CN107115299A - 一种雷帕霉素纳米胶束滴眼液及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种雷帕霉素纳米胶束滴眼液的制备方法,包括将聚乙烯己内酰胺‑聚乙酸乙烯酯‑聚乙二醇接枝共聚物、雷帕霉素、无水乙醇和葡萄糖混合,得到含有雷帕霉素的混合液;将含有雷帕霉素的混合液经过蒸发和水化步骤后置于冰上,冰浴至透明,得到雷帕霉素纳米胶束滴眼液。本发明实施例的结果显示:经雷帕霉素纳米胶束滴眼液治疗后,小鼠和兔角膜植片持续维持透明;雷帕霉素纳米胶束滴眼液可有效延长角膜植片的存活时间;雷帕霉素纳米胶束滴眼液可有效减少炎性细胞浸润、抑制角膜水肿,维持角膜植片的正常结构,浸润到角膜植片中的CD11b+巨噬细胞、Ly6G+中性粒细胞、CD11c+树突状细胞以及CD4+T细胞明显减少。
Description
技术领域
本发明属于眼科疾病治疗技术领域,尤其涉及一种雷帕霉素纳米胶束滴眼液及其制备方法。
背景技术
据统计我国目前约有400万因角膜疾病致盲的患者,而角膜移植手术是其复明的主要手段。角膜移植手术是用透明的角膜片置换混浊或有病变部分的角膜,以达到增视、治疗某些角膜病和改善外观的目的,是异体移植效果最好的一种手术。但是术后免疫排斥反应的发生可能会导致角膜植片水肿,甚至混浊,最终导致手术失败。研究资料显示,初次进行角膜移植的非高危患者的角膜植片2年存活率达90%,而具有血管化的角膜植床或具有移植排斥病史的高危患者发生免疫排斥的几率高达60-100%。因此,角膜植片免疫排斥反应成为制约植片存活时间的关键性因素,也是影响移植物远期存活率的重要因素。
目前,角膜移植的免疫治疗药物主要有环孢素、他克莫司等。这些药物可局部或全身应用,使用后可以明显延长角膜移植术后植片存活时间,但是这些药物的毒副作用尤其是肾毒性明显,使这些药物的临床应用受到一定限制。雷帕霉素作为一种新型的免疫抑制剂,化学结构与他克莫司相似,但免疫抑制机制与环孢素和他克莫司截然不同。由于眼球的独特解剖结构,即存在“血眼屏障”和“角膜屏障”,使得全身用药和目前的眼用制剂很难达到有效的眼内药物浓度,制约了雷帕霉素在眼科临床治疗中的应用。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于针对现有技术的不足,而提供一种雷帕霉素纳米胶束滴眼液的制备方法,制备得到的雷帕霉素纳米胶束滴眼液能够用于防治角膜移植手术后的免疫排斥反应。
本发明提供了一种雷帕霉素纳米胶束滴眼液的制备方法,包括以下步骤:
1)将聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物、雷帕霉素、无水乙醇和葡萄糖混合,得到含有雷帕霉素的混合液;
2)将所述步骤1)得到的含有雷帕霉素的混合液在温度为38~42℃和压强为0.085~0.095MPa下蒸发55~65min,再在温度为58~62℃和压强为0.085~0.095MPa下蒸发12~18min成膜;
3)将所述步骤2)得到的膜与磷酸盐缓冲液混合后,在温度为38~42℃下水化10~20min,再在温度为23~27℃下水化170~190min,得到水化后的混合液;
4)将所述步骤3)水化后的混合液冰浴至透明,得到雷帕霉素纳米胶束滴眼液。
优选的,所述雷帕霉素纳米胶束滴眼液中雷帕霉素的质量百分含量为0.37~0.9%。
优选的,所述步骤1)中的雷帕霉素与聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物的质量比为(45~55):(880~920)。
