CN107177556B - 抗羊IgMμ链单克隆抗体、分泌该抗体的杂交瘤细胞株及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了抗羊IgMμ链单克隆抗体、分泌该抗体的杂交瘤细胞株及其用途。本发明以分泌型IgM蛋白为靶蛋白，克隆获得IgMμ链基因的完整开放阅读框，亚克隆至原核表达载体，利用镍柱纯化重组蛋白，并对6‑8周龄的雌性BALB/c小鼠进行免疫，当抗体滴度在1∶10000以上时，对免疫小鼠脾细胞的单细胞悬液与对数生长期的骨髓瘤细胞进行融合，筛选获得分泌抗羊IgMμ链的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；向6‑8周龄的经产BALB/c小鼠腹腔注射杂交瘤细胞，注射7天左右收集腹水，protein G/A琼脂糖珠纯化腹水，获得纯度较高的抗羊IgMμ链的单克隆抗体。本发明提供的单克隆抗体效价高，可用于羊IgM免疫球蛋白的检测，并且有望实现对多种羊病的早期筛查与监测，具有广泛的应用范围和社会需求。

Description

抗羊IgMμ链单克隆抗体、分泌该抗体的杂交瘤细胞株及其 用途

技术领域

本发明涉及一种抗羊IgMμ链单克隆抗体，还涉及分泌该抗体的杂交瘤细胞株及其用途，属于生物技术领域。

背景技术

IgM是免疫球蛋白之一，分泌型IgM为五聚体，是分子量最大的Ig(约900KD)，主要存在于血液中，占血清免疫球蛋白总量的5％～10％。IgM是抗原初次刺激机体后体液免疫应答中最早出现的抗体，是机体抗感染的“先锋部队”；具有很强的细胞毒活性和细胞溶解活性，是抗血管内感染的第一线抗体，IgM抗体一般为保护性抗体，对防止菌血症起主要作用。

在生物进化中，IgM也是出现最早的Ig。在胚胎发育晚期，胎儿就开始具有产生IgM的能力，但是IgM不能通过胎盘。一旦发生感染，机体就快速产生IgM，但持续时间不长，IgM的半衰期短，仅5.1天，而且在感染的早期即已产生。此外，由于IgM在结合补体和活化补体后可通过补体活化片段发挥调理吞噬的作用的能力均较IgG强。因此，血清中检出特异性IgM抗体水平标志着机体近期发生了感染，对某些传染病的早期诊断具有较高的临床价值。

随着科技的发展，流通方式日趋走向多元化和频繁化，造成多种传染病跨地区、跨国界传播，对卫生安全带来了更大的危害。因此，对某些传染病，尤其是潜伏期较长的传染病而言，早期诊断具有重要的防治价值。

重链μ链是IgM分子所特有，抗IgMμ链单克隆抗体具有高效、特异性结合IgM的特性，在体外诊断试剂领域具有非常广泛的应用。市场上不易购买到不同物种的IgMμ链。在制备其单克隆抗体时，一般采用SDS-PAGE切胶获取免疫用μ链，方法繁琐，回收率不高。本实验利用原核表达系统大量表达制备羊IgMμ链，以镍琼脂糖亲和层析和阳离子交换层析纯化的重组蛋白免疫动物，获得分泌抗羊IgMμ链单克隆抗体的杂交瘤细胞系。

发明内容

本发明的目的之一是提供一株能够稳定分泌抗羊型IgMμ链单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

本发明的目的之二是提供由上述杂交瘤细胞株分泌产生的抗羊IgMμ链的单克隆抗体。

本发明的目的之三是提供所述杂交瘤细胞株以及单克隆抗体在制备诊断或检测羊IgM免疫球蛋白及其抗体试剂中的应用。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明以分泌型IgM蛋白为靶蛋白，克隆获得IgMμ链基因的完整开放阅读框，并将其亚克隆至原核表达载体，利用镍柱纯化重组蛋白，并对6-8周龄的雌性BALB/c小鼠进行免疫，当抗体滴度在1∶10000以上时，对免疫小鼠脾细胞的单细胞悬液与对数生长期的骨髓瘤细胞进行融合，筛选获得分泌抗羊IgMμ链的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；向6-8周龄的经产BALB/c小鼠腹腔注射杂交瘤细胞，注射7天左右收集腹水，protein G/A琼脂糖珠纯化腹水，获得纯度较高的抗羊IgMμ链的单克隆抗体。

