CN107167538A - 一种检测蛋白质性质的方法 - Google Patents

一种检测蛋白质性质的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107167538A
CN107167538A CN201710492392.1A CN201710492392A CN107167538A CN 107167538 A CN107167538 A CN 107167538A CN 201710492392 A CN201710492392 A CN 201710492392A CN 107167538 A CN107167538 A CN 107167538A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cief
protein
rplc
cathode cell
mobile phase
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201710492392.1A
Other languages
English (en)
Inventor
戚良
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Happy Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Shanghai Happy Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Happy Biotechnology Co Ltd filed Critical Shanghai Happy Biotechnology Co Ltd
Priority to CN201710492392.1A priority Critical patent/CN107167538A/zh
Publication of CN107167538A publication Critical patent/CN107167538A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)

Abstract

本发明提供一种检测蛋白质性质的方法，包括：提供基于膜的微透析阴极电池，阴极电池围绕三通建立；CIEF毛细管填充两性电解质溶液，将蛋白质待测样品从阳极侧通过压力注入，聚焦后，施加压力给CIEF毛细管的阳极端，通过位于阴极电池上游的UV吸收检测器的液体动力将样品推动至聚焦带；两性电解质溶液、蛋白质待测样品由CIEF注入RPLC，蛋白质从RPLC洗脱；洗脱后的蛋白质用质谱仪进行分析。本发明在CIEF和MS之间插入额外的分离步骤——反相液相层析(RPLC)。RPLC很容易与ESI‑MS结合，并提供去除两性电解质的机会，进一步分离被CIEF部分分离的蛋白质。