优选的,所述步骤1)中的雷帕霉素的质量与无水乙醇的体积比为(45~55)mg:(8~12)ml。
优选的,所述步骤1)中的雷帕霉素与葡萄糖的质量比为(45~55):(415~435)。
优选的,所述步骤2)得到的膜中的雷帕霉素的质量与步骤3)中的磷酸盐缓冲液的体积比为(45~55)mg:(5~15)ml。
优选的,所述磷酸盐缓冲液包括:6.1~6.5mMNa2HPO4、13.5~13.9mM NaH2PO4,所述磷酸盐缓冲液的pH值为6.0~7.0。
优选的,所述冰浴至透明后还包括:将得到的雷帕霉素纳米胶束滴眼液再经0.22μm微孔滤膜过滤。
本发明还提供了所述滴眼液的制备方法制备得到的雷帕霉素纳米胶束滴眼液,包含雷帕霉素、聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物、磷酸盐缓冲液以及葡萄糖。
本发明提供了一种雷帕霉素纳米胶束滴眼液的制备方法,包括以下步骤:1)将聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物、雷帕霉素、无水乙醇和葡萄糖混合,得到含有雷帕霉素的混合液;2)将所述步骤1)得到的含有雷帕霉素的混合液在温度为38~42℃和压强为0.085~0.095MPa下蒸发55~65min,再在温度为58~62℃和压强为0.085~0.095MPa下蒸发12~18min成膜;3)将所述步骤2)得到的膜与磷酸盐缓冲液混合后,在温度为38~42℃下水化10~20min,再在温度为23~27℃下水化170~190min,得到水化后的混合液;4)将所述步骤3)水化后的混合液冰浴至透明,得到雷帕霉素纳米胶束滴眼液。以聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物为药物载体得到的纳米胶束滴眼液通过增加雷帕霉素的溶解性、靶向性和组织细胞的相容性等提高其在角膜内的有效药物浓度,进而有效抑制角膜移植免疫排斥反应。
本发明实施例的结果显示:经雷帕霉素纳米胶束滴眼液治疗后,小鼠和兔角膜植片持续维持透明,而未治疗组角膜植片浑浊并伴有角膜新生血管;对照组与雷帕霉素治疗组的小鼠角膜植片平均存活时间分别为17.17±1.54天和56.50±1.96天,差异具有统计学意义(p<0.0001),对照组与雷帕霉素治疗组的兔角膜植片平均存活时间分别为16.17±0.65天和95.20±3.26天,差异具有统计学意义(p<0.0001),表明雷帕霉素纳米胶束滴眼液可有效延长角膜植片的存活时间;雷帕霉素纳米胶束滴眼液可有效减少炎性细胞浸润、抑制角膜水肿,维持角膜植片的正常结构;经雷帕霉素纳米胶束滴眼液治疗后,浸润到角膜植片中的CD11b+巨噬细胞、Ly6G+中性粒细胞、CD11c+树突状细胞以及CD4+T细胞明显减少。
由此可以得出,雷帕霉素纳米胶束滴眼液可用于防治角膜移植手术后的免疫排斥反应。
附图说明
图1为雷帕霉素纳米胶束滴眼液维持小鼠角膜植片的透明性;
图2为帕霉素纳米胶束滴眼液延长小鼠角膜植片的存活时间;
图3为雷帕霉素纳米胶束滴眼液对小鼠角膜植片病理改变的影响;
图4为雷帕霉素胶束滴眼液对小鼠角膜植片中炎性细胞浸润的影响;
图5为雷帕霉素胶束滴眼液对兔高危角膜移植模型中角膜植片透明性的影响;
图6为雷帕霉素胶束滴眼液对兔高危移植角膜植片存活时间的影响;
图7为雷帕霉素纳米胶束滴眼液对兔角膜植片中炎性细胞浸润的影响。
具体实施方式
本发明提供了一种雷帕霉素纳米胶束滴眼液的制备方法,包括以下步骤:
1)将聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物、雷帕霉素、无水乙醇和葡萄糖混合,得到含有雷帕霉素的混合液;
