CN107106721A - 软组织的无缝合修复 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及在包括韧带例如前交叉韧带(ACL)的软组织中修复软组织缺损的无缝合方法。具体地，本申请涉及修复软组织缺损的无缝合方法，所述方法包括：(i)提供适于包围至少部分所述软组织缺损的含有胶原的贴剂；(ii)使所述软组织缺损和/或含有胶原的贴剂与致敏剂接触；(iii)将所述软组织缺损包围在所述含有胶原的贴剂中以形成生物活性腔；和(iv)使所述含有胶原的贴剂粘附于所述软组织缺损而不进行缝合。

Description

软组织的无缝合修复
技术领域
本申请涉及在包括韧带例如前交叉韧带(ACL)的软组织中修复软组织缺损的无缝合方法。所述修复包括修复部分或完全撕裂。具体地，本申请涉及修复软组织缺损的无缝合方法，所述方法包括使用致敏剂使含有胶原的贴剂粘附于软组织缺损的部位，其中围绕所述软组织缺损形成生物活性腔，其提供有助于修复所述组织的微环境。
背景技术
肌腱组织、韧带组织、血管组织、皮组织等通常统称为软组织。韧带为特殊的结缔软组织，其连接不同的器官或组织且使骨和骨接附。在后者情况下，韧带由于足够柔韧以使骨自然运动而为关节提供稳定性，但同时是强壮且不能延伸的以防止对所施加的力产生抵抗。肌腱连接肌肉与骨并能够承受张力。此外，肌腱被动调节运动过程中的力，这提供额外的稳定性而无需主动工作。它们的弹性使肌腱能够高效储存并回收能量。在肌腱和韧带中，胶原纤维束嵌入由蛋白聚糖组分构成的连接矩阵。这些胶原纤维束提供承载元件。在肌腱中，胶原纤维以几乎平行的形式排列，由此使它们能够承受单向高载量。在韧带中，胶原纤维以较不平行的形式排列，由此使它们能够承受一个方向上的主要张力及其它方向上的较小张力。
每年数十万人发生韧带扭伤、撕裂或断裂，特别是在膝盖、肩膀及踝中，或遭受上肢和下肢肌腱损伤，特别是在肩膀、膝盖、足和踝中。经常受到这些类型的损伤的影响的一种韧带为膝盖的前交叉韧带(ACL)。ACL用作前胫骨平移的主要稳定结构且用作膝盖外翻内翻角度的次要稳定结构且通常由于与运动损伤和交通事故相关的屈曲-旋转-外翻力而易发生断裂或撕裂。断裂或撕裂通常导致：严重的运动受限；疼痛和不适；及不能参与运动和锻炼。仅在美国每年就有超过200,000人发生ACL撕裂或断裂，这导致用于ACL再造手术和全面康复的开支为约30亿美元。通常已知的是ACL具有差的治愈能力。当ACL遭受导致关节不稳定的严重撕裂或断裂时，需要全面的手术置换和再造。最常见的措施为通过将撕裂的韧带用患者自身的组织替换而对撕裂的ACL进行再造(也称为自体移植)。用于替换韧带的其它选择包括来自另一个生命体的供体组织(也称为同种异体移植)及合成移植。
使用胶原纤维、生物可降解聚合物和复合材料对软组织破损进行的再造已与由蛋白质、水凝胶或胶原构成的三维支架一起使用。然而，所有这些措施通常都需要某种形式的缝合。
消除对缝合的需要且避免旁系组织损伤的手术技术就显微外科修复韧带、肌腱、血管和神经而言是未完成的目标。置于精细结构例如韧带和肌腱中的缝线不可避免地引起持续的问题。例如，永久性缝线的存在导致在修复部位发生包括炎症和瘢痕化在内的免疫反应。缝线材料还产生内皮不规则及由此产生血栓形成作用。此外，缝线的存在与其它封闭技术相比不提供瞬时防水密封，如相对低的渗漏点压力所示。
为了克服对缝合修复韧带、肌腱、血管、神经等的一些限制，研究人员先前已使用了环、夹子、胶水和激光焊接。这些方法学中的一些参见Zeebregts等人(2003),Br J Surg；90:261-271；然而，所有这些可选方法都具有与明显异物反应或相关组织损伤相关的显著缺点，这已阻止了广泛的临床使用。
激光辅助修复已成为25年多以来的研究主题且涉及递送激光能量以加热修复部位以实现“焊接”(Wolf-de Jonge等人(2004),Eur J Vasc Endovasc Surg.,27:466-476)。自20世纪70年代末已出现大量关于使用氩气、CO2、近红外二极管和Nd:YAG激光对组织进行焊接的报道(参见例如Gelli等人(1997),J.Reconstr.Microsurg.,13:199-205；Jain和Gorisch(1979),Surgery,85:684-688；Lewis和Uribe(1993),Laryngoscope,103:850-853；Neblett等人(1986),Neurosurgery,19:914-934；Samonte和Fried(1991),Lasers SurgMed.,11:511-516；Serure等人(1983),Surg.Forum,34:634-636；Tang等人(1994),LasersSurg Med.,14:229-237；Vale等人(1986),Plast.Reconstr.Surg.,77:759-766)。在这些及许多其它报道中，激光能量转化为热以使局部组织温度升高且使细胞外基质蛋白变性，由此实现组织焊接和修复。
尽管激光焊接有很多理论益处，但所述技术尚未在临床上使用。原因有很多，但加热组织必然引起损伤且由此尚未实现在临床领域中的使用而无视在激光焊接领域中的所有临床前研究。
因此，仍需要对软组织缺损包括肌腱组织缺损、韧带组织缺损、血管组织缺损、皮组织缺损等进行修复的方法，其减轻就使用支架和缝合所出现的问题或至少在克服以上问题中发挥作用。
发明内容
在第一方面，本申请提供修复软组织缺损的无缝合方法，所述方法包括：
(i)提供适于包围至少部分所述软组织缺损的含有胶原的贴剂；