Description

一种检测蛋白质性质的方法
技术领域
本发明涉及一种蛋白质检测方法，尤其涉及一种通过毛细管等电聚焦、反相液相层析法和质谱分析法分析蛋白质的性质的方法。
背景技术
高通量DNA测序引起基因组数据库迅速膨胀。基因组是相对静态的，而相应的蛋白质组却是动态的：蛋白表达水平可以迅速改变，与mRNA水平不相关。个别蛋白质并不是按DNA序列预测的方式进行改变和处理。识别这些变化非常重要，因为它们定义和控制细胞加工过程；在蛋白质样品中，通常大多数蛋白质的物理化学性质差别非常大，包括分子量(MW)、等电点(P7)、溶解度、酸度/碱度和疏水性/亲水性。此外，蛋白浓度可以跨越6个以上数量级，而且一般蛋白质越不丰富，在系统生物学中越受到关注。
二维凝胶电泳分离(2D-PAGE)是蛋白质组学研究的核心技术。作为一种多维分离方法，2D-PAGE一次可以处理1000多个蛋白质。但两个主要缺点—灵敏度和生产量—最终限制了它在蛋白质组学研究中的使用。2D-PAGE通常使用考马斯蓝或银染色来显示凝胶中分离的蛋白质。在这些方法中，银染色更敏感，检测0.1-10ng量的蛋白质，对应20-200fmol的50-kDa蛋白质。2D-PAGE的动态范围至多为104，使得很难研究低丰度蛋白。生产量受到阻碍，因为凝胶制备至蛋白质分离和分析的整个过程的都非常缓慢，难以完全自动化。从原则上来讲，多维基于液体的分离可以解决这些问题。基于液体的方法促进了质谱(MS)与蛋白质表征的直接结合。如果分离模式与2D-PAGE类似，那么2D-PAGE数据建立的全面而强大的数据库就能得到有效利用。
用毛细管等电聚焦(CIEF)与MS结合的方法来解决这个问题非常有前景。CIEF提供基于pi的高分辨率分离，而MS提供高精度和准确度的质量测量。从CIEF-MS数据中获得的pi与MW显示，其生产量和灵敏度高于2D-PAGE。
但是，仍然存在很多实质性问题。最重要的是CIEF需要两性电解质，与分析物共洗脱，以抑制分析物信号强度和降低质量分辨率的方式扰乱电喷雾电离(ESI)过程。此外，单单CIEF的分辨率不足以完成复杂样品的分离。当多个蛋白质共洗脱至一个ESI源时，其中一些可能会由于其他蛋白质的存在而受到额外的信号抑制，这就增加了检测限制和动态范围。最后，很难添加试剂来增强疏水性蛋白质的溶解度，因为它们与两性电解质一样，会降低ESI的性能。
发明内容
本发明提供一种检测蛋白质性质的方法，在CIEF和MS之间插入额外的分离步骤——反相液相层析(RPLC)。RPLC很容易与ESI-MS结合，并提供去除两性电解质的机会，进一步分离被CIEF部分分离的蛋白质。
本发明提供的检测蛋白质性质的方法，包括：
提供基于膜的微透析阴极电池，阴极电池围绕三通建立，其中：一个共线端口连接至CIEF毛细管；反向共线端口连接至熔融石英毛细管，通向废料瓶；垂直端口连接至阴极小瓶，阴极小瓶包括管以及连接所述管两端的的两个异径接头，第一个异径接头连接至三通，将微透析膜插入垂直端口；另一个异径接头与所述管之间安装有阴极；
CIEF毛细管填充两性电解质溶液，将蛋白质待测样品从阳极侧通过压力注入，聚焦后，施加压力给CIEF毛细管的阳极端，通过位于阴极电池上游的UV吸收检测器的液体动力将样品推动至聚焦带；
两性电解质溶液、蛋白质待测样品由CIEF注入RPLC，蛋白质从RPLC洗脱；洗脱后的蛋白质用质谱仪进行分析。
在一种优选实施例中，阳极电解液为H3PO4水溶液，阴极电解液为NaOH水溶液。并且更优选地，阳极电解液为91mM H3PO4水溶液，阴极电解液为20mM NaOH水溶液。
在一种优选实施例中，洗脱剂为水、乙腈和乙酸混合溶液。
在一种优选实施例中，洗脱剂包括流动相A和流动相B，按照重量含量，流动相A为94.9％H2O、5％乙腈和0.1％乙酸，流动相B为94.9％乙腈、5％H2O，和0.1％的乙酸。
在一种优选实施例中，RPLC洗脱过程中，洗脱剂进行梯度洗脱。在一种更优选实施例中，所述梯度洗脱过程包括：
过程A：流动相B体积为25％-60％；
过程B：流动相B体积为60％-90％。
在一种优选实施例中，洗脱之前先将RPLC中的两性电解质进行清洗去除。
其中，清洗去除两性电解质的方法为用洗涤剂清洗。其中，所述洗涤剂优选为94.9％H2O、5％乙腈和0.1％乙酸。
在一种优选实施例中，所述质谱检测过程中，ESI电压为2.5kV。
在一种优选实施例中，所述微透析膜截留分子量为3500Da。
在一种优选实施例中，所述微透析膜由不锈钢过滤器支撑。
在一种优选实施例中，所述阴极优选为铂丝作为阴极电极。
在本发明上下文以及权利要求书内容中，蛋白质的含义也包括肽。
在一种优选实施例中，还包括注入环，在阳极端施加压力将聚焦带推入注入环，去除压力后停留在毛细管中的分析物不会移动，收集的组分转移至保护柱并清洗后在阳极端注入环重新施加压力收集新的组分
本发明提供了一种蛋白质分离和鉴定的CIEF-RPLC-MS系统，微透析膜将阴极电池从分离毛细管中分离出来。在聚焦步骤中，阴极电解液能够穿过该膜，而蛋白质分子却不能。聚焦后，蛋白质被液体动力推动穿过膜至微型选择阀，该阀可以收集和转移组分至RPLC，用于进一步分离。这样安排保证了分离毛细管中具有一个线性pH梯度，微型选择阀中无电压。阴极电池和微型选择阀可以很容易、安全地放入商用仪器。用高灵敏度和分辨率的仪器可以在2个小时内分离和分析蛋白混合物。
具体实施方式
基于膜的微透析阴极电池
阴极电池围绕PEEK三通建立。一个共线端口连接至55cm长的CIEF毛细管。反向共线端口连接至20cm长的熔融石英毛细管，通向废料瓶。垂直端口连接至阴极小瓶。