2)将所述步骤1)得到的含有雷帕霉素的混合液在温度为38~42℃和压强为0.085~0.095MPa下蒸发55~65min,再在温度为58~62℃和压强为0.085~0.095MPa下蒸发12~18min成膜;
3)将所述步骤2)得到的膜与磷酸盐缓冲液混合后,在温度为38~42℃下水化10~20min,再在温度为23~27℃下水化170~190min,得到水化后的混合液;
4)将所述步骤3)水化后的混合液冰浴至透明,得到雷帕霉素纳米胶束滴眼液。
在本发明中,所述雷帕霉素纳米胶束滴眼液中雷帕霉素的质量百分含量优选为0.37~0.9%,更优选为0.43~0.6%,最优选为0.5%。
本发明将聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物、雷帕霉素、无水乙醇和葡萄糖混合,得到含有雷帕霉素的混合液。
在本发明中,所述雷帕霉素与聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物的质量比优选为(45~55):(880~920),更优选为(48~52):(890~910),最优选为50:900;所述雷帕霉素的质量与无水乙醇的体积比优选为(45~55)mg:(8~12)ml,更优选为(48~52)mg:(9~11)ml,最优选为50mg:10ml;所述雷帕霉素与葡萄糖的质量比优选为(45~55):(415~435),更优选为(48~52):(420~430),最优选为50:425。本发明对上述试剂的来源没有特殊限定,采用本领域技术人员常规选用的市售产品即可。在本发明中,所述聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物为BASF(中国)有限公司提供
在本发明中,所述混合优选为将所述聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物和雷帕霉素溶于无水乙醇中,溶解后再加入葡萄糖混合。
本发明将得到的含有雷帕霉素的混合液经过蒸发成膜,所述含有雷帕霉素的混合液在温度为38~42℃和压强为0.085~0.095MPa下蒸发55~65min,再在温度为58~62℃和压强为0.085~0.095MPa下蒸发12~18min;优选为在温度为39~41℃和压强为0.088~0.092MPa下蒸发58~62min,再在温度为59~61℃和压强为0.088~0.092MPa下蒸发13~17min;更优选为在温度为40℃和压强为0.090MPa下蒸发60min,再在温度为60℃和压强为0.090MPa下蒸发15min。本发明对所述蒸发使用的仪器没有特殊限定,在本发明实施例中具体采用旋转蒸发仪。
本发明将得到的膜与磷酸缓冲液混合,再经过水化,得到水化后的溶液。
在本发明中,所述膜中的雷帕霉素的质量与磷酸盐缓冲液的体积比优选为(45~55)mg:(5~15)ml,更优选为(48~52)mg:(8~12)ml,最优选为50mg:10ml。本发明对上述试剂的来源没有特殊限定,采用本领域技术人员常规选用的市售产品即可。
在本发明中,所述水化的条件包括:在温度为38~42℃下水化10~20min,再在温度为23~27℃下水化170~190min;优选为在39~41℃下水化12~18min,再在温度为24~26℃下水化175~185min;更优选为在40℃下水化15min,再在温度为25℃下水化180min。