本发明的一株能够稳定分泌抗羊型IgMμ链单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为5D1，分类命名为小鼠骨髓瘤细胞与脾细胞杂交瘤细胞，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其菌种保藏编号为:CGMCC No.11283，保藏时间为2015年10月12日。

进一步的，本发明还提供了由所述的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体(5D1)。

经Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit检测，将5D1单克隆抗体亚型确定为IgG1，轻链类型为κ，间接ELISA检测方法测定效价，可知：5D1株单抗的腹水效价为2.56×10⁵，且具有耐热、耐酸、耐碱，稳定性好的特点，因此可用于羊IgM免疫球蛋白及其抗体的直接或间接检测。

本发明的提出为羊IgM免疫球蛋白及其抗体的检测提供了一种有效的技术手段，有望实现对多种羊病的早期筛查与监测，具有广泛的应用范围和社会需求。

附图说明

图1为BSA标准曲线；

图2为单克隆抗体亚型鉴定；

图3为单克隆抗体热稳定性试验结果；

图4为单克隆抗体酸稳定性试验结果；

图5为单克隆抗体碱稳定性试验结果；

图6为3株单抗饱和度曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1 羊IgM重组蛋白的制备

一、羊IgM重组蛋白(tH蛋白)的表达

1、引物设计

参照GenBank分泌型IgM前体序列(登录号:X59994.1)，设计合成游引物。

上游引物：5’-GAATTCATG CAGGTGCAGCTGCAGGAGT-3’

下游引物：5’-CTCGAGTCAGTAGCAGGTGCTGGCCGT-3’

其中，下划横线部分分别为EcoR I和Xho I酶切位点。

2、RT-PCR扩增

(1)分离淋巴细胞：无菌采取健康山羊抗凝血10mL与等量的PBS混合稀释,取5mL稀释的外周血缓慢加入等量淋巴细胞分离液进行密度梯度离心,水平离心机2300r/min室温离心15min；吸取中间的白色淋巴细胞层,加入PBS洗涤,以2000r/min离心15min,去上清,沉淀物再加入PBS重复洗涤1次；收集淋巴细胞用含10％胎牛血清RPMI1640(含100mg/L青霉素和100mg/L的链霉素)培养液稀释,并取10μL细胞液进行细胞计数,之后将细胞液稀释至1×10⁶个/mL。

(2)提取淋巴细胞RNA；

(3)RT-PCR扩增

①反转录(RT):10μL Total RNA悬液和1μL Oligo d(T)引物，混匀，70℃预变性5min后立即冰浴5min；然后加入4μL 5×cDNA Synthesis Buffer、1μL dNTP Mixture(2.5mM)、0.5μL Rnasin(50u/μL)、1μL反转录酶，DEPC水补加至20μL，混匀，瞬时离心后42℃水浴60min，75℃5min灭活反转录酶。

②PCR扩增

反应体系为：反转录产物5μL、10×PCR Buffer 5μL、dNTP Mixture(2.5mM)5μL、上、下游引物(50pmol/μL)各1.5μL、MgCl2(25mM)5μL、Taq酶1μL，无核酶水补加至50μL，混匀。

反应条件为：95℃预热变性5min；94℃，60s；53℃，60s；72℃，100s，35个循环，72℃，10min。

(4)将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在1785bp处出现一条特异电泳条带，与预期的大小一致。

(5)将扩增产物连接到原核表达载体pET-30a(+)中，取用EcoR I和Xho I双酶切的pET-30a(+)载体2μL(50μg/μL)与上述RT-PCR片段8μL混合后，加入2×Rapid ligasebuffer 5μL，T₄DNA连接酶1μL(3u/μL)，混匀后置16℃连接过夜，得到重组质粒pET-30a(+)-IgM。

(6)将构建的重组表达载体pET-30a(+)-IgM经PCR、双酶切(EcoR I和Xho I)鉴定均为阳性；阳性菌液送往上海生工生物工程有限公司测序鉴定。测序结果表明，IgM成功插入到pET-30a(+)表达载体中且保持正确的阅读框，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所对应的重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

