CN107106487A - 药物的眼部递送 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种水性组合物，其包含浓度低于2％w/v的大环内酯免疫抑制剂药物和分子量范围为1‑50kDa的两亲性碳水化合物，所述组合物通过局部施用于眼睛来治疗眼部疾病，其中所述两亲性碳水化合物以组合物的10％w/v以下的浓度存在。优选的碳水化合物为棕榈酰乙二醇壳聚糖季铵盐(GCPQ)。还提供了药物组合物和治疗方法。例如可用于治疗干眼综合征(DES)、春季角结膜炎(VKC)、湿疹、特应性角结膜炎(AKC)、

Description

药物的眼部递送
技术领域
本发明涉及用于药物的眼部递送的新系统。
背景技术
局部眼用制剂通常用于治疗影响眼前部的疾病，包括但不限于青光眼、虹膜炎、结膜炎眼感染和干眼综合征(DES)。DES是指具有多种病因学的一系列眼表面疾病，其特征是，由眼泪产生和排出的不适当平衡或眼泪组成的异常而引起的角膜和结膜的慢性眼干燥。此外，经常发生眼表面炎症。
T淋巴细胞介导的炎症应答已被认为是DES的可能原因。因此，近年来出现了将环孢菌素(CSA)和他克莫司(TAC)作为局部免疫抑制剂用于治疗DES。这样的治疗已显示出降低免疫应答并且还表明其增加眼泪产生。由于CSA和TAC的疏水性和低水溶性，通常使用油性载体来配制它们，所述油性载体与生物利用度的局限性、稳定性和眼耐受性问题有关。
基于乳剂的制剂，例如市售的在泪液产生方面已显示出提供显著的改善。然而，已知并非最佳的，并且该制剂存在眼生物利用度低的问题。已报道基于蓖麻油的乳剂例如具有双峰液滴尺寸分布的特征。因此，这些组合物易发生微滴聚结，这限制了它们的保质期。
由于蓖麻油乳剂微滴有限的角膜前停留时间，以及CSA对油微滴的更大的亲和性，需要每日给药两次以在眼组织中保持药物水平在其治疗水平之上(50-300ng/g)。已建议使用带正电荷的乳剂以延长在角膜表面的停留时间。假定微滴上的正电荷将增加微滴与带负电的角膜细胞表面的相互作用。在这方面，与相比，带正电荷的乳剂已显示出在单剂量之后在家兔角膜中更高的最大浓度(P.Daull，et al；Distribution ofcyclosporine A in ocular tissues after topical administration of cyclosporineA cationic emulsions to pigmented rabbits，Cornea，32(2013)345-354)。
Kuwano等人在Pharmaceutical research，19(2002)108-111中制备了包含聚乙二醇40硬脂酸酯的CSA水分散体。所述包含聚乙二醇40硬脂酸酯的CSA水分散体与CSA的蓖麻油溶液和CSA的蓖麻油水包油(o/w)乳剂相比均具有更高的生物利用度。作者提出，CSA的生物利用度受到它从载体释放到分散介质的速率的影响。在这方面，CSA从油性载体(蓖麻油乳剂或溶液)的释放受到CSA在油相中的高分配系数的限制。包含聚乙二醇40硬脂酸酯的组合物不会受到这样的妨碍，因为它是水基的(没有油)。此外，聚乙二醇40硬脂酸酯形成200nm的胶束，这比乳剂微滴小得多，因此可释放更多的CSA。
Calvo等人在International Journal of Pharmaceutics，103(1994)283-291中报道了使用ε-己内酯纳米粒改善了CSA的眼渗透。作者证明了这些纳米粒实现了比CSA油性溶液高5倍的CSA角膜水平。作者提出，这种增强归因于纳米粒在给药位点的停留时间延长。
WO2004/026912记载了用于使疏水药物增溶的多糖。所述多糖是两亲性的并且通常选自以下物质的任何衍生物：壳聚糖、葡聚糖、海藻酸、淀粉、葡聚糖和瓜尔胶。在该专利申请的实施例中，棕榈酰乙二醇壳聚糖季铵盐(GCPQ)和十六烷基乙二醇壳聚糖季铵盐(GCHQ)被用作增溶多糖。
WO2008/017839记载了从两亲性碳水化合物聚合物形成的胶束簇以及它们用于配制疏水药物的用途。作为两亲性碳水化合物聚合物，特别地举例说明了GCPQ。特别提及了泼尼松龙作为免疫抑制剂的用途。
尽管目前被用于治疗DES，仍然需要替代性制剂以治疗这一问题。理想的制剂应当具有至少与相当的稳定性和眼耐受性，同时改善药物的生物利用度。
发明内容
根据本发明的第一方面，提供一种水性组合物，其包含浓度低于2％w/v的大环内酯免疫抑制剂药物和分子量范围为1-50kDa的两亲性碳水化合物，所述组合物通过局部施用于眼睛来治疗眼部疾病，其中：
所述两亲性碳水化合物以组合物的10％w/v以下的浓度存在并且为由以下通式表示的化合物或其盐：
其中，a+b+c+d＝1.000，并且