在本发明中,所述磷酸盐缓冲液优选包括:6.1~6.5mMNa2HPO4、13.5~13.9mMNaH2PO4,更优选包括6.15~6.4mMNa2HPO4、13.6~13.8mM NaH2PO4,最优选包括6.301mMNa2HPO4、13.703mMNaH2PO4;所述磷酸盐的pH值优选为6.0~7.0,更优选为6.3~6.8,最优选为6.5。
本发明将水化后的溶液置于冰上,进行冰浴,直至水化后的溶液透明,得到雷帕霉素纳米胶束滴眼液。在本发明中,所述冰浴的时间优选为180~480min,更优选为240~420min,最优选为360min。
在本发明中,所述冰浴至透明后优选还包括:将得到的雷帕霉素纳米胶束滴眼液再经0.22μm微孔滤膜过滤。
本发明将经过微孔滤膜过滤的雷帕霉素纳米胶束滴眼液用无菌磷酸盐溶液稀释,得到雷帕霉素的质量百分含量为0.1%的雷帕霉素纳米胶束滴眼液,所述经磷酸盐溶液稀释后的雷帕霉素纳米胶束滴眼液的pH值优选为6.5~7.0,更优选为6.7~6.8。
在本发明中,所述无菌磷酸盐溶液优选包括:6.1~6.5mMNa2HPO4、13.5~13.9mMNaH2PO4,更优选为6.15~6.4mMNa2HPO4、13.6~13.8mM NaH2PO4,最优选为6.301mMNa2HPO4、13.703mMNaH2PO4。在本发明中,将配置好的磷酸盐缓冲溶液采用0.22μm微孔滤膜过滤,得到无菌磷酸盐缓冲溶液。
本发明还提供了上述技术方案制备得到的雷帕霉素纳米胶束滴眼液,包含雷帕霉素、聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物、磷酸盐缓冲液和葡萄糖。
下面结合实施例对本发明提供的一种雷帕霉素纳米胶束滴眼液及其制备方法进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
将900.0mg聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物和50.0mg雷帕霉素溶于10.0ml无水乙醇,充分溶解后加入425.0mg的葡萄糖混合;再置于旋转蒸发仪上,在温度为40.0℃、压强为0.09MPa的条件下蒸发60.0min,随后在温度为60.0℃、压强为0.09MPa的条件下蒸发15.0min成膜;再加入10.0ml磷酸盐缓冲液,然后在40.0℃下水化15.0min,再在25℃下水化180.0min;再冰浴至溶液透明,获得雷帕霉素的质量百分含量为0.5%的纳米胶束滴眼液;滴眼液采用0.22μm微孔滤膜无菌过滤后,再用无菌磷酸盐缓冲液稀释,得到雷帕霉素质量百分含量为0.1%的纳米胶束滴眼液,调节滴眼液的pH值为6.8。
磷酸盐缓冲溶液包括:Na2HPO4·12H2O6.301mM,NaH2PO4·2H2O13.703mM,pH6.5。
实施例2
将920.0mg聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物和55.0mg雷帕霉素溶于12.0ml无水乙醇,充分溶解后加入425.0mg的葡萄糖混合;再置于旋转蒸发仪上,在温度为42.0℃、压强为0.09MPa的条件下蒸发65.0min,随后在温度为62.0℃、压强为0.09MPa的条件下蒸发20.0min成膜;再加入10.0ml磷酸盐缓冲液,然后在42.0℃下水化20.0min,再在25℃下水化190.0min;再冰浴至溶液透明,获得雷帕霉素的质量百分含量为0.55%的纳米胶束滴眼液;滴眼液采用0.22μm微孔滤膜无菌过滤后,再用无菌磷酸盐缓冲液稀释,得到雷帕霉素质量百分含量为0.1%的纳米胶束滴眼液,调节滴眼液的pH值为7.0。
磷酸盐缓冲溶液包括:Na2HPO4·12H2O6.301mM,NaH2PO4·2H2O13.703mM,pH6.5。
