CN107129992A - 用于控制植物有害生物的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

披露了对鳞翅目有害生物有毒的新颖杀昆虫蛋白。编码这些杀昆虫蛋白的DNA可以用于转化原核和真核生物以表达这些杀昆虫蛋白。这些重组生物或包含这些重组生物或这些杀昆虫蛋白的组合物单独或与适当的农用载体组合可以用于控制不同环境中的鳞翅目有害生物。

Description

用于控制植物有害生物的组合物和方法

发明领域

本发明涉及杀有害生物蛋白和编码它们的核酸分子，连同用于控制植物有害生物的组合物和方法。

背景

苏云金杆菌(Bt)是一种革兰氏阳性的孢子形成的土壤细菌，其特征在于它产生晶体包含体的能力，该晶体包含体对于某些目以及种的植物有害生物(包括昆虫)是特异地有毒性的，但是对于植物和其他非目标生物是无害的。出于这个原因，包括苏云金杆菌菌株或它们的杀昆虫蛋白质的组合物可以用作环境上可接受的杀昆虫剂以控制农业昆虫有害生物或多种人或动物疾病的昆虫载体。

来自苏云金杆菌的晶体(Cry)蛋白主要针对鳞翅目的、双翅目的、以及鞘翅目的有害生物昆虫具有有力的杀昆虫活性。这些蛋白质还已经显示针对以下目的有害生物的活性：膜翅目、同翅目、毛虱目、食毛目、以及壁虱目，连同其他的无脊椎动物目，例如线虫动物门、扁形动物门、以及肉足鞭毛亚门(斐特尔森,J.(Feitelson,J.)1993.在前沿的工程化的杀有害生物剂中的苏云金杆菌家族树(The BacillusThuringiensis family tree.In Advanced Engineered Pesticides).马塞尔德克尔公司(Marcel Dekker,Inc.),纽约,纽约州)。这些蛋白质最初主要基于它们的杀虫活性而被分类为CryI至CryVI。主要的类别是鳞翅目-特异性(I)、鳞翅目-和双翅目-特异性(II)、鞘翅目-特异性(III)、双翅目特异性(IV)、以及线虫特异性(V)和(VI)。这些蛋白质进一步被分类为子族，在各个家族内的更高相关的蛋白质指定了区分的字母，例如CryIA、CryIB、CryIC、等。在各个区分内的甚至更紧密相关的蛋白质被给定名称，例如CryIC(a)、CryIC(b)等。术语“Cry毒素”以及“δ-内毒素”与术语“Cry蛋白”已可互换地使用。对于Cry蛋白和基因的当前新命名法基于氨基酸序列同源性而不是昆虫靶标特异性(克里克莫尔(Crickmore)等人.(1998)《微生物分子生物学评论》(Microbiol.Mol.Biol.Rev.)62:807-813)。在这个更可接受的分类中，每个毒素被指定一个唯一的名称，该名称合并了一个初级等级(一个阿拉伯数字)、一个二级等级(一个大写字母)、一个三级等级(一个小写字母)、以及一个四级等级(另一个阿拉伯数字)。在当前分类中，在初级等级中罗马数字已经换为阿拉伯数字。例如，在旧命名法下的“CryIA(a)”现在在当前命名法下是“Cry1Aa”。根据易卜拉欣(Ibrahim)等人(2010,《生物工程学》(Bioeng).蝽象，1:31-50)，Cry毒素仍然可以根据其昆虫宿主特异性被分为六个主要类别并且包括：组1-鳞翅目(例如Cry1、Cry9和Cry15)；组2-鳞翅目和双翅目(例如Cry2)；组3-鞘翅目(Cry3、Cry7和Cry8)；组4-双翅目(Cry4、Cry10、Cry11、Cry16、Cry17、Cry19和Cry20)；组5-鳞翅目和鞘翅目(Cry1I)；以及组6-线虫(Cry6)。Cry1I、Cry2、Cry3、Cry10和Cry11毒素(73–82kDa)是独特的，因为它们似乎是更大Cry1和Cry4蛋白(130–140kDa)的天然截短。

Cry蛋白是在Bt的孢子形成阶段期间以晶态形式积聚为原毒素的球状蛋白质分子。在由有害生物摄取后，这些晶体典型地被溶解以释放原毒素，原毒素大小的范围可以为，例如，对于许多该鳞翅目活性的Cry蛋白质如Cry1和Cry9为从130-140kDa，并且对于鞘翅目活性的Cry3蛋白及鳞翅目/双翅目活性的Cry2蛋白为60-80kDa。在这些晶体被易感昆虫溶解后，这些释放的原毒素被昆虫肠道中的蛋白酶例如胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶加工，以产生一种抗蛋白酶的核心Cry蛋白毒素。这种蛋白水解加工涉及从各种Cry原毒素的不同区域移除氨基酸。例如，为130-140kDa的Cry原毒素典型地通过蛋白水解移除25-30个氨基酸的N-末端肽以及C-末端的大约一半的剩余蛋白，产生一种约60-70kDa成熟Cry毒素。为60-80kDa的原毒素，例如Cry2和Cry3，也被加工但是其程度不与更大的原毒素相同。与更大的原毒素相比，较小的原毒素典型地从N-末端移除相等或更多个氨基酸，但较少氨基酸被从C-末端移除。例如，Cry2家族成员的蛋白水解激活典型地涉及移除约40-50个N-末端氨基酸。许多Cry蛋白对特定的目标昆虫是相当有毒的，但许多具有窄的活性谱。

Cry蛋白质通常具有五个保守序列域、以及三个保守结构域(参见，例如，德阿加迪尔(de Maagd)等人.(2001)《遗传学趋势》(TrendsGenetics)17:193-199)。第一保守结构域(称作结构域I)典型地由七个α螺旋组成并且涉及膜插入以及孔形成。结构域II典型地由三个安排为希腊钥匙构型的β片层组成，并且结构域III典型地由两个处于‘果冻卷’(‘jelly-roll’)构造的反平行的β片层(德阿加迪尔(de Maagd)等人，2001，同上)组成。结构域II和III涉及受体识别和结合，并且因此被考虑为毒素特异性的决定物。

众多商业上有价值的植物，包括普通的农作物，易受植物有害生物(包括昆虫和线虫有害生物)的攻击的影响，导致作物产量和品质的实质性降低。例如，植物有害生物是在全世界重要农作物损失中的一个主要因素。由于昆虫有害生物和疾病，在中国每年收获的谷类损失约15％-20％。此外，由于无脊椎有害生物(包含昆虫)的侵染，仅在美国每年就损失大约80亿美元。昆虫有害生物对于菜农和果农，对于观赏性花卉的生产商，以及对于家庭花匠也是一种负担。

昆虫有害生物主要是通过密集使用化学杀有害生物剂来控制，这些化学杀有害生物剂通过抑制昆虫成长，预防昆虫摄食或繁殖，或者导致死亡而有效。生物性有害生物控制剂，例如表达杀有害生物毒素(如Cry蛋白)的苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)菌株，也已经应用至作物植物中，产生了令人满意的结果，提供化学杀有害生物剂的替代物或补充物。已经分离了编码这些Cry蛋白的一些的基因并且它们在异源性宿主(例如转基因植物)中的表达已经显示出提供了另一种用于控制经济上重要的昆虫有害生物的手段。

因此可以达到良好的昆虫控制，但是某些化学品有时也能影响非靶标有益昆虫，并且某些生物制剂具有非常窄的活性谱。此外，某些化学和生物控制方法的继续使用增加了昆虫有害生物对此类控制措施产生抗性的机会。通过各种抗性管理实践已部分地缓和了这种状况，但仍需要开发新型并有效的有害生物控制剂，这些有害生物控制剂为农民提供经济利益并且是环境可接受的。特别需要是可以靶向更广谱的经济上重要的昆虫有害生物并有效控制昆虫品系的控制剂，这些昆虫品系对现有的昆虫控制剂是有抗性的或可以变得有抗性。

概述

鉴于这些需求，本发明的一个目的是通过提供新的苏云金杆菌(Bt)分离株连同可以用来控制多种植物有害生物的新颖基因和杀有害生物蛋白来提供新的有害生物控制剂。

本发明提供了用于赋予细菌、植物、植物细胞、组织以及种子的杀有害生物活性的组合物以及方法。具体地，提供了包括从Bt分离的编码Cry蛋白的新颖多核苷酸的嵌合基因以及实质上与其一致的序列，这些序列的表达导致具有对经济上重要的昆虫有害生物(特别是侵染植物的昆虫有害生物)的毒性的蛋白质。本发明进一步涉及由这些多核苷酸的表达生成的新颖的Cry蛋白，并且涉及含有这些Cry蛋白的组合物以及配制品，它们通过抑制昆虫有害生物的生存、生长以及繁殖或者限制昆虫相关的对作物植物的损害或损失的能力对昆虫是有毒的。本发明的Cry蛋白包括天然Cry蛋白以及具有一个或多个氨基酸置换、添加或缺失的突变型或变体Cry蛋白。突变型Cry蛋白的实例包括但不限于那些被突变为具有比其天然Cry蛋白对应物更宽的活性谱或更高的特异活性，那些经突变以引入一个表位来产生从天然蛋白中差异识别出经突变的蛋白的抗体，或那些经突变以调节在转基因生物中的表达。本发明的新颖Cry蛋白质对昆虫有害生物是高毒性的。例如，本发明的Cry蛋白可以用于控制一种或多种经济学上重要的昆虫有害生物，所述昆虫有害生物例如亚洲玉米蛀虫(Asian cornborer)(亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis))、黑色地老虎(blackcutworm)(小地老虎(Agrotis ipsilon))、棉螟蛉(cotton bollworm)(棉铃虫(Helicoverpa armigera))、黄色桃螟虫(yellow peach borer)(桃蛀螟(Conogethes punctiferalis))、东方黏虫(Oriental armyworm)(东方粘虫(Mythimna sepatate))、欧洲玉米蛀虫(European cornborer)(欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis))、秋黏虫(fall armyworm)(草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda))、玉米穗蛾(corn earworm)(玉米穗虫(Helicoverpa zea))、甘蔗螟(sugarcane borer)(小蔗螟(Diatraea saccharalis))，绒毛豆毛虫(velvetbean caterpillar)(黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis))、大豆夜蛾(soybean looper)(大豆尺蠖(Chrysodeixis includes))，西南玉米蛀虫(southwest cornborer)(西南玉米螟(Diatraea grandiosella))、西部豆切根虫(westernbean cutworm)(西部豆夜蛾(Richia albicosta))、烟夜蛾(tobaccobudworm)(烟芽夜蛾(Heliothis virescens))、条纹蛀茎虫(stripedstem borer)(二化螟(Chilo suppressalis))、粉蛀茎虫(pink stemborer)(非洲大螟(Sesamia calamistis))、水稻卷叶螟(rice leaffolder)(稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis))等。

本发明还提供了合成的多核苷酸，其编码本发明的Cry蛋白，这些Cry蛋白已经进行一个或多个密码子优化用于在转基因生物如转基因细菌或转基因植物中表达。

本发明进一步涉及表达盒和重组载体，其包括一种编码本发明的Cry蛋白的多核苷酸。本发明还提供了包括嵌合基因、或表达盒或重组载体的经转化的细菌、植物、植物细胞、组织、以及种子，该嵌合基因或表达盒或重组载体在经转化的细菌、植物、植物细胞、组织以及种子中表达本发明的Cry蛋白方面是有用的。

本发明还涉及分离的苏云金杆菌(Bt)菌株，这些菌株产生本发明的Cry蛋白。此类Bt菌株可以是天然存在的分离株或一种转基因Bt菌株，其产生本发明的Cry蛋白中的一种或多种。

本发明还涉及使用这些多核苷酸的方法，例如在DNA构建体或嵌合基因或表达盒或重组载体中用于在生物(包括植物和微生物，如细菌)中进行转化和表达。核苷酸或氨基酸序列可以是已经被设计用于在一种生物(如一种植物或细菌)中表达的天然的或合成的序列，或者制成杂交的、具有增强的杀有害生物活性的Cry毒素。本发明进一步涉及制造这些Cry蛋白的多种方法以及使用这些多核苷酸序列和Cry蛋白的多种方法，例如，在微生物中控制昆虫或者在转基因植物中赋予保护免受昆虫损害。

本发明的另一个方面包括杀昆虫组合物和配制品，这些组合物和配制品包括本发明的Cry蛋白或苏云金杆菌菌株；以及使用这些组合物或配制品来控制昆虫群体的多种方法，例如通过将这些组合物或配制品施用至昆虫侵袭的区域，或者施用至预防性处理易感染昆虫的区域或植物以赋予针对昆虫有害生物的保护。任选地，除本发明的Cry蛋白或Bt菌株之外，本发明的这些组合物或配制品还可以包括其他杀有害生物剂(例如化学杀有害生物剂)以加强或增强组合物或配制品的昆虫控制能力。

本发明的这些组合物和方法有用于控制攻击植物、特别是作物植物的昆虫有害生物。本发明的这些组合物对于产生改变的或改善的具有杀有害生物活性的Cry蛋白、或对于检测商用产品或转基因生物中的Cry蛋白或核酸的存在也是有用的。

参考以下详细的说明和权利要求书，本发明的这些和其他特征、方面、以及优点将变得更好理解。

附图简要说明

图1是BT-0049和BT-0211 Cry蛋白的氨基酸序列的比对。

在序列表中的序列的简要说明

SEQ ID NO:1代表对BT-0049蛋白进行编码的核苷酸序列。

SEQ ID NO:2代表对BT-0063蛋白进行编码的核苷酸序列。

SEQ ID NO:3代表对BT-0064蛋白进行编码的核苷酸序列。

SEQ ID NO:4代表对BT-0086蛋白进行编码的核苷酸序列。

SEQ ID NO:5代表对BT-0498蛋白进行编码的核苷酸序列。

SEQ ID NO:6代表对BT-0049蛋白进行编码的密码子优化序列。

SEQ ID NO:7代表对BT-0063蛋白进行编码的密码子优化序列。

SEQ ID NO:8代表对BT-0064蛋白进行编码的密码子优化序列。

SEQ ID NO:9代表对BT-0086蛋白进行编码的密码子优化序列。

SEQ ID NO:10代表对BT-0498蛋白进行编码的密码子优化序列。

SEQ ID NO:11代表对突变型BT-0049蛋白进行编码的核苷酸序列。

SEQ ID NO:12代表对突变型BT-0063蛋白进行编码的核苷酸序列。

SEQ ID NO:13代表对突变型BT-0064蛋白进行编码的核苷酸序列。

SEQ ID NO:14代表对突变型BT-0086蛋白进行编码的核苷酸序列。

SEQ ID NO:15代表对突变型BT-0498蛋白进行编码的核苷酸序列。

SEQ ID NO:16代表BT-0049蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO:17代表BT-0063蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO:18代表BT-0064蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO:19代表BT-0086蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO:20代表BT-0498蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO:21代表突变型BT-0049蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO:22代表突变型BT-0063蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO:23代表突变型BT-0064蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO:24代表突变型BT-0086蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO:25代表突变型BT-0498蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO:26代表BT-0211蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO:27代表对BT-0049样蛋白而言独特的氨基酸序列。

SEQ ID NO:28代表对BT-0049样蛋白而言独特的氨基酸序列。

详细说明

本说明不旨在是一个本发明以其而实施的所有不同方式，或可以加入本发明中的所有特征的详细目录。例如，关于一个实施例所说明的特征可以结合入其他实施例中，并且关于一个具体实施例所说明的特征可以从那个实施例删除。因此，本发明考虑了，在本发明的一些实施例中，可以排除或省略在此陈述的任何特征或特征的组合。另外，鉴于本披露内容，对在此建议的不同实施例的众多变体以及附加对于本领域技术人员是明显的，这不脱离本发明。因此，以下说明旨在阐述本发明的一些具体实施例，并且并没有穷尽地叙述其所有排列、组合和变化。

除非另外定义，否则所有在此使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的意思。在此的本发明的说明中使用的术语是仅出于描述具体实施例的目的，且并不旨在限制本发明。

定义

当在本文和附带的权利要求中使用时，单数形式“一个/种(a)”、“和(and)”和“所述/该(the)”包括复数指代物，除非上下文明确地指示其他的情况。因此，例如，提及“一种植物”是提及一种或多种植物并且包括本领域技术人员已知的其等效物，等等。如在此使用的，词语“或/或者(or)”意指具体清单的任何一个成员并且还包括这个清单的成员的任何组合(即，还包括“和”)。

术语“约”在此用于表示近似、大致、约或在.....左右。当术语“约”结合数值范围来使用时，它通过将边界延伸至高于以及低于所阐明的数值来限定这个范围。通常，术语“约”在此用于将数值限定至以20％的变化、优选10％上下(更高或更低)地高于以及低于规定值。关于温度，术语“约”意指±1℃，优选±0.5℃。当术语“约”被用于本发明的上下文中(例如与温度或分子量值组合)时，精确值(即，无“约”)是优选的。

如在此所使用的，术语“扩增的”是指使用至少一种核酸分子作为一个模板，构建一个核苷酸分子的多个拷贝或与该核酸分子互补的多个拷贝。扩增系统包括聚合酶链式反应(PCR)系统、连接酶链式反应(LCR)系统、基于核酸序列的扩增(NASBA，Cangene公司，密西索加(Mississauga)，安大略省(Ontario))、Q-β复制酶系统、基于转录的扩增系统(TAS)以及链置换扩增(SDA)。参见例如诊断分子微生物学：原理与应用(Diagnostic Molecular Microbiology:Principles and Applications)，佩尔辛(PERSING)等人编著，美国微生物学会(American Society for Microbiology)，华盛顿哥伦比亚特区(Washington,D.C.)(1993)。扩增产物被称为“扩增子”。

如在此所使用的术语“嵌合构建体”或“嵌合基因”或“嵌合多核苷酸”或“嵌合核酸”(或类似术语)是指一种构建体或分子，该构建体或分子包括被组装进单个核酸分子中的不同来源的两个或更多个多核苷酸。术语“嵌合构建体”、“嵌合基因”、“嵌合多核苷酸”或“嵌合核酸”是指任何建体或分子，其包含但不限于(1)多核苷酸(例如，DNA)，包括在自然界中没有被发现在一起的调节多核苷酸和编码多核苷酸(即，构建体中的至少一个多核苷酸相对于它的其他多核苷酸中的至少一个是异源的)，或(2)编码不是天然毗邻的蛋白部分的多核苷酸，或(3)不是天然毗邻的启动子部分。另外，嵌合构建体、嵌合基因、嵌合多核苷酸或嵌合核苷酸可以包括衍生自不同来源的调节多核苷酸和编码多核苷酸，或包括衍生自相同来源、但以与在自然界中所发现的不同的方式进行安排的调节多核苷酸和编码多核苷酸。在本发明的一些实施例中，该嵌合构建体、嵌合基因、嵌合多核苷酸或嵌合核酸包括表达盒，该表达盒包括一种在调节多核苷酸的控制下、特别地在植物或细菌中具有功能性的调节多核苷酸的控制下的本发明的多核苷酸。

“编码序列”是转录成RNA(如mRNA、rRNA、tRNA、snRNA、正义RNA或反义RNA)的一个核酸序列。优选地，该RNA进而在一个生物体中被翻译以产生一种蛋白质。

如在此使用的，“密码子优化的”序列意指一种重组的、转基因的、或合成的多核苷酸的核苷酸序列，其中这些密码子被选择以反映宿主细胞或生物可以具有的特定的密码子偏好性。这典型地是以这样一种方式来完成，该方式是为了保持由密码子优化的核苷酸序列所编码的多肽的氨基酸序列。在某些实施例中，该重组DNA构建体的DNA序列包括已经针对该构建体有待在其中进行表达的细胞(例如，动物、植物、或真菌细胞)进行了密码子优化的序列。例如，一种有待在植物细胞中表达的构建体可以使它的全部或部分序列(例如，第一基因抑制元件或基因表达元件)进行密码子优化用于在植物中的表达。参见例如美国专利号6,121,014，通过引用结合在此。

“控制”昆虫意指通过一种毒性作用抑制昆虫有害生物存活、生长、摄食、或繁殖的能力，或者限制与昆虫有关的损害或作物植物中的损失，或者保护在昆虫有害生物存在的条件下生长时的作物的产量潜力。“控制”昆虫可以是或可以不是意指杀死昆虫，尽管它优选意指杀死昆虫。

术语“包括(comprises)”或“包括(comprising)”当用于本说明书中时指示所说明的特征、整数、步骤、操作、要素、或组分的存在，但并不排除一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、要素、组分、或其组的存在或添加。

如在此使用的，连接词“基本上由...组成”(以及语法变体)意指，权利要求书的范围有待被解读为涵盖权利要求书中所列举的指定材料或步骤以及不实质上改变所要求的发明的一个或多个基本和新颖特征的那些。因此，当用于本发明的权利要求中时，术语“基本上由......组成”并不意在被解释为等同于“包括(comprising)”。

在本发明的背景中，“相应于(corresponding to)”或“相应于(corresponds to)”意指当变体或同系物Cry蛋白的氨基酸序列与彼此比对时，“相应于”在该变体或同系物蛋白中某些枚举的位置的这些氨基酸是与参比蛋白中的这些位置比对的那些，但在相对于本发明的特定参比氨基酸序列而言的这些精确的数字位置中是不必要的。例如，如果SEQ ID NO:16是参比序列并且与SEQ ID NO:26比对的话，SEQ ID NO:26的Arg415“对应于”SEQ ID NO:16的Gly421。

如在此所使用的，术语“Cry蛋白”意指苏云金杆菌晶体δ-内毒素类型的杀昆虫蛋白。术语“Cry蛋白”可以指原毒素形式或其任何杀昆虫活性的片段或毒素。

“递送”一种组合物或毒性蛋白意指该组合物或毒性蛋白与一种昆虫接触，这促进该组合物或毒性蛋白的经口摄取，产生对昆虫的毒性作用和控制。可以按照许多公认的方式，包括但不限于转基因植物表达、一种或多种配制的蛋白质组合物、一种或多种可喷洒的蛋白质组合物、一种饵基(bait matrix)、或任何其他的领域公认的蛋白递送系统来递送该组合物或毒性蛋白。

术语“域”是指沿着进化相关蛋白的序列的比对在特定位置处保守的一组氨基酸。虽然其他位置上的氨基酸可在同系物之间有所不同，但是在特定位置处高度保守的氨基酸指示在蛋白质的结构、稳定性或功能中很可能是必需的氨基酸。通过其在蛋白质同系物家族的经比对序列中的高度保守性进行鉴别，其可用作鉴别物(identifier)，用来确定所讨论的任何多肽是否属于先前鉴别的多肽组。

“有效的昆虫控制量”意指毒性蛋白的浓度，它通过一种毒性作用抑制昆虫存活、生长、摄食或繁殖的能力，或者限制昆虫相关的损害或作物植物损失，或者保护在昆虫有害生物存在的条件下生长时的作物的产量潜力。“有效的控制昆虫的量”可以或可以不是意为杀死昆虫，尽管它优选意为杀死昆虫。

