CN107119127A - 一种男性不育突变基因位点检测试剂盒及其应用 - Google Patents

一种男性不育突变基因位点检测试剂盒及其应用 Download PDF

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王延宾
袁鹏
王鑫
张承武
李林
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Abstract

本发明属于分子生物学领域，特别涉及一种男性不育突变基因位点检测试剂盒及其应用，本发明的男性不育突变基因位点检测试剂盒的检测位点130841628位点在人类中具有很高的突变比例，本发明的检测试剂盒利用PCR引物3’末端错配显著降低PCR扩增效率的原理，将突变位点设计为正向引物的3’末端：野生型基因型PCR引物3’末端为野生型位点；突变基因型PCR引物3’末端为突变的位点；这样就可以通过两对引物进行PCR核酸电泳来确定点突变情况；两对引物扩增出来的片段都为513bp；本发明的检测试剂盒在鉴定被检测者130841628位点突变情况方面，其效果与一代测序相同，但其成本仅为一代测序技术的1/4左右，同时显著节省了实验流程和时间。

Description

一种男性不育突变基因位点检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域，特别涉及一种男性不育突变基因位点检测试剂盒及其应用。
背景技术
男性不育约占了人不孕不育症50％以上，主要表现为精子密度低，活力低或完全无精子检出，临床分别称为少精症、弱精症或无精症，其中无精症患者高达20％。无精症的发病机理主要分成两类：器质原因引起的梗阻性无精症(Obstructive Azoospermia,OA)和生精障碍引起的非梗阻性无精症(Nonobstructive Azoospermia,NOA)。其中OA患者可以正常产生精子，因此可以通过手术治疗；并且，器质性病变大多由炎症或物理损伤等外因引起，是非遗传性的。NOA的生精障碍通常与基因组异常相关，如核型异常，基因缺失或突变，表观遗传学改变等。目前研究最多的是Y染色体长臂上一段被称作无精症因子(Azoospermia Factor,AZF)的区域(Yq11.2)。AZF包括不重叠的三个区段：AZFa、AZFb和AZFc，编码众多精子发生相关基因，如USPY9、DBY、RBM和DAZ等。该区段的微缺失(microdelation)通常会造成NOA。除性染色体外，已发现部分常染色体异常也会引起NOA，但目前对其确切的机制还未见报道。尽管随着生殖医学的发展，显微睾丸精子提取(micro-TESE)和卵浆内单精子注射(ICSI)等技术使部分NOA患者能够繁育后代；但同时，引起不育的基因缺陷也遗传给了下一代。
作为Ago家族PIWI亚家族成员，PIWI蛋白特异性地在动物生殖世系细胞中表达，调控生殖干细胞的自我更新和维持、生殖细胞发育分化等一系列生殖相关事件，为动物配子形成必需。在果蝇、线虫、斑马鱼等低等动物中，PIWI在雌性和雄性生殖细胞均表达，对卵子发生和精子发生均至关重要，Piwi基因的突变同时导致雌性和雄性不育。有趣的是，在哺乳动物中，PIWI主要在雄性生殖细胞中表达。如小鼠有3个Piwi基因，包括Miwi、Miwi2和Mili，均特异地在睾丸组织中表达，在小鼠生精细胞发育过程中发挥作用在小鼠中缺失任何一个PIWI均致雄性不育，但不影响雌性生育。2006年7月，四个独立的研究组几乎同时在果蝇、小鼠、大鼠和人等物种的生殖系细胞中发现了一类新型小分子非编码RNA，因为它们特异性地与PIWI蛋白质相互作用，所以被命名为PIWI相互作用RNA(PIWI-interacting RNA)，简称piRNA。目前认为PIWI/piRNA通过表观遗传水平和转录后水平下调转座子和重复序列等自私性遗传元件的活性，维持生殖细胞基因组的稳定性和完整性，保证遗传信息在世代间的稳定传递。PIWI蛋白由四个结构域组成，从N-端到C-端依次为N-端结构域、PAZ结构域、MID结构域和PIWI结构域。PIWI结构域与PIWI蛋白的剪切活性有关；PAZ和MID结构域决定了PIWI蛋白与piRNA的相互作用。相应的，人类中与小鼠PIWI蛋白同源的蛋白有HIWI、HIWI2和HILI，人类中的HIWI蛋白与男性不孕症的关系还知之甚少。且目前，检测人类基因组上的点突变最直接的方法是一代测序技术，但是该技术成本偏高且耗费时间。
发明内容
本发明的目的在于提供提供一种检测快速方便、准确率高，可以实现HIWI基因上130841628位点点突变检测的试剂盒，用于检测男性不育突变基因位点。
本发明的技术方案如下：
一种男性不育突变基因位点检测试剂盒，所述检测试剂盒的检测位点为：HIWI基因第13个外显子上杂合和纯合点突变130841628，G突变为A。
优选地，所述男性不育突变基因位点检测试剂盒包括外周血基因组提取体系和PCR反应体系。
优选地，所述男性不育突变基因位点检测试剂的外周血基因组提取体系包括碱裂解法溶液，所述PCR反应体系包括PCR预混合溶液和PCR引物。
优选地，所述男性不育突变基因位点检测试剂盒的PCR引物包括：
正向引物，序列为：GCCATGGGCATGCAAATGAG
