CN107202778B - 一种青菜新鲜度的荧光检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及食品贮藏和保鲜领域，旨在提供一种青菜新鲜度的荧光检测方法。包括：取青菜外叶，剪成长条状后，冷冻干燥；加入煮沸的乙醇后研磨，再转入离心管中重复提取和离心三次，合并上清液；在荧光分光光度计中注入上清液，设定激发波长255nm、发射波长347nm，读取发射峰的荧光强度，并根据其数值判断青菜新鲜度。本发明采用简单快速的荧光检测方法，建立了青菜新鲜度的新的评估指标。相比传统的理化检测和无损检测，其能够发现和区分青菜早期的衰老程度，并且灵敏度也得到极大提高。可以用于青菜新鲜度的检测，以及保鲜处理方法的快速筛选。
Description
技术领域
本发明属于食品贮藏和保鲜领域，涉及绿色蔬菜采后新鲜度的荧光检测方法。
背景技术
叶菜类蔬菜在采后很快会发生一系列的变化，如发黄、萎蔫、腐烂等，保质期很短。这使蔬菜在运送及贮藏过程中，损耗和成本大大增加。目前已有通过检测蔬菜品质变化，以及利用这些检测参数变化来筛选保鲜方法，从而确定新鲜度和选出最佳的蔬菜采后保鲜处理方式。蔬菜新鲜度一般使用感官打分来确定，但其缺少精确数据，因此也常常使用理化检测方法，例如常用丙酮提取蔬菜叶绿素，用水提取维生素C、可溶性蛋白后添加显色剂，再使用可见光比色法测定其含量。
近年来，随着无损检测技术的发展，人们使用叶绿素荧光仪测定叶绿素荧光参数Fm/Fo、Fv/Fm等，还有基于细胞ATP含量光谱的无损检测技术，利用高光谱成像技术测定蔬菜外观形态和内部叶绿素的变化等，来反映蔬菜的新鲜度。但是这些测定参数在蔬菜采后的初期变化较小，一般与外观变化同步，或者稍微早于外观变化，其主要是有利于定量。很多保鲜处理试验，需要处理后蔬菜贮藏较长时间，才能比较出处理和对照的差异。
因此，开发出保鲜处理后品质的早期评价指标，将有利于加快研究速度，提高研究效率。利用荧光技术来研究青菜衰老过程中的早期变化，并寻找比常规检测指标变化更早的指标，有利于未来蔬菜新鲜度的评估和保鲜方法的快速筛选。目前国内外未见使用基于特定激发和发射荧光波长和强度来检测蔬菜新鲜度的相关报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种能早期和较高区分度的指标来检测青菜采后新鲜度的荧光检测方法。
为解决技术问题，本发明的解决方案是：
提供一种青菜新鲜度的荧光检测方法，包括以下步骤：
(1)取青菜外叶，剪成长条状后，冷冻干燥；
(2)取0.1g冻干的青菜叶，加入5mL煮沸的乙醇后研磨5min后，再转入离心管中静置10min，在4℃和4000×g条件下离心15min；沉淀物中加5mL乙醇，重复提取和离心，合并上清液；提取和离心操作共三次，总共使用15mL乙醇；
(3)在荧光分光光度计的样品室中注入5mL上清液，设定激发波长255nm、发射波长347nm，读取发射峰的荧光强度，并根据其数值判断青菜新鲜度：
青菜在25℃下贮藏时，
如荧光强度为0.2a.u.以下时，表明是刚采收的青菜；
如荧光强度为0.2-0.3a.u.时，表明是采收后第1天内的青菜；
如荧光强度为0.3-1.08a.u.时，表明是采收后第2天内的青菜；
如荧光强度为1.08-2.86a.u.时，表明是采收后第3天内的青菜；
如荧光强度为2.86-8.70a.u.时，表明是采收后第4天内的青菜；
如荧光强度超过8.70a.u.时，表明青菜样品已采收超过4天。
本发明中，步骤(1)中，将青菜外叶剪成宽0.3cm、长1.0cm的长条状。
发明原理描述：