a为0.00至0.84，
b为0.01至0.40，
c为0.10至0.94，且
d为0.05至0.50；
并且其中：
X是疏水基团；
R1、R2和R3独立地选自取代的或未取代的烷基；
R4、R5、R6和R10独立地选自氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的醚基、或取代的或未取代的烯基；
R7可存在或不存在，并且当存在时，其为取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的氨基、或取代的或未取代的酰氨基；
R8和R9独立地选自氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的醚基、或取代的或未取代的烯基。
根据本发明的第二方面，提供一种适合于眼部给药的药物组合物，其包含一种或更多种药学上可接受的赋形剂和浓度低于2％w/v的大环内酯免疫抑制剂药物和分子量范围为1-50kDa的两亲性碳水化合物，其中：
所述两亲性碳水化合物以组合物的10％w/v以下的浓度存在并且为由以下通式表示的化合物或其盐：
其中，a+b+c+d＝1.000，并且
a为0.00至0.84，
b为0.01至0.40，
c为0.10至0.94，且
d为0.05至0.50；
并且其中：
X是疏水基团；
R1、R2和R3独立地选自取代的或未取代的烷基；
R4、R5、R6和R10独立地选自氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的醚基、或取代的或未取代的烯基；
R7可存在或不存在，并且当存在时，其为取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的氨基、或取代的或未取代的酰氨基；
R8和R9独立地选自氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的醚基、或取代的或未取代的烯基。
根据本发明的第三方面，提供一种治疗眼部疾病的方法，其中将本发明第一或第二方面的组合物局部施用于眼睛。
所述两亲性碳水化合物能够在水性介质中自组装成纳米粒。
本发明的目的是提供具有良好稳定性、耐受性和生物利用度的眼用组合物。这通过使用能够在水性介质中自组装的带正电荷的两亲性自组装聚合物来实现。这些聚合物具有多功能性，这使它们适合于眼用组合物。所述聚合物形成以带正电荷的纳米粒药物载体形式的粘性或非粘性水分散体，所述带正电荷的纳米粒药物载体具有粘膜粘附性能。由于仅可使用一种赋形剂，所以可以保持制剂的简单性。值得注意的是，不需要使用脂质或乳剂。
聚合物分子的分子量是重要的，因为如果分子量低于1kDa，通常聚合物分子将太小而无法包封充足水平的药物，如果分子量高于50kDa，则聚合物可导致产生粘性太大的组合物。适当的聚合物浓度也是重要的，并且应当在组合物的10％w/v以下以防止形成凝胶。此外，2％w/v以下的药物浓度使得它们能够完全纳入聚合物分子内部。
具体实施方式
大环内酯药物适合用作免疫抑制剂并且通常选自西罗莫司(sirolimus)、环孢菌素A、他克莫司和依维莫司(everolimus)，优选环孢菌素A(CSA)。CSA是有效的免疫抑制剂，已表明它可应用于眼科，用于治疗角膜移植物排斥和多种眼部疾病，包括干燥性角结膜炎和葡萄膜炎。由于CSA的水溶性差，它目前被配制为眼用乳剂如上文详细讨论的。
本发明的组合物可用于治疗干眼综合征(DES)(也称为干燥性角结膜炎(KCS))、春季角结膜炎(VKC)、湿疹、特应性角结膜炎(AKC)、综合征、术后屈光手术、角膜移植或隐形眼镜不耐受。
药物通常被自组装的带正电荷的两亲性聚合物包封。
优选将药物递送到表面的眼组织，例如角膜和结膜。
所述两亲性化合物为壳聚糖衍生物。
所述两亲性碳水化合物为由下式表示的化合物或其盐：
其中，a+b+c+d＝1.000，并且
a为0.00至0.84，
b为0.01至0.40，
c为0.10至0.94，且
d为0.05至0.50；
并且其中：
X是疏水基团；
R1、R2和R3独立地选自取代的或未取代的烷基；
R4、R5、R6和R10独立地选自氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的醚基、或取代的或未取代的烯基；
R7可存在或不存在，并且当存在时，其为取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的氨基、或取代的或未取代的酰氨基；
R8和R9独立地选自氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的醚基、或取代的或未取代的烯基。