(7)将重组质粒转化至E.coli BL21感受态细胞，用含氨苄青霉素的LB培养基筛选；用IPTG诱导表达，并优化、确定蛋白的最佳表达条件。

灰度扫描分析发现，经IPTG诱导的重组基因工程菌获得表达，产生分子量大小约为66kDa的特异性蛋白条带，重组IgM蛋白主要以包涵体形式表达。通过改变诱导温度、诱导时间和IPTG浓度来增加重组IgM蛋白的表达量，SDS-PAGE分析显示，按1％比例接入二级种子液，37℃振荡培养OD值达到0.6左右时，以IPTG终浓度为0.5mmol/L于15℃诱导表达过夜的表达量最高。所以最终选择诱导条件为15℃诱导过夜，IPTG浓度为0.5mmol/L。

二、IgM重组蛋白的纯化

1.超声破碎菌体

(1)将收集的菌体用上清Buffer(50mM Tris，300mMNaCl，0.1％Triton X-100，pH8.0，)混匀，冰浴中超声破碎菌体，功率500W，20min(超声3S，暂停5S为一个循环)。

(2)超声完毕，12000rpm，4℃，离心20min，保留沉淀。

(3)沉淀用包涵体洗液(1M脲，50mM Tris，5mM DTT，1％Triton X-100，pH8.0)洗涤，冰浴中超声破碎，功率500W，20min(超声3S，暂停5S为一个循环)。

(4)超声完毕，12000rpm，4℃，离心20min，保留沉淀。

(5)沉淀用buffer(7M盐酸胍，50mM Tris，0.1％Triton X-100，pH8.0)溶解，冰浴中超声破碎菌体，功率500W，20min(超声3S，暂停5S为一个循环)。

2.镍琼脂糖亲和层析

(1)取5mLNi-IDA，用10倍柱床体积的Binding buffer(7M盐酸胍，50mM Tris，pH8.0)清洗平衡柱子，流速5mL/min。

(2)样品(溶解液上清)上柱，流速为2mL/min，收集穿透液。

(3)用10倍柱床体积的Binding buffer清洗柱子，流速10mL/min。

(4)用含不同浓度咪唑的Wash Buffer洗脱，流速5mL/min，收集洗脱液。

注：Wash buffer为Wash buffer 1(10mM Imidazole，8M脲，50mM Tris，300mMNaCl，pH8.0)以及Wash buffer 2(20mM Imidazole，8M脲，50mM Tris，300mM NaCl，pH8.0)。

(5)Elution Buffer(500mM Imidazole，8M脲，50mM Tris，300mM NaCl，pH8.0)洗脱，流速2ml/min，收集洗脱液。

(6)将样品透析到含有4M脲，10mM MES，PH6.0的透析缓冲液中，准备进行离子交换层析。

3.阳离子交换层析

(1)取10ml SP Sepharose TM FF填料，用10倍柱床体积的Binding Buffer(4M脲，10mM MES，pH＝6.0)清洗平衡柱子，流速5mL/min。

(2)样品上柱，流速为3mL/min，收集穿透液。

(3)用10倍柱床体积的Wash Buffer(4M脲，10mM MES，50/100mM NaCl，pH＝6.0)清洗柱子，流速2mL/min。

(4)Eultion Buffer(4M脲，10mM MES，250/500mM NaCl，pH＝6.0)洗脱,流速1mL/min，收集洗脱液。

(5)将高纯度的洗脱液组分透析到透析液中(25mM Tris，150mM NaCl，0.2％SKLpH＝8.0)，SDS-PAGE电泳检测。

4.蛋白浓度测定

将纯化的重组IgM蛋白进行SDS-PAGE，染色、脱色后灰度扫描分析纯化产物。

以牛血清白蛋白(BSA)作为标准品，用SK3071非干扰型蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，结果如表1所示。以含不同量标准蛋白(0，8，16，24、40和50L)吸收值的平均值为纵坐标，对应的BSA蛋白量为横坐标，绘制BSA标准曲线(图1所示)。根据标准曲线和待定量的蛋白质样品溶液的480nm吸收值的平均值，计算出所对应的稀释蛋白质样品溶液的浓度，进而得出纯化蛋白质样品溶液的原始浓度为0.41mg/mL。

表1 不同稀释度蛋白OD值

测试1	测试2	平均值	BSAμg/μL
				0.934	0.949	0.9415	0
0.882	0.886	0.884	8
				0.829	0.835	0.832	16
0.773	0.781	0.777	24
				0.675	0.676	0.6755	40
0.637	0.636	0.6365	50
				A14031		0.856	0.419445333