(ii)使所述软组织缺损和/或含有胶原的贴剂与致敏剂接触；
(iii)将所述软组织缺损包围在所述含有胶原的贴剂中以形成生物活性腔；和
(iv)使所述含有胶原的贴剂粘附于所述软组织缺损而不进行缝合。
在一些实施方案中，软组织缺损存在于选自以下的软组织中：韧带组织、肌腱组织、静脉组织、动脉组织和神经管组织。在一些实施方案中，软组织缺损存在于韧带例如前交叉韧带(ACL)中。
本领域技术人员在已阅读本说明书通篇后将认识到的是，致敏剂具有以下作用：由放射线或光线吸收能量且将能量传递至含有胶原的贴剂和/或软组织以使含有胶原的贴剂粘附或“焊接”于所处理的软组织。
可用于本申请的致敏剂的非穷举性实例包括苯乙酮类、二苯甲酮类、萘类、双乙酰、曙红、玫瑰红、芘类、蒽类、吩噻嗪类等。在一些实施方案中，致敏剂为玫瑰红。
含有胶原的贴剂优选具有以下性质：
a)以有利于组织整合和血管化的方式相互连接的孔；
b)使正常组织最终替换支架的生物可降解性和/或生物可再吸收性；
c)促进细胞粘附、增殖和分化的表面化学；
d)强度和柔性；和
e)低抗原性。
含有胶原的贴剂包含大于80％的I型胶原。在其它实施方案中，含有胶原的贴剂包含至少85％的I型胶原。在其它实施方案中，含有胶原的贴剂包含大于90％的I型胶原。
含有胶原的贴剂中的胶原纤维或束包含编织结构。本申请使用的术语“编织结构”是指包含第一和第二组纤维或束的结构，其中第一组中的纤维或束主要在第一方向上延伸且第二组中的纤维或束主要在第二方向上延伸，其中第一和第二方向彼此不同且第一组中的纤维或束与第二组中的纤维或束交错或以其它方式编织。方向上的不同可为约90°。
在一些实施方案中，含有胶原的贴剂所具有的最大拉伸负荷强度大于20N。在一些实施方案中，本申请含有胶原的贴剂所具有的最大拉伸负荷强度大于25N、40N、60N、80N、100N、120N或140N。
在一些实施方案中，含有胶原的贴剂所具有的模量大于100MPa。在其它实施方案中，含有胶原的贴剂所具有的模量大于200MPa、300MPa、400MPa或500MPa。
在一些实施方案中，含有胶原的贴剂在最大负荷时所具有的延伸小于原始长度的85％。
最重要的是，本申请含有胶原的贴剂的厚度必须足以为正在修复的软组织提供支撑；然而，又不能过厚以使所述含有胶原的贴剂与所述软组织粘附的能力受损。因此，在一些实施方案中，含有胶原的贴剂的厚度为25μm至200μm。在一些实施方案中，含有胶原的贴剂的厚度为30μm至180μm。在其它实施方案中，含有胶原的贴剂的厚度为35μm至170μm。在其它实施方案中，含有胶原的贴剂的厚度为40μm至160μm。在其它实施方案中，含有胶原的贴剂的厚度为45μm至150μm。在其它实施方案中，含有胶原的贴剂的厚度为50μm至140μm。在其它实施方案中，含有胶原的贴剂的厚度为50μm至100μm。最后在一些实施方案中，含有胶原的贴剂的厚度为约50μm。
在一些实施方案中，含有胶原的贴剂通过使所述贴剂成形来调整以提供较好方式的原位处理。在一些实施方案中，含有胶原的贴剂对应于图2所示的含有胶原的贴剂。
本领域技术人员将认识到的是，含有胶原的贴剂可使用多种技术来制备。在一些实施方案中，含有胶原的贴剂如下制备：
(i)分离含有胶原的组织并使其在乙醇溶液中温育；
(ii)使来自步骤(i)的含有胶原的组织在包含无机盐和阴离子表面活性剂的第一溶液中温育以使其所含有的非胶原蛋白变性；
(iii)使在步骤(ii)中产生的含有胶原的组织在包含无机酸的第二溶液中温育直到所述物质中的胶原变性；和
(iv)在同时进行机械刺激的情况下使在步骤(iii)中产生的含有胶原的组织在包含无机酸的第三溶液中温育足以使所述含有胶原的组织中的胶原束能够对齐的时间；
其中所述机械刺激包括将张力循环施加于所述含有胶原的组织。
在第二方面，本申请提供用于无缝合修复软组织的含有胶原的贴剂，其中所述贴剂的厚度为25μm至200μm，所述贴剂包含大于90％的I型胶原，所述贴剂所具有的最大拉伸负荷强度大于100N，所述贴剂所具有的模量大于200MPa且所述贴剂能够包围所述软组织以形成生物活性腔。
在一些实施方案中，用于无缝合修复软组织的含有胶原的贴剂如下产生：
(i)分离含有胶原的组织并使其在乙醇溶液中温育；
(ii)使来自步骤(i)的含有胶原的组织在包含无机盐和阴离子表面活性剂的第一溶液中温育以使其所含有的非胶原蛋白变性；
(iii)使在步骤(ii)中产生的含有胶原的组织在包含无机酸的第二溶液中温育直到所述物质中的胶原变性；和
(iv)在同时进行机械刺激的情况下使在步骤(iii)中产生的含有胶原的组织在包含无机酸的第三溶液中温育足以使所述含有胶原的组织中的胶原束能够对齐的时间；
其中所述机械刺激包括将张力循环施加于所述含有胶原的组织。
在第三方面，本申请提供修复前交叉韧带(ACL)部分或完全撕裂的方法，所述方法包括：
(i)提供适于包围至少部分所述ACL的含有胶原的贴剂；
(ii)使所述ACL和/或含有胶原的贴剂与致敏剂接触；
(iii)将所述ACL包围在所述含有胶原的贴剂中以形成生物活性腔；和
(iv)使所述含有胶原的贴剂粘附于所述ACL而不进行缝合。
本领域技术人员将认识到的是，使本申请含有胶原的贴剂粘附于软组织的步骤可为本领域已知的任何方法，包括使用激光所发射的光能或射频(“RF”)能量对组织进行“焊接”的组织焊接方法。可使用其它非缝合粘附方式例如生物相容性胶水例如纤维蛋白胶水或PLA/PLG聚合物。
在一些实施方案中，通过使用激光对组织进行焊接使含有胶原的贴剂粘附于软组织。激光的最佳脉冲长度将由本领域技术人员确定；然而，例如可使用33-600ms脉冲历时1-6分钟来粘附厚度为100μm的含有胶原的贴剂。
