CN1560627A - 基于阵列毛细管等电聚焦的多维色谱-电泳分离与检测系统 - Google Patents

Abstract

本发明是一种基于阵列毛细管等电聚焦的多维色谱、电泳分离与检测系统。本系统采用反相液相色谱与毛细管等电聚焦联用，第一维是毛细管反相色谱，对复杂的蛋白混合物进行高效的分离，分离得到的馏分流入第二维—毛细管等电聚焦阵列进一步得到高效、高通量和快速的分离。与单通道的多维色谱系统相比，阵列的设计更适合于大规模的复杂样品分析，而且能使整个二维系统的峰容量得到进一步的提高。本发明具有高效、快速、灵敏度高和加工简便等优点，在样品浓缩、低丰度蛋白检测方面有很好表现，且CIEF可以和质谱在线连接进行样品鉴定，十分适合作为蛋白组学中高度复杂样品的分离检测。

Description

基于阵列毛细管等电聚焦的多维色谱-电泳分离与检测系统

技术领域

本发明是一种用于复杂蛋白样品的高效快速多维色谱-电泳分离与检测系统。

技术背景

多维色谱/电泳分离是近年来发展起来的新型的蛋白组学研究方法。它将两种分离机理正交的色谱模式组合起来，经过前一维分离，所有组分进入下一维，在前一维未完全分离的样品进一步得到分离。其分辨能力大大高于单维色谱或电泳。

反相液相色谱(RPLC)和毛细管等电聚焦(CIEF)是两种高分辨率的生物样品分离模式，其分离机理正交。RPLC是一种最常用的分离模式，在梯度条件下能承受较高的进样量而不会引起明显的峰展宽，适合作为第一维分离。CIEF能分辨pI值相差0.005pH单位的蛋白，且分离过程中的聚焦效应能使样品浓缩几个数量级，十分适合作为第二维，以便补偿第一维分离时不可避免的样品稀释。LIF(激光诱导荧光)是高灵敏的检测方式，在某些情况下甚至能进行单分子检测，样品中的低浓度组分也能得到有效的检测。

一般来说多维色谱分离的第二维是单通道分离，分析通量较低，分离时间较长。而对于在线系统，为避免组分损失，前一维的每个流出峰必须被下一维至少采样三次，所以下一维的分离速度要足够快才能跟上前一维的流出速度。这样下一维的分辨率由于速度的限制不可能很高，整个多维系统的分辨率也会相应受到影响。

下一维采用阵列的形式是一个很好的解决方法，可以同时分离前一维的馏分，快速且重现性好。阵列的检测一般用单点检测，全柱成像检测(WCID)更适合于CIEF，样品聚焦后在原位得到检测，分离速度、分辨率和重现性都优于单点检测。

发明内容

本发明的目的是设计一种多维色谱-电泳分离与检测系统，将两种或多种高分辨的分离模式结合起来，配合高灵敏的检测器和高通量的毛细管阵列，以实现对高度复杂的生物样品进行高效、快速和灵敏的分离鉴定。

本发明提出的多维色谱-电泳分离与检测系统，由RPLC、CIEF和WCID-LIF阵列检测器组成，其结构如图1所示。其中，RPLC为第一维分离，CIEF采用阵列形式，作为第二维分离；WCID-LIF阵列探测器由激光器、激光化线器、平移台、CCD相机、滤光片等部件组成。毛细管阵列中央4～8cm长度的毛细管除去聚酰亚胺涂层作为检测窗，检测窗的两端(用快干胶)固定在绝缘材料基片上，基片固定在平移台上。基片上刻有2个凹槽(快干胶就涂在凹槽的四周)。每根毛细管在凹槽处均折断，折断处覆盖导电薄膜(如多孔聚合物薄膜)，能使小分子或离子通过而导电，当向毛细管中导入样品时，样品又不会从薄膜处漏出。这两个凹槽就作为加电解液和高压的电连接处。激光束通过激光化线器成为一条能量均衡的直线以一定的倾角垂直照射在检测窗。电泳聚焦结束后，激光线扫过阵列的检测窗。

本发明中，在RPLC前还可加上其它机理正交的色谱模式(如离子交换)即成为三维系统。CIEF也可方便地与质谱在线连接。

检测系统WCID-LIF是快速、高灵敏的阵列检测器。使用本系统时，样品首先进入RPLC进行初步分离，根据梯度时间和分离情况决定截取馏分的数目，RPLC的馏分加上两性电解质以在线或离线的方式进入毛细管阵列进行第二维分离，样品在阵列中进行10分钟左右聚焦，由于毛细管阵列的内壁涂层消除了电渗流，样品组分聚焦在其pI点处，基本不发生位移。

电泳聚焦结束以后，平移台以一定速度移动，使激光线扫过阵列的检测窗，检测窗中的蛋白区带在激光的激发下发出荧光，CCD收集阵列中的荧光信号，得到全柱成像的二维分离图，各荧光信号点的强弱与各组分量成正比。