如在此使用的“表达盒”意指能够在适当的宿主细胞中指导至少一种感兴趣的多核苷酸(例如编码本发明的Cry蛋白的多核苷酸)的表达的核酸序列，包括启动子，该启动子可操作地连接至感兴趣的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至终止信号。“表达盒”还典型地包括正确翻译感兴趣的多核苷酸所需的另外的多核苷酸。该表达盒还可以包括在感兴趣的多核苷酸的直接表达中不是必需的但是由于用于从一个表达载体去除该表达盒的方便限制位点而存在的其他多核苷酸。包括一个或多个感兴趣的核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，意味着它的组分中的至少一种相对于它的其他组分中的至少一种是异源的。该表达盒还可以是一种天然发生的表达盒，但已经是以对于异源表达有用的重组形式而获得的。然而，典型地，该表达盒相对于该宿主是异源的，即在该表达盒中的感兴趣的多核苷酸不是天然存在于该宿主细胞中的，并且必须已经通过转化过程或育种过程引入到该宿主细胞或该宿主细胞的祖先中。该表达盒中的一个或多个感兴趣的多核苷酸的表达通常是在启动子的控制下。在多细胞生物(如一种植物)的情况下，该启动子还可能对于特定组织、或器官、或者发育阶段是特异性的或优先的。当被转化进植物中时，表达盒或其片段也可被称为“插入的多核苷酸”或者“插入多核苷酸”。

“基因”在此定义为包括一个或多个多核苷酸的一种遗传单位，该遗传单位占据染色体或质粒上特定位置并且包含用于生物中的具体特征或性状的遗传指令。

“肠蛋白酶”是在虫的消化道中天然发现的一种蛋白酶。该蛋白酶通常涉及被摄取的蛋白质的消化中。肠蛋白质酶的实例包括胰蛋白酶，其典型地切割赖氨酸(K)或精氨酸(R)残基的C-端侧上的肽；以及胰凝乳蛋白酶，其典型地切割苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)或酪氨酸(Y)的C-端侧上的肽。

当提及基因或多核苷酸或多肽使用时，术语“异源”是指基因或多核苷酸或多肽不是在其天然环境中或包含其非天然环境中存在的一部分(即，已经通过人工改变)。例如，异源基因可以包括自一个物种引入到另一个物种的多核苷酸。异源基因还可以包括对生物来说是天然的多核苷酸，该多核苷酸已经以一些方式(例如，突变；以多个拷贝添加；连接至一种非天然启动子或增强子多核苷酸等)被改变。异源基因可以进一步包括植物基因多核苷酸，其包括植物基因的cDNA形式；这些cDNA可以以正义方向(以产生mRNA)或反义方向(以产生一种反义RNA转录本，其与mRNA转录本是互补的)被表达。在本发明的一个方面，异源基因区别于内源性植物基因在于该异源基因多核苷酸被典型地连接至包括调节元件如启动子的多核苷酸上，未发现这些多核苷酸与由该异源基因编码的蛋白质的基因或与该染色体中的植物基因多核苷酸天然相关联，或者与在自然界中未发现的染色体的部分(例如，在基因座中表达的基因，其中该基因未正常表达)相关联。另外，“异源”多核苷酸是指不与将多核苷酸引入其中的宿主细胞天然地相关联的多核苷酸，包括天然存在的多核苷酸的非天然存在的多拷贝。

“同源重组”是在相同的多核苷酸的一个区域中成对染色体的两个DNA分子或染色单体之间的DNA片段的交换(“交叉”)。“重组事件”在此被理解为意指一种减数分裂交叉。

当核酸序列编码了一种多肽(该多肽与由一种参考核酸序列所编码的多肽具有相同的氨基酸序列)时，这种核苷酸序列与这种参考核酸序列“同类编码”。例如，SEQ ID NO:6与SEQ ID NO:1为同类编码，因为它们都编码由SEQ ID NO:16代表的氨基酸序列。

术语“分离的”核酸分子、多核苷酸或蛋白是一种不再存在于其天然环境中的核酸分子、多核苷酸或蛋白。本发明的分离的核酸分子、多核苷酸或蛋白可以按照一种纯化的形式存在，或者可以存在于重组宿主中，例如转基因细菌或转基因植物中。

“核酸分子”是可以从任何来源中分离的单链或双链DNA或RNA。在本发明的背景中，该核酸分子优选地是一个DNA区段。

“可操作地连接”是指在一个单一核酸片段上多核苷酸的关联，这样使得一者的功能影响另一者的功能。例如，当启动子能够影响编码多核苷酸或功能RNA的表达时(即，该编码多核苷酸或功能RNA处于该启动子的转录控制之下)，则该启动子与该编码多核苷酸或功能RNA是可操作地连接的。正义方向或者反义方向的编码多核苷酸能够与调节多核苷酸可操作地连接。

如在此使用的“杀有害生物”、“杀昆虫”等是指本发明的Cry蛋白控制有害生物的能力或者可以控制如在此所定义的有害生物的Cry蛋白的量。因此，杀有害生物Cry蛋白可以杀死或抑制有害生物(例如，昆虫有害生物)存活、生长、摄食、或繁殖的能力。

“植物”是在发育的任何阶段的任何植物，特别是种子植物。

“植物细胞”是植物的结构和生理单位，包括原生质体和细胞壁。植物细胞可以处于一种分离的单细胞或一种培养细胞的形式，或者是作为较高级的组织单位(例如，植物组织、植物器官、或整株植物)的一部分。

“植物细胞培养物”意指植物单元(例如像，原生质体、细胞培养物细胞、植物组织中的细胞、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、接合子以及处于不同发育阶段的胚)的培养物。

“植物材料”是指叶、茎、根、花或花的部分、果实、花粉、卵细胞、接合子、种子、切条、细胞或组织培养物、或一种植物的任何其他部分或产物。

“植物器官”是植物的一个独特而明显的已结构化并且分化的部分，如根、茎、叶、花蕾或胚。

如在此使用的“植物组织”意指组织化成结构和功能单元的一组植物细胞。包括植物中或培养物中的任何植物组织。这个术语包括但不限于：全株植物、植物器官、植物种子、组织培养物以及被组织化成结构或功能单元的任何植物细胞群组。这个术语与以上列出的或由该定义以其他方式涵盖的任何具体类型的植物组织的联合应用或单独应用并不旨在排除任何其他类型的植物组织。

“多核苷酸”是指由共价键合于一条链中的许多核苷酸单体构成的一种聚合物。此类“多核苷酸”包括DNA、RNA、经修饰的寡核苷酸(例如，包括对于生物RNA或DNA不典型的碱基的寡核苷酸，如2'-O-甲基化寡核苷酸)等。在一些实施例中，核酸或多核苷酸可以是单股、双股、多股或其组合。除非另外指示，否则本发明的具体核酸或多核苷酸任选地包括或编码除明确指示的任何多核苷酸之外的互补多核苷酸。

“感兴趣的多核苷酸”是指任何多核苷酸，当其转移至一个生物(例如，一种植物)中时赋予该生物一种所希望的特征，如昆虫抗性、疾病抗性、除草剂耐受性、抗生素抗性、改善的营养价值、工业过程中改善的性能、商业上有价值的酶或代谢物的生产、或者改变的繁殖能力。

术语“启动子”是指多核苷酸，通常在它的编码多核苷酸的上游(5')，它通过提供对正确转录所需的RNA聚合酶以及其他因子的识别来控制该编码多核苷酸的表达。

“原生质体”是一种分离的植物细胞，没有细胞壁或仅具有部分的细胞壁。

如在此所使用的，术语“重组”是指核酸分子(例如，DNA或RNA)或蛋白质或生物的一种形式，该形式通常不会在自然界中发现并且正因为如此通过人类干预来产生。如在此所使用的，“重组核酸分子”是包括多核苷酸组合的核酸分子，这些多核苷酸不会天然地一起存在并且是人类干预的结果，例如，一种核酸分子，该核酸分子由至少两种彼此异源的多核苷酸的组合组成；或一种核酸分子，该核酸分子是人工合成的并且包括偏离通常存在于自然界中的多核苷酸的一种多核苷酸；或一种核酸分子，该核酸分子包括人工掺入至宿主细胞的基因组DNA中的转基因和该宿主细胞基因组的相关侧翼DNA。重组核酸分子的一个实例是由将转基因插入至植物的基因组DNA中产生的一种DNA分子，其可以最终导致该生物中的重组RNA或蛋白质分子的表达。如在此使用的，“重组植物”是一种通常不会在自然界中存在的植物，是人类干预的结果，并且包含掺入至其基因组中的转基因或异源核酸分子。由于此类基因组改变，该重组植物明显不同于相关的野生型植物。

“调节元件”是指涉及控制核苷酸序列的表达的序列。调节元件包括一个可操作地连接至感兴趣的核苷酸序列和终止信号上的启动子。它们还典型地涵盖了适当翻译该核苷酸序列所要求的序列。

在两个核酸或氨基酸序列的背景下，术语“一致性”或“一致的”或“实质上一致的”是指当针对最大对应性进行比较和比对时具有至少60％、优选至少80％、更优选90％、甚至更优选95％、并且最优选至少99％核苷酸或氨基酸残基一致性的两个或更多个序列或子序列，如使用以下序列比较算法之一或通过目测检查所测量的。优选地，该实质上的一致性存在于整个具有长度为至少约50个残基或碱基的序列的区域中，更优选地在整个至少约100个残基或碱基的区域中，并且最优选地这些序列在至少约150个残基或碱基上是实质上一致的。在一个尤其优选的实施例中，这些序列在这些编码区的全部长度上基本上是一致的。此外，实质上一致的核酸或氨基酸序列实质上执行相同的功能。

对于序列比较，典型地，一个序列充当与测试序列进行比较的参比序列。当使用一种序列比较算法时，将测试和参比的序列输入到电脑中(若有必要，指定子序列坐标)，并且指定序列算法程序的参数。然后，这种序列比较算法基于所指定的程序参数来计算这个或这些测试序列相对于该参考序列的序列一致性百分比。

用于比较的序列的最佳比对可以按照以下方式进行，例如通过史密斯(Smith)和沃特曼(Waterman)，《应用数学进展》(Adv.Appl.Math.)2:482(1981)的局部同源性算法、通过尼德尔曼(Needleman)和伍兹(Wunsch)，《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)48:443(1970)的同源比对算法、通过皮尔森(Pearson)和李普曼(Lipman)，《美国科学院院报》(Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA)85:2444(1988)的相似性法的搜索，通过这些算法(威斯康星州遗传学分析软件包、遗传学计算机组、575科学驱动(Science Dr.)，麦迪逊(Madison),Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA、以及TFASTA)的计算机化实施、或通过目测检查(总体上见奥苏贝尔(Ausubel)等人，下文)。

一种适合于确定序列一致性百分数以及序列相似性的算法的一个实例是BLAST算法，它说明于Altschul等人，《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol).215:403-410(1990)。执行BLAST分析的软件是通过国家生物技术信息中心(the National Center for BiotechnologyInformation，美国国家医学图书馆(U.S.National Library ofMedicine)，8600 Rockville Pike,Bethesda,MD 20894 USA)可供公众使用的。这种算法涉及首先通过识别查询序列中具有长度W的短字码而识别得分高的序列对(HSP)，这些得分高的序列对当与数据库序列中具有相同长度的字码(word)进行比对时匹配或满足一些正值阈值的得分T。T被称为邻近字码得分阈(Altschul等人，1990)。这些初始的邻近字码命中充当种子用于起始搜索以发现包含它们的较长的HSP。然后，将这些字码命中在两个方向上沿着每个序列延伸直到累积的比对得分可以得到增加。对于核苷酸序列，使用参数M(对于一对匹配残基的奖赏得分；总是>0)和N(对于错配残基的罚分；总是<0)来计算累积的得分。对于氨基酸序列，使用得分矩阵来计算该累积得分。当累积的比对得分从它的最大达到值降低了数量X；由于累积一个或多个负得分的残基比对使累积得分趋于0或0以下；或者到达任一序列的末端时，停止这些字码命中在每个方向上的延伸。BLAST算法的参数W、T、以及X决定了该比对的灵敏度与速度。BLASTN程序(对核苷酸序列来说)使用字长(W)为11、期望值(E)为10、截止值(cutoff)为100、M＝5、N＝-4、以及两条链的比较作为默认值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长(W)为3、期望值(E)为10、以及BLOSUM62评分矩阵作为默认设置(参见赫尼科夫(Henikoff)和赫尼科夫(Henikoff)，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89:10915(1989))。

除了计算序列一致性百分数之外，BLAST算法还进行两个序列之间相似性的一种统计分析(见，例如Karlin&Altschul,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 90:5873-5787(1993))。由BLAST算法提供的相似性的一种量度是最小概率总和(P(N))，它提供了在两个核苷酸或氨基酸序列之间会偶然发生一个匹配的概率的一个指示。例如，若在一个测试核酸序列与一个参比核酸序列的比较中该最小概率和是小于约0.1、更优选地是小于约0.01、并且最优选地是小于约0.001，则该测试核酸序列被认为是与该参比序列相类似的。

两个核酸序列实质上一致的另一指示是这两种分子在严格条件下彼此杂交。短语“特异性杂交”是指一种分子在严格条件下仅可与一种特定的核苷酸序列结合、双链化或杂交，这是在该序列存在于一种复合混合物(例如，总细胞的)DNA或RNA中时进行的。“实质上结合”是指在一个探针核酸与一个靶核酸之间的互补杂交，并且涵盖少量错配，这些错配可以通过降低该杂交介质的严格来容纳，以实现该靶核酸序列的所希望的检测。

在核酸杂交实验(如DNA和RNA杂交)的背景下“严格杂交条件”和“严格杂交洗涤条件”是序列依赖性的，并且在不同的环境参数下是不同的。较长的序列特定地在较高的温度下杂交。对核酸杂交的广泛指导见于蒂森(Tijssen)(1993)生物化学和分子生物学实验室技术-使用核酸探针的杂交第2章第I部分“杂交原理和核酸探针检验策略综述”(Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic Acid Probes part I chapter 2"Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleicacid probe assays")，爱思唯尔，纽约。总体上，高严格杂交和洗涤条件在限定的离子强度和pH下被选定为比特定序列的热熔点(T_m)低约5℃。典型地，在“严格条件”下，一种探针将会与它的目标子序列进行杂交，但不会与其他序列杂交。

T_m是50％的目标序列与完全匹配的探针进行杂交时的温度(在限定的离子强度和pH下)。极严格条件被选定为等于具体探针的T_m。对于互补核酸(它们在DNA或RNA印迹中在滤器上具有超过100个互补的残基)的杂交的严格杂交条件的一个实例是在42℃下、具有1mg肝素的50％甲酰胺、将杂交进行过夜。高严格洗涤条件的一个实例是0.15M NaCl在72℃下大约15分钟。严格洗涤条件的一个实例是在65℃下，0.2x SSC洗涤持续15分钟(参见，Sambrook，以下，对于SSC缓冲剂的说明)。经常，高严格洗涤之前会先进行低严格洗涤，以去除背景探针信号。对于一个例如多于100个核苷酸的双链体的实例性中等严格性洗涤是1x SSC，在45℃持续15分钟。对于一种例如超过100个核苷酸的双链体(duplex)的低严格洗涤的一个实例是在40℃下的4-6x SSC持续15分钟。对于短探针(例如，大约10-50个核苷酸)，严格条件典型地涉及小于约1.0M的Na离子的盐浓度，典型地在pH 7.0至8.3下，大约0.01至1.0M的Na离子浓度(或其他盐类)，并且该温度典型地是至少约30℃。通过加入去稳定试剂例如甲酰胺也可以实现严格条件。一般而言，相比于不相关的探针，在特定的杂交测定中观察到高出2倍(或更高)的一个信噪比就表明检测到一个特异的杂交。如果在严格条件下彼此不杂交的核酸所编码的蛋白是实质上一致的，则它们仍然是实质上一致的。例如，当使用该遗传密码允许的最大程度的密码简并而生成一个核酸的拷贝时，则发生这种情况。

以下是杂交/洗涤条件的组的实例，这些条件可被用来克隆与本发明的参比核苷酸序列实质上一致的同源核苷酸序列：一种参比核苷酸序列在以下条件下优选地与该参比核苷酸序列杂交：在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄、1mM EDTA中在50℃下，并且在2x SSC、0.1％SDS中在50℃下洗涤；更令人希望的是在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄、1mM EDTA种在50℃下，并且在1x SSC、0.1％SDS中在50℃下洗涤；仍又更加令人希望的是在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄、1mM EDTA中在50℃下，并且在0.5x SSC、0.1％SDS中在50℃下洗涤；优选地在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄、1mM EDTA中在50℃下，并且在0.1x SSC、0.1％SDS中在50℃下洗涤；更优选地在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄、1mM EDTA中在50℃下，并且在0.1x SSC、0.1％SDS中在65℃下洗涤。

两个核酸序列或蛋白基本上是一致的另一个指示是指由该第一核酸编码的蛋白与由该第二核酸编码的蛋白进行免疫性交联反应或与其特异性结合。因此，一种蛋白典型地是与一种第二蛋白基本上一致的，例如其中这两种蛋白仅区别于保存性取代。

“合成的”是指一种核苷酸序列，该核苷酸序列包括在天然序列中不存在的碱基或结构特征。例如，编码本发明的Cry蛋白的一种人工序列，其更类似于G+C含量并且双子叶或单子叶植物基因的正常密码子分布表述为合成的。

如在此使用的，一种对昆虫有害生物是“毒性的”Cry蛋白意指该Cry蛋白充当一种口服活性的昆虫控制剂以杀死昆虫有害生物，或者该Cry蛋白质能够破坏或阻止昆虫摄食、或引起对昆虫有害生物的生长抑制，其两者可以引起或可以不引起昆虫死亡。当本发明的Cry蛋白被递送至昆虫或昆虫与Cry蛋白进行经口接触时，该结果典型地是该昆虫的死亡、或者该昆虫的生长减慢、或者该昆虫停止以使该有毒的Cry蛋白可供该昆虫利用的来源为食。

“转化”是一种用于将异源核酸引入到宿主细胞或生物的方法。具体地，“转化”意为DNA分子稳定整合到一种感兴趣生物的基因组中。

“转化的/转基因的/重组的”是指一种宿主生物，例如其中引入了一种异源核酸分子的一种细菌或一种植物。该核酸分子可以被稳定地整合到宿主的基因组中，或者该核酸分子还可以作为一种染色体外分子存在。这样的一种染色体外分子能够自主复制。转化的细胞、组织或植物应当理解为不仅包含转化过程的终产物，而且包含其转基因子代。一种“非转化的”、“非转基因的”、或“非重组的”宿主是指一种野生型生物，例如一种细菌或植物，它不包含该异源的核酸分子。

核苷酸通过其碱基由以下标准缩写进行表示：腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)、以及鸟嘌呤(G)。氨基酸同样是由以下标准缩写来表示：丙氨酸(Ala；A)、精氨酸(Arg；R)、天冬酰胺(Asn；N)、天冬氨酸(Asp；D)、半胱氨酸(Cys；C)、谷氨酰胺(Gln；Q)、谷氨酸(Glu；E)、甘氨酸(Gly；G)、组氨酸(His；H)、异亮氨酸(Ile；I)、亮氨酸(Leu；L)、赖氨酸(Lys；K)、蛋氨酸(Met；M)、苯丙氨酸(Phe；F)、脯氨酸(Pro；P)、丝氨酸(Ser；S)、苏氨酸(Thr；T)、色氨酸(Trp；W)、酪氨酸(Tyr；Y)、以及缬氨酸(Val；V)。

本发明提供了用于控制有害的植物有害生物的多种组合物以及方法。特别地，本发明涉及Cry蛋白，其可以分离自细菌如苏云金杆菌，其对昆虫有害生物是有毒的；并且涉及包括编码这些Cry蛋白质的核苷酸序列的多核苷酸；以及涉及制造和使用这些多核苷酸和Cry蛋白以控制昆虫有害生物的方法。

根据一些实施例，本发明提供一种核酸分子或任选地一种分离的核酸分子，所述核酸分子包括编码处于其原毒素形式的一种Cry蛋白或其一种生物学活性或毒素片段的一个核苷酸序列，其中该核苷酸序列(a)与SEQ ID NO:1-5中任一项或其一种毒素编码片段具有至少80％到至少99％序列一致性；或者(b)编码包括一种氨基酸序列的一种蛋白，该氨基酸序列与SEQ ID NO:16-20中任一项或其毒素片段具有至少80％到至少99％序列一致性；或者(c)是(a)或(b)的一种合成序列，该合成序列已经进行密码子优化用于在一种转基因生物中表达。在其他实施例中，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、或SEQ ID NO:1-5中任一项的任何毒素编码片段。在其他实施例中，该合成核苷酸序列包括SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、或SEQ ID NO:6-15中任一项的任何毒素编码片段。

本发明还涵盖多核苷酸，其是Cry蛋白原毒素编码多核苷酸的片段。“片段”是指编码一种Cry蛋白的核苷酸序列的一个部分。核苷酸序列的片段可以编码Cry蛋白的生物活性部分，即所谓的“毒性片段”，或它可以是一个片段，使用以下披露的方法该片段可以用作一种杂交探针或PCR引物。核酸分子是Cry蛋白质核苷酸序列的片段，根据所期望的用途包括至少约15、20、50、75、100、200、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450个连续核苷酸，或高达存在于在此披露的全长Cry蛋白编码核苷酸序列中的核苷酸的数目(例如，用于SEQ ID NO:1的2343个核苷酸)。“连续的”核苷酸是指彼此直接相邻的核苷酸残基。本发明的核苷酸序列的一些片段将编码保留Cry蛋白的生物活性、并且因此保留杀昆虫活性的毒性片段。“保留杀昆虫活性”是指该片段将具有至少约30％、优选至少约50％、更优选至少约70％、甚至更优选至少约80％的Cry蛋白的杀昆虫活性。用于测量杀昆虫活性的方法在本领域是已熟知的。参见例如恰普拉(Czapla)和朗(Lang)(1990)《经济昆虫学杂志》(J.Econ.Entomol.)83:2480-2485；安德鲁斯(Andrews)等人(1988)《生物化学杂志》(Biochem.J.)252:199-206；马罗内(Marrone)等人(1985)《经济昆虫学杂志》(J.of EconomicEntomology)78:290-293；以及美国专利号5,743,477，其全部通过引用以其全文结合于此。

本发明的Cry蛋白的毒素片段将编码至少约15、25、30、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、和450个连续的氨基酸，或高达存在于本发明的全长Cry蛋白中的总数目的氨基酸(例如，用于SEQ ID NO:16的781个氨基酸)。