阴极小瓶由两个异径接头和一个5cm长的DAYCO聚乙烯管构成。第一个异径接头通过3cm长的PEEK管道连接聚乙烯管道至PEEK三通，PEEK管道连接至垂直端口。将内径切割为1/16英寸的微透析膜(截留分子量3500)插入垂直端口，并由0.5-WM不锈钢过滤器支撑。第二个异径接头通过另一根3cm长的PEEK管道连接聚乙烯管道的另一端，该PEEK管道包含6cm的铂丝作为阴极电极。该阴极“小瓶”脱气后填充约1.5ml的阴极电解液。
带基于膜的微透析阴极电池的CIEF
CIEF与基于膜的微透析阴极电池共同作用，该电池安装在商业自动化毛细管电泳系统内(带UV检测器)。该CIEF毛细管填充两性电解质溶液。
将蛋白质/肽测试混合物(待测样品)从阳极侧通过压力注入，时间为2分钟。聚焦在300V/cm的电场内进行；阳极电解液为91mM H3PO4，阴极电解液(密封在阴极电池中)为20mM NaOH。阴极电池中的铂丝连接至仪器的负电极，并设置为0V。聚焦4分钟后，将0.8psi的压力施加至毛细管的阳极端，通过位于阴极电池上游10cm处的UV吸收检测器的液体动力推动至聚焦带。在液体动力推动过程中，毛细管内保持300V/cm的电场。在280nm处监控吸收情况。将UV检测器定位至阴极电池下游10cm处，研究阴极电池的样品损失。每个检测器位置的毛细管长度和尺寸都相同。
CIEF-RPLC-MS
将基于膜的阴极电池组件连接到一个六端口的电子控制微型选择阀，该阀门带5cm长的熔融石英毛细管。两性电解质溶液和蛋白质/肽测试混合物均根据以由CIEF注入并分离。
然后将聚焦带通过水动力穿过阴极电池推动至1uL的不锈钢注入环，该环附于微型选择阀。之后切换阀门位置，将蛋白循环组分转移至C18反相保护柱，该反相保护柱附于商用毛细管LC系统的第二个六端口阀门上。组分蛋白从反相保护柱洗脱，并通过RPLC分离。同时，另一部分收集在1uL的循环中，且序列重复。在整个期间，将300V/cm的电场施加至CIEF毛细管，以保持等电聚焦。在实验过程中，CIEF毛细管的阳极端出现电渗流的情况。该电渗流通过将废液瓶放置在CIEF毛细管阳极端10cm以上来抵消液体动力。
通过注射环取样的蛋白组分装载在保护柱上，并用94.9％H2O、5％乙腈和0.1％乙酸溶液洗涤，流速为20uL/min，清洗3分钟。在此期间大部分两性电解质被去除。
然后通过流动相从保护柱洗脱蛋白质组分，在C4反相柱进一步分离。流动相A(94.9％H2O，5％乙腈和0.1％乙酸)和流动相B(94.9％乙腈，5％H2O，和0.1％的乙酸)均以20uL/min的流速输送，使用两个梯度(相B为25％-60％)，时间为2分钟(相B为60％-90％)。对于本实施例中的蛋白质/肽，从一个至下一个组分未观察到样品残留，且每种化合物都能在同一组分中运行几百次。
蛋白质用Q-TOF Ultima API-US质谱仪进行质量分析：经RPLC柱洗脱的样品发送到传统的API-ESI源，ESI电压为2.5kV；质谱来自600至2000Da，扫描时间0.5秒，扫描间隔时间0.1秒。
用MaxEnt1处理数据，将多电荷离子的原始光谱转换成单电荷离子的去卷积显示。从CIEF和MS分析分别获得的各蛋白质的pi和MW以类似于2D-PAGE的格式显示。
实验显示：通过基于膜的微透析阴极电池而实现分离的样品包含0.1nmol核糖核酸酶A、肌红蛋白、碳酸酐酶II、β乳球蛋白、胰蛋白酶抑制剂和0.1nmol CCK侧翼肽。
吸收检测器放置在阴极电池的上游，电流分布显示在开始几分钟迅速下降，之后几乎没有变化。长时间观察后发现电流微微上升，这是由于磷酸进入毛细管的液体动力而产生。电流分布几乎与使用商用阴极电池进行的分离相同，这表明氢氧离子在微透析膜中自由移动。pI与基于膜的阴极电池的迁移时间绘图也与商用阴极电池获得的类似。氢氧离子通过扩散和电泳可以在微透析膜中移动，扩散非常缓慢，而阴极电池填充一次可以运行几百次，时间长达一个月以上。
当UV检测器位于电池的上游和下游时，可以通过比较核糖核酸酶A的峰面积研究基于膜的阴极电池的样品损失。检测器的位置并不影响流速，因为每个实验中使用的毛细管长度和直径都相同。当检测器位于电池的下游时，峰分布显著变宽(聚焦无法保持，因为电池下游未施加电场)，在实验误差内两个检测位置之间未观察到峰面积变化(士6％)。
要连续收集和分析pi组分，流体动力流必须循环开启和关闭。在“走”的模式中，在阳极端施加压力将聚焦带推入注入环。在“停”的模式，去除压力，停留在毛细管中的分析物不会移动。收集的组分转移至保护柱并清洗后，微型选择阀切换至原来的配置，在阳极端重新施加压力收集新的组分。当收集新的组分时，装载在保护柱上的组分被RPLC-MS洗脱和分析。
在毛细管的阳极端施加0.9psi的压力。每个停止循环持续10分钟，期间不施加压力。总共有六个循环。在走走停停循环之前，将样品聚焦4分钟，然后用0.9psi的压力推动9分钟，使聚焦带靠近检测器，电流分布以及pi与迁移时间的曲线图均与前述的电流分布相似，进一步说明注入环形成的CIEF分离在走走停停条件下的有效性。
本发明中，CIEF收集的组分均在保护柱上清洗，以去除两性电解质。在两性电解质存在的情况下，未观察到细胞色素c的信号，这表明了MS分析前去除两性电解质的必要性。含有0.1pmol核糖核酸酶A、细胞色素C、肌红蛋白、胰岛素、β乳球蛋白、20pmol碳酸酐酶II和牛血清白蛋白以及1pmol CCK侧翼肽的混合物也由CIEF-RPLC-MS分析。结果显示，蛋白质/肽由CIEF聚焦，然后通过走走停停操作分为七个pi组分。有两个组分包括两种蛋白，一个组分不含有蛋白，其余组分只包含一个蛋白/肽，检测结果与实验样品相符。本发明要收集七个组分的CIEF-RPLC-MS实验要求的总时间为120分钟，但相对于2D-PAGE分离为2个小时，还要加上现场可视化和分析需要的额外时间，本发明具有明显优势。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (10)