附图说明
图1的扫描电子显微镜图像显示了通过实施例1的方法制备的含有胶原的贴剂的表面形态。可观察到贴剂具有两种不同的表面：特征为压实胶原束的平滑表面(A)和松散胶原纤维的粗糙多孔表面(B)。比例尺：500μm。
图2显示了通过本申请方法产生的胶原膜的扫描电子显微镜(SEM)图像(×100)。
图3显示了本申请贴剂的“蝶状”排列。
具体实施方式
除非另有定义，本申请使用的所有术语(包括技术和科学术语)具有与本申请所属领域的技术人员所通常理解相同的含义。还将理解的是，术语例如常用字典所定义的那些术语应当被解释为具有与其在本说明书和相关领域中的含义一致的含义且不应当以理想化或过于形式的方式被解释，除非本申请明确如此定义。出于简要和/或清楚的目的而可能没有对众所周知的功能或构造进行详细描述。
本申请使用的术语学仅用于描述具体实施方案的目的而不意在限制本申请。本申请使用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”意在同时包括复数形式，除非上下文另有明确说明。还将理解的是，本说明书使用的术语“包含”和/或“包括”是指存在所描述的特征、整数、步骤、操作、要素和/或组分，但不排除存在或添加一个或多个其它特征、整数、步骤、操作、要素、组分和/或其组合。本申请使用的术语“和/或”包括一个或多个相关所列项目中的任何一个和各种组合。本申请使用的短语例如“在X和Y之间”及“在约X和Y之间”应当被解释为包括X和Y。本申请使用的短语例如“在约X和Y之间”是指“在约X和约Y之间”。本申请使用的短语例如“约X至Y”是指“约X至约Y”。
本申请记载的数值范围明确包括在所述范围之间的具有相同精度的每个插入数值。例如，范围6-9除6和9外还包括数值7和8且范围6.0-7.0明确包括数值6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。
本申请使用的术语“约”是指该术语后的数值向上或向下偏离10％。例如，当提及厚度为约50μm的含有胶原的贴剂时，包括在45μm和55μm之间的范围即数值50μm向上或向下10％。其包括45μm、46μm、47μm、48μm、49μm、50μm、51μm、52μm、53μm、54μm和55μm。
将理解的是，在本申请方法中描述的操作(或步骤)的顺序不限于在权利要求书或附图中呈现的次序，除非另有明确说明。
在最可能宽的方面，本申请涉及使用含有胶原的贴剂来修复软组织。
本申请使用的术语“胶原”是指所有形式的胶原，包括已加工或以其它方式修饰的那些胶原。优选的胶原被处理以除去免疫原性端肽区(“无端肽胶原”)，为可溶的且被再造为纤维形式。I型胶原最适于最广泛的应用，包括韧带组织、肌腱组织、静脉组织或神经组织修复。然而，与I型胶原组合的其它形式的胶原也可用于实施本申请且不被本申请排除。
术语“贴剂”是指一片或一段含有胶原的组织，其通过本申请公开的方法产生且可将其置于和/或粘附于软组织缺损或软组织缺损部位以修复所述组织。贴剂可为任何几何形状，但通常为基本上平面的且可在原位符合下方或上方组织的形状。
含有胶原的贴剂优选具有以下性质：
a)以有利于组织整合和血管化的方式相互连接的孔；
b)使正常组织最终替换支架的生物可降解性和/或生物可再吸收性；
c)促进细胞粘附、增殖和分化的表面化学；
d)强度和柔性；和
e)低抗原性。
含有胶原的贴剂通常由在任何哺乳动物中发现的包含致密结缔组织的“含有胶原的组织”制备或生产。术语“含有胶原的组织”是指可由含有胶原的哺乳动物体分离的皮肤、肌肉等。术语“含有胶原的组织”还包括“以合成方式”产生的组织，其中的胶原或含有胶原的物质已在体外组装或制备。
在一些实施方案中，含有胶原的组织由哺乳动物分离，包括但不限于羊、牛、猪或人类。在其它实施方案中，含有胶原的组织由人类分离。
在一些实施方案中，含有胶原的组织为“自体的”即由需要治疗的患者的身体分离。
在一些实施方案中，含有胶原的贴剂包含大于80％的I型胶原。在其它实施方案中，含有胶原的贴剂包含至少85％的I型胶原。在其它实施方案中，含有胶原的贴剂包含大于90％的I型胶原。
含有胶原的贴剂可通过本领域已知的任何方法制备；然而，一种优选的方法包括以下步骤：
(i)分离含有胶原的组织并使其在乙醇溶液中温育；
(ii)使来自步骤(i)的含有胶原的组织在包含无机盐和阴离子表面活性剂的第一溶液中温育以使其所含有的非胶原蛋白变性；
(iii)使在步骤(ii)中产生的含有胶原的组织在包含无机酸的第二溶液中温育直到所述物质中的胶原变性；和
(iv)在同时进行机械刺激的情况下使在步骤(iii)中产生的含有胶原的组织在包含无机酸的第三溶液中温育足以使所述含有胶原的组织中的胶原束能够对齐的时间；
其中所述机械刺激包括将张力循环施加于所述含有胶原的组织。
将认识到的是，任何无机盐都可用于第一溶液，只要其能够与路易斯酸形成络合物。在一些实施方案中，无机盐选自三甲基氯化铵、四甲基氯化铵、氯化钠、氯化锂、高氯酸盐和三氟甲磺酸盐。在其它实施方案中，无机盐为氯化锂(LiCl)。
尽管多种阴离子表面活性剂可用于第一溶液，但在一些实施方案中，阴离子表面活性剂选自烷基硫酸盐、烷基醚硫酸盐、烷基磺酸盐和烷基芳基磺酸盐。特别有用的阴离子表面活性剂包括烷基硫酸盐例如十二烷基硫酸钠(SDS)。
在一些实施方案中，第一溶液包含约1％(v/v)SDS和约0.2％(v/v)LiCl。
在一些实施方案中，第二溶液中的无机酸包括约0.5％(v/v)HCl，而第三溶液中的无机酸包括约1％(v/v)HCl。