本发明的多维分离检测系统，其分离模式的组合及检测方法均不同于其他多维色谱-电泳。在设计上采用以下几个独创之处：

1、CIEF阵列的采用：在第二维使用毛细管阵列，不仅提高了分离通量，而且使得第二维的分离时间不再受前一维的限制，能够更大限度地发挥CIEF的高分辨率。

2、扫描式全柱成像检测：CIEF的全柱成像检测技术其分辨率和重现性均优于单点检测。以往的WCID主要用于单根毛细管，本设计中对毛细管阵列也同样实现了全柱成像检测，激光线首先照射每根毛细管的一个点，而后扫过毛细管的检测区域。激光的强度优于其他光源，因而灵敏度也高，采用扫描的方法即可激发整个阵列中的荧光样品。

3、激光化线器的使用：化线器能使激光束化为能量均衡的激光线，而传统的圆柱形透镜将激光束变成能量高斯分布的直线。

4、多孔聚合物薄膜的电连接：CIEF的进样方式不同于其他电泳模式，一般不采用电迁移或重力进样，而是使全柱充满样品。在本设计中CIEF阵列的检测采用全柱成像，检测长度一般是几个厘米，且外壁涂层已除去，这种情况下进样比较困难。本系统采用较长的毛细管以便于进样，而在毛细管的中间制作两个电连接便于聚焦和检测，这样样品组分基本不会损失。

综上所述，本发明获得了以下优良效果：

1.CIEF的聚焦效果对样品中的低浓度成分也能有效检出。

2.毛细管阵列CIEF，分析时间大大缩短，重现性提高。

3.扫描式全柱成像检测，进一步提高了CIEF的分辨率和重现性

4.分离区域(加高压区域)两端的电连接既方便了样品的导入，又不损失样品组分。

5.能量均衡的激光线更适合于毛细管阵列检测，尤其是在需要定量的时候。

附图说明

图1是本发明的RPLC/CIEF阵列/WCID-LIF多维分离检测系统示意图。

图2是绝缘材料基片的凹槽处的剖面图。

图中标号：1是RPLC泵，2是CIEF在线或离线的进样处，3是激光化线器，4是CCD相机，5是电动平移台，6是激光束，7是两性电解质，8是凹槽，9是检测窗，10是毛细管阵列，11是滤光片，12是激光线，13是快干胶，14是电解液，15是塑料基片，16是导电薄膜，17是盛放电解液的围栏，18是毛细管实现电连接的折断处。

具体实施方式

1、RPLC一般采用250μm的毛细管，流速2μl/min。根据样品情况和梯度时间决定截取馏分的数目和间隔。

2、数十根(一般为40-100根)长为20.0cm、内径75μm的石英毛细管在中央部位除去4～8cm(例如6cm)外壁涂层作为检测窗，在检测窗的两端各刻上划痕，但不折断。用快干胶将毛细管固定于绝缘材料基片的两个凹槽处，快干胶涂于凹槽四周。再于凹槽上固定一个塑料围栏和铂丝，以便于盛放电解液和加高压。

3、毛细管固定好以后，在每个划痕处轻轻折断，折断处覆盖一层多孔聚合物薄膜(如醋酸纤维素膜)。

4、RPLC的馏分与两性电解质混合后，由毛细管的端口导入，进样后，加上500V/cm的电泳电压，阴极电解液是20mM的NaOH，阳极电解液是80mM的H₃PO₄。电泳聚焦时间是10分钟

5、打开激光器，调整激光化线器的位置和角度，使所产生的激光线的长度和位置符合实验要求。

6、聚焦结束后，打开电动平移台，使激光线从6cm检测窗的一端扫向另一端，CCD在扫描时间内收集荧光信号。

Claims (3)

1、一种多维色谱-电泳分离和检测系统，其特征在于由反相液相色谱、毛细管等电聚焦和全柱成像激光诱导荧光阵列检测器组成，其中，反相液相色谱为第一维分离，毛细管等电聚焦采用阵列形式，作为第二维分离；全柱成像-激光诱导荧光阵列检测器由激光器、激光线化器、平移台、CCD相机、滤光片组成；毛细管阵列中央有4-8cm长度的毛细管除去聚酰亚胺涂层作为检测窗，检测窗两端固定在绝缘材料基片上，该基片固定于平移台上；基片上刻有两个凹槽，每根毛细管在凹槽处折断，在该折断处覆盖有导电薄膜；两个凹槽作为加电解液和高压的电连接处。

2、根据权利要求1所述的多维色谱-电泳分离和检测系统，其特征是反相液相色谱前再加其他机理正交的色谱模式，成为三维系统。

3、根据权利要求1所述的多维色谱-电泳分离和检测系统，其特征是激光束通过激光化线器成为一条直线，以一定倾角垂直照射于毛细管阵列。