实施例2 杂交瘤细胞系的构建

1材料

1.1抗原、细胞株、动物

抗原：实施例1制备的IgM重组蛋白；

小鼠骨髓瘤细胞(Sp2/0)细胞：由中国农业科学院兰州兽医研究所保存；

BALB/c小鼠：由中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物厂提供。

1.2主要试剂

RPMI1640培养液、胎牛血清(FBS)购自GIBCO公司；8-氮鸟嘌呤、HT、HAT、PEG、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂和封闭液(Blocking buffer)均购自Sigma公司；96孔细胞板和酶标板均购自Costar公司；辣根过氧化物酶标记驴抗鼠IgG购自武汉三鹰生物技术有限公司；酶标底物TMB购自promega公司；吐温-20购自Solarbio公司；细胞冻存管购自CORNING公司；其它试剂均为国产分析纯。

1.3溶液及培养基

50％PEG2 000溶液：称取10g PEG2 000，10磅高压25min，冷却至50～60℃，加10mL不完全培养基RPMI-1640，混匀，调pH至7.0～7.4，分装于高压过的2mL eppendorf管，每管1mL，4℃保存备用。

A贮存液(氨基蝶呤液)：称取3.5mg Aminopterin，加高压过的三蒸水180mL，轻轻震荡至完全溶解，最后加水至200mL，0.22μm滤器过滤，分装于高压过的2mL eppendorf管，每管1mL，-20℃保存备用。

次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷(HT)贮存液(100×，H：10-4mol/L；T：1.6×10-3mol/L)：称取0.054g Hypoxanthine，0.016g Aminopterin，加高压过的三蒸水40mL，待溶解后0.22μm滤器过滤，分装于高压过的2mL eppendorf管，每管1mL，-20℃保存备用。

8-氮鸟嘌呤贮存液：称取20mg 8-氮鸟嘌呤，加10mL水和约30μL氨水，待溶解后，0.22μm滤器过滤，分装于高压过的2mL eppendorf管，每管1mL，-20℃保存备用。

HAT选择培养液：78％RPMI-1640培养液，l％A储存液，l％HT储存液，20％胎牛血清，混合均匀，4℃保存备用。

HT培养液：79％RPMI-1640培养液，l％HT储存液，20％胎牛血清，混合均匀，4℃保存备用。

细胞冻存液：70％RPMI-1640培养液，20％小牛血清，10％二甲亚砜(DMSO)，4℃保存，混合均匀，4℃保存备用。

包被液(0.05mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，pH9.6)：NaHCO3 2.9g，Na₂CO₃1.5g，加双蒸水定容至1 000m1，调pH至9.6，4℃保存备用。

PBS：Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g、KCl 0.2g、KH₂PO₄ 0.2g、NaCl 8g，溶解于950ml去离子水中，用NaOH调pH值至7.2后用容量瓶定量至1000ml

PBST溶液：在PBS溶液中加入再加0.05％Tween-20，摇匀即可使用。

酶标封闭液(1×Blocking buffer)：90mL灭菌去离子水中加入10mL 10×Blocking buffer，混匀后保存于4℃备用。

酶标终止液(2mol/L H₂SO₄溶液)：双蒸水89mL，浓硫酸11mL，将硫酸缓慢滴加至双蒸水中并不断搅拌。

7.5％碳酸氢钠溶液：称取7.5g碳酸氢钠粉末，加入90mL蒸馏水充分溶解，再定容至100mL，用0.22μm滤器过滤除菌，分装至高压灭菌的2mL离心管内，用封口膜封口保存于4℃备用。

20 000U/mL双抗储备溶液：在购买的80万单位青霉素瓶中加入高压过的三蒸水4mL，100万单位链霉素瓶中加入高压过的三蒸水5mL，轻轻摇晃直至瓶内粉末完全溶解，分别取4mL加入32mL高压过的三蒸水中，用0.22μm滤器过滤除菌，分装至高压灭菌的2mL离心管内，用封口膜封口后保存于-20℃备用。

2实验方法

2.1动物免疫及小鼠效价测定

2.1.1动物免疫

采用常规免疫方法对8—10周龄BALB/c小鼠进行免疫。初次免疫是用抗原与弗氏完全佐剂等体积混合，充分搅拌混匀，采用背部多点注射免疫(100μg/只)；后期免疫均用抗原与弗氏不完全佐剂等体积混合，充分搅拌混匀，每隔两周免疫一次；待小鼠效价达到融合要求，在准备细胞融合前3天将小鼠腹腔再冲击免疫一次(50μg/只)。