在一些实施例中，本发明的核酸分子包括以下项、或基本上由以下项组成、或由以下项组成：编码Cry蛋白的核苷酸序列，该Cry蛋白包括一种氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:16-20中任一项或其一种毒素片段具有至少80％到至少99％序列一致性。在一些其他实施例中，该氨基酸序列包括以下项、或基本由以下项组成、或由以下项组成：SEQ ID NO:16-20中任一项或其一种毒素片段。因此，在一些实施例中，借助于蛋白酶水解加工(例如通过从昆虫的肠中制备的蛋白酶)而已经被激活的Cry蛋白可以被表征并且经激活的毒素片段的N-末端或C-末端氨基酸被鉴定。在本发明的这个方面，本领域技术人员可以确定：例如，SEQ ID NO:17的毒素片段可能包括来自SEQ ID NO:17的约27-603或约27-624或约27-629个的氨基酸，或者SEQ ID NO:18的毒素片段可能包括来自SEQ ID NO:18的约43-623或约44-623个的氨基酸，或者SEQ ID NO:19的毒素片段可能包括来自约42-640或约43-640个的氨基酸，或者SEQ ID NO:20的毒素片段最可能包括来自SEQ ID NO:20的约27-603或约27-622个的氨基酸，或者通过在该编码序列的适当的位置处引入或消除蛋白酶加工位点以允许、或消除昆虫、植物或微生物蛋白酶对较大变体蛋白质的蛋白水解切割而产生的毒素片段Cry蛋白变体也在本发明的范围内。此类操作的最终结果被理解为产生具有与完整Cry原毒素蛋白相同或更好活性的毒素片段分子。

在本发明的一些实施例中，提供了一种嵌合基因，该嵌合基因包括异源启动子，该启动子可操作地连接至多核苷酸，该多核苷包括以下项、或基本上由以下项组成、或由以下项组成：核苷酸序列，该核苷酸序列编码对于鳞翅目有害生物是有毒的Cry蛋白，其中该核苷酸序列(a)与SEQ ID NO:1-5中任一项或其一种毒素编码片段具有至少80％(例如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％)到至少99％(99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％)序列一致性；或者(b)编码包括一种氨基酸序列的蛋白，该氨基酸序列与SEQ ID NO:16-20中任一项或其一种毒素片段具有至少80％(例如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％)到至少99％(99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％)序列一致性；或者(c)是(a)或(b)的一种合成序列，该合成序列已经进行密码子优化用于在一种转基因生物中表达。

在其他实施例中，该异源启动子是一种植物可表达型启动子。例如但不限于，该植物可表达型启动子可以选自下组，该组由以下各项组成：泛素、夜香树属黄病毒、玉米TrpA、OsMADS 6、玉蜀黍H3组蛋白、噬菌体T3基因95'UTR、玉米蔗糖合成酶1、玉米醇脱氢酶1、玉米捕光复合物、玉米热休克蛋白、玉米mtl、豌豆小亚基RuBP羧化酶、水稻肌动蛋白、水稻亲环蛋白、Ti质粒甘露碱合酶、Ti质粒胭脂碱合酶、矮牵牛查尔酮异构酶、豆类富甘氨酸蛋白1、马铃薯糖蛋白(potato patatin)、凝集素、CaMV 35S以及S-E9小亚基RuBP羧化酶启动子。

在另外的实施例中，由嵌合基因编码的蛋白对一种或多种鳞翅目有害生物是有毒的，这些鳞翅目有害昆虫选自下组，该组由以下各项组成：亚洲玉米蛀虫(Asian corn borer)(亚洲玉米螟(Ostriniafurnacalis))、黑色地老虎(black cutworm)(小地老虎(Agrotisipsilon))、棉螟蛉(cotton bollworm)(棉铃虫(Helicoverpaarmigera))、黄色桃螟虫(yellow peach borer)(桃蛀螟(Conogethespunctiferalis))、东方黏虫(Oriental armyworm)(东方粘虫(Mythimnasepatate))、欧洲玉米蛀虫(European corn borer)(欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis))、秋黏虫(fall armyworm)(草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda))、玉米穗蛾(corn earworm)(玉米穗虫(Helicoverpa zea))、甘蔗螟(sugarcane borer)(小蔗螟(Diatraeasaccharalis))，绒毛豆毛虫(velvetbean caterpillar)(黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis))、大豆夜蛾(soybean looper)(大豆尺蠖(Chrysodeixis includes))，西南玉米蛀虫(southwest corn borer)(西南玉米螟(Diatraea grandiosella))、西部豆切根虫(western beancutworm)(西部豆夜蛾(Richia albicosta))、烟夜蛾(tobaccobudworm)(烟芽夜蛾(Heliothis virescens))、条纹蛀茎虫(stripedstem borer)(二化螟(Chilo suppressalis))，粉蛀茎虫(pink stemborer)(非洲大螟(Sesamia calamistis))和水稻卷叶螟(rice leaffolder)(稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis))。

在另外的实施例中，该多核苷酸包括以下项、基本上由以下项组成、或由以下项组成：核苷酸序列，该核苷酸序列与SEQ ID NO:1或其一种毒素编码片段具有至少85％到至少99％序列一致性，或者与SEQ ID NO:2或其一种毒素编码片段具有至少95％到至少99％序列一致性，或者与SEQ ID NO:3或其一种毒素编码片段具有至少90％到至少99％序列一致性，或者与SEQ ID NO:4或其一种毒素编码片段具有至少90％到至少99％序列一致性，或者与SEQ ID NO:5或其一种毒素编码片段具有至少95％到至少99％序列一致性。在其他实施例中，该多核苷酸包括以下项、基本由以下项组成、或由以下项组成：SEQ ID NO:1-5中任一项或其一种毒素片段

在其他实施例中，该多核苷酸包括以下项、基本上由以下项组成、或由以下项组成：编码一种蛋白的一种核苷酸序列，该蛋白包括以下项、基本上由以下项组成、或由以下项组成：一种氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:16-20中任一项或其一种毒素片段具有至少80％到至少99％序列一致性。

在又其他实施例中，该氨基酸序列与SEQ ID NO:16或其一种毒素片段具有至少80％、或至少81％、或至少82％、或至少83％、或至少84％、或至少85％、或至少86％、或至少87％、或至少88％、或至少89％、或至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％、或至少99.1％、或至少99.2％、或至少99.3％、或至少99.4％、或至少99.5％或至少99.6％、或至少99.7％、或至少99.8％、或至少99.9％序列一致性。

在另外的实施例中，该氨基酸序列与SEQ ID NO:17或其一种毒素片段具有至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％、或至少99.1％、或至少99.2％、或至少99.3％、或至少99.4％、或至少99.5％或至少99.6％、或至少99.7％、或至少99.8％、或至少99.9％序列一致性。

在又另外的实施例中，该氨基酸序列与SEQ ID NO:18或其一种毒素片段具有至少80％、或至少81％、或至少82％、或至少83％、或至少84％、或至少85％、或至少86％、或至少87％、或至少88％、或至少89％、或至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％、或至少99.1％、或至少99.2％、或至少99.3％、或至少99.4％、或至少99.5％或至少99.6％、或至少99.7％、或至少99.8％、或至少99.9％序列一致性。

在其他实施例中，该氨基酸序列与SEQ ID NO:19或其一种毒素片段具有至少86％、或至少87％、或至少88％、或至少89％、或至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％、或至少99.1％、或至少99.2％、或至少99.3％、或至少99.4％、或至少99.5％或至少99.6％、或至少99.7％、或至少99.8％、或至少99.9％序列一致性。

在又其他实施例中，该氨基酸序列与SEQ ID NO:20或其一种毒素片段具有至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％、或至少99.1％、或至少99.2％、或至少99.3％、或至少99.4％、或至少99.5％或至少99.6％、或至少99.7％、或至少99.8％、或至少99.9％序列一致性。

在一些实施例中，本发明的嵌合基因包括一种多核苷酸，该多核苷酸包括以下项、基本上由以下项组成、或由以下项组成：核苷酸序列的合成序列，与SEQ ID NO:6-15中任一项或其一种毒素编码片段具有至少80％、或至少81％、或至少82％、或至少83％、或至少84％、或至少85％、或至少86％、或至少87％、或至少88％、或至少89％、或至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少94％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％、或至少99.1％、或在至少99.2％、或至少99.3％、或至少99.4％、或至少99.5％或至少99.6％、或至少99.7％、或至少99.8％、或至少99.9％一致性，其中该合成序列已经进行密码子优化用于在一种转基因生物中表达。在其他实施例中，本发明的嵌合基因包括一种多核苷酸，该多核苷酸包括以下项、基本上由以下项组成、或由以下项组成：编码蛋白的核苷酸序列的合成序列，该蛋白包括一种氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:16-25中任一项或其一种毒素片段具有至少80％、或至少81％、或至少82％、或至少83％、或至少84％、或至少85％、或至少86％、或至少87％、或至少88％、或至少89％、或至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少94％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％、或至少99.1％、或在至少99.2％、或至少99.3％、或至少99.4％、或至少99.5％或至少99.6％、或至少99.7％、或至少99.8％、或至少99.9％序列一致性，其中该合成序列已经进行密码子优化用于在一种转基因生物中表达。在另外的实施例中，该转基因生物是一种转基因细菌或转基因植物。

在一些实施例中，本发明提供了一种合成多核苷酸，该合成多核苷酸包括以下项、基本上由以下项组成、或由以下项组成：一种核苷酸序列，该核苷酸序列编码对于鳞翅目有害生物是有毒的一种蛋白，其中该核苷酸序列与SEQ ID NO:6-15中任一项或其一种毒素编码片段具有至少80％、或至少81％、或至少82％、或至少83％、或至少84％、或至少85％、或至少86％、或至少87％、或至少88％、或至少89％、或至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少94％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％、或至少99.1％、或至少99.2％、或至少99.3％、或至少99.4％、或至少99.5％或至少99.6％、或至少99.7％、或至少99.8％、或至少99.9％序列一致性。

在其他实施例中，本发明提供了一种合成多核苷酸，该合成多核苷酸包括以下项、基本上由以下项组成、或由以下项组成：一种核苷酸序列，该核苷酸序列编码对于鳞翅目有害生物是有毒的一种蛋白，其中该核苷酸序列编码一种氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:16-25中任一项或其一种毒素片段具有至少80％、或至少81％、或至少82％、或至少83％、或至少84％、或至少85％、或至少86％、或至少87％、或至少88％、或至少89％、或至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少94％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％、或至少99.1％、或至少99.2％、或至少99.3％、或至少99.4％、或至少99.5％或至少99.6％、或至少99.7％、或至少99.8％、或至少99.9％序列一致性。

本发明的Cry蛋白可以分离自某些苏云金杆菌(Bt)菌株，例如YN171-1、GX078-2和GX435-1。应当认识到本发明的Cry蛋白还可以分离自其他Bt菌株并且此类Bt菌株可以通过标准技术分离并且测试对本发明的鳞翅目有害生物的毒性。通常，Bt菌株可以通过本领域中已知的方法分离自任何环境样品，包括土壤、植物、昆虫、谷物升降机粉尘、以及其他样品材料等。参见，例如，特拉弗斯(Travers)等人(1987)《应用与环境微生物学》(Appl.Environ.Microbiol.)53:1263-1266；萨利赫(Saleh)等人(1969)《加拿大微生物学杂志》(Can J.Microbiol.)15:1101-1104；德卢卡(DeLucca)等人(1981)《加拿大微生物学杂志》27:865-870；以及诺里斯(Norris)等人(1981)“芽孢杆菌属和芽孢乳杆菌属”(“The genera Bacillus andSporolactobacillus,”)于斯塔尔(Starr)等人.(编著)，原核生物：关于细菌的栖息地、分离和鉴定手册，第II卷，施普林格德国海德堡柏林(Springer-Verlog Berlin Heidelberg)中。分离之后，可以测试Bt菌株对于鳞翅目有害生物的毒性并且可以鉴定由本发明涵盖的Cry蛋白。因此，在一些实施例中，本发明提供了一种经分离的苏云金杆菌(Bt)菌株，该菌株产生一种Cry蛋白或一种重组Cry蛋白，所述Cry蛋白包括以下项、基本上由以下项组成、或由以下项组成：一种氨基酸序列，其与SEQ ID NO:16-25中任一项具有至少80％到至少99％序列一致性。在其他实施例中，该Bt菌株选自下组，该组由以下各项组成：YN171-1、GX078-2和GX435-1。在又另外的实施例中，该Cry蛋白或重组Cry蛋白包括以下项、基本上由以下项组成、或由以下项组成：SEQ ID NO:16-25中的任一项。

根据一些实施例，本发明提供了一种任选地被分离的Cry蛋白，其对于鳞翅目有害生物是有毒的，其中该蛋白包括以下项、基本上由以下项组成、或由以下项组成：(a)一种氨基酸序列，与SEQ ID NO:16-25中任一项或其一种毒素片段具有至少80％序列一致性到至少99％序列一致性；或者(b)一种氨基酸序列，其由一种核苷酸序列编码，该核苷酸序列与由SEQ ID NO:6-15中任一项代表的核苷酸序列或其一种毒素编码片段具有至少80％序列一致性到至少99％序列一致性。

在其他实施例中，该任选地被分离的Cry蛋白包括以下项、基本上由以下项组成、或由以下项组成：一种氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:16-25中任一项或其一种毒素片段具有至少80％到至少99％序列一致性。在又其他实施例中，该氨基酸序列与SEQ ID NO:16或其一种毒素片段具有至少80％、或至少81％、或至少82％、或至少83％、或至少84％、或至少85％、或至少86％、或至少87％、或至少88％、或至少89％、或至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少94％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％、或至少99.1％、或至少99.2％、或至少99.3％、或至少99.4％、或至少99.5％或至少99.6％、或至少99.7％、或至少99.8％、或至少99.9％序列一致性。

该氨基酸序列与SEQ ID NO:17或其一种毒素片段具有至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％、或至少99.1％、或至少99.2％、或至少99.3％、或至少99.4％、或至少99.5％或至少99.6％、或至少99.7％、或至少99.8％、或至少99.9％序列一致性。

在另外的实施例中，该氨基酸序列与SEQ ID NO:18或其一种毒素片段具有至少80％、或至少81％、或至少82％、或至少83％、或至少84％、或至少85％、或至少86％、或至少87％、或至少88％、或至少89％、或至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％、或至少99.1％、或至少99.2％、或至少99.3％、或至少99.4％、或至少99.5％或至少99.6％、或至少99.7％、或至少99.8％、或至少99.9％序列一致性。

在又另外的实施例中，该氨基酸序列与SEQ ID NO:19或其一种毒素片段具有至少86％、或至少87％、或至少88％、或至少89％、或至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％、或至少99.1％、或至少99.2％、或至少99.3％、或至少99.4％、或至少99.5％或至少99.6％、或至少99.7％、或至少99.8％、或至少99.9％序列一致性。

在其他实施例中，该氨基酸序列与SEQ ID NO:20或其一种毒素片段具有至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％、或至少99.1％、或至少99.2％、或至少99.3％、或至少99.4％、或至少99.5％或至少99.6％、或至少99.7％、或至少99.8％、或至少99.9％序列一致性。

在一些实施例中，该氨基酸序列包括以下项、基本由以下项组成、或由以下项组成：SEQ ID NO:16-25中任一项或其一种毒素片段。在其他实施例中，该氨基酸序列是由一种核苷酸序列编码的，该核苷酸序列包括以下项、基本由以下项组成、或由以下项组成：SEQ ID NO:6-15中任一项或其一种毒素编码片段。

在其他实施例中，本发明的Cry蛋白对鳞翅目有害生物是有毒的，该鳞翅目有害昆虫选自下组，该组由以下各项组成：亚洲玉米蛀虫(Asian corn borer)(亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis))、黑色地老虎(black cutworm)(小地老虎(Agrotis ipsilon))、棉螟蛉(cottonbollworm)(棉铃虫(Helicoverpa armigera))、黄色桃螟虫(yellowpeach borer)(桃蛀螟(Conogethes punctiferalis))、东方黏虫(Orientalarmyworm)(东方粘虫(Mythimna sepatate))、欧洲玉米蛀虫(European corn borer)(欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis))、秋黏虫(fall armyworm)(草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda))、玉米穗蛾(corn earworm)(玉米穗虫(Helicoverpa zea))、甘蔗螟(sugarcane borer)(小蔗螟(Diatraea saccharalis))，绒毛豆毛虫(velvetbean caterpillar)(黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis))、大豆夜蛾(soybean looper)(大豆尺蠖(Chrysodeixis includes))，西南玉米蛀虫(southwest corn borer)(西南玉米螟(Diatraeagrandiosella))、西部豆切根虫(western bean cutworm)(西部豆夜蛾(Richia albicosta))、烟夜蛾(tobacco budworm)(烟芽夜蛾(Heliothis virescens))、条纹蛀茎虫(striped stem borer)(二化螟(Chilo suppressalis))，粉蛀茎虫(pink stem borer)(非洲大螟(Sesamia calamistis))和水稻卷叶螟(rice leaffolder)(稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis))。

在一些实施例中，本发明涵盖了重组Cry蛋白，其对于鳞翅目有害生物是有毒的，其中该重组Cry蛋白包括以下项、基本上由以下项组成、或由以下项组成：(a)一种氨基酸序列，与由SEQ ID NO:21-25中任一项代表的氨基酸序列或其一种毒素片段具有至少80％到至少99％序列一致性；或者(b)一种氨基酸序列，其由一种核苷酸序列编码，该核苷酸序列与由SEQ ID NO:11-15中任一项代表的核苷酸序列或其一种毒素编码片段具有至少80％到至少99％序列一致性。

在其他实施例中，该重组Cry蛋白包括以下项、基本上由以下项组成、或由以下项组成：一种氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:21-25中任一项或其一种毒素片段具有至少80％到至少99％序列一致性。在又其他实施例中，该氨基酸序列与SEQ ID NO:21或其一种毒素片段具有至少80％、或至少81％、或至少82％、或至少83％、或至少84％、或至少85％、或至少86％、或至少87％、或至少88％、或至少89％、或至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少94％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％、或至少99.1％、或至少99.2％、或至少99.3％、或至少99.4％、或至少99.5％或至少99.6％、或至少99.7％、或至少99.8％、或至少99.9％序列一致性。

在又其他实施例中，该氨基酸序列与SEQ ID NO:22或其一种毒素片段具有至少80％、或至少81％、或至少82％、或至少83％、或至少84％、或至少85％、或至少86％、或至少87％、或至少88％、或至少89％、或至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少94％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％、或至少99.1％、或至少99.2％、或至少99.3％、或至少99.4％、或至少99.5％或至少99.6％、或至少99.7％、或至少99.8％、或至少99.9％序列一致性。

在又其他实施例中，该氨基酸序列与SEQ ID NO:23或其一种毒素片段具有至少80％、或至少81％、或至少82％、或至少83％、或至少84％、或至少85％、或至少86％、或至少87％、或至少88％、或至少89％、或至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少94％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％、或至少99.1％、或至少99.2％、或至少99.3％、或至少99.4％、或至少99.5％或至少99.6％、或至少99.7％、或至少99.8％、或至少99.9％序列一致性。

在又其他实施例中，该氨基酸序列与SEQ ID NO:24或其一种毒素片段具有至少80％、或至少81％、或至少82％、或至少83％、或至少84％、或至少85％、或至少86％、或至少87％、或至少88％、或至少89％、或至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少94％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％、或至少99.1％、或至少99.2％、或至少99.3％、或至少99.4％、或至少99.5％或至少99.6％、或至少99.7％、或至少99.8％、或至少99.9％序列一致性。

在又其他实施例中，该氨基酸序列与SEQ ID NO:25或其一种毒素片段具有至少80％、或至少81％、或至少82％、或至少83％、或至少84％、或至少85％、或至少86％、或至少87％、或至少88％、或至少89％、或至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少94％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％、或至少99.1％、或至少99.2％、或至少99.3％、或至少99.4％、或至少99.5％或至少99.6％、或至少99.7％、或至少99.8％、或至少99.9％序列一致性。

在又另外的实施例中，该重组Cry蛋白包括以下项、基本上由以下项组成、或由以下项组成：SEQ ID NO:21-25中任一项的氨基酸序列或其一种毒素片段。在其他实施例中，该重组Cry蛋白是由一种核苷酸序列编码的，该核苷酸序列包括以下项、基本由以下项组成、或由以下项组成：SEQ ID NO:11-15中任一项或其一种毒素编码片段。

本发明还涵盖响应于通过一种天然的或突变型BT-0049、BT-0063、BT-0064、BT-0086和BT-0498、或相关Cry蛋白的免疫激发而产生的抗体。此类抗体可以使用生产多克隆抗血清的标准免疫学技术生产，并且如果需要的话，无限增殖免疫宿主的抗体产生细胞用于单克隆抗体生产源。用于生产任一感兴趣物质的抗体的技术是熟知的，例如如在哈洛(Harlow)和莱恩(Lane)(1988.《抗体：实验室手册》(Antibodies a laboratory manual.)第726页.冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory)中以及如在在戈丁(Goding)(单克隆抗体：原理与实践(Monoclonal Antibodies:Principles&practice)1986.学术出版社公司(Academic Press,Inc.)，奥兰多(Orlando)，佛罗里达州(FL))中。本发明涵盖杀昆虫蛋白，其与抗体、特别是单克隆抗体交叉反应，产生了针对本发明的杀昆虫Cry蛋白中的一种或多种。

本发明中生产的这些抗体在用于确定生物样品中天然或突变型BT-0049、BT-0063、BT-0064、BT-0086和BT-0498或相关Cry蛋白的量或存在的免疫测定中也是有用的。此类测定在质量控制生产包含本发明的Cry蛋白中的一种或多种或相关毒性蛋白的组合物中也是有用的。此外，这些抗体可以用来评估本发明的Cry蛋白中的一种或多种或相关蛋白的重组生产的功效，连同针对编码本发明的Cry蛋白中的一种或多种的核苷酸序列或相关蛋白编码序列的存在而筛选表达文库的功效。抗体还作为亲和性配体用于纯化或分离本发明的蛋白质中的任何一种或多种以及相关蛋白质是有用的。本发明的Cry蛋白和包含相关抗原表位的蛋白可以通过在一种优选的宿主细胞中过度表达一种编码全部或部分本发明的Cry蛋白或相关蛋白的序列的全长或部分长度来获得。

应当认识到，可以通过不同的方法来改变编码本发明的Cry蛋白的DNA序列，并且这些改变可以导致编码以下蛋白质的DNA序列，这些蛋白质具有不同于由本发明的天然Cry蛋白所编码的氨基酸序列。这种突变型Cry蛋白可以按照不同的方式进行改变，包括SEQ IDNO:16-20中任一项的一个或多个氨基酸的氨基酸置换、缺失、截短、以及插入，包括多达约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约100、约105、约110、约115、约120、约125、约130、约135、约140、约145、约150、约155个、或更多个氨基酸置换、缺失或插入。用于这样的操作的方法在本领域中是通常是已知的。例如，通过在编码该蛋白的多核苷酸中的突变可以制备天然Cry蛋白的氨基酸序列变体。这还可以通过几种诱变形式之一或在定向进化中来完成。在某些方面，在该氨基酸序列中所编码的改变将实质上不影响该蛋白质的功能。此类变体将具有所希望的杀昆虫活性。在本发明的一些实施例中，由SEQ ID NO:1-5代表的核苷酸序列被改变，以在编码的蛋白中引入氨基酸置换。在其他实施例中，所得到的突变型蛋白是由合成的突变型多核苷酸编码的，该多核苷酸包括由SEQ ID NO:11-15中任一项代表的核苷酸序列。在其他实施例中，这些突变型蛋白包括以下项、基本上由以下项组成、或由以下项组成：由SEQ ID NO:21-25中任一项代表的氨基酸序列。