实施例3
将880.0mg聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物和45.0mg雷帕霉素溶于10.0ml无水乙醇,充分溶解后加入425.0mg的葡萄糖混合;再置于旋转蒸发仪上,在温度为38.0℃、压强为0.09MPa的条件下蒸发55.0min,随后在温度为58.0℃、压强为0.09MPa的条件下蒸发12.0min成膜;再加入10.0ml磷酸盐缓冲液,然后在38.0℃下水化10.0min,再在25℃下水化170.0min;再冰浴至溶液透明,获得雷帕霉素的质量百分含量为0.45%的纳米胶束滴眼液;滴眼液采用0.22μm微孔滤膜无菌过滤后,再用无菌磷酸盐缓冲液稀释,得到雷帕霉素质量百分含量为0.1%的纳米胶束滴眼液,调节滴眼液的pH值为6.5。
磷酸盐缓冲溶液包括:Na2HPO4·12H2O6.301mM,NaH2PO4·2H2O13.703mM,pH6.5。
实施例4实施例1制备得到的0.1%雷帕霉素纳米胶束滴眼液可维持小鼠角膜植片的透明性
(1)小鼠穿透性角膜移植模型构建:
以C57BL/6小鼠为角膜供体、BALB/C小鼠作为角膜移植的受体构建穿透性角膜移植模型,主要手术过程如下:
①散瞳:于角膜移植术前1天用1%阿托品眼膏涂眼1次,术前1小时用复方托吡卡胺眼液点眼0.005ml×2次,使瞳孔散大;
②麻醉与消毒:盐酸氯胺酮注射液和盐酸氯丙嗪注射液混合液行腹腔注射麻醉(0.45ml/只小鼠),倍诺喜滴眼液表面麻醉0.005ml×3次,并用0.5%安尔碘Ⅲ型(无醇型)消毒术眼及周围毛发;
③供体角膜植片制作:手术全过程在显微镜下进行,显微镜的放大倍率为16倍;取直径为2mm的环钻于供体小鼠角膜中央钻切直至角膜某象限穿通,然后眼前房注入眼用无菌粘弹剂,维纳斯剪取下角膜植片,放置于HBSS缓冲液中备用成分:NaCl137mM,KCl5.4mM,MgSO4.7H2O6.301mM,MgCl2.6H2O0.5mM,Na2HPO4·2H2O0.3mM,KH2PO40.4mM,葡萄糖5.6mM,CaCl21.3MM,NaHCO34.2mM);
④角膜植床制备:取同样大小的环钻在角膜中央钻切,达角膜1/2深度左右时,用15度角的剪刀斜形加深切口并入前房,然后用维纳斯剪沿切口剪下角膜片,使植床边缘为一斜面;
⑤植片缝合:将供体角膜植片置于植床上,11-0尼龙线8-12针间断缝合并使线结外漏;32号针头注入无菌空气形成前房;涂0.3%氧氟沙星眼膏,10-0缝线间断1-2针缝合眼睑。术后继续涂0.3%氧氟沙星眼膏,每日2-3次,3天拆除眼睑缝线,7天拆除角膜缝线。
(2)实验分组及药物干预
将角膜移植后的小鼠随机分为对照组和实验组;对照组利用不含雷帕霉素的空载纳米胶束滴眼液进行点眼治疗,每次大约0.005ml,每天3次,实验组用0.1%的雷帕霉素纳米胶束滴眼液进行点眼治疗,每次大约0.005ml,每天3次,连续点眼60天,并采用裂隙灯观察角膜植片的透明性,结果见图1。
根据图1可以得出,经雷帕霉素纳米胶束滴眼液治疗后,小鼠角膜植片持续维持透明,而对照组角膜植片浑浊并伴有角膜新生血管。
实施例5实施例1制备的雷帕霉素纳米胶束滴眼液有效延长小鼠角膜植片的存活时间
具体操作同实施例4,利用裂隙灯实时观察每组小鼠角膜植片浑浊度的变化,连续观察60天,并记录角膜植片发生浑浊的时间,然后利用kaplan-meier统计学方法绘制角膜植片生存曲线,结果见图2。
