CN103204912A - 对鳞翅目害虫高毒力杀虫基因cry2Ah-like及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及“对鳞翅目害虫高毒力杀虫基因cry2Ah-like及应用”，属于生物技术领域。对鳞翅目害虫高毒力杀虫蛋白Cry2Ah-like，Cry2Ah-likesp，Cry2Ah-likevp，其蛋白序列分别如SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3所示。本发明提供的新的基因对棉铃虫、玉米螟具有高毒力，丰富了杀虫基因资源，同时将基应用于转化微生物，使之表现出对相关害虫的毒性，并克服、延缓害虫对工程菌的抗药性产生。

Description

对鳞翅目害虫高毒力杀虫基因cry2Ah-like及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及苏云金芽孢杆菌对鳞翅目害虫高毒力的新的杀虫基因cry2Ah-like，cry2Ah-likesp，cry2Ah-likevp及其应用。

背景技术

虫害是造成农作物减产的重要原因之一,减少虫害的损失是增加粮食与饲料作物产量的重要途径。据统计全球粮食与饲料作物总产量每年因虫害造成的损失达14%,直接给农业生产造成的经济损失高达数千亿美元。我国每年因虫害造成的损失水稻减产10%、小麦减产20%、棉花减产30%以上。采用喷施化学农药和生物杀虫剂等防治手段固然可以减轻害虫对农作物的为害,但化学农药造成环境污染,生物杀虫剂成本较高。长期以来,大量喷施化学杀虫剂,不仅会增强害虫的抗药性,使益虫及其它生态区系遭受破坏,而且严重污染环境,提高生产成本,破坏生态平衡。因此,减少杀虫剂使用量,发展现代植物保护技术,已成为可持续发展农业中必须正视的课题之一。

苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt）是一种分布广泛的革兰氏阳性细菌，是一种对害虫毒力强且对天敌无毒性的昆虫病原微生物，对高等动物和人无毒性。它是目前研究最为深入、使用最为广泛的微生物杀虫剂，对16个目3000多种害虫有活性。Bt在芽孢形成期可形成杀虫晶体蛋白(Insecticidal CrystalProteins，ICPs)，也称δ-内毒素(delta-endotoxin)[Bravo.A.,GillS.S.,Soberón M.Bacillus thuringiensisMechanisms and Use.Comprehensive MolecularInsectScience Elsevier,2005,175～206.]，它的形状、结构和大小均与其毒力有着密切关系。苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白因其杀虫效果好、对人畜无害[De Maagd R.A.,Bravo A.,CrickmoreN.How Bacillus thuringiensis has evolved specific toxins to col onize the insect world.Trends Genet,2001,17:193～199.]，不污染环境，因而Bt在害虫的生物防治中得到了最广泛的应用。

1996年全世界第一例转基因抗虫植物在美国获准应用，它使用的基因来自Bt cry1Ac。在接下来的几年里，转cry1Ab基因的抗虫玉米，转cry3Aa基因的抗虫土豆等相距问世。在中国，自1998年开始正式推广含有cry1Ac/cry1A基因的抗虫棉以来，已经被普遍种植。在转基因作物商业化的第一个12年(1996-2007)中，由于能得到持续稳定的收益，农民种植转基因作物量逐年增加。2009年有25个国家的1400万小农户和大农场主种植了1.34亿公顷（3.3亿英亩）的转基因作物，比2008年增长了7%，即900万公顷（2200万英亩），达到历史最高点；相应的“性状或实际面积”增长了8%，即相比2008年的1.66亿公顷，增长了1400万公顷，达到2009年的1.8亿公顷。1996年至2009年间转基因作物种植面积空前地增长了80倍，使转基因成为农业近代史上利用最快的作物技术。

由于目前商品化的转基因抗虫作物的抗虫基因种类比较单一，如此大面积推广种植存在害虫避难所减少与害虫抗药性上升的风险。因此需要不断分离高毒力的或者新的基因组合来避免害虫抗药性上升的风险。

因此，筛选分离克隆新的、高毒力的Bt杀虫基因，可以丰富杀虫基因资源，为转基因作物与工程菌株提供新的基因来源，提高Bt转基因产品的抗虫效果，并且可以降低害虫对Bt毒蛋白的抗性风险，避免新的生态灾难降临，具有重要的经济、社会和生态效益。

发明内容

本发明提供一种新的对玉米螟、棉铃虫等鳞翅目害虫具有高毒力的苏云金芽孢杆菌晶体杀虫蛋白基因序列，以应用于转化微生物，使之表现出对相关害虫的毒性，并克服、延缓害虫对工程菌的抗药性产生。