正向引物，序列为：GCCATGGGCATGCAAATGAA
反向引物，序列为：CGAAAACTGCCTATATGTCA。
该试剂盒主要利用PCR引物3’末端错配显著降低PCR扩增效率的原理，将突变位点设计为正向引物的3’末端：野生型基因型PCR引物3’末端为野生型位点；突变基因型PCR引物3’末端为突变的位点；这样就可以通过两对引物进行PCR核酸电泳来确定点突变情况；两对引物扩增出来的片段都为513bp。
优选地，所述男性不育突变基因位点检测试剂盒的碱裂解法溶液包括：
碱裂解法溶液A1，包括的25mM NaOH和0.2mM的EDTA；
碱裂解法溶液A2，包括40mM Tris-Cl；
PCR预混合溶液包括Taq酶、dNTPs和缓冲溶液。
所述检测试剂盒用于检测男性不育突变基因位点。
相对于现有技术，本发明的优点如下，
本发明的男性不育突变基因位点检测试剂盒的检测位点130841628位点在人类中具有很高的突变比例，且其纯合子突变可能会导致男性不育，通过本发明的检测试剂盒对被检测人该位点的检测，可以很好的指导被检测人的婚育；
本发明的检测试剂盒在鉴定被检测者130841628位点突变情况方面，其效果与一代测序相同，但其成本仅为一代测序技术的1/4左右，同时显著节省了实验流程和时间；
随着高通量测序技术越来越广泛的应用，能够导致男性不育的突变位点将越来越多的被发现，这些新发现的突变位点也可以根据本发明的试剂盒的原理开发为类似的试剂盒。
附图说明
图1为抽提外周血基因组的流程图；
图2为采用一代测序检测样本的峰图；
图3为采用本发明的试剂盒检测样本的核酸电泳胶图。
具体实施方式
实施例1：
男性不育症突变位点的发现
对HIWI基因组上PAZ结构域的三个外显子和MID结构域的三个外显子分别设计引物，引物如表1：
表1测序PCR引物汇总
名称 序列
PAZ-1-F AGGCCAGTGTAATGAATAGC
PAZ-1-R GAACTAGAAAGCCACAATAC
PAZ-2-F CTGTTCCTTCTTTTTCCAAC
PAZ-2-R GGAACCAGGAGAGGGCATTT
PAZ-3-F ATTTGCCGTGAACAGCGACC
PAZ-3-R CACAAAACTGAAACCCTGCC
MID-1-F TCTACCCCCATTGAGGACAT
MID-1-R CTTCTCCCACCCATTCTTAG
MID-2-F CCATTTGTCGCTACTGTGTC
MID-2-R ACCCTACTCTTCCCATACCT
MID-3-F GCTGTGTGGCTGAAATGAAT
MID-3-R GCAGTTTGACGAATACAGGA
与相关医院合作，对192例无精及严重少弱精男性患者和192例正常男性患者抽取血样，抽提基因组，以这些基因组为模板并应用上述引物分别进行PCR反应，然后进行一代测序。测序结果与NCBI上HIWI基因组进行比对，比对结果显示男性不育症患者HIWI基因第13个外显子上存在杂合和纯合点突变130841628(G突变为A)，而正常人中只存在杂合点突变。该突变位点位于MID结构域上，导致HIWI蛋白527位的精氨酸突变为赖氨酸。病人和正常人突变比例如表2：
表2测序比对结果汇总
病人组(192例) 正常人组(192例)
野生型 162 170
杂合子 24 22
纯合子 6 0
测序分析结果可知，正常人HIWI基因上存在杂合点突变130841628(G突变为A)，该突变的比例大概为22/192(约等于11.46％)，而该位点的纯合突变可能造成男性不育，所以在婚前和孕前检测男性该位点的突变状况是很有必要的。
实施例2：
一种可以实现HIWI基因上130841628位点点突变检测的试剂盒，以下简称HIWI-527试剂盒，主要利用PCR引物3’末端错配显著降低PCR扩增效率的原理，将突变位点设计为正向引物的3’末端：野生型基因型PCR引物3’末端为野生型位点；突变基因型PCR引物3’末端为突变的位点。这样就可以通过两对引物进行PCR核酸电泳来确定点突变情况。两对引物扩增出来的片段都为513bp。
该试剂盒由六种溶液组成：
1)碱裂解法溶液A1(25mM NaOH、0.2mM EDTA，NaOH供应商：上海生工生物；EDTA供应商：上海生工生物)
2)碱裂解法溶液A2(40mM Tris-Cl，Tris-Cl供应商：上海生工生物)
3)PCR 2*MIX溶液M(包含Taq酶、dNTPs和Buffer，供应商：DBI)
4)正向引物液F-WT(序列见表3，由上海生工生物合成，然后加水稀释到20μM，反应终浓度为2μM)
5)正向引物液F-MUT(序列见表3，由上海生工生物合成，然后加水稀释到20μM，反应终浓度为2μM)
6)反向引物液R(序列见表3，由上海生工生物合成，然后加水稀释到20μM，反应终浓度为2μM)
表3HIWI-527试剂盒引物序列
F-WT GCCATGGGCATGCAAATGAG
F-MUT GCCATGGGCATGCAAATGAA
R CGAAAACTGCCTATATGTCA
本实施例的HIWI-527检测试剂盒，包括外周血基因组提取体系和PCR反应体系。
1、外周血基因组提取体系