应当理解的是可以通过使用此类技术改进杀昆虫蛋白对本发明的这些组合物赋予杀昆虫活性的能力。例如，可以在以下宿主细胞中表达Cry蛋白，这些宿主细胞在DNA复制过程中展现高比率的碱基错误结合，如XL-1Red(斯特塔杰公司(Stratagene)，拉荷亚(La Jolla)，加利福尼亚州)。在此类菌株中繁殖之后，可以分离出该DNA(例如通过制备质粒DNA，或通过由PCR进行扩增并且将得到的PCR片段克隆到一个载体中)，在一种非诱变菌株中培养这些Cry蛋白突变体，并且鉴定具有杀昆虫活性的经突变的基因，例如通过进行一项对杀昆虫活性进行测试的测定。总体上，在摄食测定中混合并使用了该蛋白质。参见例如马罗内(Marrone)等人.(1985)《经济昆虫学杂志》(J.of Economic Entomology)78:290-293。此类测定可以包括使植物与一种或多种有害生物接触，并且确定该植物存活或引起这些有害生物死亡的能力。导致毒性提高的突变的实例见于史涅夫(Schnepf)等人.(1998)《微生物分子生物学综述》(Microbiol.Mol.Biol.Rev).62:775-806中。

可替代地，可以在氨基或羧基的末端上对本发明的氨基酸序列进行改变，而实质上不影响活性。这可以包括通过现代分子方法所引入的插入、缺失、或改变，这些方法如PCR，包括PCR扩增，这些PCR扩增借助于将编码氨基酸的序列包含到在PCR扩增中所使用的寡核苷酸之中而改变或延长该蛋白编码序列。可替代地，所加入的蛋白质序列可以包括完整的蛋白质编码序列，例如在本领域内通常用于产生蛋白质融合物的那些序列。此类融合蛋白常常用于(1)增加一种感兴趣的蛋白质的表达；(2)引入结合域、酶活性、或表位以促进蛋白质纯化、蛋白检测、亦或本领域已知的其他实验用途；(3)将蛋白质的分泌或翻译靶向亚细胞器，例如革兰氏阴性菌的壁膜间隙，或真核细胞的内质网，后者常常导致蛋白质的糖基化。

本发明的Cry蛋白还可以被突变以引入表位来产生识别该突变蛋白的抗体。因此，在一些实施例中，本发明提供了经突变的Cry蛋白，其中在天然Cry蛋白中的氨基酸置换产生一种具有抗原性区域的突变型Cry蛋白，该抗原性区域允许该突变型Cry蛋白在蛋白质检测分析中区别于该天然Cry蛋白。

在一些实施例中，本发明提供了一种制备以下抗体的方法，所述抗体从衍生出经突变的Cry蛋白质的天然Cry蛋白中差异识别出经突变的Cry蛋白，该方法包括以下步骤：在天然Cry蛋白的抗原环中取代氨基酸；并且产生特异性识别突变Cry蛋白的突变抗原环但不识别该天然Cry蛋白的抗体。在一个实施例中，该抗原环在天然Cry蛋白的结构域I的外部的非保守区中被鉴定。在另一个实施例中，该抗原环不是一种参与Cry蛋白的昆虫肠受体识别或参与Cry蛋白的蛋白酶活化的环。

本发明的变体核苷酸和氨基酸序列还涵盖了由诱变和引起重组的程序(例如DNA改组)所衍生的序列。使用此类程序，可以将一个或多个不同的毒性蛋白编码区用来创造出一种具有所希望特性的新的毒性蛋白。用这种方式，从相关序列多核苷酸的群体产生重组多核苷酸文库，这些相关序列多核苷酸包含以下的序列区域，这些序列区域具有实质性的序列一致性并且可以在体外或活体内进行同源重组。例如，使用这种方法，可以将编码感兴趣的域的序列基序在本发明的杀有害生物基因与其他已知的杀有害生物基因之间进行改组，以获得编码一种蛋白质的新基因，该蛋白质具有一种改善的感兴趣的特性，例如一种增加的杀昆虫活性。用于此种DNA改组的策略在本领域中是已知的。参见例如施特默尔(Stemmer)(1994)《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)91:10747-10751；施特默尔(Stemmer)(1994)《自然》(Nature)370:389-391；克莱默(Crameri)等人.(1997)《自然生物技术》(Nature Biotech).15:436-438；穆尔(Moore)等人(1997)《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol).272:336-347；张(Zhang)等人.(1997)《美国国家科学院院刊》94:4504-4509；克莱默(Crameri)等人.(1998)《自然》391:288-291；以及美国专利号5,605,793和5,837,458。

域交换或改组是针对产生本发明的经改变的Cry蛋白的另一种机制。可以在Cry蛋白之间交换域，从而导致具有改善的杀有害生物活性或目标谱的杂合或嵌合毒性蛋白。用于产生重组蛋白和测试它们的杀有害生物活性的方法在本领域是已熟知的(参见，例如，纳莫夫(Naimov)等人.(2001)《应用与环境微生物学》(Appl.Environ.Microbiol).67:5328-5330；德阿加迪尔(de Maagd)等人，(1996)《应用与环境微生物学》62:1537-1543；格(Ge)等人.(1996)《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)266:17954-17958；史涅夫(Schnepf)等人.(1990)《生物化学杂志》265:20923-20930；兰格(Rang)等人.(1999)《应用与环境微生物学》65:2918-2925)。

在一些实施例中，本发明提供了一种重组载体，该重组载体包括本发明的多核苷酸、核酸分子、表达盒或嵌合基因。在其他实施例中，该载体被进一步限定为质粒、粘粒、噬菌粒、人工染色体、噬菌体或病毒载体。用于在植物和其他有机体的转化中使用的某些载体在本领域是已知的。

因此，本发明的一些实施例针对被设计来表达本发明的多核苷酸和核酸分子的表达盒。如在此所使用，“表达盒”是指一种核酸分子，该核酸分子具有操作性地连接到感兴趣的核苷酸序列上的至少一个控制序列。以这种方式，例如，可操作地连接至待表达的核苷酸序列的植物启动子可以在表达盒中提供，用于在植物、植物部分或植物细胞中的表达。

包含感兴趣的多核苷酸的表达盒可以是嵌合的，意味着它的组分中的至少一种相对于它的其他组分中的至少另外一种是异源的。表达盒还可以是一种天然存在但已经是以适用于异源表达的重组形式获得的表达盒。然而，典型地，该表达盒相对于该宿主而言是异源的，即该表达盒的特定核酸序列不是天然存在于该宿主细胞中的，并且必须已经通过一个转化事件引入到该宿主细胞或该宿主细胞的祖先(ancestor)中。

除可操作地连接至本发明的核苷酸序列的启动子之外，本发明的表达盒还可以包括其他调节序列。如在此使用的，“调节序列”意指位于编码序列的上游(5'非编码序列)、内部或下游(3'非编码序列)并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译的核苷酸序列。调节序列包括但不限于增强子、内含子、翻译前导序列、终止信号、以及多腺苷酸化信号序列。

在一些实施例中，本发明的表达盒还可以包括编码除本发明的Cry蛋白之外的其他所希望的性状的多核苷酸。此类包括叠加性状的表达盒可以用来产生具有所希望的含有叠加性状(即，分子叠加)的表型的植物、植物部分或植物细胞。植物中的此类叠加的组合还可以通过其他方法来产生，包括但不限于通过任何常规的方法学的杂交育种植物。如果是通过遗传转化这些植物来进行叠加的，所感兴趣的核苷酸序列可以在任何时间并且以任何次序进行组合。例如，包括一种或多种所希望的性状的转基因植物可以用作通过后续转化而引入另外的性状的靶标。另外的核苷酸序列可以在一个共转化方案中与由表达盒的任何组合提供的本发明的核苷酸序列、核酸分子、核酸构建体、或组合物同时引入。例如，如果将引入两个核苷酸序列，则它们可以合并在分开的盒(反式)中或可以合并在相同的盒(顺式)上。多核苷酸的表达可以通过相同的启动子或通过不同的启动子驱动。进一步认识到多核苷酸可以使用一种位点特异性重组系统在一个所希望的基因组位置处叠加。参见，例如，国际专利申请公开号WO 99/25821；WO 99/25854；WO 99/25840；WO 99/25855；以及WO 99/25853。

表达盒还可以包括用于农艺性状的感兴趣的一个或多个多肽或双链RNA分子(dsRNA)的另外的编码序列，这些农艺性状的主要受益者是种子公司、栽培者或谷物加工者。感兴趣的多肽可以是由感兴趣的核苷酸序列编码的任何多肽。适合用于在植物中生产的感兴趣的多肽的非限制性实例包括产生农艺学重要性状的那些多肽，这些性状如除草剂抗性(有时也称为“除草剂耐受性”)、病毒抗性、细菌病原体抗性、昆虫抗性、线虫抗性、或真菌抗性。参见，例如，美国专利号5,569,823；5,304,730；5,495,071；6,329,504；以及6,337,431。该多肽还可以是提高植物活力或产量(包括允许植物在不同的温度、土壤条件以及日光和沉淀水平下生长的性状)的多肽、或是允许对展现感兴趣性状的植物进行鉴定的多肽(例如，可选择性标志、种皮颜色、等等)。不同的感兴趣的多肽，以及用于将这些多肽引入植物的方法描述于例如，美国专利号4,761,373；4,769,061；4,810,648；4,940,835；4,975,374；5,013,659；5,162,602；5,276,268；5,304,730；5,495,071；5,554,798；5,561,236；5,569,823；5,767,366；5,879,903；5,928,937；6,084,155；6,329,504和6,337,431；以及美国专利公开号2001/0016956中。还参见，万维网上的lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/。

赋予对抑制生长点或分生组织的除草剂(例如咪唑啉酮或磺酰脲)的抗性/耐受性的多核苷酸也可以适用于本发明的一些实施例中。对于突变型ALS和AHAS酶在这一分类号中的示例性多核苷酸如描述于例如，美国专利号5,767,366和5,928,937中。美国专利号4,761,373和5,013,659针对抵抗不同的咪唑啉酮或磺酰脲除草剂的植物。美国专利号4,975,374涉及包含以下核酸的植物细胞和植物，所述核酸编码突变的谷氨酰胺合酶(GS)，所述突变的谷氨酰胺合酶抵抗已知抑制GS的除草剂(例如，草胺膦和甲硫氨酸磺基肟(methioninesulfoximine))的抑制作用。美国专利号5,162,602披露了抵抗环己二酮和芳氧苯氧丙酸除草剂的抑制作用的植物。该抗性由改变的乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)赋予。

赋予对草甘膦抗性的、由核苷酸序列编码的多肽也适用于本发明。参见，例如美国专利号4,940,835和美国专利号4,769,061。美国专利号5,554,798披露了抗草甘膦的转基因玉米植物，所述抗性由改变的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸(EPSP)合成酶基因赋予。

编码对磷酰基化合物(例如草铵膦或草胺膦、以及吡啶氧丙酸或苯氧丙酸以及环己酮)的抗性的多核苷酸也是适合的。参见欧洲专利申请号0 242 246。参见，例如美国专利号5,879,903、5,276,268和5,561,236。

其他合适的多核苷酸包括编码对抑制光合作用的除草剂(例如三嗪和苯基氰(腈水解酶))的抗性的那些，参见美国专利号4,810,648。编码用于除草剂抗性的另外的合适多核苷酸包括编码对2,2-二氯丙酸、烯禾啶、吡氟氯禾灵、咪唑啉酮除草剂、硫酰脲除草剂、三唑并嘧啶除草剂、均三嗪除草剂以及溴草腈的抗性的那些。同样适合的是赋予对原卟啉原氧化酶的抗性或者提供增强的对植物疾病的抗性、增强的对不利环境条件(非生物胁迫)的耐受性(这些条件包括但不限于干旱、极冷、极热、或极端的土壤盐度或极端的酸度或碱度)、以及在植物构造或发育中的改变(包括发育时间方面的变化)的多核苷酸。参见，例如，美国专利公开号2001/0016956和美国专利号6,084,155。

另外的合适的多核苷酸包括对杀有害生物(例如杀昆虫)多肽进行编码的那些。这些多肽可以按足以控制例如昆虫有害生物的量(即，昆虫控制量)进行生产。认识到在植物中对控制昆虫或其他有害生物必要的杀有害生物多肽的生产量可以变化，这取决于栽培品种、有害生物的类型、环境因素等。有用于另外的昆虫或有害生物抗性的多核苷酸例如包括这些核苷酸序列，它们编码芽孢杆菌属(Bacillus)生物中鉴定到的毒素。已经克隆了包括编码来自几个亚种的苏云金杆菌(Bt)Cry蛋白的核苷酸序列的多核苷酸，并且已经发现这些重组克隆对鳞翅目、双翅目和鞘翅目昆虫幼虫是有毒的。此类Bt杀昆虫蛋白的实例包括这些Cry蛋白，例如Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1B、Cry1C、Cry1D、Cry1Ea、Cry1Fa、Cry3A、Cry9A、Cry9B、Cry9C等，连同营养期杀昆虫蛋白例如Vip1、Vip2、Vip3等。Bt来源的蛋白的完整清单可以在万维网在苏塞克斯大学(University of Sussex)维护的苏云金杆菌毒素命名法数据库中找到(还参见，克里克摩尔(Crickmore)等人.(1998)《微生物分子生物学综述》(Microbiol.Mol.Biol.Rev.)62:807-813)。

适合在植物中生产的多肽进一步包括改进或通过其他方式有助于收获的植物或植物部分转化成为一种商业上有用的产品(包括(例如)增加的或改变的碳水化合物含量或分布、改善的发酵特性、增加的油含量、增加的蛋白含量、改善的消化率、以及增加的营养成分含量(例如，增加的植物甾醇含量、增加的生育酚含量、增加的甾烷醇含量或增加的维生素含量))的那些。感兴趣的多肽还包括，例如在一种收获的作物中导致或促成不需要的成分(例如植酸、或降解糖的酶类)的含量降低的那些。“导致”或“促成”是指这种感兴趣的多肽可以直接或间接地促成一种感兴趣的性状的存在(例如，通过一种异源纤维素酶的使用来增加纤维素降解)。

在一些实施例中，多肽促成了食品或饲料的改善的可消化度。木聚糖酶是半纤维素分解酶，这些酶改善了植物细胞壁的分解，这导致动物更好地利用这些植物营养素。这导致了改善的生长率和饲料转化。同样，可以减小包含木聚糖的饲料的粘度。在植物细胞内异源产生木聚糖酶也可以促进木质纤维素转化成工业加工中的可发酵糖。

来自真菌和细菌微生物的多种木聚糖酶已经得到鉴别和特征化(参见，例如美国专利号5,437,992；库格林(Coughlin)等人(1993)“里氏木霉纤维素酶和其他水解酶的第二三醋酸纤维研讨会论文集(Proceedings of the Second TRICEL Symposium on Trichodermareesei Cellulases and Other Hydrolases)”，埃斯波(Espoo)；索米宁(Souminen)和雷尼凯恩(Reinikainen)编(1993)生物技术和工业发酵研究基金会(Foundation for Biotechnical and IndustrialFermentation Research)8:125-135；美国专利公开号2005/0208178；以及PCT公开号WO 03/16654)。具体地说，在里氏木霉(T.reesei)中已经鉴别出三种特异性木聚糖酶(XYL-I、XYL-II、和XYL-III)(滕卡宁(Tenkanen)等人，(1992)微生物酶技术(Enzyme Microb.Technol.)14:566；特洛宁(Torronen)等人，(1992)生物/技术(Bio/Technology)10:1461；以及徐(Xu)等人，(1998)应用微生物生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnol.)49:718)。

在其他实施例中，对于本发明有用的多肽可以是多糖降解酶。产生这样一种酶的本发明的植物对于产生例如用于生物加工的发酵原料会是有用的。在一些实施例中、可用于发酵过程的酶包括α淀粉酶、蛋白酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、环糊精糖基转移酶、脂肪酶、植酸酶、漆酶、氧化酶、酯酶、角质酶、颗粒淀粉水解酶以及其他葡糖淀粉酶。

多糖降解酶包括：淀粉降解酶，例如α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、葡萄糖醛酸酶(E.C.3.2.1.131)；外-1,4-α-D葡聚糖酶，例如淀粉糖化酶和葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3)、β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)、α-糖苷酶(EC3.2.1.20)以及其他外-淀粉酶；淀粉脱支酶，例如a)异淀粉酶(EC3.2.1.68)、支链淀粉酶(EC 3.2.1.41)以及类似物；b)纤维素酶，例如外-1,4-3-纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)、外-1,3-β-D-葡聚糖酶(EC3.2.1.39)、β-糖苷酶(EC 3.2.1.21)；c)L-阿拉伯糖酶(arabinases)，例如内-1,5-α-L-阿拉伯糖酶(EC 3.2.1.99)、α-阿拉伯糖苷酶(EC3.2.1.55)以及类似物；d)半乳聚糖酶(galactanase)，例如内-1,4-β-D-半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)、内-1,3-β-D-半乳聚糖酶(EC 3.2.1.90)、α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)、β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)以及类似物；e)甘露聚糖酶(mannanase)，例如内-1,4-β-D-甘露聚糖酶(EC3.2.1.78)、β-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.25)、α-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.24)以及类似物；f)木聚糖酶，例如内-1,4-β-木聚糖酶(EC 3.2.1.8)、β-D-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)、1,3-β-D-木聚糖酶以及类似物；以及g)其他酶，例如α-L-岩藻糖苷酶(EC 3.2.1.51)、α-L-鼠李糖苷酶(EC3.2.1.40)、果聚糖酶(EC 3.2.1.65)、菊粉酶(EC 3.2.1.7)以及类似物。在一个实施例中，该α-淀粉酶是描述于美国专利号8,093,453中的合成α-淀粉酶Amy797E，将该专利通过引用以其全文结合在此。

可以与本发明一起使用的另外的酶包括蛋白酶，如真菌和细菌蛋白酶。真菌蛋白酶包括但不限于从曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)、毛霉属(Mucor)和根霉属(Rhizopus)，如黑曲霉(A.niger)、泡盛曲霉(A.awamori)、米曲霉(A.oryzae)和米黑毛霉(M.miehei)获得的那些。在一些实施例中，本发明的多肽可以是纤维二糖水解酶(CBH)(EC 3.2.1.91)。在一个实施例中，该纤维二糖水解酶可以是CBH1或CBH2。

与本发明一起使用的其他酶包括但不限于半纤维素酶，如甘露聚糖酶和阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)；木质素酶；脂肪酶(例如，E.C.3.1.1.3)、葡萄糖氧化酶、果胶酶、木聚糖酶、转葡糖苷酶、α1.6葡糖苷酶(例如，E.C.3.2.1.20)；酯酶，如阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73)和乙酰基木聚糖酯酶(EC 3.1.1.72)；以及角质酶(例如E.C.3.1.1.74)。

与本发明一起使用的双链RNA分子包括但不限于抑制目标昆虫基因的那些。如在此使用的词语“基因抑制”当一起考虑时旨在是指用于减少作为基因转录为mRNA和该mRNA的后续翻译的结果而产生的蛋白质的水平的任何熟知的方法。基因抑制还旨在意指减少从基因或编码序列表达蛋白质，包括转录后基因抑制和转录抑制。转录后基因抑制由从靶向抑制的基因或编码序列转录的mRNA的全部或其一部分与用于抑制的相应双链RNA之间的同源性介导，并且是指在细胞中可供被核糖体结合使用的可获得的mRNA的量的实质且可测量的减少。经转录的RNA可以处于有义方向而发挥作用，称为共抑制，处于反义方向而发挥作用，称为反义抑制，或在两个方向上产生dsRNA而发挥作用，称为RNA干扰(RNAi)。转录抑制由细胞中存在作为基因抑制剂的与启动子DNA序列或其补体展示出实质序列一致性而发挥作用的dsRNA介导，称为启动子反式抑制。针对与性状相关的天然植物基因，基因抑制可以是有效的，例如，以提供具有减少水平的由该天然基因编码的蛋白质或具有增强或减少水平的受影响代谢物的植物。针对植物有害生物中的靶基因，基因抑制也可以是有效的，这些有害生物可以摄取或接触包含基因抑制剂的植物材料，这些基因抑制剂专门设计用于阻抑或抑制一种或多种同源或互补序列在该有害生物的细胞中的表达。靶向抑制的此类基因可以编码一种必需蛋白质，其预测功能选自下组，该组由以下各项组成：肌肉形成、保幼激素形成、保幼激素调节、离子调节和转运、消化酶合成、细胞膜电势的维持、氨基酸生物合成、氨基酸降解、精子形成、外激素(pheromone)合成、外激素感测、触角形成、翼形成、腿形成、发育和分化、卵形成、幼虫成熟、消化酶形成、血淋巴合成、血淋巴维持、神经传递、细胞分裂、能量代谢、呼吸以及凋亡。

在一些实施例中，本发明提供了一种转基因非人类宿主细胞，该细胞包含本发明的多核苷酸、核酸分子、嵌合基因、表达盒或重组载体。该转基因非人类宿主细胞可以包括但不限于植物细胞、酵母细胞、细菌细胞或昆虫细胞。因此，在一些实施例中，本发明提供了一种选自以下属的细菌细胞：芽孢杆菌属(Bacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、梭菌属(Clostridium)、致病杆菌属(Xenorhabdus)、发光杆菌属(Photorhabdus)、巴斯德氏芽菌属(Pasteuria)、埃希氏菌属(Escherichia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、欧文氏菌属(Erwinia)、沙雷氏菌属(Serratia)、克雷伯杆菌属(Klebsiella)、沙门氏菌属(Salmonella)、巴氏杆菌属(Pasteurella)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、根瘤菌属(Rhizobium)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、嗜甲基菌属(Methylophilius)、农杆菌属(Agrobacterium)、醋杆菌属(Acetobacter)、乳杆菌属(Lactobacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、固氮菌属(Azotobacter)、明串珠菌属(Leuconostoc)或产碱杆菌属(Alcaligenes)。因此，例如，作为生物昆虫控制剂，本发明的Cry蛋白可以通过在细菌细胞中表达编码本发明的Cry蛋白的嵌合基因而产生。例如，在一些实施例中，提供了一种包含本发明的嵌合基因的苏云金杆菌细胞。