本领域技术人员将认识到的是，所述三个步骤各自的温育期将随以下而变化：(i)含有胶原的组织的类型；(ii)无机盐/酸和/或阴离子表面活性剂的类型；(iii)所使用的每种无机盐/酸和/或阴离子表面活性剂的强度(浓度)；和(iv)温育的温度。在一些实施方案中，步骤(i)的温育期为至少8小时。在其它实施方案中，步骤(ii)的温育期小于60分钟，而在其它实施方案中，步骤(iii)的温育期为至少20小时。
在一些实施方案中，步骤(ii)的温育在约4℃进行。在其它实施方案中，步骤(ii)的温育进行至少12小时。
在一些实施方案中，第二溶液包含约0.5％(v/v)HCl。
在一些实施方案中，步骤(iii)的温育进行约30分钟。在其它实施方案中，步骤(iii)的温育在振荡下进行。
在一些实施方案中，第三溶液包含约1％(v/v)HCl溶液。
在一些实施方案中，步骤(iv)的温育进行约12至36小时，优选约24小时。在其它实施方案中，步骤(iv)的温育在振荡下进行。
在一些实施方案中，本申请方法还包括在步骤(iii)和步骤(iv)之间的中和步骤，其包括使含有胶原的组织与约0.5％(v/v)NaOH一起温育。
在一些实施方案中，本申请方法还包括步骤(v)，其包括使来自步骤(iv)的含有胶原的组织与丙酮一起温育，然后干燥含有胶原的组织。
在一些实施方案中，本申请方法还包括在步骤(ii)和(iii)之间和/或在步骤(iii)和(iv)之间的以下步骤：使含有胶原的组织与甘油接触以使脂肪和/或血管可视化并有助于其除去。
可使甘油与含有胶原的组织接触有助于除去脂肪和/或血管的任何时长。在一些实施方案中，接触时间为至少10分钟。
在一些实施方案中，本申请方法还包括在步骤(ii)和(iii)之间和/或在步骤(iii)和(iv)之间针对含有胶原的组织的洗涤步骤。在步骤(ii)和(iii)之间使用洗涤步骤的目的是为了除去变性蛋白。因此，可使用能够除去变性蛋白的任何洗涤溶液。在一些实施方案中，在步骤(ii)和(iii)之间使用的洗涤溶液为丙酮。
用丙酮洗涤后，含有胶原的组织进一步用无菌水洗涤。
在一些实施方案中，含有胶原的组织进一步在NaOH:NaCl溶液中洗涤。若含有胶原的组织用NaOH:NaCl洗涤，则其然后优选用无菌水洗涤。
在一些实施方案中，含有胶原的组织在步骤(iv)后进一步用第一溶液洗涤。
本申请所述方法使用的术语“同时进行机械刺激”是指在对含有胶原的组织进行化学加工期间使所述含有胶原的组织拉伸的措施。含有胶原的组织可经历静态和/或循环拉伸。因此，在一些实施方案中，同时进行机械刺激可包括：
(i)在预设时段内使所述含有胶原的组织拉伸；
(ii)在预设时段内使所述含有胶原的组织松弛；和
(iii)将步骤(i)和(ii)重复n次，其中n为大于或等于1的整数。
若机械刺激通过使含有胶原的组织拉伸来进行，则优选沿其长轴使所述含有胶原的组织拉伸。
在一些实施方案中，同时进行机械刺激包括将张力循环施加于含有胶原的组织，其中张力周期包括约10秒至约20秒的拉伸期及约10秒的松弛期且由此产生的应变为约10％且连续进行机械刺激直到所述含有胶原的组织中的胶原束如本申请所述那样对齐。
产生后，含有胶原的组织包含具有编织结构的胶原纤维或束。本申请使用的术语“编织结构”是指包含第一和第二组纤维或束的结构，其中第一组中的纤维或束主要在第一方向上延伸且第二组中的纤维或束主要在第二方向上延伸，其中第一和第二方向彼此不同且第一组中的纤维或束与第二组中的纤维或束交错或以其它方式编织。方向上的不同可为约90°。
通过优选方法制备的含有胶原的组织所具有的“最大拉伸负荷强度”大于20N。在一些实施方案中，本申请含有胶原的组织所具有的最大拉伸负荷强度大于25N、40N、60N、80N、100N、120N或140N。
还据信含有胶原的组织中的编织结构使所述含有胶原的贴剂在最大负荷时的延伸得以减小同时使模量得以增加。
本申请使用的术语“模量”是指杨氏模量(Young’s Modulus)且被确定为应力与应变的比例。这可度量含有胶原的组织和/或贴剂的刚度。
在一些实施方案中，含有胶原的组织所具有的模量大于100MPa。在其它实施方案中，含有胶原的组织所具有的模量大于200MPa、300MPa、400MPa或500MPa。
本申请使用的术语“在最大负荷时的延伸”是指含有胶原的组织在最大拉伸负荷强度时与含有胶原的组织在无负荷的条件下的原始长度相比的延伸。这与最大延伸是不同的，后者更大。
在一些实施方案中，含有胶原的组织在最大负荷时所具有的延伸小于原始长度的85％。
产生含有胶原的组织后，可使其成形为含有胶原的贴剂以供使用。在一些实施方案中，含有胶原的贴剂通过使所述贴剂成形来调整以提供较好方式的原位处理。在一些实施方案中，含有胶原的贴剂对应于图3所示的含有胶原的贴剂。
最重要的是，本申请含有胶原的贴剂的厚度必须足以为正在修复的软组织提供支撑；然而，又不能过厚以使所述含有胶原的贴剂与所述软组织粘附的能力受损。因此，在一些实施方案中，含有胶原的贴剂的厚度为25μm至200μm。在一些实施方案中，含有胶原的贴剂的厚度为30μm至180μm。在其它实施方案中，含有胶原的贴剂的厚度为35μm至170μm。在其它实施方案中，含有胶原的贴剂的厚度为40μm至160μm。在其它实施方案中，含有胶原的贴剂的厚度为45μm至150μm。在其它实施方案中，含有胶原的贴剂的厚度为50μm至140μm。在其它实施方案中，含有胶原的贴剂的厚度为50μm至100μm。最后在一些实施方案中，含有胶原的贴剂的厚度为约50μm。
