑枝提取物水溶液，将所述桑枝提取物水溶液经石油醚萃取后再加入乙酸乙酯、氯仿或丙酮中，再次萃取获得萃取液，将所述萃取液浓缩至浸膏，即得桑枝的乙酸乙酯、氯仿或丙酮的萃取物；
（3）利用聚酰胺柱色谱，依次以体积分数为30%、60%、80%的乙醇溶液对步骤（2）中制得的乙酸乙酯、氯仿或丙酮的萃取物进行洗脱，收集80%的乙醇溶液洗脱液，再利用硅胶柱色谱，以氯仿和甲醇的混合液对所述80%的乙醇溶液洗脱液进行洗脱，收集氯仿和甲醇的混合液洗脱液，对所述氯仿和甲醇的混合液洗脱液进行浓缩，获得浓缩液，向所述浓缩液加入体积分数为50%的乙醇溶液，混匀至氧化白藜芦醇晶体析出，制得氧化白藜芦醇。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤（2）中，所述桑枝粉末与无水乙醇或甲醇的质量体积比为1mg：20mL。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤（2）中，所述桑枝提取物水溶液与石油醚的体积比为1：1；经石油醚萃取后的桑枝提取物水溶液与所述乙酸乙酯、氯仿或丙酮的体积比为1：1。
5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤（2）中，所述提取具体为在350 W下微波提取三次，每次30min。
6.如权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤（3）中，所述聚酰胺柱色谱中聚酰胺颗粒大小为80-100目。
7.如权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤（3）中，所述氯仿和甲醇的体积比为14:1。
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