CN107144621A - 一种快速表征及筛选分析物毛细管电泳分析条件的方法 - Google Patents

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吴晶
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Abstract

本发明公开一种快速表征及筛选分析物毛细管电泳分析条件的方法，该方法以肌红蛋白作为特征分析物，通过测定在同一运行缓冲液，不同涂层或添加剂条件下，特征分析物与毛细管表面作用产生的流动电势随时间的变化速率，通过流动电势随时间的变化速率的大小判断所述运行缓冲液及涂层或添加剂对待测分析物的适用性。该方法能够在50 s甚至更快的时间内得出该条件下毛细管电泳中毛细管表面电荷的稳定度，实现毛细管电泳条件的快速筛选，是一种快速、原位、非标记表征及筛选方法。

Description

一种快速表征及筛选分析物毛细管电泳分析条件的方法
技术领域
本发明属于毛细管电泳分析领域，涉及一种快速表征及筛选分析物毛细管电泳分析条件的方法，以优化毛细管电泳分析条件。
背景技术
生物样品，包括蛋白质分子是生命活动得以正常运行的基础，研究生物样品(如蛋白质)相关的性质对于生命活动的研究具有推动的作用。毛细管电泳法作为一种有效的分离分析手段，已被广泛应用于生物样品的分离与分析，为生命活动的研究与发展做出了很大的贡献。生物分子，尤其是蛋白质分子作为一种两性的高分子化合物，其在毛细管表面的吸附影响了毛细管电泳法对其分离分析的效率。通常情况下，毛细管电泳条件的表征及筛选是通过系统研究电泳介质对分析物柱效的影响来实现的，每个参数的改变均需进行完整的电泳分析，耗时长，且容易受其它因素的影响。直接测定生物样品在毛细管内的吸附可获得更可靠的结果。已有的方法总是基于分析物在表面的吸附作用对生物样品的毛细管电泳条件进行优化与筛选，如文献“Pressure-Based Approach for the Analysis of ProteinAdsorption in Capillary Electrophoresis” (Analytical Chemistry, 2012, 84 (1):453-458)中对测定蛋白质分子吸附的方法进行了总结，其中包括双检测器法、不可逆吸附-脱附测定，以及压力驱动吸附测定的毛细管电泳法，但如上的方法需要两个紫外或荧光检测器，同时需要对蛋白质分子进行荧光标记，是非原位的分析方法，上述方法利用一定条件下蛋白质分子的吸附选取蛋白质分子的毛细管电泳分析条件的的方法具有针对性差，以及不同毛细管之间测定误差大、单次分析所需时间较长等问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供了一种快速表征及筛选分析物毛细管电泳分析条件的方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
一种快速表征及筛选分析物毛细管电泳分析条件的方法：以肌红蛋白作为特征分析物，通过测定在同一运行缓冲液，不同涂层或添加剂条件下，特征分析物与毛细管表面作用产生的流动电势随时间的变化速率，通过流动电势随时间的变化速率的大小判断所述运行缓冲液及涂层或添加剂对待测分析物的适用性。
进一步，所述待测分析物为蛋白质分子。
进一步，所述蛋白质分子为α-胰凝乳蛋白酶原、核糖核苷酸酶A、溶菌酶、细胞色素c、肌红蛋白等。
具体过程为：先用氢氧化钠溶液和超纯水冲洗毛细管；然后向毛细管中通入涂层或添加剂溶液，进行毛细管表面改性；再用运行缓冲液冲洗毛细管；接着通入肌红蛋白溶液，测定流动电势随时间的变化速率。
本发明方法能够在50 s甚至更快的时间内得出该条件下毛细管电泳中毛细管表面电荷的稳定度，可实现快速、原位、非标记表征及筛选毛细管电泳条件。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为实施例1分别以CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）和DDAB（双十二烷基二甲基溴化铵）作为添加剂的肌红蛋白在毛细管壁吸附产生的流动电势随时间的变化速率结果；
图2为实施例2五种碱性蛋白分别在在CTAB和DDAB作为添加剂的缓冲中的毛细管电泳分析结果；
图3为实施例3肌红蛋白分别在poly-DADMAC(聚二烯丙基二甲基氯化铵，450000)和PEI(聚乙烯亚胺，70000)涂层的毛细管表面吸附产生的流动电势随时间的变化速率结果；