本申请实施方案大体上涉及含有胶原的贴剂，其特别适于在哺乳动物或人类患者中修复软组织缺损。患者除人类外还可为灵长类、马类、犬类或猫科动物。因此，在使用中将含有胶原的贴剂施用于待治疗的患者的软组织缺损或缺损部位以使其包围所述缺损。术语“组织缺损”或“组织缺损部位”是指肌腱、韧带、静脉/动脉或神经管的上皮或组织的破损。组织缺损使组织性能处于亚适水平或使组织处于亚适状态。例如，组织缺损可为肌腱或韧带中部分厚度或全部厚度的撕裂。组织缺损可呈“空隙”构造，其被理解为是指三维缺陷例如缺口、腔隙、孔洞或上皮或组织结构完整性的其它实质性破损。在一些实施方案中，组织缺损使其不能内源性或自发性修复。组织缺损可为事故、疾病和/或手术操作所导致的结果。
术语“包围”是指含有胶原的贴剂基本上包封组织缺损部位以在所述贴剂下且在所述组织缺损上形成生物活性腔。术语“生物活性腔”是指在含有胶原的贴剂和组织缺损表面之间的空间。在该空间内，内源细胞或在一些实施方案中引入的细胞、药理学活性剂等被包含在组织缺损部位中，由此能够进行细胞和组织修复。
本申请使用的术语“修复”或其语法等同形式包括修复哺乳动物优选人类中的组织缺损。“修复”是指所形成的新组织足以至少部分填充组织缺损部位的空隙或结构不连续性。然而，修复不是指或不必然是就使组织缺损恢复至其缺损前生理学/结构/机械状态而言100％有效的完全治愈或治疗过程。
在一些实施方案中，将含有胶原的贴剂施用于组织缺损前或将含有胶原的贴剂施用于组织缺损后，使含有胶原的贴剂和/或组织缺损或缺损部位与致敏剂接触。致敏剂具有以下作用：由放射线或光线吸收能量且将能量传递至含有胶原的贴剂和/或软组织以使含有胶原的贴剂粘附或“焊接”于所处理的软组织。
可用于本申请的致敏剂的非穷举性实例包括苯乙酮类、二苯甲酮类、萘类、双乙酰、曙红、玫瑰红、芘类、蒽类、吩噻嗪类等。在一些实施方案中，致敏剂为玫瑰红(4,5,6,7-四氯-2’,4’,5’,7’-四碘荧光素)。
将含有胶原的贴剂施用于组织缺损后，本领域技术人员例如整形外科医生通过使所述贴剂粘附于所述软组织缺损而将所述贴剂固定在患者的缺损部位。含有胶原的贴剂与缺损部位的这种粘附提供本申请所述生物活性腔，其促进细胞生长和正在治疗的组织的治愈。粘附方式的实例包括但不限于生物相容性胶水、组织焊接及其组合。
生物相容性胶水可选自但不限于明胶、海藻酸、琼脂糖、淀粉、纤维蛋白、胶原、层粘连蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白、蛋白聚糖和/或糖胺聚糖例如硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素和/或硫酸角质素、酪蛋白、葡聚糖、焦糖、果胶、角叉菜胶和黄原胶。可用于本申请的生物相容性胶水的非限制性实例为纤维蛋白粘合剂，其由Oesterreichisches Institut FuerHaemoderivate G.M.B.H.,Vienna,Austria制造并由Baxter Healthcare Corporation,Glendale,Calif.以商品名TISSEELTM销售。可替换生物相容性胶水或除生物相容性胶水外还可使用的其它粘附方式的非限制性实例包括组织焊接，参见例如Helmsworth,T.F.等人,Laser Surgery Medicine 10:576-583,1990。还可使用生物相容性或生物可吸收性材料例如但不限于PLA/PLG聚合物。
可使含有胶原的贴剂粘附于软组织缺损的一种方法为通过光化学组织粘结(PTB)即光驱动方法学的一种替换方法，其依赖于化学能而非热能来密封组织(Chan等人(2005),J Surg Res；124:274-279；Chan等人(2002)J Surg Res；108:77-84；Kamegaya等人(2005)Lasers Surg Med；37:264-270；Mulroy等人(2000)Invest Ophthalmol Vis Sci；41:3335-3340；Proano等人(2004)J Cataract Refract Surg；30:2420-2424；Proano等人(2004)Invest Ophthalmol Vis Sci；45:2177-2181)。PTB使用可见光和光反应性染料的组合以在组织表面之间进行直接粘结和紧密密封。不需要任何其它添加剂。染料对光的吸收导致反应性中间体的产生，其在所粘合的组织表面上的分子之间引起交联反应(Lambert和Kochevar(1997)Photochem Photobiol.,66:15-25)。尽管确切的作用机制是不清楚的，但已证实可使用光化学方法使I型胶原发生化学交联。PTB通过光化学机制发生且通常以比激光焊接低很多的能量进行。其不涉及加热组织且由此可提供激光修复的所有优点同时避免热损伤后遗症。
可用于暴露的放射线的实例包括远紫外线，例如汞灯亮线谱(波长：254nm)、KrF准分子激光(波长：248nm)、ArF准分子激光(波长：193nm)、F2准分子激光(波长：157nm)和EUV(波长：13nm)等；X射线，例如同步加速器放射线；带电粒子射线，例如电子束等。放射线优选为远紫外线和带电粒子射线。更优选地，放射线为KrF准分子激光(波长：248nm)、ArF准分子激光(波长：193nm)、F2准分子激光(波长：157nm)和电子束。
激光用于为含有胶原的贴剂提供均匀照明。激光优选是脉冲的以使附近软组织热损伤区域最小化。选择激光波长以使所述激光被致敏剂吸收。能量使贴剂和相邻软组织表面上的薄层升温，这使所述贴剂粘结或“焊接”于所述软组织表面。贴剂作为连接组织的手段。贴剂上的致敏剂薄层使损伤区域最小化，这是因为处于贴剂-软组织界面的该薄层优先吸收激光能量且被加热。因此，致敏剂薄层对于渗透有致敏剂的贴剂是优选的。