首先按照常规方法抽取检测人的外周新鲜血液。1.0-3.0ml新鲜血加1/6体积ACD液(0.62％柠檬酸钠，0.24％柠檬酸和1.6％葡萄糖)抗凝，分装于1.5ml离心管内。然后对有核细胞进行富集。采用冻融法将上离心管立即放置-20℃冻存。从冰箱取出离心管在室温下待红细胞融破后，经台式离心机4000r/min，离心5分钟，弃上清中绝大部分血红蛋白和细胞脆片，沉淀中即富含血液有核细胞。
按照图1的流程抽提外周血基因组，所得的150μl外周血基因组溶液即可进入下一步作为PCR的模板。
2、PCR反应体系
用不同的F引物进行两次PCR反应，按照表4配置PCR反应体系：
表4HIWI-527试剂盒PCR反应体系
组分 浓度 体积
2*MIX溶液M 10μl
F-WT或者F-MUT 20μM 2μl
通用反向引物R 20μM 2μl
外周血基因组 2μl
ddH2O 4μl
总体积 20μl
应用下表程序进行PCR反应：
表5HIWI-527试剂盒PCR反应程序
3、核酸电泳鉴定
配制百分之二的含有核酸染料溴化乙锭(Ethidium bromide)的琼脂糖胶，120V恒压在TAE缓冲液中进行电泳，电泳完毕后在紫外探照灯下看结果(如图3)：正常人只有F-WT引物能够PCR出513bp的条带，含有130841628突变位点杂合子的人F-WT与F-MUT均能PCR出513bp的条带，含有130841628突变位点纯合子的人只有F-MUT能够PCR出513bp的条带；含有130841628突变位点纯合子的男性不育。
实施例3：
HIWI-527试剂盒与常规一代测序的比较
选用一代测序鉴定出来的130841628位点野生型、突变杂合子和突变纯合子的人采用实施例2的HIWI-527试剂盒测试，测试结果见附图3；从图2和图3上可以看出该试剂盒得到的结果(图3)与一代测序得到的结果(图2)完全一致。
需要说明的是上述实施例仅仅是本发明的较佳实施例，并没有用来限定本发明的保护范围，在上述基础上做出的等同替换或者替代均属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京北恒生物科技有限公司
<120>一种男性不育突变基因位点检测试剂盒及其应用
<160> 15
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213>人类基因组
<400> 1
GCCATGGGCATGCAAATGAG 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213>人类基因组
<400> 2
GCCATGGGCATGCAAATGAA 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213>人类基因组
<400> 3
CGAAAACTGCCTATATGTCA 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213>人类基因组
<400> 4
AGGCCAGTGTAATGAATAGC 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213>人类基因组
<400> 5
GAACTAGAAAGCCACAATAC 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213>人类基因组
<400> 6
CTGTTCCTTCTTTTTCCAAC 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213>人类基因组
<400> 7
GGAACCAGGAGAGGGCATTT 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213>人类基因组
<400> 8
ATTTGCCGTGAACAGCGACC 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213>人类基因组
<400> 9
CACAAAACTGAAACCCTGCC 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213>人类基因组
<400> 10
TCTACCCCCATTGAGGACAT 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213>人类基因组
<400> 11
CTTCTCCCACCCATTCTTAG 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213>人类基因组
<400> 12
CCATTTGTCGCTACTGTGTC 20
<210> 13
<211> 20
<211> 20
<212> DNA
<213>人类基因组
<400> 13
ACCCTACTCTTCCCATACCT 20
<210> 14
<211> 20
<211> 20
<212> DNA
<213>人类基因组
<400> 14
GCTGTGTGGCTGAAATGAAT 20
<210> 15
<211> 20
<211> 20
<212> DNA
<213>人类基因组
<400> 15
GCAGTTTGACGAATACAGGA 20

