CN107164512B - 一种基于单核苷酸多态性的葡萄球菌种水平鉴定和菌株分型一体化方法 - Google Patents
一种基于单核苷酸多态性的葡萄球菌种水平鉴定和菌株分型一体化方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种葡萄球菌种水平鉴定和菌株分型一体化的方法，以及用于鉴定和分型的靶基因和引物组合物，该方法具体包括待检菌株DNA提取、靶基因PCR扩增、核酸测序、序列比对和聚类分析等步骤。基于该方法，建立常见葡萄球菌靶基因序列数据库，将待检菌株靶基因序列与数据库标准序列进行比对和聚类分析，对葡萄球菌进行种水平鉴定和菌株分型。本发明所述的葡萄球菌种水平鉴定和菌株分型一体化方法，具有通用性高、鉴定准确和分辩力强等优点，且操作简单、快速有效，为葡萄球菌鉴定分型一体检测提供了新的技术平台，可用于药品质量监管单位、药品生产企业，对葡萄球菌种水平鉴定和菌株分型溯源，具有广阔市场前景和较大的经济、社会效益。
Description
技术领域
本发明涉及药品安全微生物检测技术领域，具体涉及一种用于葡萄球菌种水平鉴定和菌株分型的引物组合物，以及一种葡萄球菌种水平鉴定和菌株分型一体化方法。
背景技术
随着药品生产质量规范和国家药品质量标准的提升，药品生产质量控制中对微生物检验要求和鉴定水平越来越高。新实施的《中国药典》2015年版规定：微生物鉴定水平视情况而定，包括种、属鉴定和菌株分型；无菌试验结果阳性时，对检出微生物鉴定必要时需达到菌株水平；药品微生物实验室在过程控制中应具有通过对污染菌溯源分析，发现污染源的能力。
葡萄球菌属在自然界中分布十分广泛，传统微生物检验方法通常以“凝固酶阳性”作为判定葡萄球菌具有致病性的重要标准，如凝固酶阳性的金黄色葡萄球菌能够引起化脓感染、败血症、肺炎等疾病，是药品微生物检验中重要控制菌。但近些年研究发现，凝固酶阴性葡萄球菌(如表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌和人葡萄球菌等)也是人类疾病重要病原体。环境微生物监测结果表明凝固酶阴性葡萄球菌是污染药品、生产环境和检测实验室环境的主要微生物，占到50％以上。传统微生物检测方法仅关注“凝固酶阳性”葡萄球菌存在较大的安全风险，亟需建立能够准确鉴定多种致病性葡萄球菌的方法。基于16S rRNA序列比对的方法目前被广泛应用于细菌的鉴定，但有研究表明16S rRNA核酸序列在葡萄球菌属中高度保守，对于亲缘关系较近的葡萄球菌种的区分能力差[Species identification ofcoagulase-negative staphylococci:Genotyping is superior to phenotyping_[J].Veterinary Microbiology,2009,134(1–2):20-28]，不能够提供准确的鉴定结果，因此亟需在葡萄球菌属中寻找新的区分能力强的靶基因用于葡萄球菌种水平的鉴定。
此外，《中国药典》2015年版指出药品微生物检验实验室应具有对微生物分型溯源的能力。多位点序列分型方法(Multilocus sequence typing，MLST)是一种基于核酸序列测定的细菌分型方法。这种方法通过PCR扩增多个管家基因内部片段并测定其序列，利用管家基因序列之间的变异来区分不同菌株。MLST方法操作简单，能快速得到菌株分型结果，便于不同实验室进行数据比较分析，已经用于多种细菌的流行病学监测和进化研究。目前已经针对葡萄球菌属中的金黄色葡萄球菌[Multilocus sequence typing forcharacterization of methicillin-resistant and methicillin-susceptible clonesof Staphylococcus aureus[J].J Clin Microbiol 38(3):1008-1015]、表皮葡萄球菌[Improved multilocus sequence typing scheme for Staphylococcus epidermidis[J].J Clin Microbiol 45(2):616-619]、人葡萄球菌[Multilocus sequence typing andfurther genetic characterization of the enigmatic pathogen,Staphylococcushominis[J].PLoS One 8(6):e66496]等建立了相应的MLST方法，但是这些葡萄球菌MLST分型方法所用的靶基因和引物都具有种特异性，并不能用于其它葡萄球菌菌株的分型。另外，MLST方法的应用需建立在菌株鉴定的基础上，极大的降低了工作效率，提高了实验成本。
因此，本领域的技术人员致力于开发一套基于核酸序列差异分析的，能够同时实现多种葡萄球菌种水平鉴定和菌株分型的一体化方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种用于葡萄球菌种水平鉴定和菌株分型的靶基因及其对应的PCR扩增引物，及利用该PCR扩增引物对葡萄球菌种水平鉴定和菌株分型一体化的方法，该方法能够同时实现多种葡萄球菌种水平的鉴定和分型，提高了工作效率，降低了实验成本。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一个目的是提供一种用于葡萄球菌种水平鉴定和菌株分型的靶基因，其为具有单核苷酸多态性特征的葡萄球菌持家基因，其包括femA(Aminoacyltransferase)、ftsZ(Cell division protein)、gap(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)、pyrH(Uridylate kinase)、rpoB(RNA polymerase B)和tufA(Translational elongation factor)。
本发明之所以选择femA、ftsZ、gap、pyrH、rpoB和tufA等6个持家基因作为葡萄球菌种水平鉴定和菌株分型靶标是通过以下方法筛选到的：
从NCBI网站上下载57株代表性葡萄球菌全基因组序列，涵盖28个葡萄球菌种。然后进行泛基因组学分析，通过以下筛选条件的设置：1)核心基因(core genes)，2)靶基因编码的氨基酸序列在葡萄球菌之间的同源性大于50％，3)靶基因在葡萄球菌基因组中必须是单拷贝基因，4)氨基酸序列长度大于200个氨基酸。进行泛基因组学数据整理分析，对筛选出的靶基因序列逐一进行序列分析，剔除有明显片段缺失和没有明显保守区段的靶基因序列，最后筛选出具有单核苷酸多态性特征的葡萄球菌持家基因。
优选的，上述各靶基因的标准分析序列为SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：6所示序列。
本发明的第二个目的是提供一种用于葡萄球菌种水平鉴定和菌株分型的引物组合物，其包括：
femA引物对：
FemA-F TAAYAAARTCACCAACATAYTC SEQ ID NO：7