2.1.2小鼠效价测定

使用纯化的IgM重组蛋白和间接ELISA方法检测免疫小鼠血清的抗体效价，选取免疫效价检测值最高的小鼠追加免疫一次，三天后取该鼠的脾脏进行细胞融合。

2.2杂交瘤细胞株的建立

2.2.1骨髓瘤细胞(Sp2/0)的准备

于融合前两周复苏Sp2/0，置于5％CO₂、37℃恒温培养箱中传代培养。培养过程在培养液中加入8-氮鸟嘌吟，连续处理3次，使Sp2/0细胞对HAT培养液更加敏感。融合前一天传代一次，使融合当天的骨髓瘤细胞处于对数生长期。

2.2.2饲养细胞的准备

细胞融合当天，取8～10周龄健康BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，调整细胞浓度至l～5×10⁵个/mL，按100μL/孔转入到96孔细胞培养板中。

2.2.3脾细胞的准备

取三天前加强免疫的小鼠，无菌摘取脾脏，收集脾细胞悬液，脾细胞计数后备用。

2.2.4细胞的融合

将Sp2/0细胞和免疫小鼠脾细胞悬液混匀，使用聚乙二醇融合细胞，然后转入96孔细胞培养板中，置于5％CO₂、37℃恒温培养箱中培养。

2.2.5杂交瘤细胞的筛选

融合后注意观察杂交瘤细胞生长状况，待细胞长到孔底的1/4～1/3时吸出上清进行间接ELISA检测。以P/N≥2.5作为阳性判断标准，用未免疫小鼠血清作阴性对照，用抗体稀释液做空白对照。对检测为阳性的细胞进行扩大培养，同时进行克隆化培养。

2.2.6杂交瘤细胞的克隆化培养

克隆化培养采用有限稀释法，待细胞长到孔底的l/4～1/3时，对细胞上清进行间接ELISA检测。选择克隆数少、OD_450nm值高的阳性孔，将其再次克隆。经3～4次克隆化操作，直至所有克隆化细胞孔检测阳性率达100％时，即可确定获得分泌特异性单抗的杂交瘤细胞株，及时扩大培养并冻存。

3实验结果

3.1免疫BALB/c小鼠抗体效价检测

第五次免疫后一周左右，应用间接ELISA方法对免疫小鼠进行抗体效价的检测，结果显示1#小鼠血清效价最高，大约为1︰256K，可以满足细胞融合的要求(见表2)，因此取1#小鼠进行冲击免疫，并于三天后进行细胞融合。

表2 用于细胞融合的免疫BALB/c小鼠血清效价

3.2单克隆细胞株的筛选及杂交瘤细胞株的建立

免疫的BALB/c小鼠脾细胞和Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞融合后，取细胞上清经间接ELISA方法测定OD_450nm值，选中其中阳性值最高的3株经亚克隆筛选，共获得3株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为2D11、3E4和5D1。

3.3单克隆细胞上清效价检测

将杂交瘤细胞培养上清进行系列稀释，然后用间接ELISA法测定OD_450nm值；同时设立阳性、阴性血清对照。以P/N比值≥2.5时单克隆抗体的最大稀释度即为其抗体效价，3株阳性杂交瘤细胞的上清效价见表3。

表3 单克隆抗体杂交瘤细胞上清效价

3.4细胞冻存

将获得的3株阳性杂交瘤细胞株转至细胞瓶中扩大培养，待细胞形态良好、生长旺盛时吹打混匀细胞，1 000r/min离心10min收集细胞，用1mL细胞冻存液将细胞悬起，加入到细胞冻存管中，同时做好标记，将冻存管先放置于4℃30min，然后移至-20℃冷冻30min，再移至-70℃低温冰箱中过夜，最后投入液氮容器中，并做好记录。

实施例3 单克隆抗体的制备

1材料

1.1细胞株、动物

细胞株：实施例2制备的杂交瘤细胞株2D11、3E4和5D1；

BALB/c小鼠：由中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物厂提供。

1.2主要试剂

RPMI1640培养液、胎牛血清(FBS)购自GIBCO公司；封闭液(Blocking buffer)均购自Sigma公司；96孔酶标板购自Costar公司；辣根过氧化物酶标记驴抗鼠IgG购自武汉三鹰生物技术有限公司；酶标底物TMB购自promega公司；吐温-20购自Solarbio公司；其它试剂均为国产分析纯。