随着青菜叶片的衰老，某些降解物在特定波长下能发射特定波长的荧光，该波长的荧光强度随着叶片的衰老迅速增强，能有效用来即时评估青菜采后的新鲜度，也可用于保鲜技术是否具有延缓青菜衰老进行早期快速评判。本发明提供使用特定激发波长和发射波长的荧光来检测青菜衰老，其发射波长的荧光强度会随着青菜衰老而急速增加。以该荧光激发和发射波长，建立起青菜新鲜度的检测方法的灵敏度会比叶绿素含量变化高1.5倍(早期)，136倍(后期)。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明采用一种简单快速的荧光检测方法，建立了青菜新鲜度的新的评估指标。相比传统的理化检测和无损检测，其能够发现和区分青菜早期的衰老程度，并且灵敏度也得到极大提高。可以用于青菜新鲜度的检测，以及保鲜处理方法的快速筛选。
附图说明
图1中是青菜衰老过程中乙醇提取物的荧光强度变化曲线(激发波长255nm)。
具体实施方式
(1)青菜叶片衰老过程的荧光检测方法建立
挑选新鲜青菜分装于0.04mm厚度的聚乙烯薄膜袋中贮藏，袋上每平方分米扎有10个直径为0.5mm均匀小孔，常温(25±2℃)贮藏。分别测定第0d，1d，2d，3d，4d，5d，6d青菜外叶，测定重复3次。
青菜乙醇提取液制备：取青菜外叶剪碎，宽度和长度为0.3cm和1.0cm左右。冷冻干燥，取0.1g，加入煮沸的乙醇5mL研磨5min，转入离心管中静置10min，在4000×g4℃下离心15min，沉淀物加5mL乙醇，重复提取和离心。总计三次。合并上清液，取5mL上清液，使用RF-5301pc荧光分光光度计进行荧光测定。
最佳发射波长选择：由于目前未见有文献报道荧光扫描叶菜的最佳激发波长，且多数化合物没有荧光特性，只有具有苯环和共轭双键的物质具有荧光，因此激发光源一般为短波紫外线激发荧光(激发波长为254nm，用于检测含有苯环的有机化合物)和长波紫外线激发荧光(激发波长为365nm，用于检测3个苯环共轭的恩醌类化合物)，故选择254nm和365nm作为初始的激发波长进行发射光谱的扫描。发现使用两种激发波长，新鲜青菜都只有两个发射波长峰，分别是515nm和693nm。可作为发射波长来筛选最佳激发波长。衰老青菜使用365nm激发波长，只有两个发射波长峰，分别是515nm和693nm。但是选择254nm激发波长时，有三个发射波长峰，分别是347nm、515nm和693nm。显然发射波长347nm的荧光强度不断增加是衰老引起的。
最佳激发波长选择：347nm作为发射波长，在小于发射波长的范围内扫描，寻找最强激发波长。结果发现在255nm处有最高峰值，故采用255nm作为激发波长来扫描发射光谱，发现发射波长为347nm时，荧光强度变化最灵敏。因此选择该条件，来测量青菜衰老过程中乙醇提取物的荧光强度变化。见图1。
青菜衰老过程中荧光强度的变化：读出激发波长255nm，发射波长347nm处峰值的荧光强度。
(2)青菜叶片新鲜度的荧光检测方法建立
对青菜外观品质变化进行打分，对青菜叶片叶绿素含量进行测定，并与青菜叶片荧光检测数据进行比较，获得新的青菜新鲜度的荧光参数指标。
外观品质变化：采用十分制评定方法。
10分：田间刚采后青菜，外叶绿色饱满，没有腐烂。8分：外叶绿色稍淡，仍然较新鲜，没有腐烂。6分：外叶轻微变黄，没有腐烂。4分：外叶一半面积以内变黄，或有轻微腐烂。2分：外叶完全变黄，或有轻度腐烂。0分：外叶、中叶完全变黄，或外叶大面积腐烂。其中，尚新鲜青菜临界点为7.5分，青菜可售临界为5.5分。
叶绿素含量测定：采用可见光比色法。
将青菜叶片剪成细条状混合，取0.2g放入25mL试管中，加入8mL乙醇-丙酮溶液(乙醇：丙酮＝1：1)，放入-20℃冰箱中冷冻2h后，拿出放入常温下、黑暗中浸提16h。此后，取1mL浸提液加4mL乙醇-丙酮溶液(乙醇：丙酮＝1：1)，在645nm和663nm处比色，并计算叶绿素含量。