根据图2可以得出,对照组的角膜植片平均存活时间为17.17±1.54天,雷帕霉素纳米胶束滴眼液治疗组的角膜植片平均存活时间为56.50±1.96天,差异具有统计学意义(p<0.0001),表明雷帕霉素纳米胶束滴眼液可有效延长角膜植片的存活时间。
实施例6:实施例1制备的雷帕霉素纳米胶束滴眼液对小鼠角膜植片病理改变的影响
具体操作同实施例4,于角膜移植术后的第60天取小鼠眼球并用后续的角膜植片病理改变分析。
(1)小鼠眼球组织石蜡标本制作
①标本固定:将眼球浸泡在4%多聚甲醛内,4℃下固定24h;
②脱水:75%乙醇2h;85%乙醇2h;90%乙醇1.5h;95%乙醇1h;无水乙醇1h×2次;
③透明:无水乙醇/二甲苯(1:1)15min;二甲苯15min×2次;
④浸蜡:石蜡在52-58℃下处理45min,然后再在52-58℃下处理15min;
⑤包埋:将眼球以眼轴水平位置于一次性包埋盒中,加入热石蜡使其没过组织,待蜡表面凝固后轻轻将石蜡标本转移到冰上,加速凝固;
⑥切片:石蜡切片机切取5μm厚度切片,然后置于40℃水浴展片锅内,用平镊轻轻分开蜡片,载玻片捞取蜡片,并将其置于60℃烘片机,烤片30-60min;
(2)苏木素-伊红染色
①脱蜡:将石蜡切片置于二甲苯溶液中脱蜡10min×3次;
②水化:无水乙醇溶液2min;95%乙醇溶液2min;80%乙醇溶液2min;蒸馏水冲洗;
③苏木素染色:苏木素染液5-10min,水洗;1%盐酸乙醇溶液分化40秒左右;0.5%-1%氨水返蓝,至细胞核呈蓝色;
④伊红染色:流水冲洗2min,伊红染色2-5min;
⑤脱水:80%乙醇溶液1min;90%乙醇溶液1min;95%乙醇溶液1min;无水乙醇溶液1min;
⑥封片与镜检:中性树胶封片,显微镜下观察,结果见图3。
根据图3可以得出,与对照组相比较,雷帕霉素纳米胶束滴眼液可有效减少炎性细胞浸润、抑制角膜水肿,维持角膜植片的正常结构。
实施例7实施例1制备的雷帕霉素胶束滴眼液对小鼠角膜植片中炎性细胞浸润的影响
具体操作同实施例4,于角膜移植术后第60天取小鼠眼球用于制备冰冻切片并通过免疫荧光技术分析角膜植片中炎性细胞浸润情况。
(1)冰冻切片制备
将眼球以眼轴水平位包埋于OCT冰冻切片包埋剂中,置于-80℃冰箱中保存,切片时将标本置于冰冻切片机内,制作厚度为7μm的冰冻切片并贴附于多聚赖氨酸包被的防脱载玻片上,存入-20℃冰箱待染。
(2)免疫荧光技术
①冷冻胶清除:切片自-20℃冰箱取出后,室温复温30min;PBS洗5min×3次,去除残留的冷冻胶;
②固定:4%的多聚甲醛固定15min,PBS洗5min×3次;
③透化:0.1%TritonX-100透化5min,PBS洗5min×3次;
④封闭:免疫组化笔在标本周围划圈,滴加5%BSA,室温封闭1h;
⑤抗体孵育:分别滴加抗CD11b、Ly6G、CD11c以及CD4的抗体(稀释比例为1:100-1:200),4℃湿盒内孵育过夜;
⑥荧光标记二抗孵育:PBS洗5min×3次,滴加荧光标记的二抗(稀释比例为1:200),37℃水浴锅避光孵育1h;
⑦细胞核染色:PBS洗5min×3次,DAPI染细胞核5min,PBS5min×1次;
⑧封片与镜检:滴加防淬灭剂后封片,荧光显微镜镜下观察,结果见图4。
根据图4可以得出,与对照组相比较,经雷帕霉素纳米胶束滴眼液干预治疗后,浸润到角膜植片中的CD11b+巨噬细胞、Ly6G+中性粒细胞、CD11c+树突状细胞以及CD4+T细胞明显减少。
实施例8实施例1制备的雷帕霉素胶束滴眼液对兔高危角膜移植模型中角膜植片透明性的影响
(1)新西兰大白兔角膜新生血管诱导
使用5-0丝线于右眼角膜各象限间断缝合一针,跨距2mm,深度达角膜深基质层,每周裂隙灯显微镜观察3次,待3个或3个以上象限新生血管长入角膜≥4mm时,于表面麻醉下拆除缝线备用。