1.3溶液及培养基

包被液(0.05mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，pH9.6)：NaHCO3 2.9g，Na₂CO₃ 1.5g，加双蒸水定容至1 000m1，调pH至9.6，4℃保存备用。

PBS：Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g、KCl 0.2g、KH₂PO₄ 0.2g、NaCl 8g，溶解于950ml去离子水中，用NaOH调pH值至7.2后用容量瓶定量至1000ml

PBST溶液：在PBS溶液中加入再加0.05％Tween-20，摇匀即可使用。

酶标封闭液(1×Blocking buffer)：90mL灭菌去离子水中加入10mL 10×Blocking buffer，混匀后保存于4℃备用。

酶标终止液(2mol/L H₂SO₄溶液)：双蒸水89mL，浓硫酸11mL，将硫酸缓慢滴加至双蒸水中并不断搅拌。

7.5％碳酸氢钠溶液：称取7.5g碳酸氢钠粉末，加入90mL蒸馏水充分溶解，再定容至100mL，用0.22μm滤器过滤除菌，分装至高压灭菌的2mL离心管内，用封口膜封口保存于4℃备用。

20 000U/mL双抗储备溶液：在购买的80万单位青霉素瓶中加入高压过的三蒸水4mL，100万单位链霉素瓶中加入高压过的三蒸水5mL，轻轻摇晃直至瓶内粉末完全溶解，分别取4mL加入32mL高压过的三蒸水中，用0.22μm滤器过滤除菌，分装至高压灭菌的2mL离心管内，用封口膜封口后保存于-20℃备用。

2实验方法

2.1单克隆抗体的制备

给每只8-10周龄雌性BALB/c小鼠腹腔注射0.2mL液体石蜡。在此期间，对阳性单克隆杂交瘤细胞株进行扩大培养。一周后，将扩大培养的细胞从细胞瓶中吹下，用高压过的PBS重悬，洗涤两次遍，1000r/min离心10min，苔盼兰染色计数，将细胞密度调至1～2×10⁶个/mL，每只小鼠腹腔注射0.5mL细胞悬液。接种细胞后每天观察小鼠腹部，待小鼠腹部明显膨大，行动困难时，将小鼠颈椎脱臼处死，用无菌注射器从小鼠腹部吸出暗红色的液体，3000r/min离心20min，取清亮的上清分装、标记，-20℃保存备用。

2.2单克隆抗体特性的鉴定

2.2.1抗体亚类的测定

吸取杂交瘤细胞培养液上清200μL，用Isostrip Mouse Monoclonal AntibodyIsotyping Kit抗体亚类试剂盒对单抗进行亚型鉴定。

取杂交瘤细胞上清20μL，加入pH7.2的PBS 180μL做1:10稀释；取该稀释液150μL加入含有兰色粉末的实验管中，轻轻震荡混匀，至兰色粉末完全融化；将Isotrip胶体金试纸条插入管底，5～10min内观察结果。

2.2.2腹水效价的测定

为测定腹水中抗IgM单克隆抗体效价，用纯化的IgM重组蛋白作为包被抗原，将小鼠腹水作2倍梯度稀释，从1:1000～1:256000倍，用间接ELISA方法检测腹水效价。同时用SP2/0细胞上清、正常小鼠腹水作阴性对照，用抗体稀释液做空白对照，以重组蛋白免疫小鼠血清做阳性对照，具体判定标准为：P/N>2.0时的腹水最大稀释倍数为腹水的ELISA效价。

2.2.3单克隆抗体对热稳定性试验

取粗纯的腹水用灭菌的PBS 1:1 000稀释，置56℃水浴中4h、8h、12h、24h、36h和48h，然后用间接ELISA检测其OD450值的变化，根据试验数据绘制稳定性变化曲线。

2.2.4单克隆抗体对酸碱稳定性试验

酸稳定性试验：将腹水用pH2.2的盐酸溶液1:10倍稀释，于4℃保存4h、8h、12h、24h、36h和48h，再用pH7.2的PBS稀释到1:1000，ELISA检测其OD450值变化，根据试验数据绘制稳定性变化曲线。