在另外的实施例中，本发明提供了一种作为双子叶植物细胞或单子叶植物细胞的转基因植物细胞。在另外的实施例中，该双子叶植物细胞选自下组，该组由以下各项组成：大豆细胞、向日葵细胞、番茄细胞、芸苔属作物细胞、棉花细胞、糖用甜菜细胞以及烟草细胞。在另外的实施例中，该单子叶植物细胞选自下组，该组由以下各项组成：大麦细胞、玉蜀黍细胞、燕麦细胞、水稻细胞、高粱细胞、甘蔗细胞以及小麦细胞。在一些实施例中，本发明提供了多个双子叶植物细胞或单子叶植物细胞，这些细胞表达由本发明的嵌合基因编码的本发明的Cry蛋白。在其他实施例中，将该多个细胞并列以形成质外体并且使其在自然光照中生长。

在本发明的其他实施例中，在高等生物(例如，植物)中表达本发明的杀昆虫Cry蛋白。在这种情况下，表达有效量的杀昆虫蛋白的转基因植物保护自身免受植物有害生物如昆虫有害生物的伤害。当昆虫开始摄食这样一种转基因植物时，它摄取了所表达的杀昆虫Cry蛋白。这可以妨碍昆虫进一步咬食植物组织或者甚至可以伤害或杀死昆虫。本发明的多核苷酸被插入表达盒中，然后该表达盒被稳定地整合到该植物的基因组中。在其他实施例中，该多核苷酸被包含在非致病性自我复制病毒中。根据本发明转化的植物可以是单子叶植物或双子叶植物，并且包括但不限于玉米(玉蜀黍)、大豆、水稻、小麦、大麦、黑麦、燕麦、高粱、粟、向日葵、红花、糖用甜菜、棉花、甘蔗、油菜、苜蓿、烟草、花生、蔬菜(包括甘薯、豆类、豌豆、菊苣、莴苣、甘蓝、花椰菜、西兰花、芜菁、胡萝卜、茄子、黄瓜、萝卜、菠菜、马铃薯、番茄、芦笋、洋葱、大蒜、瓜类、胡椒、芹菜、南瓜、西葫芦、绿皮西葫芦)、水果(包括苹果、梨、榅桲、李、樱桃、桃、蜜桃、杏、草莓、葡萄、覆盆子、黑莓、菠萝、鳄梨、番木瓜、芒果、香蕉)和特种植物如拟南芥以及木本植物如针叶树和落叶树。优选地，本发明的植物是作物植物，如玉蜀黍、高粱、小麦、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒、马铃薯、棉花、水稻、大豆、糖用甜菜、甘蔗、烟草、大麦、油菜等。

一旦令人希望的多核苷酸已经被转化进特定的植物种类中，便可以使用传统的育种技术将其在该种类中繁殖或将其转移到相同种类的其他品种中，特别是包括商业品种。

在转基因植物中表达本发明的多核苷酸，由此导致在这些转基因植物中对处于原毒素或成熟毒素形式的相应Cry蛋白的生物合成。以此方式，产生在存在昆虫压力下具有增强的产量保护的转基因植物。对应它们在转基因植物中的表达，本发明的核苷酸序列可能要求修饰和优化。尽管在许多情况下，来自微生物生物体的基因能够在植物中高水平表达而无需修饰，在转基因植物中的低水平表达可能是由于微生物的核苷酸序列的缘故，这些序列具有在植物种并不优选的密码子。在本领域中已知，活生物具有特定的密码子使用偏好，而且在本发明中所描述的这些核苷酸序列的密码子可以被改变以符合植物偏好，同时维持由其编码的氨基酸。此外，在植物(例如玉米植物)中高表达最好是由以下编码序列实现的，这些编码序列具有至少约35％、或至少约45％、或至少约50％、或至少约60％的GC含量。具有低GC含量的微生物核苷酸序列在植物中也许表达欠佳，这是由于存在着可能使信息不稳定的ATTTA基序，以及可导致不恰当的多聚腺苷酸化的AATAAA基序。尽管某些基因序列可以在单子叶植物和双子叶植物种类两者中充分表达，但是可以对序列进行修饰以便迎合单子叶植物或双子叶植物的特定密码子偏好以及GC含量偏好，因为这些偏好已经被证明是不同的(默里(Murray)等人核酸研究(Nucl.Acids Res.)17:477-498(1989))。此外，针对不正常剪接位点的存在来对这些核苷酸序列筛选，这些位点可能导致信息平截(message truncation)。使用描述于例如美国专利号5,625,136；5,500,365和6,013,523中的方法，使用熟知的定点诱变、PCR以及合成基因构建技术对在这些核苷酸序列之内所有需要做出的变化(如以上所描述的那些)进行改变。

在一些实施例中，本发明提供了根据披露于美国专利号5,625,136中的程序制备的合成编码序列或多核苷酸，将该专利通过引用结合在此。在这个操作中，使用了玉米偏爱的密码子，即最频繁地编码玉米中的氨基酸的单一密码子。针对一种特定的氨基酸的玉米偏爱的密码子可源自(例如)来自玉米的已知基因序列。例如，针对来自玉蜀黍植物的28个基因的玉蜀黍密码子使用发现于默里(Murray)等人，核酸研究(Nucleic Acids Research)17:477-498(1989)中，将其披露内容通过引用结合在此。本发明的确切示例的用玉蜀黍优化密码子制备的合成序列由SEQ ID NO:6-15中的任一项表示。以此方式，这些核苷酸序列可以针对在任何植物中表达被优化。应认识到，核苷酸序列的全部或任何部分可以是优化的或合成的。也就是说，多核苷酸可以包括作为部分天然序列和部分密码子优化序列的核苷酸序列。

为了有效的翻译起始，可能需要修饰与起始甲硫氨酸相邻的序列。例如，它们可以通过包含已知在植物中有效的序列而被修饰。Joshi已经提出了针对植物的一种合适的共有序列(NAR 15:6643-6653(1987))，并且Clonetech提出了另一个共有翻译起始子(1993/1994目录，210页)。这些共有序列适宜与本发明的核苷酸序列一起使用。将这些序列添加至包含核苷酸序列的构建体中，达到ATG并且包括ATG(同时保持不修饰第二个氨基酸)，或者可替代地达到ATG后的GTC并且包括ATG后的GTC(具有修饰该转基因的第二个氨基酸的可能性)。

本发明的新颖Cry蛋白编码序列(作为它们的天然序列抑或作为如上所述的合成序列)可以可操作地融合至用于在植物中表达的多种启动子(包括组成型、诱导型、时序性调节的、发育调节的、化学调节的、组织优选的以及组织特异性启动子)以制备重组DNA分子(即，嵌合基因)。启动子的选择将依赖于表达的时间和空间需要而变化，并且还依赖于目标种类而变化。因此，本发明的核苷酸序列在叶、在柄(stalk)或茎(stem)、在穗、在花序(例如穗状花序、圆锥花序、穗轴等)、在根或籽苗中的表达是优选的。然而在许多情况下，寻求针对多于一种类型虫害的保护，并且因此在多个组织中的表达是令人希望的。尽管已经显示来自双子叶植物的很多启动子在单子叶植物中是可操作的并且反之亦然，但理想的是选择双子叶植物启动子用于在双子叶植物中的表达，并且选择单子叶植物启动子用于在单子叶植物中的表达。然而，对所选择的启动子的起源并没有限制，足够的是它们在推动核苷酸序列在所希望的细胞中的表达中是操作性的。

适合的组成型启动子包括例如CaMV 35S启动子(SEQ ID NO:1546；奥德尔(Odell)等人，自然(Nature)313:810-812，1985)；拟南芥At6669启动子(SEQ ID NO:1652；参见PCT公开号WO04081173 A2)；玉蜀黍Ubi 1(克里斯滕森(Christensen)等人，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)18:675-689，1992)；水稻肌动蛋白(麦克尔罗伊(McElroy)等人，植物细胞(Plant Cell)2:163-171，1990)；pEMU(拉斯特(Last)等人，理论与应用遗传学(Theor.Appl.Genet.)81:581-588，1991)；CaMV 19S(尼尔森(Nilsson)等人，植物生理学(Physiol.Plant)100:456-462，1997)；GOS2(德佩特(de Pater)等人，植物杂志(Plant J)11月；2(6):837-44，1992)；泛素(克里斯滕森等人，植物分子生物学18:675-689，1992)；水稻亲环蛋白(布霍尔茨(Bucholz)等人，植物分子生物学25(5):837-43，1994)；玉蜀黍H3组蛋白(莱佩提(Lepetit)等人，分子遗传学与普通遗传学(Mol.Gen.Genet.)231:276-285，1992)；肌动蛋白2(安(An)等人，植物杂志10(1)；107-121，1996)、组成型根尖CT2启动子(SEQ ID NO:1535；还参见PCT申请号IL/2005/000627)以及Synthetic Super MAS(尼(Ni)等人，植物杂志(The Plant Journal)7:661-76，1995)。其他组成性启动子包括美国专利号5,659,026、5,608,149、5,608,144、5,604,121、5,569,597、5,466,785、5,399,680、5,268,463、以及5,608,142中的那些。

对于在植物(特别是玉蜀黍)中表达本发明的新颖cry蛋白编码序列有用的组织特异性或组织优先启动子是指导在根、髓、叶或花粉中的表达的那些。适合的组织特异性启动子包括但不限于叶特异性启动子[如例如由山本(Yamamoto)等人，植物杂志(Plant J.)12:255-265，1997；权(Kwon)等人，植物生理学(Plant Physiol.)105:357-67，1994；山本等人，植物细胞生理学(Plant Cell Physiol.)35:773-778，1994；戈托尔(Gotor)等人，植物杂志3:509-18，1993；奥罗斯科(Orozco)等人，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)23:1129-1138，1993；以及松冈(Matsuoka)等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90:9586-9590，1993所描述]，种子优选启动子[例如来自种子特异性基因(西蒙(Simon)等人，植物分子生物学5.191，1985；斯科菲尔德(Scofield)等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)262:12202，1987；巴钦斯基(Baszczynski)等人，植物分子生物学14:633，1990)、巴西坚果白蛋白(皮尔森(Pearson)等人，植物分子生物学18:235-245，1992)、豆球蛋白(艾利斯(Ellis)等人，植物分子生物学10:203-214，1988)、谷蛋白(水稻)(高岩(Takaiwa)等人，分子遗传学与普通遗传学(Mol.Gen.Genet.)208:15-22，1986；高岩等人，欧洲生化学会联合会快报(FEBS Letts.)221:43-47，1987)、玉米蛋白(玛特兹科(Matzke)等人，植物分子生物学，143).323-321990)、napA(斯塔尔贝里(Stalberg)等人，植物(Planta)199:515-519，1996)、小麦SPA(阿尔巴尼达(Albanietal)，植物细胞(Plant Cell)，9:171-184，1997)、向日葵油体蛋白(oleosin)(康明斯(Cummins)等人，植物分子生物学19:873-876，1992)]，胚乳特异性启动子[例如，小麦LMW和HMW、麦谷蛋白-1(分子遗传学与普通遗传学216:81-90，1989；NAR 17:461-2)、小麦a、b和g麦醇溶蛋白(EMB03:1409-15，1984)、大麦ltrl启动子、大麦B1、C、D大麦醇溶蛋白(理论与应用遗传学(Theor Appl Gen)98:1253-62，1999；植物杂志4:343-55，1993；分子遗传学与普通遗传学250:750-60，1996)、大麦DOF(米纳(Mena)等人，植物杂志(The Plant Journal)，116(1):53-62，1998)、Biz2(EP 99106056.7)、合成启动子(维森特-卡巴优萨(Vicente-Carbajosa)等人，植物杂志13:629-640，1998)、水稻谷醇溶蛋白NRP33、水稻-球蛋白Glb-1(吴(Wu)等人，植物细胞生理学39(8)885-889，1998)、水稻α-球蛋白REB/OHP-1(中濑(Nakase)等人，植物分子生物学33:513-S22，1997)、水稻ADP-葡萄糖PP(Trans Res 6:157-68，1997)、玉蜀黍ESR基因家族(植物杂志12:235-46，1997)、高粱γ-高粱醇溶蛋白(植物分子生物学32:1029-35，1996)]，胚特异性启动子[例如，水稻OSH1(佐藤(Sato)等人，美国国家科学院院刊(Proc.Nati.Acad.Sci.USA)，93:8117-8122)、KNOX(波斯特玛-哈斯玛(Postma-Haarsma)等人，植物分子生物学39:257-71，1999)、水稻油体蛋白(吴等人，生物化学杂志(J.Biochem.)，123:386，1998)]，花特异性启动子[例如，AtPRP4，查尔酮合酶(chalene synthase；chsA)(凡德尔米尔(Vander Meer)等人，植物分子生物学15，95-109，1990)，LAT52(特维尔(Twell)等人，分子遗传学与普通遗传学217:240-245；1989)，apetala-3，植物繁殖组织[例如，OsMADS启动子(美国专利申请2007/0006344)]。

本发明的核苷酸序列也可以在被化学调节的启动子的调节下表达。这使得本发明的Cry蛋白能够仅在用诱导化学品对作物植物进行处理时被合成。用于基因表达的化学诱导的此类技术的实例详述于公开申请EP 0 332 104和美国专利号5,614,395中。在一个实施例中，该化学调节的启动子是烟草PR-1a启动子。

另一类在本发明中有用的启动子是创伤可诱导的启动子。已经说明了数量众多的在创伤部位并且还在植物病原菌感染的部位表达的启动子。理想的是，这样一种启动子在昆虫入侵的部位应该仅有局部活性，并且以此方式这些杀昆虫蛋白仅在需要合成这些杀昆虫蛋白的细胞中积聚以杀死入侵的昆虫有害生物。这类启动子的实例包括由斯坦福(Stanford)等人分子遗传学与普通遗传学(Mol.Gen.Genet.)215:200-208(1989)、徐(Xu)等人植物分子生物学(Plant Molec.Biol.)22:573-588(1993)、洛格曼(Logemann)等人植物细胞(Plant Cell)1:151-158(1989)、罗尔迈尔(Rohrmeier)&莱勒(Lehle)，植物分子生物学(Plant Molec.Biol.)22:783-792(1993)、费雷克(Firek)等人植物分子生物学(Plant Molec.Biol.)22:129-142(1993)以及华纳(Warner)等人植物杂志(Plant J.)3:191-201(1993)所描述的那些。

导致在本发明中有用的组织特异性表达模式的启动子的非限制性实例包括绿色组织特异性的、根特异性的、茎特异性的或花特异性的。适用于在绿色组织中表达的启动子包括调节涉及光合作用的基因的许多启动子，并且这些中的许多已经从单子叶植物和双子叶植物两者中得以克隆。一个这样的启动子是来自磷酸烯醇羧化酶基因的玉米PEPC启动子(赫兹佩思和格鲁勒(Hudspeth&Grula)，《植物分子生物学》(Plant Molec.Biol.)12:579-589(1989))。另一种用于根特异性表达的启动子是由德弗拉曼德(de Framond)(FEBS290:103-106(1991)或美国专利号5,466,785)描述的启动子。另一种在本发明中有用的启动子是描述于美国专利号5,625,136中的茎特异性启动子，它天然地驱动玉蜀黍trpA基因的表达。

除了选择一种适合的启动子之外，用于在植物中表达杀昆虫毒素的构建体还需要一种适当的可操作地连接在异源核苷酸序列下游的转录终止子。一些此类的终止子是可获得的并且在本领域中是已知的(例如来自CaMV的tml，来自rbcS的E9)。任何一种已知在植物中发挥功能的可供使用的终止子均可以在本发明的背景下使用。

可以将数量众多的其他序列掺入本发明中所说明的表达盒中。这些序列包括已经显示出增强表达的序列，如内含子序列(例如，来自Adhl和bronzel)以及病毒的前导序列(例如，来自TMV、MCMV、以及AMV)。

本发明的核苷酸在植物中针对不同的细胞定位的靶向表达可能是更优选的。在某些情况下，在胞质溶胶中的定位可能是令人希望的，而在其他情况下，在某个亚细胞器中的定位可能是优选的。用于靶向例如植物中的基因产物的任何机构都可以用于实践本发明，并且已知此类机构存在于植物中并且已经相当详细地表征了控制这些机构的功能的序列。已经表征了导致将基因产物靶向其他细胞区室的序列。氨基末端序列可以负责将感兴趣的蛋白质靶向任何细胞区室，如植物的液泡、线粒体、过氧化物酶体、蛋白体、内质网、叶绿体、淀粉颗粒、淀粉体、质外体或细胞壁(例如昂格尔(Unger)等人植物分子生物学(Plant Molec.Biol.)13:411-418(1989)；罗杰斯(Rogers)等人(1985)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)82:6512-651；美国专利号7,102,057；WO 2005/096704，将其全部通过引用而特此结合)。任选地，该信号序列可以是来自waxy的N-末端信号序列、来自γ-玉米蛋白的N-末端信号序列、淀粉结合域、C-末端淀粉结合域、将成熟蛋白引入叶绿体的叶绿体靶向序列(措麦(Comai)等人(1988)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)263:15104-15109；范登布洛克(van den Broeck)等人(1985)自然(Nature)313:358-363；美国专利号5,639,949)或来自糊粉细胞的分泌信号序列(克勒(Koehler)&霍(Ho)，植物细胞(Plant Cell)2:769-783(1990))。另外，与羧基末端序列结合的氨基末端序列负责基因产物的液泡靶向(神使(Shinshi)等人(1990)植物分子生物学(Plant Molec.Biol.)14:357-368)。在一个实施例中，选择的信号序列包括已知的切割位点，并且构建的融合体考虑了在一个或多个切割位点之后的需要切割的任何氨基酸。在一些情况下，这个要求可以通过在切割位点与转基因ATG之间添加小数目的氨基酸，或可替代地置换转基因序列内的一些氨基酸来满足。这些构建技术在本领域是熟知的并且同样适用于任何细胞区室。

应认识到，用于细胞靶向的上述机构不仅可以与其同源启动子结合使用，还可以与异源启动子结合使用，从而在启动子的转录调节下实现特定的细胞靶向目标，该启动子具有不同于自其衍生靶向信号的启动子的表达谱。

植物转化

用于转化植物的程序在本领域中是熟知且常规的并且普遍描述于文献中。用于植物转化的方法的非限制性实例包括通过以下各项的转化：细菌介导的核酸递送(例如，经由农杆菌)、病毒介导的核酸递送、碳化硅或核酸须晶介导的核酸递送、脂质体介导的核酸递送、微注射、微粒轰击、磷酸钙介导的转化、环糊精介导的转化、电穿孔、纳米粒子介导的转化、超声处理、渗入、PEG介导的核酸吸收、以及使得核酸引入到植物细胞中的任何其他电学的、化学的、物理的(机械的)或生物的机制，包括其任何组合。对于本领域已知的不同植物转化方法的一般指导包括今井(Miki)等人(在格里克B.R.(Glick,B.R.)和汤普逊J.E.(Thompson,J.E.)编辑的《植物分子生物学与生物技术方法》(Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology)中的“用于将外来DNA引入植物中的程序(Procedures forIntroducing Foreign DNA into Plants)”(CRC出版公司(CRC Press,Inc.)，波卡拉顿(Boca Raton)，1993)，第67-88页)和拉科沃奇-特罗扬诺夫斯卡(Rakowoczy-Trojanowska)(《细胞与分子生物学快报》(Cell.Mol.Biol.Lett.)7:849-858(2002))。

对于农杆菌介导的转化，二元载体或携带至少一个T-DNA边界序列的载体是适合的，而对于直接基因转移(例如，微粒轰击等)，任何载体都是适合的，并且仅含有感兴趣的构建体的线性DNA可以是优选的。在直接基因转移的情况下，可以使用以单个DNA种类的转化或共转化(斯科切尔(Schocher)等人生物技术(Biotechnology)4:1093-1096(1986))。对于直接基因转移以及农杆菌介导的转移二者，转化通常(但不是必需的)用一种选择性标记进行，该选择性标记可以是正向选择(磷甘露糖异构酶)，提供对抗生素(卡那霉素、潮霉素或甲氨蝶呤)或除草剂(草甘膦或草丁膦)的抗性。然而，选择性标记的选择对于本发明并不是至关重要的。

农杆菌介导的转化是一种用于转化植物的常用方法，因为它的高转化效率以及因为它对于许多不同物种的广泛实用性。农杆菌介导的转化典型地涉及将携带感兴趣的外来DNA的二元载体转移至适当的农杆菌菌株，这可能取决于由宿主农杆菌菌株或者在共同存在的Ti质粒上或染色体地携带的vir基因的互补体(乌肯斯(Uknes)等人(1993)植物细胞(Plant Cell)5:159-169)。将该重组二元载体转移至农杆菌可以使用携带该重组二元载体的大肠杆菌、一种辅助大肠杆菌菌株(该辅助菌株携带能够将该重组二元载体移动到目标农杆菌菌株中的质粒)通过三亲本交配程序实现。可替代地，可以通过核酸转化将该重组二元载体转移至农杆菌中(霍夫根&威尔米策(Willmitzer)(1988)核酸研究(Nucleic Acids Res.)16:9877)。

可以使用农杆菌转化双子叶植物以及单子叶植物。用于农杆菌介导的水稻转化方法包括熟知的水稻转化方法，如任何以下文献中描述的那些：欧洲专利申请EP 1198985 A1，阿尔德米塔(Aldemita)&霍奇斯(Hodges)(植物(Planta)199:612-617，1996)；陈(Chan)等人(植物分子生物学(Plant Mol Biol)22(3):491-506，1993)，日江井(Hiei)等人(植物杂志6(2):271-282，1994)，将这些披露通过引用结合在此，其引用程度如同完全阐明一样。在玉米转化的情况下，优选方法是如石田(Ishida)等人(自然生物技术(Nat.Biotechnol)14(6):745-50，1996)或弗雷姆(Frame)等人(植物生理学(PlantPhysiol)129(1):13-22，2002)中所描述的，将这些披露通过引用结合在此，其引用程度如同完全阐明一样。所述方法例如在B.Jenes等人基因转移技术(Techniques for Gene Transfer)，在：转基因植物第1卷，工程化以及利用(Transgenic Plants,Vol.1,Engineering andUtilization)中，S.D.Kung&R.Wu编著，学术出版社(1993)128-143以及在Potrykus植物生理学年评(Annu.Rev.Plant Physiol.)植物分子生物学(Plant Molec.Biol.)42(1991)205-225)中进一步描述。有待表达的核酸或构建体优选地克隆至适合于转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的载体例如pBin19中(Bevan等人，核酸研究12(1984)8711)。然后，能够以已知的方式使用由这种载体转化的农杆菌来转化植物，如用作模型的植物如拟南芥或作物植物如烟草植物，方法是例如通过将捣碎的叶或切碎的叶浸没于农杆菌溶液中，并且然后将其在适合的培养基中培养。例如，借助于根癌农杆菌来转化植物由哈根(Hagen)和威尔米策(Willmitzer)描述于核酸研究(Nucl.Acid Res.)(1988)16,9877中或尤其自以下文献已知：F.F.怀特(F.F.White)，用于高等植物中的基因转移的载体(Vectorsfor Gene Transfer in Higher Plants)；在转基因植物第1卷，工程化以及利用(Transgenic Plants,Vol.1,Engineering and Utilization)中，S.D.孔(S.D.Kung)&R.吴(R.Wu)编著，学术出版社，1993，第15-38页。