生物相容性胶水层也可存在于贴剂上以促进或加强粘结，或在暴露于激光后发生聚合的化学物质可用于形成与软组织表面的机械粘结。除经涂敷的贴剂外或为了替换经涂敷的贴剂，也可将致敏剂层或生物相容性胶水层或聚合物层直接施用于软组织表面，尽管用化学层对贴剂进行涂敷可能是较容易的。
贴剂或软组织表面通常具有致敏剂层或生物相容性胶水层且在传递激光并被贴剂吸收时使贴剂焊接于软组织缺损。
必须小心地选择用于焊接贴剂的激光的脉冲结构以最小化或防止对所焊接的软组织的损伤。带有温度反馈的脉冲激光照射对血管内贴剂焊接的作用已使用计算机模拟来研究。参见Glinsky等人,“Computer modeling of endovascular patch welding usingtemperature feedback”,Proceedings of Medical Applications of Lasers III,Vol.2623,pp.349-358(1995)和Glinsky等人,“Modeling of endovascular patchwelding using the computer program LATIS”,Proceedings of Laser-TissueInteraction IV,Vol.2391,pp.262-272(1995)。这些研究(通过引用的方式并入本申请)显示可使用脉冲激光照射来控制损伤区域。
最佳脉冲长度使将贴剂焊接于软组织缺损所需要的总体处理时间最小化同时保持受损组织的厚度小于100μm。
在本申请各个实施方案中，通过使含有胶原的贴剂与软组织缺损粘附而产生的生物活性腔可包含一种或多种药理学活性剂。本申请使用的“药理学活性剂”通常是指在引入宿主后具有直接或间接有益治疗作用的药理学活性剂。可适用于本申请的药理学活性剂的代表性实例包括：
抗高血压药，例如肼屈嗪、米诺地尔、卡托普利、依那普利、可乐定、哌唑嗪、异喹胍、二氮嗪、胍乙啶、甲基多巴、利舍平、曲美芬；
钙通道阻断剂，例如地尔硫非洛地平、氨氯地平、尼群地平、硝苯地平和维拉帕米；
抗心律失常药，例如胺碘酮、氟卡尼、丙吡胺、普鲁卡因胺、美西律和奎尼丁；
抗心绞痛药，例如甘油三硝酸酯、丁四醇四硝酸酯、戊四醇四硝酸酯、甘露醇六硝酸酯、派克昔林、异山梨醇二硝酸酯和尼可地尔；
β-肾上腺素能阻断剂，例如阿普洛尔、阿替洛尔、布拉洛尔、卡替洛尔、拉贝洛尔、美托洛尔、纳多洛尔、萘肟洛尔、奥普洛尔、吲哚洛尔、普萘洛尔、索他洛尔、噻吗洛尔和马来酸噻吗洛尔；
肾上腺素能兴奋剂，例如肾上腺素、麻黄碱、非诺洛尔、异丙肾上腺素、奥西那林、rimeterol、沙丁胺醇、沙美特罗、特布他林、多巴酚丁胺、去氧肾上腺素、苯丙醇胺、伪麻黄碱和多巴胺；
血管扩张剂，例如环扁桃酯、异舒普林、罂粟碱、二嘧啶醇、异山梨醇二硝酸酯、酚妥拉明、烟醇、双氢麦角碱、烟酸、甘油三硝酸酯、戊四醇四硝酸酯和羟丙茶碱；
抗增殖剂，例如紫杉醇、放线菌素D、西罗莫司、他克莫司、依维莫司和地塞米松；
抗凝血剂和血栓溶解剂，例如华法林、双香豆素、低分子量肝素例如依诺肝素、链激酶及其活性衍生物；
止血剂，例如抑肽酶、氨甲环酸和鱼精蛋白；
镇痛药和解热药，包括阿片类镇痛药例如丁丙诺啡、右吗拉胺、右丙氧芬、芬太尼、阿芬太尼、舒芬太尼、氢吗啡酮、美沙酮、吗啡、羟考酮、阿片全碱、喷他佐辛、哌替啶、苯哌利定、可待因、二氢可待因、乙酰水杨酸(阿司匹林)、对乙酰氨基酚和安替比林；
免疫抑制剂、抗增殖剂和细胞抑制剂，例如雷帕霉素(西罗莫司)及其类似物(依维莫司和他克莫司)；
非甾体抗炎剂，包括其外消旋混合物或单独的对映异构体(适用时)，其优选可与真皮和/或粘膜渗透促进剂组合配制，例如布洛芬、氟比洛芬、酮洛芬、醋氯芬酸、双氯芬酸、阿洛普令、萘普生、阿司匹林、二氟尼柳、非诺洛芬、吲哚美辛、甲芬那酸、萘普生、保泰松、吡罗昔康、水杨酰胺、水杨酸、舒林酸、脱氧舒林酸、替诺昔康、曲马多、酮咯酸、氟芬尼酸、双水杨酯、水杨酸三乙醇胺、氨基比林、安替比林、羟布宗、阿扎丙宗、辛喷他宗、氟芬那酸、clonixerl、氯尼辛、甲氯芬那酸、氟尼辛、秋水仙碱、秋水仙胺、别嘌醇、羟嘌呤醇、盐酸苄达明、二甲法登、吲哚克索、吲四唑、盐酸米姆本、盐酸瑞尼托林、四氢甲吲胺、盐酸苯吲吡林、氟洛芬、异丁芬酸、萘普索、芬布芬、辛可芬、二氟米酮钠、非那莫、氟替阿嗪、美他扎咪、盐酸来替米特、盐酸萘西利定、奥他酰胺、吗林那宗、新辛可芬、尼莫唑、枸橼酸普罗沙唑、替昔康、苄叉异喹酮、托美丁和三氟米酯；
抗微生物剂，包括头孢菌素类，例如头孢氨苄、头孢噻吩和头孢噻吩；
青霉素类，例如阿莫西林、阿莫西林与克拉维酸、氨苄西林、巴氨西林、苄星青霉素、苄青霉素、羧苄西林、氯唑西林、甲氧西林、苯氧乙基青霉素、苯氧甲基青霉素、氟氯西林、美洛西林、哌拉西林、替卡西林和阿洛西林；
四环素类，例如米诺环素、金霉素、四环素、地美环素、多西环素、美他环素和土霉素及其它四环素类抗生素；
氨基糖苷类，例如阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星和妥布霉素；
抗真菌剂，例如阿莫罗芬、异康唑、克霉唑、益康唑、咪康唑、制霉菌素、特比萘芬、联苯苄唑、两性霉素、灰黄霉素、酮康唑、氟康唑和氟胞嘧啶、水杨酸、非扎硫酮、替克拉酮、托萘酯、三醋汀、巯氧吡啶和巯氧吡啶钠；
喹诺酮类，例如萘啶酸、西诺沙星、环丙沙星、依诺沙星和诺氟沙星；