对鳞翅目害虫高毒力杀虫蛋白Cry2Ah-like，Cry2Ah-likesp，Cry2Ah-likevp，其蛋白序列分别如SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3所示。

编码上述蛋白的杀虫基因，名称为cry2Ah-like，cry2Ah-likesp，cry2Ah-likevp，其基因序列分别如SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6所示。

含有上述基因的载体。

所述载体分别为pET2Ah-like、pET2Ah-likesp和pET2Ah-likevp，其骨架载体为pET。

所述基因在杀灭棉铃虫、玉米螟中的应用。

所述应用为将基因表达的蛋白制成药剂杀灭棉铃虫、玉米螟。

所述应用为将基因转化微生物或植物，使植物受体表达对棉铃虫、玉米螟的抗性。

本发明从SC6H8菌株（新型cry2基因克隆、表达及活性分析，张静涛，2009,硕士论文）中克隆得到了一个新的基因即cry2Ah-like，该基因序列如SEQ ID NO4，蛋白序列如SEQ IDNO1，该基因对棉铃虫、玉米螟具有高毒力。

利用重复PCR得到了cry2Ah-like的两个突变体，该两个突变基因的序列分别为SEQ IDNO5，SEQ ID NO6；蛋白序列如SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，该两个突变体基因对棉铃虫的毒力较cry2Ah-like高。

本发明提供的新的基因对棉铃虫、玉米螟具有高毒力，丰富了杀虫基因资源，同时将基应用于转化微生物，使之表现出对相关害虫的毒性，并克服、延缓害虫对工程菌的抗药性产生。

附图说明

图1cry2Ah-like基因在大肠杆菌BL21菌株中表达，

图2cry2Ah-likesp和cry2Ah-likevp基因在大肠杆菌BL21菌株中表达，

图3杀虫活性趋势图，

图4pET2类基因的载体结构图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。

Bt质粒提取

RNaseA(10mg/ml)：称取0.1g RNaseA溶于10ml10mM Tris·HCl(pH7.5)，15mM NaCl中，100℃煮沸15min，冰浴冷却，-20℃保存备用。

SC6H8菌株，申请人的实验室有保存，可以对外公开发放。

1.过夜培养5ml SC6H8菌液。

2.离心收集菌体，用含有30mg/ml溶菌酶的25%的蔗糖溶液悬浮细胞，总体积为200μl，37℃孵育15mins。

3.加入400μl碱裂解液（3%SDS，0.2N NaOH），立即缓慢混匀，室温孵育5mins。

4.加入300μl冰冷的3M醋酸钠（pH4.8），立即混匀，12000g离心10mins。

5.取上清，加入等体积的异丙醇，充分混匀，-20℃放置30mins，12000g离心5mins。

6.弃上清，70%乙醇洗涤沉淀，晾干后加入320ul纯水溶解沉淀，加入200μl含有0.5mg/ml EB的7.5M醋酸铵溶液。混匀后加入等体积的酚氯仿，混匀。12000g离心5mins。

7.取上清，加入2倍体积冰冷的无水乙醇，充分混匀，-20℃放置30mins，12000g离心5mins。

8.去上清，70%乙醇洗涤沉淀，晾干，加入40μl TE溶解沉淀，加入1μl RNase A除RNA。

0.7%琼脂糖凝胶电泳检测。

DNA回收（步骤参见Axygen公司试剂盒）

1.在长波紫外灯下切下含所需目的DNA片段的凝胶，置于1.5mL离心管中；

2.加入3倍溶胶体积的ED-A溶胶缓冲液，置于70°c水浴锅中；

3.待溶解后加入0.5个ED-A溶胶缓冲液的ED-B；

4.混匀后转入回收柱，离心12000r/min0.5min；

5.弃去残液，加入洗脱缓冲液W₁500μL，离in心12000r/min0.5min；

6.弃去残液，加入洗脱缓冲液W₂700μL，重复一次；

7.将15～30μL TE或超纯水适量加入回收柱中，静置5min；

8.离心12000r/min2min，备用。

E.coli质粒提取

SI：50mM葡萄糖，25mM Tris·Cl（pH8.0），10mM EDTA（pH8.0）；SII：0.2M NaOH，1%SDS（用时以2M NaOH和10%SDS稀释）；SIII：5M KAc，用冰乙酸调至pH4.8。