FemA-R TYMGNTCATTTATGGAAGATAC SEQ ID NO：8
ftsZ引物对：
FtsZ-F GCBACDYTDAARGTYATYGG SEQ ID NO：9
FtsZ-R TTRTCWTCRAADCCWGTHGC SEQ ID NO：10
gap引物对：
gap-F ATGGTTTTGGTAGAATTGGTCGTTTA SEQ ID NO：11
gap-R GACATTTCGTTATCATACCAAGCTG SEQ ID NO：12
pyrH引物对：
PyrH-F AYTDAGYGGHGAAGCDYTMG SEQ ID NO：13
PyrH-R AGAARGANGANGCHGTWGA SEQ ID NO：14
rpoB引物对：
rpoB-F CAATTCATGGACCAA GC SEQ ID NO：15
rpoB-R CCGTCCCAAGTCATGAAA C SEQ ID NO：16
tufA引物对：
TufA-F CCAATGCCACAAACTCGT SEQ ID NO：17
TufA-R CCTGAACCAACAGTACGT SEQ ID NO：18。
上述6个靶基因的PCR扩增引物是通过对NCBI数据库中下载的葡萄球菌靶基因序列，序列比对分析后，利用Primer 5.0软件在靶基因保守序列区域设计引物，然后对引物的有效性和通用性进行评价，最终筛选出6对性能较优的引物。所述6对PCR扩增引物序列，在葡萄球菌中具有较好的通用性，能够实现葡萄球菌属多种葡萄球菌的有效扩增。
本发明第三个目的是提供一种葡萄球菌种水平鉴定和菌株分型一体化的方法，其包括以下步骤：
步骤1、提取待检测菌株DNA；
步骤2、将步骤1中提取的待检测菌株DNA作为模板，利用上述引物组合物分别对6种靶基因：femA、ftsZ、gap、pyrH、rpoB和tufA进行PCR扩增；
步骤3、通过凝胶电泳，检测步骤2中所得的扩增产物，定性判断待检测菌株是否为葡萄球菌；
步骤4、将步骤3中定性判断为葡萄球菌的产物进行核酸序列测定，
步骤5、将步骤4中的测定的6个靶基因的序列与对应靶基因的标准序列进行序列比对分析，截取片段大小一致的序列；
步骤6、将步骤5中截取的待检测菌株靶基因序列按femA-ftsZ-gap-pyrH-rpoB-tufA顺序进行序列串联；
步骤7、将步骤6中所得的待检测菌株串联序列与葡萄球菌菌种数据库中的标准菌株串联序列进行聚类分析，构建邻接法(Neighbor-Joining method)进化树，根据邻接法进化树中菌株之间的亲缘聚类关系，进行葡萄球菌种水平鉴定和菌株分型。
为了进一步优化上述技术方案，本发明所采取的技术措施还包括：
优选地，在步骤1和步骤2之间，包括筛选具有单核苷酸多态性的葡萄球菌持家基因femA、ftsZ、gap、pyrH、rpoB和tufA，作为葡萄球菌种水平鉴定和菌株分型的靶基因的步骤。
优选地，所述筛选方法为葡萄球菌泛基因组学分析方法，其筛选条件如下：1)核心基因(core genes)，2)靶基因编码的氨基酸序列在葡萄球菌之间的同源性大于50％，3)靶基因在葡萄球菌基因组中必须是单拷贝基因，4)氨基酸序列长度大于200个氨基酸。
优选地，所述葡萄球菌泛基因组学分析方法中包括57株代表性葡萄球菌全基因组序列，涵盖28个葡萄球菌种。
优选地，所述葡萄球菌泛基因组学分析方法包括：
i)对氨基酸序列的比对分析，按同源性从高到低逐一进行序列分析，剔除有明显片段缺失和没有明显保守区段的氨基酸靶序列；
ii)对筛选出的氨基酸靶序列的核酸序列进行比对分析，剔除没有明显保守区段的靶基因序列，筛选出具有单核苷酸多态性特征的葡萄球菌持家基因。
PCR的反应过程是本领域技术人员所能掌握的，一般为五步法，预变性、变性、退火、延伸、再延伸。根据本发明人研究，优选地，步骤2中的PCR扩增反应体系包括：Takara 2×PreMix预混液12.5μL，引物对(10μmol/L)各1.0μL，菌株DNA模板2.0μL，使用灭菌ddH2O水补足20.0μL。
优选地，步骤2中的PCR扩增程序如下：
femA：95℃预变性5min，95℃预变性30s，48℃退火30s，72℃延伸30s，进行35个循环，最后72℃延伸10min；
ftsZ：95℃预变性5min，95℃预变性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，进行35个循环，最后72℃延伸10min；
gap：95℃预变性5min，95℃预变性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，进行35个循环，最后72℃延伸10min；
pyrH：95℃预变性5min，95℃预变性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，进行35个循环，最后72℃延伸10min；
rpoB：95℃预变性5min，95℃预变性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，进行35个循环，最后72℃延伸10min；
tufA：95℃预变性5min，95℃预变性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，进行35个循环，最后72℃延伸10min；
优选地，所述步骤3中定性判断待检测菌株的标准为：如果凝胶电泳结果中出现6个靶基因的明显亮色条带，则表明该条带对应的菌株为葡萄球菌菌株，否则为非葡萄球菌菌株。
优选地，所述步骤3中凝胶电泳可采用本领域常用的凝胶电泳类型，更优选为琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可以进行电泳，且对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。
本发明收集整理国家权威微生物菌种保藏中心葡萄球菌标准菌株，及经过明确鉴定的微生物检验实验室常见葡萄球菌菌株。进行靶基因PCR扩增和核酸测序分析后，建立不同葡萄球菌种靶基因femA、ftsZ、gap、pyrH、rpoB和tufA的标准序列及串联序列数据库。将待检测菌株的6个靶基因串联序列与数据库中不同葡萄球菌标准菌株进行比对和聚类分析，进行葡萄球菌菌种水平鉴定和菌株分型。
本发明分别在上述6个靶基因的SNP多态性丰富的区域定义每个靶基因的标准分析序列(约500bp)，其序列如下所示：
femA标准分析序列(SEQ ID NO：1)：