磺胺类，例如酞磺胺噻唑、磺胺多辛、磺胺嘧啶、磺胺甲噻二唑和磺胺甲基异噁唑；
砜类，例如氨苯砜；
其它各种抗生素，例如氯霉素、克林霉素、红霉素、红霉素碳酸乙酯、依托红霉素、葡庚糖酸红霉素、琥乙红霉素、乳糖酸红霉素、罗红霉素、林可霉素、那他霉素、呋喃妥因、大观霉素、万古霉素、氨曲南、粘菌素IV、甲硝唑、替硝唑、夫西地酸、甲氧苄啶和2-硫吡啶N-氧化物、卤素化合物且具体为碘和碘化合物例如碘-PVP络合物和双碘喹啉、六氯酚、氯己定、氯胺化合物和过氧化苯甲酰。
本领域技术人员在考虑以下参数且参考众所周知的资料例如Physicians’DeskReferenceTM:PDR--第52版(1998)--Medical Economics 1974后可容易地确定上述一种或多种药理学活性剂的有效量，所述参数为例如所选择的具体药理学活性剂、患者的身形和体重、所预期的疗效、所选择的药理学活性剂的药代动力学等。
以上出于说明和描述的目的而对本申请优选实施方案进行了描述而非意在是穷举性的或将本申请限于所公开的精确形式。许多调整和变化在以上教导的基础上是可能的。
本申请参考或引用的所有专利、专利申请、临时申请和公开文本通过引用的方式完整并入本申请至不与本说明书的明确教导相矛盾的程度，包括所有附图和表格。
以下是对用于实施本申请的操作进行说明的实施例。这些实施例不应当被理解成是限制性的。
实施例1：用于制备胶原膜的方法
小心地分离来自猪内部器官衬里的胶原片段并置于包含约70％乙醇的溶液中并在室温短暂温育。然后在工作表面上将含有胶原的组织在脂肪侧朝上的情况下拉伸并尽可能多地除去脂肪组织和血管。
为了使所存在的脂肪组织可视化，含有胶原的组织用甘油涂敷约10分钟。此时胶原为透明的，但脂肪组织为白色的。在解剖显微镜下使用镊子将白色脂肪组织与胶原分离。
完成后，将含有胶原的组织小心地转移至密封容器中并在包含约1％(v/v)SDS和0.2％(v/v)LiCl的溶液中温育以使非胶原蛋白变性。温育在4℃留置过夜。
然后将含有胶原的组织在100％丙酮中小心地洗涤两次以除去变性的非胶原蛋白。然后将组织在200ml容器中以100RPM离心以温和地旋转分离来自含有胶原的组织的残留溶液、非胶原蛋白和核酸。
小心地取出含有胶原的组织并再次在膜SteripureTM水中洗涤3次。
有时还将含有胶原的组织在包含NaOH:NaCl的溶液中洗涤，然后将组织以100RPM离心90分钟。
然后将含有胶原的组织浸入0.5％(v/v)HCl并在振荡器上放置30分钟以使胶原变性。发现HCl浓度和温育时间是重要的以避免损伤所得组织的机械结构。
然后取出含有胶原的组织并再次在SteripureTM水中洗涤3次。
然后含有胶原的组织使用0.5％(v/v)NaOH来中和。在该阶段可初步测试所得含有胶原的组织的机械性质。
然后使用不锈钢框架使用机械力(压缩和延伸)对含有胶原的组织进行处理。含有胶原的组织被拉伸至合适的大小和厚度后，使所述组织在原位即在框架中变性即浸入包含1％(v/v)HCl的溶液。通常，将组织在以100RPM进行振荡的情况下温育22-25小时直到胶原纤维束对齐。
然后含有胶原的组织用水洗涤并用1％(v/v)SDS和0.2％(v/v)LiCl的混合物淋洗。
取决于最终用途，含有胶原的组织然后用甘油重新涂敷10分钟以使任何残留的脂肪组织可视化。如上所述，在解剖显微镜下使用镊子将剩余的白色脂肪组织与胶原分离。在该阶段还除去任何多余的胶原束以控制含有胶原的组织的厚度。
最后含有胶原的组织用丙酮处理并风干同时仍在框架中拉伸以使对齐的胶原束固定。然后将含有胶原的组织拉伸、压缩和/或卷起以产生平滑表面。然后检查成品胶原膜组织并使用激光切割机切割成一定尺寸。
进行SEM以表征胶原膜与其它类型的膜相比的表面形态。简言之，用厚度为5nm的铂对组织样品进行溅射镀膜(SEM涂敷单元,E1020,Hitachi Science Systems Ltd.,Japan)并在扫描电子显微镜(S260,Leica,Cambridge,England)下以低电压(20kV)观察两侧。
图1显示了通过本申请方法产生的胶原膜(本申请将TympacolTM称为ACS)与其它膜相比的表面形态。扫描电子显微镜显示了三个支架的表面形态(组A-C；×500,D；×200)。TympacolTM(在图1中称为ACS)具有两种不同的表面即特征为压实胶原束的平滑表面(组A)和松散胶原纤维的粗糙多孔表面(组B)。纸贴(膜)表面是不平整的且具有少量小孔(组C)。显示出大量具有不同尺寸的孔(组D)。比例尺：500μm。
图2显示了通过上述方法产生的胶原膜的扫描电子显微镜(SEM)图像(×100)。
实施例2：肌腱修复
使用50只12至20周龄的体重为3-5kg的白化新西兰白兔(Oryctolaguscuniculus)。所有兔子繁殖自保持在University of Western Australia(Nedlands,Australia)的动物房中的远系繁殖兔子群。兔子随意进食兔子/豚鼠粒料、干草且随意饮水。兔子待在宽为1.5m、长为0.75m且高为0.75m及具有格栅地板以预防足皮炎的笼中。所有手术操作及笼活动均在National Health and Medical Research Council(NHMRC,Canberra,Australia)所详细说明的严格指导下进行。