1.一种检测蛋白质性质的方法，其特征在于，包括：
提供基于膜的微透析阴极电池，阴极电池围绕三通建立，其中：一个共线端口连接至CIEF毛细管；反向共线端口连接至熔融石英毛细管，通向废料瓶；垂直端口连接至阴极小瓶；
阴极小瓶包括管以及连接所述管两端的两个异径接头，第一个异径接头连接至所述三通，将微透析膜插入垂直端口；另一个异径接头与所述管之间安装有阴极；CIEF毛细管填充两性电解质溶液，将蛋白质待测样品从阳极侧通过压力注入，聚焦后，施加压力给CIEF毛细管的阳极端，通过位于阴极电池上游的UV吸收检测器的液体动力将样品推动至聚焦带；
两性电解质溶液、蛋白质待测样品由CIEF注入RPLC，蛋白质从RPLC洗脱；洗脱后的蛋白质用质谱仪进行分析。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，阳极电解液为H3PO4水溶液，阴极电解液为NaOH水溶液。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，阳极电解液为91mM H3PO4水溶液，阴极电解液为20mM NaOH水溶液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，洗脱剂为水、乙腈和乙酸混合溶液。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，洗脱剂包括流动相A和流动相B，按照重量含量，流动相A为94.9％H2O、5％乙腈和0.1％乙酸，流动相B为94.9％乙腈、5％H2O，和0.1％的乙酸。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，RPLC洗脱过程中，洗脱剂进行梯度洗脱。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱过程包括：
过程A：流动相B体积为25％-60％；
过程B：流动相B体积为60％-90％。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，洗脱之前先将RPLC中的两性电解质进行清洗去除。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述质谱检测过程中，ESI电压为2.5kV。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微透析膜截留分子量为3500Da。
CN201710492392.1A 2017-06-26 2017-06-26 一种检测蛋白质性质的方法 Pending CN107167538A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710492392.1A CN107167538A (zh) 2017-06-26 2017-06-26 一种检测蛋白质性质的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710492392.1A CN107167538A (zh) 2017-06-26 2017-06-26 一种检测蛋白质性质的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107167538A true CN107167538A (zh) 2017-09-15