TCTTCGGCATCTTCACTAAAGTCACCACTAATACCATAGAAATTATACCGATCAATACCATGTTCAATTGCATAGTTAATCATCTTCCATTGAACCGCATAGCTCCCTGCAAAATGGCGATAACGATTTGAAGTTCCACCAGCGTAGTAAACTACTTCAAACGGATTGATTATAAAGAAGCCAGCAGAGATGGGTAATTCATTGCCATGTTCTTGTTTTAAGTTTTTGGCTTCATTAATTTTTTGCTGGTTTGCATCAAGTTGTTGTTCTAAATTTTCTTTTTTGTTATGTGCTTTTTTATTCTCTGGACGCTTCTCAATGTCTTTTAAAGCTTTATTATAATCTTTATTAAGCACATTTCTTTCATTATTTAGTTCCTCTATGTACTCATCGAAGTTAATATAGGCTAGTGGTACTAAAACACGGTCTTTATAGTGTTTGAATCTGTTGTAATAAAAACTATCATCTCTATCTGCAAAATCTTTAGTTTCAGAGGTA；
ftsZ标准分析序列(SEQ ID NO：2)：
ACACGTGGATTAGGTGCTGGTGCTAATCCTGAAATTGGAAAGAAAGCAGCAGAAGAATCAAGAGAACAAATTGAAGATGCTATCCAAGGTGCTGATATGGTATTCGTAACTGCTGGTATGGGTGGCGGTACTGGAACAGGTGCTGCGCCGGTTGTTGCTAAAATTGCAAAAGAAATGGGTGCTTTAACTGTAGGTGTTGTTACGCGTCCATTCGGTTTCGAAGGTCGTAAGCGCCAAACACAAGCGGCAGCTGGTGTAGAATCTATGAAAGCAGCAGTGGATACATTAATTGTTATTCCAAATGATCGCTTATTAGATATCGTTGACAAATCTACGCCGATGATGGAAGCATTTAAAGAAGCGGATAATGTATTACGTCAAGGTGTACAAGGTATTTCAGATTTAATTGCAGTATCAGGTGAAGTGAACTTAGACTTTGCAGACGTTAAAACAATTATGTCTAATCAAGGTTCTGCGTTAATGGGTATCGGTGTGTCATCTGGTGAAAACAGAGCAGTCGAA；
gap标准分析序列(SEQ ID NO：3)：
AGGTCGTTTCACTGGAGAAGTTGAAGTTATCGAAGGTGGTTTCCGTGTAAACGGTAAAGAAATTAAATCATTCGATGAACCAGATGCTGGTAAATTACCATGGGGCGATTTAGATATCGACGTAGTATTAGAATGTACTGGTTTCTATACTGATAAAGAAAAAGCACAAGCTCACATCGATGCAGGTGCTAAAAAAGTATTAATCTCCGCTCCAGCTAAAGGTGATGTAAAAACAATCGTATTCAACACTAACCATGATACATTAGATGGTTCAGAAACAGTTGTTTCAGGTGCTTCTTGTACTACTAACTCATTAGCACCAGTTGCAAAAGTTTTAAGTGACGAATTCGGTTTAGTTGAAGGTTTCATGACTACAATTCACGCTTACACTGGTGACCAAAATACACAAGACGCACCTCACAGAAAAGGTGACAAACGTCGTGCACGTGCAGCAGCAGAAAATATTATTCCTAACTCAACAGGTGCTGCTAAAGCTATCGGTAAAGTTATTCCAGAAATCGATGGTAAA；
pyrH标准分析序列(SEQ ID NO：4)：
TTGAATATGTGTCAAATGTTCATATTTAATTGCATTTGCATCAACTTTTGGATCAGCTGAATAAACACCATCTACATTATTTTTACCCATTAAAATTACATCTGCTTCTACTTCAGCCGCACGTAAAGCAGCAGTTGTGTCAGTTGAGAAGTAAGGATTACCAATTCCAGCGGCAAATATAACAACACGTTTTTTCTCCAAATGTCTAATTGCACGTCGACGAATATATGGTTCAGCAACTTGTTTCATTTCAATAGAAGTTAAAACACGTGTATCACAATCTAATTGTTCTAAACTGTCTTGTAATGCTAAAGCATTCATTACAGTAGCAAGCATCCCCATGTAATCAGCCGTACCACGATCCATACCTAGGTCGCTACCAGTTTTGCCTCTCCAAATATTTCCACCGCCGACAATGACAGCAATTTCACAATCCATTTTGGCAACTTCAGCAACTTGCTGTGCAACGCTTTT；
rpoB标准分析序列(SEQ ID NO：5)：
TAACAAGTACCAGAGTTTGAACGCTTGAATTTCGCTAAAGGATAACGATCTAATTCACCTTCATGCTCAGTTCCATTTTCTTCAACTAAACGACGAACTAAAATTTCATTAGATTCAACATGTTCAACGCGCCCTCTATGCTTAGCAGTGATTGCAGCACCAGAGTCTCTTGCGGCTACATGTTCCATACCTGTACCCACAAATGGAGCTTCAGGATTCATTAAAGGCACTGCTTGACGTTGCATGTTTGCTCCCATTAACGCACGGTTAGAGTCGTCATTTTCTAAGAATGGAATACATGCTGTTGCTGCTGAAACAACTTGTTTTGGTGAAACGTCCATGTAATCCATTTTCTCTTTAGCCATAACAGTGTTATTACCACGGAAACGACAAACAACTTCATCATCTAAGAAACGTCCATTTTCATCAAGTCTAGAATTAGCCTGTGCAACAACGTAGCTATCCTCTTCATCAGCTGTCAAATAATCTATTTGATCGGTGATTGAGTTTGTATCTAAATCCACTTTACGATATGG；
tufA标准分析序列(SEQ ID NO：6)：
CCCAGGTGACGATGTACCTGTAATCGCTGGTTCTGCATTAAAAGCATTAGAAGGCGATGCTGAATACGAACAAAAAATCTTAGACTTAATGCAAGCAGTTGATGATTACATTCCAACTCCAGAACGTGATTCTGACAAACCATTCATGATGCCAGTTGAGGACGTATTCTCAATCACTGGTCGTGGTACTGTTGCTACAGGCCGTGTTGAACGTGGTCAAATCAAAGTTGGTGAAGAAGTTGAAATCATCGGTATGCATGAAACTTC---TAAAACAACTGTTACTGGTGTAGAAATGTTCCGTAAGTTATTAGACTACGCTGAAGCTGGTGACAACATCGGTGCTTTATTACGTGGTGTTGCACGTGAAGACGTACAACGTGGTCAAGTATTAGCTGCTCCTGGTTCTATTACACCACACACAAAATTCAAAGCTGAAGTATACGTATTATCTAAAGATGAAGGTGGACGTCACACTCCATTCTTCACTAACTATCGCCC。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明采用以上优化方案，优选6个靶基因，基于靶基因的单核苷酸多态性建立了葡萄球菌种水平鉴定和菌株分型一体化方法，该方法可对国内常见的葡萄球菌种能够快速有效的鉴定，鉴定同时能够进行菌株分型。本发明所述的葡萄球菌鉴定及分型的一体化方法，具有通用性高、鉴定准确和分辩力强等优点，且通量高、操作简单、快速有效。解决了现有分型方法需在菌株鉴定的基础上才能实现菌株分型的弊端，实现了葡萄球菌种水平鉴定和分型的一体化，降低了试验成本，提高了工作效率，结果判定方便准确，更加具有实用性。