将50只兔子随机分配到两个25只组中且通过肌内注射氯胺酮(Parke-Davis,Auckland,NZ)和赛拉嗪(Troy Laboratories Australia)来麻醉。在左肩上进行纵切且肩袖肌腱的手术暴露通过由肩峰释放部分斜方肌和三角肌来完成。切断肩袖肌腱，由此产生软组织缺损。然后缺损通过(A)对肌腱切断端进行简单缝合或(B)本申请所述方法来修复。简言之，将0.1％(w/v)玫瑰红(Aldrich,Milwaukee,WI)在磷酸盐缓冲盐水中的溶液小心地施用于约5mm的切断肌腱外表面。如图3所示，将通过实施例1的方法制备的厚度为50μm的含有胶原的贴剂包裹围绕肌腱两端以使肌腱两端邻接(接触)且将缺损包围。然后将贴剂暴露于来自350mW Compass 415连续波长倍频Nd/YAG激光器(Coherent,Inc.,Santa Clara,CA,光斑大小为～1cm)的波长为532nm的照射度为～0.5W/cm2的绿光5分钟。选择该系统是因为激发波长被玫瑰红强烈吸收。其它激光参数可通过离体先导研究确定。肌腱再造后，将伤口封闭在层中并包扎，但肢没有用夹板固定。
在4周和8周时将兔子麻醉并通过静脉内注射戊巴比妥来处死。由两肩(手术处理或非手术处理)收集肱骨头、肩袖肌腱和部分肌肉。在松弛状态下用游标卡尺测量手术处理和非手术处理的肌腱的长度和宽度且用千分尺测量厚度。然后将样品在4％多聚甲醛中固定。固定后，样品用10％甲酸脱钙，脱水，用石蜡包埋，切成5μm切片并用苏木精、曙红和阿辛蓝染色。

Claims (17)

1.修复软组织缺损的无缝合方法，所述方法包括：
(i)提供适于包围至少部分所述软组织缺损的含有胶原的贴剂；
(ii)使所述软组织缺损和/或含有胶原的贴剂与致敏剂接触；
(iii)将所述软组织缺损包围在所述含有胶原的贴剂中以形成生物活性腔；和
(iv)使所述含有胶原的贴剂粘附于所述软组织缺损而不进行缝合。
2.修复韧带缺损的无缝合方法，所述方法包括：
(i)提供适于包围至少部分所述韧带缺损的含有胶原的贴剂，其中所述贴剂的厚度为25μm至200μm；
(ii)使所述韧带缺损和/或含有胶原的贴剂与玫瑰红接触；
(iii)将所述韧带缺损包围在所述含有胶原的贴剂中以形成生物活性腔；和
(iv)将所述含有胶原的贴剂暴露于来自激光器或光源的光以使其粘附于所述韧带缺损。
3.权利要求1或2的无缝合方法，其中所述含有胶原的贴剂通过包括以下的方法产生：
(i)分离含有胶原的组织并使其在乙醇溶液中温育；
(ii)使来自步骤(i)的含有胶原的组织在包含无机盐和阴离子表面活性剂的第一溶液中温育以使其所含有的非胶原蛋白变性；
(iii)使在步骤(ii)中产生的含有胶原的组织在包含无机酸的第二溶液中温育直到所述物质中的胶原变性；和
(iv)在同时进行机械刺激的情况下使在步骤(iii)中产生的含有胶原的组织在包含无机酸的第三溶液中温育足以使所述含有胶原的组织中的胶原束能够对齐的时间；
其中所述机械刺激包括将张力循环施加于所述含有胶原的组织。
4.权利要求1的方法，其中所述软组织缺损存在于选自以下的软组织中：韧带组织、肌腱组织、静脉组织、动脉组织和神经管组织。
5.权利要求2-4中任一项的方法，其中所述韧带缺损存在于前交叉韧带(ACL)中。
6.权利要求1的方法，其中所述致敏剂选自苯乙酮类、二苯甲酮类、萘类、双乙酰、曙红、玫瑰红、芘类、蒽类和吩噻嗪类。
7.权利要求1和3-6中任一项的方法，其中所述致敏剂为玫瑰红。
8.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述含有胶原的贴剂包含大于80％的I型胶原。
9.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述含有胶原的贴剂包含大于90％的I型胶原。
10.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述含有胶原的贴剂所具有的最大拉伸负荷强度大于25N。
11.权利要求1-10中任一项的方法，其中所述含有胶原的贴剂所具有的模量大于100MPa。
12.权利要求1-11中任一项的方法，其中所述含有胶原的贴剂在最大负荷时所具有的延伸小于原始长度的85％。
13.权利要求1-12中任一项的方法，其中所述含有胶原的贴剂的厚度为25μm至200μm。
14.权利要求1-12中任一项的方法，其中所述含有胶原的贴剂的厚度为约50μm。
15.用于无缝合修复软组织的含有胶原的贴剂，其中所述贴剂的厚度为25μm至200μm，所述贴剂包含大于90％的I型胶原，所述贴剂所具有的最大拉伸负荷强度大于100N，所述贴剂所具有的模量大于200MPa且所述贴剂能够包围所述软组织以形成生物活性腔。
16.权利要求15的含有胶原的贴剂，其中所述贴剂如下产生：
(i)分离含有胶原的组织并使其在乙醇溶液中温育；
(ii)使来自步骤(i)的含有胶原的组织在包含无机盐和阴离子表面活性剂的第一溶液中温育以使其所含有的非胶原蛋白变性；
(iii)使在步骤(ii)中产生的含有胶原的组织在包含无机酸的第二溶液中温育直到所述物质中的胶原变性；和
(iv)在同时进行机械刺激的情况下使在步骤(iii)中产生的含有胶原的组织在包含无机酸的第三溶液中温育足以使所述含有胶原的组织中的胶原束能够对齐的时间；
其中所述机械刺激包括将张力循环施加于所述含有胶原的组织。
17.修复前交叉韧带(ACL)部分或完全撕裂的方法，所述方法包括：
(i)提供适于包围至少部分所述ACL的含有胶原的贴剂；
(ii)使所述ACL和/或含有胶原的贴剂与致敏剂接触；
(iii)将所述ACL包围在所述含有胶原的贴剂中以形成生物活性腔；和
(iv)使所述含有胶原的贴剂粘附于所述ACL而不进行缝合。
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