通过重组农杆菌进行的植物转化通常涉及该农杆菌与来自该植物的外植体的共培养，并且遵循本领域熟知的方法。在携带位于这些二元质粒T-DNA边界之间的抗生素或除草剂抗性标记的选择培养基上对转化的组织进行再生。

如先前所讨论的，另一种用于转化植物、植物部分和植物细胞的方法涉及在植物组织和细胞上推进惰性或生物活性的粒子。参见例如美国专利号4,945,050；5,036,006和5,100,792。通常，这种方法涉及在有效于穿透该细胞的外表面并提供在其内部中的合并的条件下在植物细胞处推进惰性或生物活性的粒子。当使用惰性粒子时，可以通过用含有感兴趣的核酸的载体包被这些粒子而将该载体引入该细胞中。可替代地，一个或多个细胞可以被该载体围绕使得该载体通过该粒子的激发而被带入该细胞中。也可以将生物活性的粒子(例如，干酵母细胞、干细菌或噬菌体，各自含有一种或多种被试图引入的核酸)推进到植物组织中。

在其他实施例中，本发明的多核苷酸可以被直接转化进质体基因组中。质体转化的一种主要优点在于质体通常能够表达细菌基因而无需实质性的修饰，而且质体能够在一种单一启动子的控制下表达多个开放阅读框。在美国专利号5,451,513、5,545,817和5,545,818中，在PCT申请号WO 95/16783中，以及在麦克布莱德(McBride)等人(1994)美国国家科学院院刊(Proc.Nati.Acad.Sci.USA)91，7301-7305中广泛描述了质体转化技术。基本的叶绿体转化技术涉及将位于选择性标记侧翼的克隆的质体DNA区连同感兴趣的基因一起引入适合的靶组织中，这是(例如)使用生物射弹(biolistic)或原生质体转化(例如，氯化钙或PEG介导的转化)来进行的。这些1至1.5kb的侧翼区(被命名为靶向序列)促进了与质体基因组的同源重组，并且因而允许置换或修饰该原质体(plastome)的特定区域。最初，可以将叶绿体16S rRNA和rps12基因(赋予针对大观霉素或链霉素的抗性)的点突变用作供转化用的选择性标记(斯瓦布，Z.(Svab,Z.)、海杜凯维奇，P.(Hajdukiewicz,P.)和马利加，P.(Maliga,P.)(1990)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)87，8526-8530)；斯托布，J.M.(Staub,J.M.)和马利加，P.(1992)植物细胞(Plant Cell)4，39-45)。在这些标记之间克隆位点的存在允许建立质体靶向载体用于外来基因的引入(斯托布，J.M.(Staub,J.M.)和马利加，P.(Maliga,P.)(1993)欧洲分子生物学杂志(EMBOJ.)12，601-606)。转化效率的实质性增加可以通过用显性的选择性标记(对大观霉素解毒酶氨基糖甙-3'-腺苷转移酶进行编码的细菌aadA基因)置换隐性的rRNA或r蛋白抗生素抗性基因而获得(斯韦伯，Z.(Svab,Z.)和马利加，P.(Maliga,P.)(1993)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90，913-917)。先前，这种标记已经被成功地用于莱茵衣藻这种绿藻的质体基因组的高频率转化(戈尔德施密特-克莱蒙特，M.(Goldschmidt-Clermont,M.)(1991)核酸研究(Nucl.Acids Res.)19:4083-4089)。有用于质体转化的其他选择性标记在本领域是已知的，并且被包括在本发明的范围之内。典型地，转化之后需要大致15-20个细胞分裂循环以便达到一种同质状态。质体表达(其中多种基因通过同源重组被插入到在每个植物细胞中存在的所有数千个环状质体基因组的拷贝中)利用了超过核表达的基因的庞大的拷贝数目的优点，以便允许能够很容易超过总的可溶性植物蛋白的10％的表达水平。在一个实施例中，可以将本发明的多核苷酸插入质体靶向载体中并转化进所希望的植物宿主的质体基因组中。因此，可以获得与包含本发明的核苷酸序列的质体基因组同型的植物，这些植物能够高表达该多核苷酸。

选择转化的转基因植物、植物细胞或植物组织培养物的方法在本领域中是常规的，并且可以用于在此提供的本发明的方法中。例如，本发明的重组载体还可以包括包含用于选择性标记的核苷酸序列的表达盒，该选择性标记可以用于选择转化的植物、植物部分或植物细胞。如在此使用的，“选择性标记(selectable marker)”意指一种核苷酸序列，当该核苷酸序列表达时向表达该标记的植物、植物部分或植物细胞赋予一种不同的表型，并且因此允许此类转化的植物、植物部分或植物细胞与不具有该标记的那些区别开来。这样一个核苷酸序列可以编码一种可选择的抑或可筛选的标记，这取决于该标记是否赋予可以通过化学手段而被选择的性状，如通过使用选择剂(例如，抗生素、除草剂等)，或者取决于该标记是否仅是一种人们可以通过观察或测试而鉴别的性状，如通过筛选(例如，R座位性状)。当然，适合的选择性标记的许多实例在本领域中是已知的并且可以用于在此描述的表达盒中。

选择性标记的实例包括但不限于一种编码neo或nptII的核苷酸序列，它赋予对卡那霉素、G418等的抗性(拍特里库斯(Potrykus)等人(1985)分子遗传学与普通遗传学(Mol.Gen.Genet.)199:183-188)；一种编码bar的核苷酸序列，它赋予对草丁膦的抗性；一种编码改变的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸(EPSP)合酶的核苷酸序列，它赋予对草甘膦的抗性(欣奇(Hinchee)等人(1988)生物技术(Biotech.)6:915-922)；一种编码腈水解酶(如来自臭鼻克雷白氏杆菌(Klebsiella ozaenae)的bxn)的核苷酸序列，它赋予对溴草腈的抗性(斯托克尔(Stalker)等人(1988)，科学(Science)242:419-423)；-种编码改变的乙酰乳酸合酶(ALS)的核苷酸序列，它赋予对咪唑啉酮、磺酰脲或其他ALS-抑制化学品的抗性(欧洲专利申请号154204)；一种编码甲氨蝶呤-抗性的二氢叶酸还原酶(DHFR)的核苷酸序列(泰莱特(Thillet)等人(1988)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)263:12500-12508)；一种编码茅草枯脱卤素酶的核苷酸序列，它赋予对茅草枯的抗性；一种编码甘露糖-6-磷酸异构酶(也称为磷酸甘露糖异构酶(PMI))的核苷酸序列，它赋予代谢甘露糖的能力(美国专利号5,767,378和5,994,629)；一种编码改变的邻氨基苯甲酸盐合酶的核苷酸序列，它赋予对5-甲基色氨酸的抗性；或一种编码hph的核苷酸序列，它赋予对潮霉素的抗性。本领域技术人员能够选择用于在本发明的表达盒中使用的适合的选择性标记。

另外可选择性标志包括但不限于：一种编码β-葡萄糖醛酸酶的核苷酸序列或编码对于多种显色底物已知的一种酶的uidA(GUS)；一种编码在植物组织中对花色苷色素(红色)进行调节的产物的R基因座核苷酸序列(Dellaporta(德拉普塔)等人，染色体结构与功能：新概念的影响(Chromosome Structure and Function:Impact of NewConcepts)中的263-282“通过Ac转座子标签技术对玉米R-nj等位基因的分子克隆”(“Molecular cloning of the maize R-nj allele bytransposon-tagging with Ac”)，第18届斯特德莱遗传学专题讨论会(18th Stadler Genetics Symposium)(古斯塔夫森(Gustafson)和阿佩尔斯(Appels)编，Plenum出版社(Plenum Press)(1988))；一种编码β-内酰胺酶的核苷酸序列，对于β-内酰胺酶而言多种显色底物是已知的(例如，PADAC，一种显色头孢菌素)(苏利夫(Sutcliffe)(1978)美国科学院院刊75:3737-3741)；一种编码xylE的核苷酸序列，xylE编码一种儿茶酚双加氧酶(茹科夫斯基(Zukowsky)等人(1983)美国科学院院刊80:1101-1105)；一种编码酪氨酸酶的核苷酸序列，酪氨酸酶能够氧化酪氨酸成为DOPA以及多巴醌，其进而缩合形成黑色素(卡茨(Katz)等人(1983)普通微生物学杂志(J.Gen.Microbiol.)129:2703-2714)；一种编码β-半乳糖苷酶的核苷酸序列，对于β-半乳糖苷酶而言存在显色底物；一种编码荧光素酶(lux)的核苷酸序列，荧光素酶允许生物发光检测(奥(Ow)等人(1986)科学234:856-859)；一种编码水母发光蛋白的核苷酸序列，水母发光蛋白可以在钙敏感的生物发光检测中采用(普鲁切(Prasher)等人(1985)生物化学与生物物理学研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Comm.)126:1259-1268)；或一种编码绿色荧光蛋白的核苷酸序列(涅茨(Niedz)等人(1995)植物细胞报道(Plant Cell Reports)14:403-406)。本领域技术人员能够选择用于在本发明的表达盒中使用的适合的选择性标记。

此外，如本领域中所熟知的，完整的转基因植物可以使用多种已知技术中的任何技术从转化的植物细胞、植物组织培养物或培养的原生质体再生而来。在以下文献中描述了从植物细胞、植物组织培养物或培养的原生质体进行的植物再生：例如，埃文斯(Evans)等人(植物细胞培养物手册(Handbook of Plant Cell Cultures)，第1卷，麦克米兰出版公司(MacMilan Publishing Co.)，纽约(1983))；以及瓦西尔I.R.(Vasil I.R.)(编辑)(植物的细胞培养和体细胞遗传学(Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants)，学术出版社，奥兰多(Orlando)，第1卷(1984)和第II卷(1986))。

另外，工程化进以上所述的本发明的转基因种子和植物、植物部分或植物细胞中的遗传特性可以通过有性生殖或营养生长来传递，并且因此可以在子代植物中维持并传代。通常，维持和传代利用了被开发以适合特定目的(如收获、播种或耕作)的已知农业方法。

因此，可以按本领域熟知的任何数目的方法(如上所述的)将多核苷酸引入该植物、植物部分或植物细胞中。因此，没有依赖用于将一种或多种多核苷酸引入植物中的具体方法，相反可以使用允许将该一种或多种多核苷酸稳定地整合到该植物的基因组中的任何方法。在有待引入一种以上多核苷酸的情况下，这些对应的多核苷酸可以作为单一核酸分子的部分、或者作为分开的核酸分子而进行组装，并且可以位于相同的或不同的核酸分子上。因此，可以在单一转化事件中、在分开的转化事件中、或者例如作为育种方案的一部分在植物中，将这些多核苷酸引入感兴趣的细胞中。

本发明的另外的实施例包括从本发明的转基因植物或其部分产生的收获产物以及从所述收获产物产生的加工产物。收获产物可以是如在此描述的全株或任何植物部分。因此，在一些实施例中，收获的产物的非限制性实例包括种子、果实、花或其部分(例如，花药、柱头等)、叶、茎等。在其他实施例中，加工产物包括但不限于从收获的本发明的种子或其他植物部分产生的细粉、粗粉、油、淀粉、谷物等，其中所述种子或其他植物部分包括本发明的核酸分子/多核苷酸/核苷酸序列。

在其他实施例中，本发明提供了一种来自本发明的转基因种子或转基因植物的提取物，其中该提取物包括本发明的核酸分子、多核苷酸、核苷酸序列或毒性蛋白。可以根据本领域熟知的程序制备来自植物或植物部分的提取物(参见，德拉托雷(de la Torre)等人，食品农业与环境(Food,Agric.Environ.)2(1):84-89(2004)；吉代(Guidet)，核酸研究(Nucleic Acids Res.)22(9):1772-1773(1994)；利普顿(Lipton)等人，食品农业通讯(Food Agric.Immun.)12:153-164(2000))。

杀昆虫组合物

在一些实施例中，本发明提供了一种杀昆虫组合物，该组合物包含农业上可接受的载体中的本发明的Cry蛋白。如在此使用的“农业上可接受的载体”可以包括与活性Cry蛋白组合以有助于它施用至植物或其部分或其中的天然或合成的有机或无机材料。农业上可接受的载体的实例包括但不限于粉剂、尘剂、丸剂、颗粒剂、喷雾剂、乳剂、胶体以及溶液。农业上可接受的载体进一步包括但不限于可用于农业配制品中的惰性组分、分散剂、表面活性剂、佐剂、增粘剂、粘着剂、粘合剂或其组合。此类组合物可以按使杀昆虫蛋白或其他有害生物控制剂与这些有害生物接触的任何方式施用。因此，可以将这些组合物施用于植物或植物部分的表面，包括种子、叶、花、茎、块茎、根等。在其他实施例中，在植物体内产生本发明的Cry蛋白的植物是被表达的Cry蛋白的农业载体。

在另外的实施例中，该杀昆虫组合物包括细菌细胞或本发明的转基因细菌细胞，其中该细菌细胞或转基因细菌细胞产生本发明的Cry蛋白。这样一种杀昆虫组合物可以通过脱水、冷冻干燥、均化、萃取、过滤、离心、沉降或浓缩苏云金杆菌(Bt)的培养物而制备。此类Bt培养物可以是下文实例中描述的天然存在的Bt菌株YN171-1、GX078-2和GX435-1或转基因Bt培养物。在另外的实施例中，该组合物包括按重量计从约1％至约99％的本发明的Cry蛋白。

本发明的Cry蛋白可以与其他有害生物控制剂组合使用，以增加有害生物目标范围或用于预防或管理昆虫抗性。因此，在一些实施例中，本发明提供了一种控制一种或多种植物有害生物的组合物，其中该组合物包括本发明的第一Cry蛋白和不同于该第一Cry蛋白的第二有害生物控制剂。在其他实施例中，该组合物是一种用于局部施用至植物的配制品。在仍其他实施例中，该组合物是转基因植物。在另外的实施例中，该组合物是局部施用至转基因植物的配制品的组合。在一些实施例中，当该转基因植物包括该第二有害生物控制剂时，该配制品包括本发明的该第一Cry蛋白。在其他实施例中，当该转基因植物包括本发明的该第一Cry蛋白时，该配制品包括该第二有害生物控制剂。

在一些实施例中，该第二有害生物控制剂可以是一种选自下组的试剂，该组由以下各项组成：化学杀有害生物剂如杀昆虫剂、苏云金杆菌(Bt)杀昆虫蛋白、致病杆菌属杀昆虫蛋白、发光杆菌属杀昆虫蛋白、侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)杀昆虫蛋白、球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)杀昆虫蛋白、蛋白酶抑制剂(丝氨酸和半胱氨酸类型两者)、凝集素、α-淀粉酶、过氧化物酶、胆固醇氧化酶以及双链RNA(dsRNA)分子。

在其他实施例中，该第二有害生物控制剂是一种选自下组的化学杀有害生物剂，该组由以下各项组成：拟除虫菊酯、氨基甲酸酯、新烟碱、神经元钠通道阻断剂、杀昆虫大环内酯、γ-氨基丁酸(GABA)拮抗剂、杀昆虫脲以及保幼激素模拟物。在其他实施例中，该化学杀有害生物剂选自下组，该组由以下各项组成：阿巴美丁、乙酰甲胺磷、啶虫脒、磺胺螨酯(amidoflumet)(S-1955)、除虫菌素(avermectin)、印楝素、甲基谷硫磷、联苯菊酯、联苯肼酯(binfenazate)、噻嗪酮、克百威、溴虫腈、定虫隆、毒死蜱、甲基毒死蜱、环虫酰肼、噻虫胺、氟氯氰菊酯、β-氟氯氰菊酯、三氯氟氰菊酯、λ-三氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、灭蝇胺、溴氰菊酯、杀螨隆、二嗪磷、除虫脲、乐果、苯虫醚、甲氨基阿维菌素、硫丹、高氰戊菊酯、乙虫腈、苯硫威(fenothicarb)、苯氧威、甲氰菊酯、唑螨酯、氰戊菊酯、氟虫腈、氟啶虫酰胺、氟氰戊菊酯、τ-氟胺氰菊酯、嘧虫胺(UR-50701)、氟虫脲、地虫硫磷、氯虫酰肼、氟铃脲、吡虫啉、茚虫威、异柳磷、虱螨脲、马拉硫磷、聚乙醛、甲胺磷、杀扑磷、灭多威、烯虫酯、甲氧氯、久效磷、甲氧虫酰肼、噻虫醛(nithiazin)、双苯氟脲、多氟脲(XDE-007)、杀线威、对硫磷、甲基对硫磷、氯菊酯、甲拌磷、伏杀磷、亚胺硫磷、磷胺、抗蚜威、丙溴磷、吡蚜酮、啶虫丙醚、蚊蝇醚、鱼藤酮、多杀菌素、螺甲螨酯(spiromesifin)(BSN 2060)、硫丙磷、虫酰肼、伏虫隆、七氟菊酯、特丁硫磷、杀虫畏、噻虫啉、噻虫嗪、硫双威、杀虫双(thiosultap-sodium)、四溴菊酯、敌百虫和杀铃脲、涕灭威、杀线威、苯线磷、双甲脒、灭螨猛、乙酯杀螨醇、三环锡、三氯杀螨醇、除螨灵、依杀螨、喹螨醚、苯丁锡、甲氰菊酯、唑螨酯、噻螨酮、克螨特、哒螨灵以及吡螨胺。在仍其他实施例中，该化学杀有害生物剂选自下组，该组由以下各项组成：氯氰菊酯、三氯氟氰菊酯、氟氯氰菊酯和β-氟氯氰菊酯、高氰戊菊酯、氰戊菊酯、四溴菊酯、苯硫威、灭多威、杀线威、硫双威、噻虫胺、吡虫啉、噻虫啉、茚虫威、多杀菌素、阿巴美丁、除虫菌素(avermectin)、苯虫醚、硫丹、乙虫腈、氟虫腈、氟虫脲、杀铃脲、苯虫醚、蚊蝇醚、吡蚜酮以及双甲脒。

在另外的实施例中，该第二有害生物控制剂可以是任何数目的苏云金杆菌杀昆虫蛋白中的一种或多种，包括但不限于Cry蛋白、营养期杀昆虫蛋白(VIP)以及任何前述杀昆虫蛋白的杀昆虫嵌合体。在其他实施例中，该第二有害生物控制剂是一种选自下组的Cry蛋白，该组由以下各项组成：Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Ad、Cry1Ae、Cry1Af、Cry1Ag、Cry1Ah、Cry1Ai、Cry1Aj、Cry1Ba、Cry1Bb、Cry1Bc、Cry1Bd、Cry1Be、Cry1Bf、Cry1Bg、Cry1Bh、Cry1Bi、Cry1Ca、Cry1Cb、Cry1Da、Cry1Db、Cry1Dc、Cry1Dd、Cry1Ea、Cry1Eb、Cry1Fa、Cry1Fb、Cry1Ga、Cry1Gb、Cry1Gc、Cry1Ha、Cry1Hb、Cry1Hc、Cry1Ia、Cry1Ib、Cry1Ic、Cry1Id、Cry1Ie、Cry1If、Cry1Ig、Cry1Ja、Cry1Jb、Cry1Jc、Cry1Jd、Cry1Ka、Cry1La、Cry1Ma、Cry1Na、Cry1Nb、Cry2Aa、Cry2Ab、Cry2Ac、Cry2Ad、Cry2Ae、Cry2Af、Cry2Ag、Cry2Ah、Cry2Ai、Cry2Aj、Cry2Ak,Cry2Al、Cry2Ba、Cry3Aa、Cry3Ba、Cry3Bb、Cry3Ca、Cry4Aa、Cry4Ba、Cry4Ca、Cry4Cb、Cry4Cc、Cry5Aa、Cry5Ab、Cry5Ac、Cry5Ad、Cry5Ba、Cry5Ca、Cry5Da、Cry5Ea、Cry6Aa、Cry6Ba、Cry7Aa、Cry7Ab、Cry7Ac、Cry7Ba、Cry7Bb、Cry7Ca、Cry7Cb、Cry7Da、Cry7Ea、Cry7Fa、Cry7Fb、Cry7Ga、Cry7Gb、Cry7Gc、Cry7Gd、Cry7Ha、Cry7Ia、Cry7Ja、Cry7Ka、Cry7Kb、Cry7La、Cry8Aa、Cry8Ab、Cry8Ac、Cry8Ad、Cry8Ba、Cry8Bb、Cry8Bc、Cry8Ca、Cry8Da、Cry8Db、Cry8Ea、Cry8Fa、Cry8Ga、Cry8Ha、Cry8Ia、Cry8Ib、Cry8Ja、Cry8Ka、Cry8Kb、Cry8La、Cry8Ma、Cry8Na、Cry8Pa、Cry8Qa、Cry8Ra、Cry8Sa、Cry8Ta、Cry9Aa、Cry9Ba、Cry9Bb、Cry9Ca、Cry9Da、Cry9Db、Cry9Dc、Cry9Ea、Cry9Eb、Cry9Ec、Cry9Ed、Cry9Ee、Cry9Fa、Cry9Ga、Cry10Aa、Cry11Aa、Cry11Ba、Cry11Bb、Cry12Aa,Cry13Aa、Cry14Aa、Cry14Ab、Cry15Aa、Cry16Aa、Cry17Aa、Cry18Aa、Cry18Ba、Cry18Ca、Cry19Aa、Cry19Ba、Cry19Ca、Cry20Aa、Cry20Ba、Cry21Aa、Cry21Ba、Cry21Ca、Cry21Da、Cry21Ea、Cry21Fa、Cry21Ga、Cry21Ha、Cry22Aa、Cry22Ab、Cry22Ba、Cry22Bb、Cry23Aa、Cry24Aa、Cry24Ba、Cry24Ca、Cry25Aa、Cry26Aa、Cry27Aa、Cry28Aa、Cry29Aa、Cry29Ba、Cry30Aa、Cry30Ba、Cry30Ca、Cry30Da、Cry30Db、Cry30Ea、Cry30Fa、Cry30Ga,Cry31Aa、Cry31Ab、Cry31Ac、Cry31Ad、Cry32Aa、Cry32Ab、Cry32Ba、Cry32Ca、Cry32Cb、Cry32Da、Cry32Ea、Cry32Eb、Cry32Fa、Cry32Ga、Cry32Ha、Cry32Hb、Cry32Ia、Cry32Ja、Cry32Ka、Cry32La、Cry32Ma、Cry32Mb、Cry32Na、Cry32Oa、Cry32Pa、Cry32Qa、Cry32Ra、Cry32Sa、Cry32Ta、Cry32Ua、Cry33Aa、Cry34Aa、Cry34Ab、Cry34Ac、Cry34Ba、Cry35Aa、Cry35Ab、Cry35Ac、Cry35Ba、Cry36Aa、Cry37Aa、Cry38Aa、Cry39Aa、Cry40Aa、Cry40Ba、Cry40Ca、Cry40Da、Cry41Aa、Cry41Ab、Cry41Ba、Cry42Aa、Cry43Aa、Cry43Ba、Cry43Ca、Cry43Cb、Cry43Cc、Cry44Aa、Cry45Aa、Cry46Aa、Cry46Ab、Cry47Aa、Cry48Aa、Cry48Ab、Cry49Aa、Cry49Ab、Cry50Aa、Cry50Ba、Cry51Aa、Cry52Aa、Cry52Ba、Cry53Aa、Cry53Ab、Cry54Aa、Cry54Ab、Cry54Ba、Cry55Aa、Cry56Aa、Cry57Aa、Cry57Ab、Cry58Aa、Cry59Aa、Cry59Ba、Cry60Aa、Cry60Ba、Cry61Aa、Cry62Aa、Cry63Aa、Cry64Aa、Cry65Aa、Cry66Aa、Cry67Aa、Cry68Aa、Cry69Aa、Cry69Ab、Cry70Aa、Cry70Ba、Cry70Bb、Cry71Aa、Cry72Aa以及Cry73Aa。