本发明所述的葡萄球菌鉴定分型一体检测鉴定方法提供了新的技术平台，可用于药品质量监管部门、药品生产企业，对药品、生产和检验环境中污染葡萄球菌的种水平鉴定和菌株分型溯源，具有广阔市场前景和较大的经济、社会效益。
附图说明
图1是靶基因PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测图谱；
图2是172株葡萄球菌6个靶基因串联标准序列聚类分析图。
具体实施方式
本发明提供了一种用于葡萄球菌种水平鉴定和菌株分型的靶基因及其对应的引物序列，以及葡萄球菌种水平鉴定和菌株分型一体化方法。
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
本发明使用的葡萄球菌菌株包含国内常见的18种葡萄球菌，具体菌株信息如表1所示。共172株葡萄球菌，分别来自于国家权威微生物菌种保藏中心，及经过明确鉴定的微生物检验实验室。为保证菌株信息的准确性，我们分别使用16S rRNA序列比对和全自动微生物生化鉴定系统VITEK 2.0Compact，对菌株信息进行了再确认。
实施例1
本实施例为用于葡萄球菌种水平鉴定和菌株分型的靶基因PCR扩增方法的建立，其包括如下步骤：
步骤一：筛选葡萄球菌属具有单核苷酸多态性的持家基因；
从NCBI genome网站下载57株高质量的代表性葡萄球菌全基因组核酸序列，涵盖28个葡萄球菌种，进行葡萄球菌泛基因组学分析。其中，以氨基酸序列作为分析对象，选择OrthoMCL软件进行泛基因组学分析，利用MysqL软件进行数据管理，采用MCL软件算法进行序列之间的比对分析。通过以下筛选条件的设置：1)核心基因(core genes)，在所有葡萄球菌菌株中都具有的基因，2)靶基因编码的氨基酸序列在葡萄球菌之间的同源性大于50％，提供一定的保守性和足够的变异性，以区分不同的葡萄球菌菌株，3)靶基因在葡萄球菌基因组中必须是单拷贝基因，保证基因的唯一性，4)氨基酸序列长度大于200个氨基酸，便于设计引物并提供足够的序列多样性。通过对葡萄球菌泛基因组学数据进行整理，筛选出具有单核苷酸多态性的葡萄球菌持家基因序列。利用软件MEGA7.0进行氨基酸序列的比对分析，按同源性从高到低逐一进行序列分析。首先剔除有明显片段缺失和没有明显保守区段的氨基酸靶序列。然后再针对筛选出的氨基酸靶序列的核酸序列进行比对分析，剔除没有明显保守区段的靶基因序列，最后筛选出具有单核苷酸多态性特征的葡萄球菌持家基因。
步骤二：靶基因PCR扩增方法的评价；
靶基因PCR扩增引物设计：靶基因核酸序列比对分析后，尽量避开单核苷酸多态性位点，选择保守核酸序列区域，利用引物设计软件Primer 5.0，针对筛选出的靶基因设计多对PCR扩增引物。
靶基因PCR扩增有效性评价：选择表1中的172株葡萄球菌，提取DNA后，在优化的退火温度下，采用SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：12的引物对分别对候选靶基因的PCR扩增，验证靶基因PCR扩增引物的有效性和通用性。琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，阳性PCR扩增产物进行核酸测序。对测序后获得的靶基因序列进行分析，进一步判定PCR扩增的准确性。
表1. 172株葡萄球菌菌株信息表
如图1所示，结果表明候选靶基因femA，ftsZ，gap，pyrH，rpoB和tufA的PCR扩增引物，在172株葡萄球菌中都能够进行有效PCR扩增(图1)，且核酸测序结果表明6个靶基因的PCR扩增序列与目标序列一致。以上结果表明，针对具有单核苷酸多态性的靶基因femA，ftsZ，gap，pyrH，rpoB和tufA，成功建立了PCR扩增方法，且靶基因PCR扩增引物在葡萄球菌中具有非常好的扩增效率和适用性。
上述PCR反应体系如下：采用20.0μL的反应体系，其中包括：Takara 2×PreMix预混液12.5μL，上下游引物(10μmol/L)各1.0μL，菌株DNA模板2.0μL，使用灭菌ddH2O水补足20.0μL。
上述PCR反应循环参数如下：
femA:95℃预变性5min，95℃预变性30s，48℃退火30s，72℃延伸30s，进行35个循环，最后72℃延伸10min；
ftsZ:95℃预变性5min，95℃预变性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，进行35个循环，最后72℃延伸10min；
gap:95℃预变性5min，95℃预变性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，进行35个循环，最后72℃延伸10min；
pyrH:95℃预变性5min，95℃预变性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，进行35个循环，最后72℃延伸10min；
rpoB:95℃预变性5min，95℃预变性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，进行35个循环，最后72℃延伸10min；
tufA:95℃预变性5min，95℃预变性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，进行35个循环，最后72℃延伸10min。
实施例2
本实施例为葡萄球菌种水平鉴定和菌株分型方法的建立，其包括如下步骤：
步骤一：靶基因序列标准化及多样性分析；
对实施例1中获取得172株葡萄球菌中6个靶基因的核酸序列，利用软件MEGA 7.0进行比对分析，去除两端准确度较低的核酸序列，在SNP多态性丰富的区域定义每个靶基因的标准分析序列(约500bp)，其序列为SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：6所示序列。
利用软件DNASP 5.0分析每个靶基因标准序列的多样性，分别从等位基因(Alleles)数目、SNP位点数、Nucleotide diversity(π)和Allelic Diversity(HD)等方面，评价靶基因在不同葡萄球菌之间的序列多样性(如表2所示)。
6个靶基因在172株菌中的等位基因数目分别为femA(53)，ftsZ(50)，gap(51)，pyrH(48)，rpoB(56)和tufA(41)，SNP位点在每个靶基因中的比率都达到了30％以上，其中靶基因femA的SNP位点数最多，占到了60％以上。综合以上分析结果，本发明筛选的靶基因标准序列在不同葡萄球菌之间具有较好的多样性，提供了区分不同葡萄球菌菌株的能力。