在衰老0d-1d，青菜外观看不出变化，2d青菜外叶绿色稍微变淡，稍有失水萎焉，但仍然较新鲜，能够看出与刚采收时候的差异。此后青菜进一步变黄和萎焉，在4d时青菜外叶已经失去商品价值。见表1。
青菜外叶的叶绿素含量与感官品质有很高的相关性(R2＝0.982)，说明青菜叶片的外观品质变化与叶绿素的降解基本同步。叶绿素含量在0d-2d内稍有下降，但是没有显著差异。在3d和4d时，其含量分别为1.41mg/g FW(P<0.05)和1.12mg/g Fw(P<0.05)显著低于0d的1.71mg/g Fw。其前期差异小，可能是叶绿素降解中间产物脱镁叶绿素a和脱植基叶绿素a在600-700nm处均有较大吸收波长，对663nm和645nm吸收峰有干扰。见表1。
使用激发波长255nm，发射波长347nm时，0d青菜的荧光强度为0.20a.u.，1d升高到0.3a.u.，2d时显著上升到1.08a.u.，此后一直上升，到6d上升到26.89a.u.。347nm发射峰值与青菜外观品质呈现高度负相关(R2＝-0.919)，与叶绿素含量变化同样呈现负相关(R2＝-0.894)。说明使用该发射荧光峰值来评估青菜新鲜度是可行的。见表1。
表1青菜衰老过程中的感官品质、叶绿素含量、荧光强度的变化
注：不同字母代表相互之间有显著差异(P<0.05)
表2青菜衰老过程中的感官品质、叶绿素含量、荧光强度变化的百分比
在0d-1d，青菜外叶荧光强度上升50％，而感官品质下降0％，叶绿素含量下降2.9％，说明其在采后早期的变化比感官品质变化和叶绿素含量变化更灵敏。在还有商品价值的3d时，其荧光强度变化达到1330％，而感官品质变化25％，叶绿素变化17.5％。其灵敏度也远远高于后两者指标。见表2。
因此可以使用荧光分光光度计，选择激发波长255nm，发射波长347nm，读出发射峰的荧光强度。青菜在25℃下贮藏时，0.1g新鲜青菜外叶干重，用15mL乙醇提取液的荧光强度为0.2a.u.以下，为刚采收青菜。荧光强度为0.2-0.3a.u.时，表明是采收后第1d内的青菜；荧光强度为0.3-1.08a.u.时，表明是采收后第2d内的青菜；荧光强度为1.08-2.86a.u.时，表明是采收后第3d内的青菜；荧光强度为2.86-8.70a.u.时，表明是采收后第4d内的青菜；荧光强度超过8.70a.u.时，表明青菜样品已采收超过4d以上。
Claims (2)
1.一种青菜新鲜度的荧光检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取青菜外叶，剪成长条状后，冷冻干燥；
(2)取0.1g冻干的青菜叶，加入5mL煮沸的乙醇后研磨5min后，再转入离心管中静置10min，在4℃和4000×g条件下离心15min；沉淀物中加5mL乙醇，重复提取和离心，合并上清液；提取和离心操作共三次，总共使用15mL乙醇；
(3)在荧光分光光度计的样品室中注入5mL上清液，设定激发波长255nm、发射波长347nm，读取发射峰的荧光强度，并根据其数值判断青菜新鲜度：
青菜在25℃下贮藏时，
如荧光强度为0.2a.u.以下时，表明是刚采收的青菜；
如荧光强度为0.2-0.3a.u.时，表明是采收后第1天内的青菜；
如荧光强度为0.3-1.08a.u.时，表明是采收后第2天内的青菜；
如荧光强度为1.08-2.86a.u.时，表明是采收后第3天内的青菜；
如荧光强度为2.86-8.70a.u.时，表明是采收后第4天内的青菜；
如荧光强度超过8.70a.u.时，表明青菜样品已采收超过4天。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，将青菜外叶剪成宽0.3cm、长1.0cm的长条状。
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