在另外的实施例中，该第二有害生物控制试剂是一种选自下组的Vip3营养期杀昆虫蛋白，该组由以下各项组成：Vip3Aa1、Vip3Aa2、Vip3Aa3、Vip3Aa4、Vip3Aa5、Vip3Aa6、Vip3Aa7、Vip3Aa8、Vip3Aa9、Vip3Aa10、Vip3Aa11、Vip3Aa12、Vip3Aa13、Vip3Aa14、Vip3Aa15、Vip3Aa16、Vip3Aa17、Vip3Aa18、Vip3Aa19、Vip3Aa20、Vip3Aa21、Vip3Aa22、Vip3Aa2、Vip3Aa24、Vip3Aa25、Vip3Aa26、Vip3Aa27、Vip3Aa28、Vip3Aa29、Vip3Aa30、Vip3Aa31、Vip3Aa32、Vip3Aa33、Vip3Aa34、Vip3Aa35、Vip3Aa36、Vip3Aa37、Vip3Aa38、Vip3Aa39、Vip3Aa40、Vip3Aa41、Vip3Aa42、Vip3Aa43、Vip3Aa44、Vip3Ab1、Vip3Ab2、Vip3Ac1、Vip3Ad1、Vip3Ad2、Vip3Ae1、Vip3Af1、Vip3Af2、Vip3Af3、Vip3Ag1,Vip3Ag2、Vip3Ag3HM117633、Vip3Ag4、Vip3Ag5、Vip3Ah1、Vip3Ba1、Vip3Ba2、Vip3Bb1、Vip3Bb2以及Vip3Bb3。

在仍另外的实施例中，在转基因植物中共表达本发明的第一Cry蛋白和该第二有害生物控制剂。可以通过将植物遗传工程化以包含并表达所有的必需基因来实现一种以上杀有害生物成分在同一个转基因植物中的共表达。可替代地，可以将植物(亲本1)遗传工程化，用于本发明的Cry蛋白的表达。可以将第二植物(亲本2)遗传工程化，用于第二有害生物控制剂的表达。通过将亲本1与亲本2杂交，获得了表达被引入至亲本1和亲本2中的所有基因的子代植物。

在其他实施例中，本发明提供了一种对植物有害生物侵染有抗性的叠加性转基因植物，该植物包含编码用于在靶标有害生物中抑制必需基因的dsRNA的DNA序列和编码针对该靶标有害生物展示出生物活性的本发明的Cry蛋白的DNA序列。已经报道，dsRNA对抗某些鳞翅目有害生物是无效的(拉亚格布勒(Rajagopol)等人2002.生物化学杂志(J.Biol.Chem.)277:468-494)，这可能是由于中肠中的高pH使得dsRNA不稳定。因此，在一些靶标有害生物是鳞翅目有害生物的实施例中，本发明的Cry蛋白起作用以瞬时降低中肠pH，这用于稳定共摄取的dsRNA，从而使得该dsRNA有效沉默靶基因。

除了提供组合物之外，本发明还提供了产生对鳞翅目有害生物有毒的Cry蛋白的方法。这样一种方法包括在转基因非人类宿主细胞产生对鳞翅目有害生物有毒的蛋白质的条件下培养该宿主细胞，该宿主细胞包括本发明的多核苷酸或嵌合基因或核酸分子或重组载体。在一些实施例中，该转基因非人类宿主细胞是植物细胞。在一些其他实施例中，该植物细胞是玉蜀黍细胞。在其他实施例中，植物细胞或玉蜀黍细胞在其下生长的条件包括自然光照。在其他实施例中，该转基因非人类宿主细胞是细菌细胞。在仍其他实施例中，该转基因非人类宿主细胞是酵母细胞。

在该方法的其他实施例中，该鳞翅目有害生物选自下组，该组由以下各项组成：亚洲玉米蛀虫(Asian corn borer)(亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis))、黑色地老虎(black cutworm)(小地老虎(Agrotis ipsilon))、棉螟蛉(cotton bollworm)(棉铃虫(Helicoverpaarmigera))、黄色桃螟虫(yellow peach borer)(桃蛀螟(Conogethespunctiferalis))、东方黏虫(Oriental armyworm)(东方粘虫(Mythimnasepatate))、欧洲玉米蛀虫(European corn borer)(欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis))、秋黏虫(fall armyworm)(草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda))、玉米穗蛾(corn earworm)(玉米穗虫(Helicoverpa zea))、甘蔗螟(sugarcane borer)(小蔗螟(Diatraeasaccharalis))、绒毛豆毛虫(velvetbean caterpillar)(黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis))、大豆夜蛾(soybean looper)(大豆尺蠖(Chrysodeixis includes))、西南玉米蛀虫(southwest corn borer)(西南玉米螟(Diatraea grandiosella))、西部豆切根虫(western beancutworm)(西部豆夜蛾(Richia albicosta))、烟夜蛾(tobaccobudworm)(烟芽夜蛾(Heliothis virescens))、条纹蛀茎虫(stripedstem borer)(二化螟(Chilo suppressalis))、粉蛀茎虫(pink stemborer)(非洲大螟(Sesamia calamistis))以及水稻卷叶螟(riceleaffolder)(稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis))及其任何组合。

在该方法的另外的实施例中，该嵌合基因包括SEQ ID NO:1-5中的任何项。在仍其他实施例中，所产生的蛋白质包括SEQ ID NO:16-25中的任何项的氨基酸序列。

在该方法的一些实施例中，该嵌合基因包括针对在植物中表达进行了密码子优化的核苷酸序列。在其他实施例中，该嵌合基因包括SEQ ID NO:6-10中的任何项。在另外的实施例中，所产生的蛋白质包括SEQ ID NO:16-25中的任何项的氨基酸序列。

在另外的实施例中，本发明提供了一种产生抗有害生物(例如，抗昆虫)转基因植物的方法，该方法包括向植物中引入包含编码本发明的Cry蛋白的核苷酸序列的本发明的多核苷酸、嵌合基因、重组载体、表达盒或核酸分子，其中该核苷酸序列被表达于该植物中，由此赋予该植物对鳞翅目有害生物的抗性，并且产生抗昆虫转基因植物。在一些实施例中，与缺乏本发明的多核苷酸、嵌合基因、重组载体、表达盒或核酸分子的对照植物相比，抗有害生物转基因植物对杆野螟属(Ostrinia)的鳞翅目有害生物有抗性。在其他实施例中，杆野螟属的该昆虫是亚洲玉米蛀虫(Asian corn borer)(亚洲玉米螟(Ostriniafurnacalis))或欧洲玉米蛀虫(European corn borer)(欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis))。在一些实施例中，通过转化植物实现引入。在其他实施例中，通过使包含本发明的嵌合基因、重组载体、表达盒或核酸分子的第一植物与不同的第二植物杂交来实现引入。

在一些实施例中，至少对亚洲玉米蛀虫(Asian corn borer)(亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis))或欧洲玉米蛀虫(European cornborer)(欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis))有抗性的本发明的转基因植物还对至少一种另外的鳞翅目有害生物有抗性，其中该另外的鳞翅目有害生物包括但不限于黑色地老虎(black cutworm)(小地老虎(Agrotis ipsilon))、秋黏虫(fall armyworm)(草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda))、玉米穗蛾(corn earworm)(玉米穗虫(Helicoverpa zea))、甘蔗螟(sugarcane borer)(小蔗螟(Diatraeasaccharalis))、绒毛豆毛虫(velvetbean caterpillar)(黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis))、大豆夜蛾(soybean looper)(大豆尺蠖(Chrysodeixis includes))、西南玉米蛀虫(southwest corn borer)(西南玉米螟(Diatraea grandiosella))、西部豆切根虫(western beancutworm)(西部豆夜蛾(Richia albicosta))、烟夜蛾(tobaccobudworm)(烟芽夜蛾(Heliothis virescens))、棉螟蛉(cottonbollworm)(棉铃虫(Helicoverpa armigera))、条纹蛀茎虫(stripedstem borer)(二化螟(Chilo suppressalis))、粉蛀茎虫(pink stemborer)(非洲大螟(Sesamia calamistis))或水稻卷叶螟(rice leaffolder)(稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis))及其任何组合。

在另外的实施例中，提供了一种控制鳞翅目有害生物如亚洲玉米蛀虫(Asian corn borer)(亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis))或欧洲玉米蛀虫(European corn borer)(欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis))的方法，该方法包括向这些昆虫递送有效量的本发明的Cry蛋白。为了有效，该Cry蛋白首先被昆虫经口摄取。然而，该Cry蛋白可以按许多公认的方式被递送至该昆虫。用于将蛋白质经口地递送至昆虫的方式包括但不限于将该蛋白质提供于(1)转基因植物中，其中该昆虫取食(摄取)该转基因植物的一个或多个部分，由此摄取在该转基因植物中表达的多肽；(2)一种或多种配制的蛋白组合物中，它们可以被施加至或掺入例如昆虫生长介质中；(3)一种或多种蛋白组合物中，它们可以被施加至表面，例如喷雾在植物部分的表面，然后当该昆虫取食喷雾的一个或多个植物部分时组合物被该昆虫摄取；(4)饵基；或(5)任何其他本领域公认的蛋白递送系统。因此，可以使用经口递送至昆虫的任何方法来递送本发明的毒性Cry蛋白。在一些具体实施例中，将本发明的Cry蛋白经口递送至昆虫，其中该昆虫摄取转基因植物的一个或多个部分。

在其他实施例中，将本发明的Cry蛋白经口递送至昆虫，其中该昆虫摄取用包含本发明的Cry蛋白的组合物喷雾的植物的一个或多个部分。可以使用本领域技术人员已知的用于将化合物、组合物、配制品等施用于植物表面的任何方法将本发明的组合物递送至植物表面。递送至或接触植物或其部分的一些非限制性实例包括喷雾、撒粉、喷洒、分散、下雾、雾化、撒播、浸泡、土壤注入、土壤掺入、浸透(例如，根、土壤处理)、浸渍、灌注、涂覆、叶或茎渗透、侧施或种子处理等及其组合。用于使植物或其部分与一种或多种化合物、一种或多种组合物或一种或多种配制品接触的这些和其他程序是本领域技术人员熟知的。

在一些实施例中，本发明涵盖一种为农民提供控制鳞翅目有害生物的手段的方法，该方法包括向该农民供应或出售植物材料如种子，该植物材料包括能够在由该种子生长的植物中表达本发明的Cry蛋白的多核苷酸、嵌合基因、表达盒或重组载体，如上所述。

本发明的实施例可以通过引用以下实例而被更好地理解。前述的和以下的本发明的实施例以及各种实施例的描述不是旨在限制权利要求书，而是对其具有说明性。因此，将理解的是权利要求书不旨在限制这些实例的具体细节。将由本领域中的普通技术人员理解的是本发明的其他实施例可以在不偏离本披露的精神和范围的情况下进行实践，本披露的范围是由所附权利要求书限定。

实例

实例1.活性Bt菌株的鉴别

从在中国收集的土壤样品中分离苏云金杆菌(Bt)菌株。将土壤样品悬浮于LB+2.5M乙酸钠液体培养基中，随后70℃热处理20min。然后将一微升悬浮液涂布在T3+青霉素琼脂平板上并且在28℃下孵育，直到形成菌落。将具有芽孢杆菌属样形态学的菌落从这些平板中挑出并且在T3+青霉素琼脂平板上重新划线直到它们已经形成孢子，典型地持续大约三天。通过用考马斯蓝/乙酸将培养物染色并且用显微镜可视化来鉴别Bt菌株。孢子形成之后，将培养物悬浮于碱性缓冲液中并且测试针对感兴趣的鳞翅目种类的活性。在表面污染生物测定中测试悬浮液，在该生物测定中将液体覆盖到多种类人工饲料上。针对至少三种鳞翅目有害生物种类(包括棉螟蛉(cotton bollworm)(棉铃虫(Helicoverpa armigera))、黑色地老虎(black cutworm)(小地老虎(Agrotis ipsilon))和亚洲玉米蛀虫(Asian corn borer)(亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)))筛选每种分离物，其中样本量为12只新生幼虫。每个测定的持续时间为在27℃下约7天；针对死亡率以及幼虫生长抑制对这些平板评分。将在相对于阴性对照观察到的死亡率增加30％时认为是有效的。基于初始昆虫测试，选择三个Bt菌株YN171-1、GX078-2和GX435-1用于进一步分析。

实例2.基因组组装与分析

使用全基因组测序方法从实例1中鉴别的菌株中鉴别本发明的Btcry基因。简言之，使用Covaris S2超声波装置(Covaris公司，沃本，马萨诸塞州)剪切芽孢杆菌属DNA，其中将程序DNA_400bp设置为工作循环：10％；强度：4；循环/脉冲：200。将DNA用Ultra^TMEnd Repair/dA-加尾模块(新英格兰生物实验室公司(New EnglandBiolabs,Inc.)，伊普斯维奇，马萨诸塞州)处理。如由供应商(新英格兰生物实验室公司，伊普斯维奇，马萨诸塞州)所描述的，使用NEBQuick Ligation^TM连接生物科技(Biooscience)有索引的1-57个适配子(1-27巴西，28-57美国，英国和瑞士)。如由供应商(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter,Inc.)，印第安纳波利斯，印第安纳州)所描述的，使用Agencourt AMPure XP珠粒清洁连接物。

将文库如下进行大小分级：将50uL样品与45ul 75％珠粒混合物(25％AMPure珠粒加75％NaCl/PEG溶液TekNova目录号P4136)混合。搅拌混合物并置于磁性支架上。将所得上清液转移至新孔中并且添加45ul 50％珠粒混合物(50％AMPure珠粒加50％NaCl/PEG溶液TekNova目录号P4136)。搅拌该混合物并置于磁性支架上。除去所得上清液并且用80％乙醇洗涤珠粒。添加25uL的洗脱缓冲液(EB)并且将混合物置于磁性支架上。除去所得最终上清液并置于1.5mL管中。这个方法产生了525个DNA碱基对(bp)(插入物加适配子)大小范围内的文库。

使用KAPA生物系统高保真热启动(KAPA Biosystem HiFi HotStart)(KAPA生物系统公司(Kapa Biosystems，Inc.)，威尔明顿，马萨诸塞州)使用以下循环条件扩增大小确定的DNA文库：[98℃，45s]；12x[98℃，15s，60℃，30s，72℃，30s]；[72℃，1min]。每个反应含有：5ul DNA文库，1uL生物科技通用引物(25uM)，18uL无菌水，1uL生物科技有索引的引物(25uM)，25ul 2X KAPA高保真聚合酶。

使用高灵敏度芯片在安捷伦(Agilent)2100生物分析仪(安捷伦科技公司(Agilent Technologies)，圣克拉拉，加利福尼亚州)上跑文库，以确定文库大小范围和平均插入物大小。使用标准的制造商测序方案(亿明达公司(Illumina,Inc.)，圣地亚哥，加利福尼亚州)在HiSeq 2500测序系统上针对配对末端(PE)测序(100个循环/读数；12-24个文库/个泳道)加工所有文库。

使用被开发用于鉴别和表征可能的Cry样基因的芽孢杆菌属计算分析工具来优先化引导物，用于进一步实验室测试。

上述基因组组装与分析以及基因组文库分析在Bt菌株中鉴别出五个Cry样基因，它们对至少一种鳞翅目有害生物(例如亚洲玉米蛀虫(Asian corn borer)(亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)))有毒性。这些Cry基因和蛋白的鉴别特征示于表1中。

表1.苏云金杆菌菌株中鉴别的Cry基因/蛋白。

实例3.重组宿主细胞中的Bt蛋白表达

芽孢杆菌属表达。经由设计用于在大肠杆菌和Bt两者中表达的被指定为pCIB5634`的穿梭载体在没有可观察到的背景杀昆虫活性的无晶体(crystal minus)苏云金杆菌(Bt)菌株中表达实例2中描述的Cry蛋白。载体pCIB5634`包括驱动经克隆的Bt Cry基因的表达的Cry1Ac启动子和红霉素抗性标记。经由电穿孔将包含感兴趣的Cry编码序列的表达盒转化进宿主Bt菌株中并且在含有红霉素的琼脂平板上选择转基因Bt菌株。使所选择的转基因Bt菌株在T3培养基中于28℃下生长4-5天至孢子形成阶段。收获细胞沉淀并且在溶解于包含2mM DTT的高pH碳酸盐缓冲液(50mM)中之前反复洗涤。

大肠杆菌表达。使用pET28a或pET29a载体(默克公司(MerckKGaA)，达姆施塔特，德国)在大肠杆菌菌株中表达Cry蛋白。通过电穿孔转化构建体并且在含有卡那霉素的琼脂平板上选择转大肠杆菌克隆。使所选择的转基因大肠杆菌菌株生长并且使用IPTG诱导在28℃下诱导Cry蛋白表达。将细胞再悬浮于含有2mM DTT的高pH碳酸盐缓冲液(50mM)中并且然后使用Microfluidics LV-1匀浆器打碎。

表达分析。然后经由离心澄清来自转基因Bt或大肠杆菌菌株的所得细胞裂解物并且使用BioRad Experion系统(伯乐公司(Biorad)，赫拉克勒斯，加利福尼亚州)经由SDS-PAGE和电泳图分析样品的纯度。经由布雷福德(Bradford)或赛默(Thermo)660测定确定总蛋白浓度。然后在以下描述的生物测定中测试经纯化的Cry蛋白。

实例4.Cry蛋白在生物测定中的活性

使用本领域公认的人工饲料生物测定方法针对以下鳞翅目有害生物种类中的一种或多种测试实例3中产生的Cry蛋白：亚洲玉米蛀虫(Asian corn borer；ACB)(亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis))；棉螟蛉(cotton bollworm；CBW)(棉铃虫(Helicoverpa armigera))；黑色地老虎(black cutworm；BCW)(小地老虎(Agrotis ipsilon))；黄色桃螟虫(yellow peach borer；YPB)(桃蛀螟(Conogethespunctiferalis))；东方黏虫(Oriental armyworm；OAW)(东方粘虫(Mythimna sepatate))；条纹蛀茎虫(striped stem borer；SSB)(二化螟(Chilo suppressalis))；欧洲玉米蛀虫(European corn borer；ECB)(欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis))；秋黏虫(fall armyworm；FAW)(草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda))，玉米穗蛾(cornearworm；CEW)(玉米穗虫(Helicoverpa zea))，甘蔗螟(sugarcaneborer；SCB)(小蔗螟(Diatraea saccharalis))，大豆夜蛾(soybeanlooper；SBL)(大豆尺蠖(Chrysodeixis includes))，西南玉米蛀虫(southwest corn borer)(西南玉米螟(Diatraea grandiosella))以及烟夜蛾(tobacco budworm；TBW)(烟芽夜蛾(Heliothisvirescens))。

向24孔平板中的人工昆虫饲料(Bioserv公司，弗伦奇敦，新泽西州)的表面施加等量的溶液中的蛋白质。在饲料表面干燥之后，向每个孔中添加有待测试的昆虫种类的幼虫。将这些平板密封并且保持在就温度、光照以及相对湿度而言的环境实验室条件下。阳性对照组由暴露于非常具活性且广谱的野生型芽孢杆菌属菌株的幼虫组成。阴性对照组由暴露于仅用缓冲溶液处理的昆虫饲料的幼虫和未处理的昆虫饲料(即只有饲料)上的幼虫组成。约120小时之后评估死亡率并且相对于对照评分。

结果示于表2中，其中“-”意指与对照组相比无活性，“+/-”意指与对照相比0-10％的活性(此类别还包括具有强烈幼虫生长抑制的0％死亡率)，“+”意指与对照相比10％-25％的活性，“++”意指与对照相比25％-75％的活性，并且“+++”意指与对照相比75％-100％的活性。括号指示如下观察到的幼虫生长迟缓(生长抑制)：“(l)”意指轻生长迟缓；“(m)”意指中生长迟缓并且“(s)”意指强生长迟缓。表2中的名称“nt”意指没有针对该具体有害生物测试所指示的蛋白质。

表2.Cry蛋白的生物测定结果。

令人惊讶地，与Cry20家族的成员具有最接近的序列匹配的BT-0049具有针对某些鳞翅目有害生物特别是亚洲玉米蛀虫(Asiancorn borer)(亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis))的活性。据信这是具有针对鳞翅目有害生物的活性的Cry20相关蛋白的首次报道。Cry20蛋白在本领域中因针对双翅目昆虫(例如蚊)的活性而已知(参见例如，易卜拉欣(Ibrahim)等人同上，柯纳卡(Konecka)等人2014.生物学快报(Biol.Lett.)5:83-92；以及伽马(Gama)&中越(Nakagoshi)，2014.现代微生物学与应用科学国际杂志(Int.J.Curr.Microbiol.App.Sci.)3:179-197)。被指定为BT-0211(SEQ ID NO:26)的另一种如上所述分离的Bt Cry蛋白也是Cry20家族的一员，当在如上所述的相同条件下测试时它对亚洲玉米蛀虫(Asian cornborer)(亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis))没有活性。这是BT-0049Cry蛋白的独特活性谱的进一步指示。表3示出了BT-0049、BT-0211与已知Cry20蛋白之间的百分比一致性矩阵。已知Cry20蛋白的名称后的括号中的数字是Genbank登录号。基于示于矩阵中的一致性以及根据克里克莫尔(Crickmore)等人(1998.微生物学与分子生物学评论(Microbiol.Molec.Biol.Rev.)62:807-813)的命名新蛋白的方法，BT-0211可能是Cry20Bb2并且BT-0049可能是将被指定为Cry20Ca1的新Cry20蛋白。

表3.Cry20家族成员的百分比一致性矩阵。

具鳞翅目活性的BT-0049和不具鳞翅目活性的BT-0211蛋白之间的序列比对(图1)指示在BT-0049蛋白中存在两个明显的氨基酸差异区域，它们可能完全或部分地是造成这两种蛋白质之间的活性谱差异的原因。第一区域是从BT-0049(SEQ ID NO:16)的氨基酸674至氨基酸709，由序列SVYHPDANDAYDEGDDNTYNQNYNSMYNQNADNTYD(SEQ ID NO:27)组成。第二区域是从SEQ ID NO:16的氨基酸730至氨基酸746，由序列GYEQNNYDSDDSDYNNT(SEQID NO:28)组成。