步骤二：建立葡萄球菌鉴定和分型方法；
本发明选取每个菌株6个靶基因的标准序列，按照femA-ftsZ-gap-pyrH-rpoB-tufA顺序进行标准序列的串联，串联后利用MEGA7.0进行比对分析。将定性判断为葡萄球菌的靶基因PCR产物进行序列测定，并将其与对应靶基因的标准序列进行比对分析，截取片段大小一致的序列；利用上述截取的序列按femA-ftsZ-gap-pyrH-rpoB-tufA顺序进行序列串联。
基于序列比对结果，对所得的待检测菌株的串联序列与葡萄球菌菌种数据库中的标准菌株串联序列，选用邻接法(Neighbor-Joining method)和Bootstrap method(1000)方法进行聚类分析，其结果如图2和表2所示。
表2. 172株葡萄球菌菌种鉴定与分型结果
由如图2所示，对属于同一个葡萄球菌种的菌株标记为同一种颜色符号。聚类结果表明，本发明建立的基于单核苷酸多态性分析的葡萄球菌种水平鉴定和分型一体化方法，可以准确的把172株葡萄球菌鉴定为18个种，区分为95个序列型，其结果如表2所示。
由上述结果分析可知本发明依据172株葡萄球菌的鉴定和分型结果，建立葡萄球菌靶基因标准序列及串联序列数据库，用于鉴定待检葡萄球菌，并对葡萄球菌菌株进行分型溯源。
由上述实施例可知，解决了现有分型方法需在菌株鉴定的基础上才能实现菌株分型的弊端，实现了葡萄球菌种水平鉴定和菌株分型的一体化，降低了试验成本，提高了工作效率，结果判定方便准确，更加具有实用性
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海市食品药品检验所
<120> 一种基于单核苷酸多态性的葡萄球菌种鉴定和菌株分型一体化方法
<160> 18
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 498
<212> DNA
<213> femA标准分析序列
<400> 1
tcttcggcat cttcactaaa gtcaccacta ataccataga aattataccg atcaatacca 60
tgttcaattg catagttaat catcttccat tgaaccgcat agctccctgc aaaatggcga 120
taacgatttg aagttccacc agcgtagtaa actacttcaa acggattgat tataaagaag 180
ccagcagaga tgggtaattc attgccatgt tcttgtttta agtttttggc ttcattaatt 240
ttttgctggt ttgcatcaag ttgttgttct aaattttctt ttttgttatg tgctttttta 300
ttctctggac gcttctcaat gtcttttaaa gctttattat aatctttatt aagcacattt 360
ctttcattat ttagttcctc tatgtactca tcgaagttaa tataggctag tggtactaaa 420
acacggtctt tatagtgttt gaatctgttg taataaaaac tatcatctct atctgcaaaa 480
tctttagttt cagaggta 498
<210> 2
<211> 522
<212> DNA
<213> ftsZ标准分析序列
<400> 2
acacgtggat taggtgctgg tgctaatcct gaaattggaa agaaagcagc agaagaatca 60
agagaacaaa ttgaagatgc tatccaaggt gctgatatgg tattcgtaac tgctggtatg 120
ggtggcggta ctggaacagg tgctgcgccg gttgttgcta aaattgcaaa agaaatgggt 180
gctttaactg taggtgttgt tacgcgtcca ttcggtttcg aaggtcgtaa gcgccaaaca 240
caagcggcag ctggtgtaga atctatgaaa gcagcagtgg atacattaat tgttattcca 300
aatgatcgct tattagatat cgttgacaaa tctacgccga tgatggaagc atttaaagaa 360
gcggataatg tattacgtca aggtgtacaa ggtatttcag atttaattgc agtatcaggt 420
gaagtgaact tagactttgc agacgttaaa acaattatgt ctaatcaagg ttctgcgtta 480
atgggtatcg gtgtgtcatc tggtgaaaac agagcagtcg aa 522
<210> 3
<211> 529
<212> DNA
<213> gap标准分析序列
<400> 3
aggtcgtttc actggagaag ttgaagttat cgaaggtggt ttccgtgtaa acggtaaaga 60
aattaaatca ttcgatgaac cagatgctgg taaattacca tggggcgatt tagatatcga 120
cgtagtatta gaatgtactg gtttctatac tgataaagaa aaagcacaag ctcacatcga 180
tgcaggtgct aaaaaagtat taatctccgc tccagctaaa ggtgatgtaa aaacaatcgt 240
attcaacact aaccatgata cattagatgg ttcagaaaca gttgtttcag gtgcttcttg 300
tactactaac tcattagcac cagttgcaaa agttttaagt gacgaattcg gtttagttga 360
aggtttcatg actacaattc acgcttacac tggtgaccaa aatacacaag acgcacctca 420
cagaaaaggt gacaaacgtc gtgcacgtgc agcagcagaa aatattattc ctaactcaac 480
aggtgctgct aaagctatcg gtaaagttat tccagaaatc gatggtaaa 529
<210> 4
<211> 474
<212> DNA
<213> pyrH标准分析序列
<400> 4
ttgaatatgt gtcaaatgtt catatttaat tgcatttgca tcaacttttg gatcagctga 60
ataaacacca tctacattat ttttacccat taaaattaca tctgcttcta cttcagccgc 120
acgtaaagca gcagttgtgt cagttgagaa gtaaggatta ccaattccag cggcaaatat 180