Claims (6)

1.一种男性不育突变基因位点检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒的检测位点为：HIWI基因第13个外显子上杂合和纯合点突变130841628，G突变为A。
2.如权利要求1所述的男性不育突变基因位点检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括外周血基因组提取体系和PCR反应体系。
3.如权利要求2所述的男性不育突变基因位点检测试剂盒，其特征在于，所述外周血基因组提取体系包括碱裂解法溶液，所述PCR反应体系包括PCR预混合溶液和PCR引物。
4.如权利要求3所述的男性不育突变基因位点检测试剂盒，其特征在于，所述PCR引物包括：
正向引物，序列为：GCCATGGGCATGCAAATGAG
正向引物，序列为：GCCATGGGCATGCAAATGAA
反向引物，序列为：CGAAAACTGCCTATATGTCA。
5.如权利要求3或4所述的男性不育突变基因位点检测试剂盒，其特征在于，
所述碱裂解法溶液包括：
碱裂解法溶液A1，包括的25mM NaOH和0.2mM的EDTA；
碱裂解法溶液A2，包括40mM Tris-Cl；
所述PCR预混合溶液包括Taq酶、dNTPs和缓冲溶液。
6.如权利要求1-5任一项所述的检测试剂盒在检测男性不育突变基因位点中的应用。
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