碱稳定性试验：用包被液(pH9.6的碳酸盐缓冲液)按上述方法进行碱稳定性试验。

2.2.5单克隆抗体识别抗原表位的测定

用间接ELISA相加法检测3株单克隆抗体的抗原表位。用纯化的IgM重组蛋白包被酶标板，先用间接ELISA法测定腹水中McAb与包被抗原反应达到饱和时的稀释度。然后进行间接ELISA相加实验，用上述浓度的抗原包被酶标板，先在酶标板上横向加入3株单抗腹水，反应1h后，再纵向依次加入上述腹水，反应1h后显色测定OD450nm值。按照如下公式分别计算2株单抗叠加后的AI值：AI＝(A₁₊₂-A₁)/A₂×100％，其中A1+2表示2株单抗叠加后的OD450nm值，A1表示表示第1株单抗的OD450nm值，A2表示第2株单抗的OD450nm值；每组重复试验3次，取其平均值。当AI＞10％即可认为两种单克隆抗体识别不同的抗原表位；若AI≤10％，表明这2株单抗所识别的抗原位点相近或相同。

2.3本发明中保藏杂交瘤细胞株的确定

根据实验结果，确定分泌抗羊IgMμ链单克隆抗体的杂交瘤细胞保藏株，并将该细胞株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

3实验结果

3.1单抗的亚型鉴定

经Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit检测后，2D11、3E4和5D1单克隆抗体亚型均为IgG1，轻链类型为κ(见图2)。

3.2腹水效价的测定

将3株杂交瘤细胞株的腹水梯度稀释后用间接ELISA检测方法测定效价，从表4可知：2D11株单抗的腹水效价为3.2×10⁴，3E4株单抗的腹水效价为6.4×10⁴，5D1株单抗的腹水效价为2.56×10⁵。

表4 单克隆抗体杂交瘤细胞腹水抗体效价

制备腹水的抗体的效价≥32K，满足检测要求。

3.3单抗腹水稳定性试验

(1)单抗腹水热稳定性实验

3株杂交瘤细胞株的腹水经热稳定性试验结果见表5，根据试验数据绘制其效价热消减曲线，见图3。

表5 单克隆抗体热稳定性试验结果

*阳性对照均为未处理的腹水(1:1000)

(2)单抗腹水酸稳定性实验

3株杂交瘤细胞株的腹水经酸稳定性试验结果见表6，根据试验数据分别绘制3株单抗效价酸消减曲线，见图4。

表6 单克隆抗体酸稳定性试验结果

*阳性对照均为未处理的腹水(1:1000)

(3)单抗腹水碱稳定性实验

3株杂交瘤细胞株的腹水经碱稳定性试验结果见表7，根据试验数据分别绘制3株单抗效价碱消减曲线，见图5。

表7 单克隆抗体碱稳定性试验结果

*阳性对照均为未处理的腹水(1:1000)

由单抗腹水稳定性试验结果确定，3株细胞制备的腹水抗体耐热、耐酸、耐碱，稳定性好，可用于诊断。

3.4单抗识别抗原表位分析

经测定腹水中的McAb与包被抗原反应的饱和浓度。根据McAb饱和浓度用间接ELISA法相加实验进行3株单抗识别抗原表位分析，检测结果见表8、图6、表9。根据表中数据计算：AI＝(A₁₊₂-A₁)/A₂×100％。式中：A₁为McAb1的OD₄₅₀值；A₂为McAb2的OD₄₅₀值；A₁₊₂为McAb1叠加McAb2的OD₄₅₀值。AI≤10％表明两株单抗针对的抗原位点相近或相同，AI＞10％表明两株针对的抗原位点不同点，AI值越大，抗原位点重叠的可能性越小。计算结果显示，3株单克隆抗体所识别的抗原表位均相同，AI值均小于10％，其中2D11株识别的抗原表位包含于3E4株的识别表位中。

表8 单抗腹水饱和度实验

表9 抗原表位分析检测结果

3.5本发明中保藏杂交瘤细胞株的确定

根据以上实验结果，确定5D1为本发明所述的能够稳定分泌抗羊源IgMμ链单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并将该细胞株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.11283。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一株能够稳定分泌抗羊型IgMμ链单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为5D1，其特征在于所述的杂交瘤细胞株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为:CGMCC No.11283。

2.一种由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。

3.权利要求1所述的杂交瘤细胞株在制备检测羊IgM免疫球蛋白试剂中的应用。

4.权利要求2所述的单克隆抗体在制备检测羊IgM免疫球蛋白试剂中的应用。

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