aacaacacgt tttttctcca aatgtctaat tgcacgtcga cgaatatatg gttcagcaac 240
ttgtttcatt tcaatagaag ttaaaacacg tgtatcacaa tctaattgtt ctaaactgtc 300
ttgtaatgct aaagcattca ttacagtagc aagcatcccc atgtaatcag ccgtaccacg 360
atccatacct aggtcgctac cagttttgcc tctccaaata tttccaccgc cgacaatgac 420
agcaatttca caatccattt tggcaacttc agcaacttgc tgtgcaacgc tttt 474
<210> 5
<211> 536
<212> DNA
<213> rpoB标准分析序列
<400> 5
taacaagtac cagagtttga acgcttgaat ttcgctaaag gataacgatc taattcacct 60
tcatgctcag ttccattttc ttcaactaaa cgacgaacta aaatttcatt agattcaaca 120
tgttcaacgc gccctctatg cttagcagtg attgcagcac cagagtctct tgcggctaca 180
tgttccatac ctgtacccac aaatggagct tcaggattca ttaaaggcac tgcttgacgt 240
tgcatgtttg ctcccattaa cgcacggtta gagtcgtcat tttctaagaa tggaatacat 300
gctgttgctg ctgaaacaac ttgttttggt gaaacgtcca tgtaatccat tttctcttta 360
gccataacag tgttattacc acggaaacga caaacaactt catcatctaa gaaacgtcca 420
ttttcatcaa gtctagaatt agcctgtgca acaacgtagc tatcctcttc atcagctgtc 480
aaataatcta tttgatcggt gattgagttt gtatctaaat ccactttacg atatgg 536
<210> 6
<211> 498
<212> DNA
<213> tufA标准分析序列
<400> 6
cccaggtgac gatgtacctg taatcgctgg ttctgcatta aaagcattag aaggcgatgc 60
tgaatacgaa caaaaaatct tagacttaat gcaagcagtt gatgattaca ttccaactcc 120
agaacgtgat tctgacaaac cattcatgat gccagttgag gacgtattct caatcactgg 180
tcgtggtact gttgctacag gccgtgttga acgtggtcaa atcaaagttg gtgaagaagt 240
tgaaatcatc ggtatgcatg aaacttctaa aacaactgtt actggtgtag aaatgttccg 300
taagttatta gactacgctg aagctggtga caacatcggt gctttattac gtggtgttgc 360
acgtgaagac gtacaacgtg gtcaagtatt agctgctcct ggttctatta caccacacac 420
aaaattcaaa gctgaagtat acgtattatc taaagatgaa ggtggacgtc acactccatt 480
cttcactaac tatcgccc 498
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FemA-F
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> y is c or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> r is a or g
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> y is c or t
<400> 7
taayaaartc accaacatay tc 22
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FemA-R
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> y is c or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> m is a or c
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 8
tymgntcatt tatggaagat ac 22
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FtsZ-F
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> b is g,t,or c
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> d is g,a,or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> y is c or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> d is g,a,or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> r is a or g
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> y is c or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(18)
<223> y is c or t
<400> 9
gcbacdytda argtyatygg 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FtsZ-R
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> r is a or g
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> w is a or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> r is a or g