(2)穿透性角膜移植
①麻醉与消毒:氯胺酮(25mg/kg)和氯丙嗪(25mg/kg)混合后行肌肉注射进行全身麻醉(平均5.0ml/只兔),术前0.5%安尔碘III型涂抹术眼及周围毛发;
②角膜植片制备:在供体角膜中央以直径7.75mm的环钻钻切,15度刀做穿刺口,角膜剪剪下植片,置于盛有生理盐水的培养皿中防止干涸;
③角膜植床制备:在受体角膜中央以直径7.5mm的环钻钻切,15度刀做穿刺口,注入少许卡巴胆碱及医用透明质酸钠,角膜剪剪下角膜;
④角膜植片缝合:将角膜植片置于植床,以10-0尼龙线间断缝合16针至水密状态。术中局部使用1000U/ml肝素钠防治纤维膜形成,术毕注入平衡盐溶液形成前房。
(3)实验分组及干预
将移植术后的新西兰大白兔随机分成对照组和实验组,其中对照组用空载纳米胶束滴眼液进行点眼治疗,每次0.05ml,每天3次,实验组用0.1%的雷帕霉素纳米胶束滴眼液进行点眼治疗,每次0.05ml,每天3次,连续点眼100天,并采用裂隙灯实时观察角膜植片的透明性的变化,结果见图5。
根据图6可以得出,经雷帕霉素纳米胶束滴眼液治疗后的兔角膜植片透明性显著改善,而未治疗组角膜植片浑浊,并可见角膜植片新生血管。
实施例9实施例2制备的雷帕霉素胶束滴眼液对兔高危移植角膜植片存活时间的影响
具体操作同实施例7,利用裂隙灯实时观察兔角膜植片浑浊度的变化,连续观察100天,并记录角膜植片浑浊的时间,然后利用kaplan-meier统计学方法绘制角膜植片生存曲线,结果见图6。
根据图6可以得出,对照组的角膜植片平均存活时间为16.17±0.65天,雷帕霉素纳米胶束滴眼液治疗组的角膜植片平均存活时间为95.20±3.26天,差异具有统计学意义(p<0.0001),表明雷帕霉素纳米胶束滴眼液可有效延长角膜植片的存活时间。
实施例10实施例3制备的雷帕霉素纳米胶束滴眼液对兔角膜植片中炎性细胞浸润的影响
具体操作同实施例7,于角膜移植术后的第100天取小鼠眼球并用多聚甲醛进行固定,然后进行脱水、浸蜡、包埋等一系列过程制备石蜡切片(步骤详见实施例6),最后通过免疫组织化学技术研究RAPA纳米胶束滴眼液对角膜植片中炎性细胞浸润的影响。免疫组织化学步骤如下:
①脱蜡:将石蜡切片置于二甲苯溶液中脱蜡10min×3次;
②水化:无水乙醇溶液2min;95%乙醇溶液2min;80%乙醇溶液2min;蒸馏水冲洗;
③抗原修复:取500ml蒸馏水,加入5ml柠檬酸盐抗原修复液,PH值为6.0,加入高压锅,修复液量必须浸没切片,大火加热至沸腾,将组织切片放入沸腾的修复液中2min,然后自然冷却至室温;蒸馏水冲2次,PBS洗洗5min×3次;
④阻断灭活内源性过氧化物酶:3%过氧化氢,封闭过氧化物酶,室温放置10分钟,PBS洗5min×3次;
⑤抗原封闭:吸水纸拭去标本周围水分,载玻片标本周围使用免疫组化笔划圈(尽量小),滴加山羊血清封闭抗原,37℃水浴锅孵育15min,吸水纸拭去封闭液,不洗;
⑥抗体孵育:分别滴加抗CD4、CD8的抗体4℃冰箱孵育过夜,PBS冲洗3×5min;
⑦生物素标记二抗孵育:滴加生物素标记二抗,37℃水浴锅孵育30min,PBS洗5min×3次;
⑧DAB显色:加入DAB显色液,显微镜下观察染色结果,显色3-10min,蒸馏水洗终止反应。组织内见细胞浆染为棕黄色为阳性;
⑨苏木素复染:苏木素染2min,至细胞核呈蓝色;
⑩脱水、封片、镜检:80%乙醇溶液1min;90%乙醇溶液1min;95%乙醇溶液1min;无水乙醇溶液1min。中性树胶封片,显微镜下观察,结果见图7。