1)离心收集菌体，用200μL SI悬浮，冰浴10min；

2)加入SII400μL，翻转混匀，冰浴5min；

3)加入SIII300μL，迅速混匀，冰浴5min；

4)12000r/min离心8min，取上清用等体积的异丙醇沉淀；

5)12000r/min离心8min，弃上清，用70%的乙醇洗沉淀，干燥，溶解；

6)用RNase A2μL除RNA，用苯酚、氯仿/异戊醇分别抽提溶液；

7)加入1/10V的3M NaAc（PH5.2），加入2V的无水乙醇沉淀，-20°c10min；

8)12000r/min离心8min，70%乙醇洗沉淀，干燥，适量的水溶解。

DNA片段常规连接体系

用超纯水补足体积到10μL，充分混匀，16℃连接4h或4℃连接过夜。

E.coli化学感受态细胞制备：

LB培养基的配方如下：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L

1.挑取单菌落于5ml LB震荡培养过夜；

2.按1%接种量接种于50ml LB液体培养基中，37℃，230rpm培养2-2.5hr，（OD₆₀₀=0.5-0.6）；

3.4℃，4000rpm离心10min；

4.弃上清，加入预冷的0.1M CaCl₂50ml悬浮细胞，置于冰上30min以上；

5.4℃，4000rpm离心10min，回收细胞；

6.用2-4ml冰预冷的0.1M CaCl₂重悬细胞，分装成200μl/0.5mL离心管中，于4℃保存（可保存一周）。

E.coli的热激转化

1.5μL连接产物与200μl感受态细胞充分混匀，冰浴30min。

2.42℃热激1.5min，冰浴3min。

3.加入800μl LB培养基37℃培养45min。

4.取200μl涂板，加入相应的抗生素，及IPTG，X-gal，37℃培养过夜。

SC6H8菌株中cry2Ah-like全长基因的扩增，克隆及序列测定

参考GenBank公布的cry2基因序列设计如下引物，并在5’端引物加进EcoR I切点，3’端引物加进Hind III切点，序列如下：

cry2likeF:5‘-CCGGAATTCGATGAATAGTGTATTGAATAGCGG-3

EcoR I

cry2likeR:5‘-CCCAAGCTTATAAAGTGGTGAAAGATTAGTTGG-3

Hind III

以SC6H8质粒DNA为模板，利用pfu高保真DNA聚合酶进行PCR扩增。扩增条件与前面相同，回收PCR产物，用限制酶EcoR I和Hind III处理pET21b载体和回收产物，分别回收酶切产物，连接载体和目的片段并转化大肠杆菌JM110菌株，获得pET2Ah-like质粒。

利用重叠PCR获得cry2Ah-like突变体

利用重叠PCR获得定点突变的两个cry2Ah-like基因cry2Ah-likesp，cry2Ah-likevp

重叠片段的获得

cry2Ah-like全长引物cry2likeF/cry2likeR

重叠引物序列如下：

cd1：5‘-TTAAACGGAGAAGCGCCTAT-3

cd2：5‘-AAACGGCACAGCGCCTA-3

cd3：5‘-ATAGGCGCTTCTCCGTTTAAT-3

cd4：5‘-ATAGGCGCTGTGCCGTTTA-3

以pET2Ah-like质粒DNA为模板，利用pfu高保真DNA聚合酶进行PCR扩增。首先94℃预变性5min；然后94℃变性1min，54℃退火1min，72℃延伸2min，循环30次；最后72℃延伸10min。以cry2likeF/cd1，cry2likeR/cd3扩增后回收，再利用引物cry2likeF/cry2likeR扩增获得重叠的cry2Ahlikesp片段；以cry2likeF/cd2，cry2likeR/cd4扩增后回收，再利用引物cry2likeF/cry2likeR扩增获得重叠的cry2Ahlikevp片段；

分别回收cry2Ah-likesp和cry2Ah-likevp全长序列PCR产物，用限制酶EcoR I和Hind III处理回收产物和pET21b载体，分别回收酶切产物，连接载体和目的片段并转化大肠杆菌JM110菌株，挑取单菌落进行PCR扩增，扩增产物进行PCR-RFLP鉴定，筛选出含pET2Ahsp-like和pET2Ahvp-like阳性克隆。

新基因在大肠杆菌中表达

cry2Ah-like基因表达载体构建

将测序正确，含有pET2Ah-like质粒的JM110阳性克隆接种至LB培养基中，37℃，230rpm培养过夜，提取pET2Ah质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS菌株。挑取单菌落进行PCR扩增，扩增产物进行PCR-RFLP鉴定，筛选出含pET2Ah-like质粒的BL21(DE3)pLysS阳性克隆。基因测序和分析与以上相同。

cry2Ah-likesp和cry2Ah-likevp基因表达载体构建

将测序正确，含有pET2Ah-likesp和pET2Ah-likevp质粒的JM110阳性克隆接种至LB培养基中，37℃，230rpm培养过夜，提取pET2Ah-likesp和pET2Ah-likevp质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS菌株。挑取单菌落进行PCR扩增，扩增产物进行PCR-RFLP鉴定，筛选出含pET2Ah-likesp和pET2Ah-likevp质粒的BL21(DE3)pLysS阳性克隆。基因测序和分析与以上相同。