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> d is g, a or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> w is a or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(18)
<223> h is a, t or c
<400> 10
ttrtcwtcra adccwgthgc 20
<210> 11
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gap-F
<400> 11
atggttttgg tagaattggt cgttta 26
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gap-R
<400> 12
gacatttcgt tatcatacca agctg 25
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PyrH-F
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> y is c or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> d is g, a or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> y is c or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> h is a, t or c
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> d is g, a or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> y is c or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> m is a or c
<400> 13
aytdagyggh gaagcdytmg 20
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PyrH-R
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> r is a or g
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> h is a, t or c
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> w is a or t
<400> 14
agaarganga ngchgtwga 19
<210> 15
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rpoB-F
<400> 15
caattcatgg accaagc 17
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rpoB-R
<400> 16
ccgtcccaag tcatgaaac 19
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TufA-F
<400> 17
ccaatgccac aaactcgt 18
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TufA-R
<400> 18
cctgaaccaa cagtacgt 18
Claims (7)
1.一种用于葡萄球菌种水平鉴定和菌株分型的引物组合物，其特征在于，包括：
femA引物对：由SEQ ID NO：7-SEQ ID NO：8所示序列组成；
ftsZ引物对：由SEQ ID NO：9-SEQ ID NO：10所示序列组成；
gap引物对：由SEQ ID NO：11-SEQ ID NO：12所示序列组成；
pyrH引物对：由SEQ ID NO：13-SEQ ID NO：14所示序列组成；
rpoB引物对：由SEQ ID NO：15-SEQ ID NO：16所示序列组成；
和tufA引物对：由SEQ ID NO：17-SEQ ID NO：18所示序列组成。
2.一种非诊断目的的葡萄球菌种水平鉴定和菌株分型一体化的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、提取待检测菌株DNA；
步骤2、将步骤1中提取的待检测菌株DNA作为模板，利用权利要求1所述的引物组合物，分别对6种靶基因：femA、ftsZ、gap、pyrH、rpoB和tufA进行PCR扩增；
步骤3、通过凝胶电泳，检测步骤2中所得的扩增产物，定性判断待检测菌株是否为葡萄球菌；
步骤4、将步骤3中定性判断为葡萄球菌的产物进行核酸序列测定，
步骤5、将步骤4中的测定的6个靶基因的序列与对应靶基因的标准序列进行序列比对分析，截取片段大小一致的序列；
步骤6、将步骤5中截取的待检测菌株靶基因序列按femA-ftsZ-gap-pyrH-rpoB-tufA顺序进行序列串联；
步骤7、将步骤6中所得的待检测菌株串联序列与葡萄球菌菌种数据库中的标准菌株串联序列进行聚类分析，构建邻接法进化树，根据邻接法进化树中菌株之间的亲缘聚类关系，进行葡萄球菌种水平鉴定和菌株分型。
3.根据权利要求2所述的葡萄球菌种水平鉴定和菌株分型一体化的方法，其特征在于，在步骤1和步骤2之间，包括筛选femA、ftsZ、gap、pyrH、rpoB和tufA基因作为葡萄球菌种水平鉴定和菌株分型的靶基因的步骤。
4.根据权利要求2所述的葡萄球菌种水平鉴定和菌株分型一体化的方法，其特征在于，步骤2中的PCR扩增反应体系包括：Takara 2×PreMix预混液12.5μL，引物对各1.0μL，菌株DNA模板2.0μL，使用灭菌ddH2O水补足20.0μL。
5.根据权利要求2所述的葡萄球菌种水平鉴定和菌株分型一体化的方法，其特征在于，所述步骤2中的PCR扩增程序如下：
femA：95℃预变性5min，95℃预变性30s，48℃退火30s，72℃延伸30s，进行35个循环，最后72℃延伸10min；
ftsZ：95℃预变性5min，95℃预变性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，进行35个循环，最后72℃延伸10min；
gap：95℃预变性5min，95℃预变性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，进行35个循环，最后72℃延伸10min；