Family

ID=59826466

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710492392.1A Pending CN107167538A (zh) 2017-06-26 2017-06-26 一种检测蛋白质性质的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107167538A (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1560627A (zh) * 2004-02-26 2005-01-05 复旦大学 基于阵列毛细管等电聚焦的多维色谱-电泳分离与检测系统
CN104630058A (zh) * 2015-02-02 2015-05-20 张凌怡 一种串联多酶蛋白质微酶解反应器及其使用方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1560627A (zh) * 2004-02-26 2005-01-05 复旦大学 基于阵列毛细管等电聚焦的多维色谱-电泳分离与检测系统
CN104630058A (zh) * 2015-02-02 2015-05-20 张凌怡 一种串联多酶蛋白质微酶解反应器及其使用方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FENG ZHOU ET AL: "Intact Protein Profiling of Chlorobium tepidum by Capillary Isoelectric Focusing, Reversed-Phase Liquid Chromatography, and Mass Spectrometry", 《ANALYTICAL CHEMISTRY》 *
FENG ZHOU ET AL: "Protein Characterization by On-Line Capillary Isoelectric Focusing, Reversed-Phase Liquid Chromatography, and Mass Spectrometry", 《ANALYTICAL CHEMISTRY》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Raterink et al. Recent developments in sample-pretreatment techniques for mass spectrometry-based metabolomics
Guzman et al. The use of a concentration step to collect urinary components separated by capillary electrophoresis and further characterization of collected analytes by mass spectrometry
CN106526026B (zh) 血清中25-羟基维生素d的检测方法
CN105510483B (zh) 一种全自动在线检测血清中全氟及多氟化合物的系统
US10753915B2 (en) Methods for analysis of phase-I and phase-II metabolites and parent compounds without hydrolysis
CN110333364B (zh) 一种全自动生物评价和化学分析一体机及方法
US11879880B2 (en) Integrated machines and methods for performing fully-automated biological evaluation and chemical analysis
Montes-Bayon et al. Direct comparison of capillary electrophoresis and capillary liquid chromatography hyphenated to collision-cell inductively coupled plasma mass spectrometry for the investigation of Cd-, Cu-and Zn-containing metalloproteins
CN104977349A (zh) 全自动多肽提取飞行时间质谱检测仪
CN107402269A (zh) 基于scx/sax混合填料的集成化蛋白质组学样品前处理平台及其应用
CN103091430A (zh) 一种液相色谱-气相色谱在线联用接口的溶剂排空方法
JP2017512980A (ja) キャピラリー電気泳動装置
US20160131618A1 (en) Separation and Analysis Systems and Methods
US8298394B2 (en) Non-gel based two-dimensional protein separation multi-channel devices
CN103212217B (zh) 高丰度蛋白质去除的二维常规柱阵列式色谱分离系统及分离方法
Moritz et al. Capillary HPLC: A method for protein isolation and peptide mapping
Chen et al. Construction of discontinuous capillary isoelectric focusing system and its application in pre-fractionation of exosomal proteins
CN110045053A (zh) 一种适用于血液中苯丙胺类药物分析的QuEChERS前处理方法
CN103884807B (zh) 一种18o在线标记的蛋白质定量分析平台及其操作方法
CN107167538A (zh) 一种检测蛋白质性质的方法
CN105334282B (zh) 一种地表水体中环境雌激素的共检测方法
Liu et al. Two‐dimensional LC–MS analysis of components in Swertia franchetiana Smith
CN113341030B (zh) 一种高通量液质联用系统及分离和分析方法
CN103512997B (zh) 一种两维短梯度高效蛋白质组分离鉴定方法
HIRAOKA et al. Capillary-zone electrophoretic analyses of the proteins and amino acid components in cerebrospinal fluid of central nervous system diseases

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20170915