根据图7可以得出,与对照组相比较,雷帕霉素纳米胶束滴眼液可有效减少角膜植片中CD4+T细胞、CD8+T细胞的浸润。
根据以上实施例可以得出,经雷帕霉素纳米胶束滴眼液治疗后,小鼠和兔角膜植片持续维持透明,而未治疗组角膜植片浑浊并伴有角膜新生血管;对照组与雷帕霉素治疗组的小鼠角膜植片平均存活时间分别为17.17±1.54天和56.50±1.96天,差异具有统计学意义(p<0.0001),对照组与雷帕霉素治疗组的兔角膜植片平均存活时间分别为16.17±0.65天和95.20±3.26天,差异具有统计学意义(p<0.0001),表明雷帕霉素纳米胶束滴眼液可有效延长角膜植片的存活时间;雷帕霉素纳米胶束滴眼液可有效减少炎性细胞浸润、抑制角膜水肿,维持角膜植片的正常结构;经雷帕霉素纳米胶束滴眼液治疗后,浸润到角膜植片中的CD11b+巨噬细胞、Ly6G+中性粒细胞、CD11c+树突状细胞以及CD4+T细胞明显减少。由此可以得出,雷帕霉素纳米胶束滴眼液能够用于防治角膜移植手术后的免疫排斥反应。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种雷帕霉素纳米胶束滴眼液的制备方法,包括以下步骤:
1)将聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物、雷帕霉素、无水乙醇和葡萄糖混合,得到含有雷帕霉素的混合液;
2)将所述步骤1)得到的含有雷帕霉素的混合液在温度为38~42℃和压强为0.085~0.095MPa下蒸发55~65min,再在温度为58~62℃和压强为0.085~0.095MPa下蒸发12~18min成膜;
3)将所述步骤2)得到的膜与磷酸盐缓冲液混合后,在温度为38~42℃下水化10~20min,再在温度为23~27℃下水化170~190min,得到水化后的混合液;
4)将所述步骤3)水化后的混合液冰浴至透明,得到雷帕霉素纳米胶束滴眼液。
2.根据权利要求1所述的滴眼液的制备方法,其特征在于,所述雷帕霉素纳米胶束滴眼液中雷帕霉素的质量百分含量为0.37~0.9%。
3.根据权利要求1所述的滴眼液的制备方法,其特征在于,所述步骤1)中的雷帕霉素与聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物的质量比为(45~55):(880~920)。
4.根据权利要求1所述的滴眼液的制备方法,其特征在于,所述步骤1)中的雷帕霉素的质量与无水乙醇的体积比为(45~55)mg:(8~12)ml。
5.根据权利要求1所述的滴眼液的制备方法,其特征在于,所述步骤1)中的雷帕霉素与葡萄糖的质量比为(45~55):(415~435)。
6.根据权利要求1所述的滴眼液的制备方法,其特征在于,所述步骤2)得到的膜中的雷帕霉素的质量与步骤3)中的磷酸盐缓冲液的体积比为(45~55)mg:(5~15)ml。
7.根据权利要求6所述的滴眼液的制备方法,其特征在于,所述磷酸盐缓冲液包括:6.1~6.5mMNa2HPO4、13.5~13.9mMNaH2PO4,所述磷酸盐缓冲液的pH值为6.0~7.0。
8.根据权利要求1~7任意一项所述的滴眼液的制备方法,其特征在于,所述冰浴至透明后还包括:将得到的雷帕霉素纳米胶束滴眼液再经0.22μm微孔滤膜过滤。
9.权利要求1~8任意一项所述的滴眼液的制备方法制备得到的雷帕霉素纳米胶束滴眼液,包含雷帕霉素、聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物、磷酸盐缓冲液和葡萄糖。
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