pyrH：95℃预变性5min，95℃预变性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，进行35个循环，最后72℃延伸10min；
rpoB：95℃预变性5min，95℃预变性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，进行35个循环，最后72℃延伸10min；
tufA：95℃预变性5min，95℃预变性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，进行35个循环，最后72℃延伸10min。
6.根据权利要求2所述的葡萄球菌种水平鉴定和菌株分型一体化的方法，其特征在于，所述步骤3中定性判断待检测菌株的标准为：如果凝胶电泳结果中出现6个靶基因的明显亮色条带，则表明该条带对应的菌株为葡萄球菌菌株，否则为非葡萄球菌菌株。
7.根据权利要求2所述的葡萄球菌种水平鉴定和菌株分型一体化的方法，其特征在于，所述步骤5中靶基因的标准序列为SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：6所示序列。
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Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110157821B (zh) * | 2019-05-06 | 2020-08-28 | 浙江大学 | 一种用于人葡萄球菌检测的试剂盒 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101287844A (zh) * | 2005-07-27 | 2008-10-15 | 诊断阵列系统私人有限公司 | 用于检测和/或鉴定微生物的方法 |
| CN102154473A (zh) * | 2011-01-24 | 2011-08-17 | 杭州市农业科学研究院 | 一种基因芯片及其在水产病原微生物检测中的应用 |
| CN102703592A (zh) * | 2012-06-09 | 2012-10-03 | 江苏师范大学 | 一种产色葡萄球菌gap基因序列及其引物的获取方法 |
| KR101373756B1 (ko) * | 2012-02-27 | 2014-03-13 | 서울대학교산학협력단 | 황색포도상구균의 분자적 동정을 위한 프라이머 및 이를 이용한 황색포도상구균 동정 방법 |
| CN106755433A (zh) * | 2016-12-28 | 2017-05-31 | 厦门大学 | 一种二维编码的金黄色葡萄球菌分子分型方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8173363B2 (en) * | 2002-08-20 | 2012-05-08 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Random transposon insertion in Staphylococcus aureus and use thereof to identify essential genes |
-
2017
- 2017-06-22 CN CN201710479507.3A patent/CN107164512B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101287844A (zh) * | 2005-07-27 | 2008-10-15 | 诊断阵列系统私人有限公司 | 用于检测和/或鉴定微生物的方法 |
| CN102154473A (zh) * | 2011-01-24 | 2011-08-17 | 杭州市农业科学研究院 | 一种基因芯片及其在水产病原微生物检测中的应用 |
| KR101373756B1 (ko) * | 2012-02-27 | 2014-03-13 | 서울대학교산학협력단 | 황색포도상구균의 분자적 동정을 위한 프라이머 및 이를 이용한 황색포도상구균 동정 방법 |
| CN102703592A (zh) * | 2012-06-09 | 2012-10-03 | 江苏师范大学 | 一种产色葡萄球菌gap基因序列及其引物的获取方法 |
| CN106755433A (zh) * | 2016-12-28 | 2017-05-31 | 厦门大学 | 一种二维编码的金黄色葡萄球菌分子分型方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Multilocus Sequence Typing for Characterization of Staphylococcus pseudintermedius;S. M. Solyman等;《J Clin Microbiol.》;20121031;第51卷(第1期);第306页摘要，第309页右栏第3段 * |
| Species identification of staphylococci by amplification and sequencing of the tuf gene compared to the gap gene and by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry;M. Bergeron等;《Eur J Clin Microbiol Infect Dis》;20101022;第30卷;第343页摘要，第344页左栏第2段、右栏第2段，第346页右栏第3段，第347页左栏第3段 * |
| 多重实时荧光PCR检测甲氧西林耐药葡萄球菌的方法学研究;陈军等;《国际检验医学杂志》;20140630;第35卷(第12期);第1531-1533页 * |
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Legal Events
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Address after: 200120 No. 1500 Zhangheng Road, Pudong New Area, Shanghai Patentee after: Shanghai Institute for food and drug control Address before: No.1500, zhangheng Road, Pudong New Area, Shanghai, 201200 Patentee before: SHANGHAI INSTITUTE FOR FOOD AND DRUG CONTROL |
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| CP03 | Change of name, title or address |