实例5.针对植物表达的基因定向

在植物中表达之前，在自动基因合成平台(例如，金斯瑞公司(Genscript、Inc.)，皮斯卡塔韦，新泽西州)上合成编码Cry蛋白BT-0049(SEQ ID NO:16)、BT-0063(SEQ ID NO:17)、BT-0064(SEQ IDNO:18)、BT-0086(SEQ ID NO:19)或BT-0498(SEQ IDNO:20)或者突变的Cry蛋白mBT-0049(SEQ ID NO:21)、mBT-0063(SEQ ID NO:22)、mBT-0064(SEQ ID NO:23)、mBT-0086(SEQID NO:24)或mBT-0498(SEQ ID NO:25)的多核苷酸。用于这个实例，制备包含可操作地连接至Cry蛋白编码序列(该编码序列可操作地连接至终止子)的植物可表达型启动子的第一表达盒，并且制备包含可操作地连接至选择性标记(该选择性标记可操作地连接至终止子)的植物可表达型启动子的第二表达盒。选择性标记的表达允许在选择培养基上鉴别转基因植物。将两个表达盒克隆进适于农杆菌介导的水稻或玉蜀黍转化的载体中。

实例6.Cry蛋白在玉蜀黍植物中的表达与活性

未成熟的玉蜀黍胚的转化基本上如在内格罗托(Negrotto)等人，2000，植物细胞报告(Plant Cell Reports)19:798-803中描述的来进行。简言之，使包含描述于实例5中的表达载体的农杆菌菌株LBA4404(pSB1)在28℃下在YEP(酵母提取物(5g/L)、蛋白胨(10g/L)、NaCl(5g/L)、15g/l琼脂，pH 6.8)固体培养基上生长2-4天。将大约0.8X 10⁹个农杆菌细胞悬浮于补充有100μM As的LS-inf培养基中。在这个培养基中对细菌预诱导大约30-60分钟。

将来自自交玉蜀黍系的未成熟胚从8-12天大的穗中切除到液体LS-inf+100μM As中。用新鲜的感染培养基漂洗这些胚。然后添加农杆菌溶液，并且将这些胚涡旋30秒并且允许其与细菌一起沉降5分钟。然后将这些胚盾片向上地转移到LSA培养基中，并且在暗处培养两到三天。随后，将每皮氏板(petri plate)大约20与25个之间的胚转移至补充有头孢噻肟(250mg/l)和硝酸银(1.6mg/l)的LSDc培养基中，并且在大约28℃下在黑暗中培养10天。

将产生胚性愈伤组织的未成熟胚转移至LSD1M0.5S培养基中。在这种培养基上对培养物进行持续大约6周的选择，在约3周时进行传代培养步骤。将存活的愈伤组织转移至添加有甘露糖的Reg1培养基中。在光照中(16小时光照/8小时黑暗方案)培养之后，然后将绿色组织转移至没有生长调节剂的Reg2培养基中并且孵育约1-2周。将这些小植株转移至含有Reg3培养基的Magenta GA-7 boxes(MagentaCorp,Chicago III.)中并使其在光照中生长。约2-3周之后，通过PCR测试植物的选择性标记基因和Bt cry基因的存在。将来自PCR测定的阳性植物转移至温室用于进一步评估。

在叶切除生物测定中，针对拷贝数(通过Taqman分析确定)、蛋白质表达水平(通过ELISA确定)和对抗感兴趣的昆虫种类的功效对转基因植物进行评估。确切地说，从单拷贝事件(V3-V4阶段)中切取植物组织(叶或花丝)并且用目标有害生物的新生幼虫侵染，然后在室温下孵育5天。针对一种或多种鳞翅目有害生物如亚洲玉米蛀虫(Asian corn borer)(亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis))测试来自表达BT-0049、BT-0063、BT-0064、BT-0086、BT-0498、mBT-0049、mBT-0063、mBT-0064、mBT-0086或mBT-0498的转基因植物的叶圆片。转基因植物组织生物测定的结果将证实当在转基因植物中表达时本发明的Cry蛋白对于目标鳞翅目有害生物中的一种或多种是有毒的。

本发明的一些实施方案如下：

1.一种核酸分子，其包含编码对鳞翅目有害生物有毒的Cry蛋白的核苷酸序列，其中该核苷酸序列(a)与SEQ ID NO:1-5中任一个或其毒素编码片段具有至少80％到至少99％序列一致性；或(b)编码包含如下氨基酸序列的Cry蛋白，该氨基酸序列与SEQ ID NO:16-25中任一个或其毒素片段具有至少80％到至少99％序列一致性；或(c)是(a)或(b)的合成序列，该合成序列具有针对在转基因生物中的表达进行了优化的密码子；或(d)在严格条件下与SEQ ID NO:1-5中任一个或其毒素编码片段杂交，或与编码包含SEQ ID NO:16-25中任一个或其毒素片段的氨基酸序列的Cry蛋白的第二核苷酸序列杂交；或(e)编码包含如下氨基酸序列的Cry蛋白，该氨基酸序列由于1-50、1-20或1-10个氨基酸残基的添加、缺失和/或置换(例如，保守置换)而不同于SEQ ID NO:16-25中任一个或其毒素片段的氨基酸序列；或(f)是(a)或(b)或(d)或(e)中所定义的核苷酸序列，其源自苏云金杆菌菌株。

2.如实施方案1所述的核酸分子，其中该核苷酸序列包含SEQID NO:1-5中任一个或其毒素编码片段。

3.如实施方案1所述的核酸分子，其中该Cry蛋白包含SEQ IDNO:16-25中任一个或其毒素片段的氨基酸序列。

4.如实施方案1所述的核酸分子，其中该合成核苷酸序列包含SEQ ID NO:6-15中任一个或其毒素编码片段。

5.一种嵌合基因，其包含可操作地连接至如实施方案1-3中任一项所述的核酸分子的异源启动子。

6.如实施方案5所述的嵌合基因，其中该异源启动子是植物可表达型启动子。

7.如实施方案6所述的嵌合基因，其中该植物可表达型启动子选自：泛素、夜香树属黄病毒、玉米TrpA、OsMADS 6、玉蜀黍H3组蛋白、噬菌体T3基因95'UTR、玉米蔗糖合成酶1、玉米醇脱氢酶1、玉米捕光复合物、玉米热休克蛋白、玉蜀黍mtl、豌豆小亚基RuBP羧化酶、水稻肌动蛋白、水稻亲环蛋白、Ti质粒甘露碱合酶、Ti质粒胭脂碱合酶、矮牵牛查尔酮异构酶、豆类富甘氨酸蛋白1、马铃薯糖蛋白、凝集素、CaMV 35S和S-E9小亚基RuBP羧化酶启动子。

8.如实施方案5所述的嵌合基因，其中该鳞翅目有害生物选自：亚洲玉米蛀虫(亚洲玉米螟)、黑色地老虎(小地老虎)、棉螟蛉(棉铃虫)、黄色桃螟虫(桃蛀螟)、东方黏虫(东方粘虫)、欧洲玉米蛀虫(欧洲玉米螟)、秋黏虫(草地贪夜蛾)、玉米穗蛾(玉米穗虫)、甘蔗螟(小蔗螟)、绒毛豆毛虫(黎豆夜蛾)、大豆夜蛾(大豆尺蠖)、西南玉米蛀虫(西南玉米螟)、西部豆切根虫(西部豆夜蛾)、烟夜蛾(烟芽夜蛾)、条纹蛀茎虫(二化螟)、粉蛀茎虫(非洲大螟)和水稻卷叶螟(稻纵卷叶螟)。

9.如实施方案5所述的嵌合基因，其中该转基因生物是细菌。

10.一种对鳞翅目有害生物有毒的分离的Cry蛋白，其中该Cry蛋白包含：(a)氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:16-25中任一个或其毒素片段的氨基酸序列具有至少80％到至少99％序列一致性；或(b)由核苷酸序列编码的氨基酸序列，该核苷酸序列与SEQ IDNO:6-15中任一个或其毒素编码片段的核苷酸序列具有至少80％到至少99％序列一致性；或(c)氨基酸序列，该氨基酸序列由于1-50、1-20或1-10个氨基酸残基的添加、缺失和/或置换(例如，保守置换)而不同于(a)或(b)的氨基酸序列；或(d)(a)或(b)或(c)的氨基酸序列，其源自苏云金杆菌菌株。

11.如实施方案10所述的Cry蛋白，其中该氨基酸序列包含SEQID NO:16-25中任一个或其毒素片段。

12.如实施方案10所述的Cry蛋白，其中该氨基酸序列由核苷酸序列编码，该核苷酸序列包含SEQ ID NO:6-15中任一个或其毒素编码片段。

13.如实施方案10-12中任一项所述的Cry蛋白，其中该鳞翅目有害生物选自：亚洲玉米蛀虫(亚洲玉米螟)、黑色地老虎(小地老虎)、棉螟蛉(棉铃虫)、黄色桃螟虫(桃蛀螟)、东方黏虫(东方粘虫)、欧洲玉米蛀虫(欧洲玉米螟)、秋黏虫(草地贪夜蛾)、玉米穗蛾(玉米穗虫)、甘蔗螟(小蔗螟)、绒毛豆毛虫(黎豆夜蛾)、大豆夜蛾(大豆尺蠖)、西南玉米蛀虫(西南玉米螟)、西部豆切根虫(西部豆夜蛾)、烟夜蛾(烟芽夜蛾)、条纹蛀茎虫(二化螟)、粉蛀茎虫(非洲大螟)和水稻卷叶螟(稻纵卷叶螟)。

14.一种分离的苏云金杆菌菌株，其产生如实施方案10-13中任一项所述的Cry蛋白。

15.一种杀昆虫组合物，其包含如实施方案10-13中任一项所述的Cry蛋白和农业上可接受的载体。

16.如实施方案15所述的组合物，其中该农业上可接受的载体选自：粉剂、尘剂、丸剂、颗粒剂、喷雾剂、乳剂、胶体和溶液。

17.如实施方案15所述的组合物，其中该组合物通过脱水、冷冻干燥、均化、萃取、过滤、离心、沉降或浓缩苏云金杆菌菌株的培养物来制备。

18.如实施方案17所述的组合物，其中该苏云金杆菌菌株是如实施方案14所述的苏云金杆菌菌株。

19.如实施方案15所述的组合物，其中该组合物包含产生该Cry蛋白的转基因细菌细胞。

20.如实施方案15所述的组合物，其包含按重量计从约1％至约99％的Cry蛋白。

21.一种重组载体，其包含如实施方案1-4中任一项所述的核酸分子或如实施方案5-9中任一项所述的嵌合基因。

22.一种转基因细菌细胞或植物细胞，其包含如实施方案21所述的重组载体。

23.如实施方案22所述的转基因细胞，其是转基因细菌细胞，其中该细菌细胞属于芽孢杆菌属、梭菌属、致病杆菌属、发光杆菌属、巴斯德氏芽菌属、埃希氏菌属、假单胞菌属、欧文氏菌属、沙雷氏菌属、克雷伯杆菌属、沙门氏菌属、巴氏杆菌属、黄单胞菌属、链霉菌属、根瘤菌属、红假单胞菌属、嗜甲基菌属、农杆菌属、醋杆菌属、乳杆菌属、节杆菌属、固氮菌属、明串珠菌属或产碱杆菌属。

24.如实施方案23所述的转基因细胞，其中该芽孢杆菌属细胞是苏云金杆菌细胞。

25.如实施方案22所述的转基因细胞，其是转基因植物细胞，其中该植物细胞是双子叶植物细胞或单子叶植物细胞。

26.如实施方案25所述的转基因细胞，其中该植物细胞是双子叶植物细胞，并且其中该双子叶植物细胞选自：大豆细胞、向日葵细胞、番茄细胞、芸苔属作物细胞、棉花细胞、糖用甜菜细胞和烟草细胞。

27.如实施方案25所述的转基因细胞，其中该植物细胞是单子叶植物细胞，并且其中该单子叶植物细胞选自：大麦细胞、玉蜀黍细胞、燕麦细胞、水稻细胞、高粱细胞、甘蔗细胞和小麦细胞。

28.一种衍生自如实施方案25-27中任一项所述的转基因细胞的收获产物，其中该收获产物包含该蛋白质。

29.一种衍生自如实施方案28所述的收获产物的加工产物，其中该加工产物选自：细粉、粗粉、油和淀粉，或者从其衍生的产物。

30.一种收获产物，其衍生自包含如实施方案25-27中任一项所述的转基因细胞的转基因植物，其中该收获产物包含该蛋白质。

31.一种衍生自如实施方案30所述的收获产物的加工产物，其中该加工产物选自：细粉、粗粉、油和淀粉，或者从其衍生的产物。

32.一种产生对鳞翅目有害生物有毒的Cry蛋白的方法，该方法包括：在如实施方案22-27中任一项所述的转基因细胞产生该Cry蛋白的条件下培养该转基因细胞。

33.如实施方案32所述的方法，其中该鳞翅目有害生物选自：亚洲玉米蛀虫(亚洲玉米螟)、黑色地老虎(小地老虎)、棉螟蛉(棉铃虫)、黄色桃螟虫(桃蛀螟)、东方黏虫(东方粘虫)、欧洲玉米蛀虫(欧洲玉米螟)、秋黏虫(草地贪夜蛾)、玉米穗蛾(玉米穗虫)、甘蔗螟(小蔗螟)、绒毛豆毛虫(黎豆夜蛾)、大豆夜蛾(大豆尺蠖)、西南玉米蛀虫(西南玉米螟)、西部豆切根虫(西部豆夜蛾)、烟夜蛾(烟芽夜蛾)、条纹蛀茎虫(二化螟)、粉蛀茎虫(非洲大螟)和水稻卷叶螟(稻纵卷叶螟)，或其任何组合。

34.如实施方案32所述的方法，其中该核苷酸序列针对在植物中表达进行了密码子优化。

35.如实施方案32所述的方法，其中该核酸分子或该嵌合基因包含SEQ ID NO:1-15中任一个或其毒素编码片段。

36.如实施方案32所述的方法，其中该Cry蛋白包含SEQ ID NO:16-25中任一个或其毒素片段的氨基酸序列。

37.一种产生抗昆虫的转基因植物的方法，该方法包括：向植物中引入如实施方案6或7所述的嵌合基因，其中该Cry蛋白在该植物中表达，由此产生抗昆虫的转基因植物。

38.如实施方案37所述的方法，其中通过转化该植物来实现该引入步骤。

39.如实施方案37所述的方法，其中通过使包含该嵌合基因的第一植物与不同的第二植物杂交来实现该引入步骤。

40.如实施方案37-39中任一项所述的方法，其中该植物是水稻植物或玉蜀黍植物。

41.一种控制鳞翅目有害生物的方法，该方法包括向该鳞翅目有害生物或其环境递送组合物，该组合物包含有效量的如实施方案10-13中任一项所述的Cry蛋白或如实施方案15-20中任一项所述的杀昆虫组合物。

42.一种控制亚洲玉米蛀虫(亚洲玉米螟)的方法，该方法包括向该亚洲玉米蛀虫或其环境递送杀昆虫蛋白，该杀昆虫蛋白与SEQ IDNO:16或其毒素片段具有至少80％一致性。

43.如实施方案42所述的方法，其中该杀昆虫蛋白包含由SVYHPDANDAYDEGDDNTYNQNYNSMYNQNADNTYD(SEQ IDNO:27)或GYEQNNYDSDDSDYNNT(SEQ ID NO:28)组成的连续氨基酸序列。

44.一种核酸构建体，其包含实施方案1-5中任一项之中所定义的核苷酸序列。

45.一种融合蛋白，其包含实施方案10-13中任一项之中所定义的氨基酸序列。

46.一种植物(例如，种子)或者其部分或细胞，其包含如实施方案1-4中任一项所述的核酸分子，或如实施方案5-9中任一项所述的嵌合基因，或如实施方案10-13中任一项所述的Cry蛋白，或如实施方案44所述的核酸构建体，或如实施方案45所述的融合蛋白。

47.如实施方案46所述的植物或者其部分或细胞，其中该植物是双子叶植物或单子叶植物，并且该双子叶植物可以选自大豆、向日葵、番茄、芸苔属作物、棉花、糖用甜菜和烟草，和该单子叶植物可以选自大麦、玉蜀黍、燕麦、水稻、高粱、甘蔗和小麦。

48.如实施方案1-4中任一项所述的核酸分子用于产生抗鳞翅目的植物或植物细胞/部分或者其子代的用途。

49.如实施方案5-9中任一项所述的嵌合基因用于产生抗鳞翅目的植物或植物细胞/部分或者其子代的用途。

50.如实施方案21所述的重组载体用于产生抗鳞翅目的植物或植物细胞/部分或者其子代的用途。

51.如实施方案25-27中任一项所述的转基因细胞用于产生抗鳞翅目的植物或植物细胞/部分或者其子代的用途。

52.通过如实施方案37-40中任一项所述的方法产生的植物或者如实施方案46或47所述的植物或者其部分或细胞用于产生抗鳞翅目的植物或植物细胞/部分或者其子代的用途。

53.一种产生抗鳞翅目的植物的方法，该方法包括：a)使一种植物与通过如实施方案37-40中任一项所述的方法产生的植物或者实施方案46或47中所定义的植物杂交；b)获得子代；和c)从所述子代中选择出抗鳞翅目的植物。

54.一种产生抗鳞翅目的植物的方法，该方法包括：a)使通过如实施方案37-40中任一项所述的方法产生的植物或者实施方案46或47中所定义的植物自交；b)获得子代；和c)从所述子代中选择出抗鳞翅目的植物。

55.一种产生种子的方法，该方法包括：a)使通过如实施方案37-40、53和54中任一项所述的方法产生的植物或者实施方案46或47中所定义的植物生长；和b)收集所述植物的种子。

56.一种使用通过如实施方案37-40、53和54中任一项所述的方法产生的植物或者实施方案46或47中所定义的植物来产生植物的方法。

57.一种生长出植物的方法，该方法包括：a)种植通过如实施方案37-40、53和54中任一项所述的方法产生的植物的种子或者实施方案46或47中所定义的种子；和b)使通过a)获得的植物生长。

58.一种产生植物的方法，该方法包括使通过如实施方案37-40、53和54中任一项所述的方法产生的植物或者实施方案46或47中所定义的植物生长。

59.一种产生收获产物的方法，该方法包括使通过如实施方案37-40、53和54中任一项所述的方法产生的植物或者实施方案46或47中所定义的植物生长，并且收获该产物。

60.一种通过如实施方案37-40和53-58中任一项所述的方法获得的植物。

Claims (10)

1.一种核酸分子，其包含编码对鳞翅目有害生物有毒的Cry蛋白的核苷酸序列，其中该核苷酸序列(a)与SEQ ID NO:1-5中任一个或其毒素编码片段具有至少80％到至少99％序列一致性；或(b)编码包含如下氨基酸序列的Cry蛋白，该氨基酸序列与SEQ ID NO:16-25中任一个或其毒素片段具有至少80％到至少99％序列一致性；或(c)是(a)或(b)的合成序列，该合成序列具有针对在转基因生物中的表达进行了优化的密码子；或(d)在严格条件下与SEQ ID NO:1-5中任一个或其毒素编码片段杂交，或与编码包含SEQ ID NO:16-25中任一个或其毒素片段的氨基酸序列的Cry蛋白的第二核苷酸序列杂交；或(e)编码包含如下氨基酸序列的Cry蛋白，该氨基酸序列由于1-50、1-20或1-10个氨基酸残基的添加、缺失和/或置换(例如，保守置换)而不同于SEQ ID NO:16-25中任一个或其毒素片段的氨基酸序列；或(f)是(a)或(b)或(d)或(e)中所定义的核苷酸序列，其源自苏云金杆菌菌株。

2.如权利要求1所述的核酸分子，其中该核苷酸序列包含SEQID NO:1-5中任一个或其毒素编码片段。

3.如权利要求1所述的核酸分子，其中该Cry蛋白包含SEQ IDNO:16-25中任一个或其毒素片段的氨基酸序列。

4.如权利要求1所述的核酸分子，其中该合成核苷酸序列包含SEQ ID NO:6-15中任一个或其毒素编码片段。

5.一种嵌合基因，其包含可操作地连接至如权利要求1-3中任一项所述的核酸分子的异源启动子。

6.如权利要求5所述的嵌合基因，其中该异源启动子是植物可表达型启动子。

7.如权利要求6所述的嵌合基因，其中该植物可表达型启动子选自：泛素、夜香树属黄病毒、玉米TrpA、OsMADS 6、玉蜀黍H3组蛋白、噬菌体T3基因95'UTR、玉米蔗糖合成酶1、玉米醇脱氢酶1、玉米捕光复合物、玉米热休克蛋白、玉蜀黍mtl、豌豆小亚基RuBP羧化酶、水稻肌动蛋白、水稻亲环蛋白、Ti质粒甘露碱合酶、Ti质粒胭脂碱合酶、矮牵牛查尔酮异构酶、豆类富甘氨酸蛋白1、马铃薯糖蛋白、凝集素、CaMV 35S和S-E9小亚基RuBP羧化酶启动子。

8.如权利要求5所述的嵌合基因，其中该鳞翅目有害生物选自：亚洲玉米蛀虫(亚洲玉米螟)、黑色地老虎(小地老虎)、棉螟蛉(棉铃虫)、黄色桃螟虫(桃蛀螟)、东方黏虫(东方粘虫)、欧洲玉米蛀虫(欧洲玉米螟)、秋黏虫(草地贪夜蛾)、玉米穗蛾(玉米穗虫)、甘蔗螟(小蔗螟)、绒毛豆毛虫(黎豆夜蛾)、大豆夜蛾(大豆尺蠖)、西南玉米蛀虫(西南玉米螟)、西部豆切根虫(西部豆夜蛾)、烟夜蛾(烟芽夜蛾)、条纹蛀茎虫(二化螟)、粉蛀茎虫(非洲大螟)和水稻卷叶螟(稻纵卷叶螟)。

9.如权利要求5所述的嵌合基因，其中该转基因生物是细菌。

10.一种对鳞翅目有害生物有毒的分离的Cry蛋白，其中该Cry蛋白包含：(a)氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:16-25中任一个或其毒素片段的氨基酸序列具有至少80％到至少99％序列一致性；或(b)由核苷酸序列编码的氨基酸序列，该核苷酸序列与SEQ IDNO:6-15中任一个或其毒素编码片段的核苷酸序列具有至少80％到至少99％序列一致性；或(c)氨基酸序列，该氨基酸序列由于1-50、1-20或1-10个氨基酸残基的添加、缺失和/或置换(例如，保守置换)而不同于(a)或(b)的氨基酸序列；或(d)(a)或(b)或(c)的氨基酸序列，其源自苏云金杆菌菌株。