基因诱导表达

诱导表达过程如下：

1.活化菌种（37℃、12hr）；

2.2%接种于LB培养基中（37℃、2hr）；

3.培养至OD值到0.3-0.5之间时，加入诱导物50mMIPTG，150rpm，18-22℃低温诱导4-20h；

4.离心收集菌体，加入20mMTris·Cl（pH8.0）悬浮；

5.破碎菌体（超声波破碎完全）；

6.离心12000rpm10min4℃；

7.收集上清及沉淀各，进行蛋白电泳检测。

蛋白电泳检测

聚丙烯酰胺凝胶配置见表1。

电泳：取100μL样品，加入50μL3х样品缓冲液，100℃煮沸5min，离心去沉淀；取10μL上样，80V预电泳10min，120恒压电泳1-2h，见图1、图2所示。

染色：电泳后取出凝胶，加入50mlSI微波炉加热30s，60rpm振荡10min；倒掉SI加入含SIII的SII（每50mlSII加200μLSIII）微波炉加热30s，60rpm振荡8h。

表1SDS聚丙烯酰氨凝胶的制备

SC6H8菌株中新型cry2类全长基因的克隆与分析

用cry2类基因全长引物（cry2likeF/cry2likeR）以SC6H8质粒为模板扩增其中的cry2类全长基因，琼脂糖凝胶电泳回收扩增全长cry2片段，连接pET21b载体，转化大肠杆菌JM110菌株，筛选转化的重组质粒并鉴定，获得重组载体pET2Ah-like。对pET2Ah测序结果表明，本研究得到的cry2Ah-like基因全长1899bp。在NCBI上应用BLAST软件比较同源性显示，该基因与cry2Ab8（DQ361266.1）基因的相似性最高（94%）。由DNA序列推导的氨基酸为632个，其蛋白质分子量为70.9kDa，预测的等电点为7.35，为中性蛋白质。在NCBI上应用BLAST软件比较同源性显示，蛋白与Cry2Ab（ABC95996.1）基因的相似性最高（93%）。见表2.

表2，Cry2Ah-like氨基酸组成

cry2Ah-likesp和cry2Ah-likevp基因的克隆与分析

利用重叠PCR方法构建了cry2Ah-like的两个突变体基因cry2Ah-likesp和cry2Ah-likevp，并克隆至pET21b载体。测序结果显示构建成功。突变体cry2Ah-likesp是将Cry2Ah-like蛋白354位缬氨酸（Val）突变为丝氨酸（Ser）和脯氨酸（Pro），突变后与Cry2Ab第354位和355位相同，突变体cry2Ah-likevp是将Cry2Ah-like基因354位缬氨酸（Val）后增加一个脯氨酸（Pro）。突变后两个突变体的碳骨架与Cry2Ab碳骨架相同。

Cry2Ah-like的杀虫活性（见图3）

亚洲玉米螟（O.furnacalis）的室内杀虫活性测定

配置饲料，50g干饲料加入48g超纯水。称取2g饲料于每个培养皿中，与不同的蛋白表达产物混匀。每个培养皿接20头初孵幼虫，每个处理重复3次，26℃生化培养箱中保温，培养7天后调查活虫数，并观察幼虫取食情况。

棉铃虫的室内杀虫活性测定

称取10g人工饲料置于灭菌培养皿中，加入1ml待测样品稀释液，充分混匀，分装于经消毒（5%福尔马林浸泡）的24孔细胞培养板中。用毛笔轻轻接入甜菜夜蛾1-2龄幼虫，每孔一头，每处理重复三次，放置25℃光照培养箱中，培养七天调查死、活虫数。

表3

表4

表5，三种蛋白对棉铃虫活性比较

Claims (7)

1.对鳞翅目害虫高毒力杀虫蛋白Cry2Ah-like，Cry2Ah-likesp，Cry2Ah-likevp，其蛋白序列分别如SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3所示。

2.编码权利要求1所述杀虫蛋白的杀虫基因，名称为cry2Ah-like，cry2Ah-likesp，cry2Ah-likevp，其基因序列分别如SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6所示。

3.含有权利要求2所述的杀虫基因的载体。

4.根据权利要求3所述的载体，其分别为pET2Ah-like、pET2Ah-likesp和pET2Ah-likevp，其骨架载体为pET。

5.权利要求2所述杀虫基因在杀灭棉铃虫、玉米螟中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，为将基因表达的蛋白制成药剂杀灭棉铃虫、玉米螟。

7.根据权利要求5所述的应用，为将基因转化微生物或植物，使植物受体表达对棉铃虫、玉米螟的抗性。

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