图4为实施例4五种碱性蛋白在poly-DADMAC(450000)和PEI(70000)涂层的毛细管中的毛细管电泳分析结果。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
流动电势法作为一种表征表面电荷的手段，根据H-S方程能够将流动电势所得结果转化为zeta电势（ζ），分析物在毛细管表面的吸附会改变表面的zeta电势结果，而分析物与毛细管表面作用产生的流动电势随时间的变化速率的大小能够说明其在毛细管表面的吸附强弱，因而我们可以采用流动电势的变化表征蛋白质分子在表面的吸附。
H-S方程：，E S为流动电势，△P为压力差，η为溶液粘度，κ为溶液电导率，εr为相对介常数，ε0为真空介电常数。
用1 M NaOH、超纯水分别冲洗毛细管15 min、5 min，向毛细管中通入CTAB (0.5mM) 或者DDAB (0.1 mM)的缓冲溶液（背景缓冲为25 mM PB），涂层时间为10 min，接着用25mM PB（pH=3.0）冲洗毛细管1 min，然后以25 mM PB（pH=3.0）为运行缓冲液，50 kPa条件下，向毛细管中通入浓度为150 μg/mL的肌红蛋白溶液，测定初始阶段肌红蛋白在该体系中与毛细管表面作用产生的流动电势随时间的变化结果。
实施例2
用1 M NaOH以及超纯水分别冲洗毛细管15 min、5 min，向毛细管中通入0.5 mM的CTAB的PB(25 mM)或者0.1 mM DDAB的PB (25 mM)，涂层时间为10 min，然后用25 mM PB冲洗毛细管1 min，以25 mM PB（pH=3.0）为运行缓冲液分离五种碱性蛋白（通过加标的方式，确定1：α-胰凝乳蛋白酶原，2：核糖核苷酸酶A，3：溶菌酶，4：细胞色素c，5：肌红蛋白），如图2所示。通过蛋白质分子的毛细管电泳分析结果证明了实施例1方法的有效性。
实施例3
用1 M NaOH、超纯水分别冲洗毛细管15 min，5 min，向毛细管中通入20.0 mg/mLpoly-DADMAC（或者PEI）的水溶液，涂层时间为10 min，接着用10 mM PB（pH=5.0）冲洗毛细管2 min，然后以10 mM PB (pH 5.0)为运行缓冲，向毛细管中通入浓度为150 μg/mL的肌红蛋白溶液，测定肌红蛋白在poly-DADMAC涂层（或者PEI涂层）的毛细管表面吸附产生的流动电势随时间的变化，如图3所示。
实施例4
用1 M NaOH以及超纯水分别冲洗毛细管15 min，5 min，向毛细管中通入20.0 mg/mLpoly-DADMAC（或者PEI）的水溶液，涂层时间为10 min，接着用10 mM PB（pH=5.0）冲洗毛细管2 min，以10 mM PB (pH 5.0)为运行缓冲，在poly-DADMAC涂层（或者PEI涂层）的毛细管表面分离五种碱性蛋白（通过加标的方式确定1：肌红蛋白，2：α-胰凝乳蛋白酶原，3：核糖核苷酸酶A，4：细胞色素c，5：溶菌酶），如图4所示。通过蛋白质分子的毛细管电泳分析结果证明了实施例3方法的有效性。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种快速表征及筛选分析物毛细管电泳分析条件的方法，其特征在于：以肌红蛋白作为特征分析物，通过测定在同一运行缓冲液，不同涂层或添加剂条件下，特征分析物与毛细管表面作用产生的流动电势随时间的变化速率，通过流动电势随时间的变化速率的大小判断所述运行缓冲液及涂层或添加剂对待测分析物的适用性。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述待测分析物为蛋白质分子。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述蛋白质分子为α-胰凝乳蛋白酶原、核糖核苷酸酶A、溶菌酶、细胞色素c、肌红蛋白等。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：具体过程为：先用氢氧化钠溶液和超纯水冲洗毛细管；然后向毛细管中通入涂层或添加剂溶液，进行毛细管表面改性；再用运行缓冲液冲洗毛细管；接着通入肌红蛋白溶液，测定流动电势随时间的变化速率。
5.权利要求1所述的方法应用于生物样品毛细管电泳分析条件的选择。
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