在以上通式中，a、b、c和d单元可以以任何次序排列，并且可以是按顺序的、部分按顺序的或随机的。式中的＊用于表示连续的聚合物链。
在优选的实施方案中，d单元的摩尔比例在0.08-0.25的范围。
优选地，b单元的摩尔比例为0.02至0.4。
从上式中可看出，a和c单元可任选地不存在。d单元提供衍生出疏水基团的单体单元的第一部分，b单元提供衍生出四价氮基团的单体单元的第二部分。当a存在时，其提供单体单元的第三部分，其中氨基以与第一组或第二组不同的方式被衍生化。
当c单元存在时，其提供单体单元的第四部分，其中氨基未被衍生化。
在本发明中，疏水基团X优选选自取代的或未取代的基团，其为烷基，例如C4-30烷基；烯基，例如C4-30烯基；炔基，例如C4-30炔基；芳基，例如C5-20芳基；具有多于一个C4-C8环结构的多环疏水基团，例如固醇(例如胆固醇)；具有多于一个C4-C8杂原子环结构的多环疏水基团；多氧C1-C4亚烷基，例如多氧亚丁基聚合物；或疏水聚合取代基，例如聚(乳酸)基、聚(丙交酯-共-乙交酯)基或聚(羟乙酸)基。X基团可以是直链的、支链的或环状基团。任何X基团可直接连接至d单元(即在单体单元的C2处)，或通过官能团例如氨基、酰基或酰氨基连接，从而形成可表示为X’-环、X’-NH-、X’-CO-环、X’CONH-环的连接键，其中X’为如上文所定义的疏水基团。
X基团的优选实例包括由式CH3(CH2)n-CO-NH-或CH3(CH2)n-NH-或烯酸CH3(CH2)p-CH＝CH-(CH2)q-CO-NH-代表的那些基团，其中n为4至30，更优选6至20，p和q可以相同或不同并且为4至16，更优选4至14。特别优选的X取代基的类型经由酰氨基连接至壳聚糖单体单元，例如由式CH3(CH2)nCO-NH-所表示的，其中n为2至28。酰氨基的实例可通过将羧酸与壳聚糖的氨基偶联来产生。优选的实例为脂肪酸衍生物CH3(CH2)nCOOH，例如基于癸酸(n＝8)、月桂酸(n＝10)、豆蔻酸(n＝12)、棕榈酸(n＝14)、硬脂酸(n＝16)或花生酸(n＝18)的那些衍生物。
在上式中，R1、R2和R3优选独立地选自取代的或未取代的烷基，例如C1-10烷基。R1、R2和/或R3可为直链的或支链的。优选地，R1、R2和R3独立地选自甲基、乙基或丙基。
在上式中，R8和R9优选独立地选自氢和取代的或未取代的烷基，例如C1-10烷基。R8和/或R9可为直链的或支链的。优选地，R8和R9独立地选自甲基、乙基或丙基。
在上式中，存在于C6或糖基上的R4、R5、R6和R10独立地选自氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的醚基、或取代的或未取代的烯基。优选地，R4、R5、R6和R10被一个或更多个羟基或被另一个非离子亲水取代基取代。R4、R5、R6和R10基团的实例由式-(CH2)p-OH表示，其中p为1至10，优选为2至4；或由-(CH2)p-CH(CH2-OH)2表示，其中p为1至10；或由-(CH2)p-C(CH2-OH)r表示，其中p为1至10且r为3；或由-(CH2CH2OH)p表示，其中p为1至300。
R7基团可存在或不存在于通式中。当R7不存在时，其提供直接连接到壳聚糖骨架的单体单元上的季铵官能团。当R7基团存在时，其可以是未取代的或取代的烷基(例如C1-10烷基)，例如由式-(CH2)n-表示的烷基、由式-NH-(CH2)n-表示的氨基、或由式-NH-CO-(CH2)n-表示的酰氨基，其中n为1至10，优选1至4。R7N+R1R2R3取代基的优选实例通过将内铵盐(-OOC-CH2-N+-(CH3)3)与b单元的胺取代基偶联而提供，从而提供酰氨基，例如在-NH-CO-CH2-N+R1R2R3中。
如所说明的，本文所述的一些取代基可以是未取代的或被一种或更多种本领域技术人员公知的其他取代基取代。常见取代基的实例包括卤素、羟基、醚(例如C1-7烷氧基)、甲酰基、酰基(例如C1-7烷基酰基、C5-20芳基酰基)、酰卤、羧基、酯、酰氧基、酰氨基、乙酰氨基、硫代酰氨基、四唑基、氨基、硝基、亚硝基、叠氮基、氰基、异氰基、氰氧基、异氰氧基、氰硫基、异氰硫基、巯基、硫醚(例如C1-7烷硫基)、磺酸、磺酸盐、砜、磺酰氧基、亚磺酰氧基、磺氨基(sulfamino)、磺氨基(sulfonamino)、亚硫酰氨基(sulfinamino)、氨磺酰基(sulfamyl)、亚磺酰氨基(sulfonamido)、C1-7烷基(包括例如未取代的C1-7烷基、C1-7卤代烷基、C1-7羟基烷基、C1-7羧基烷基、C1-7氨基烷基、C5-20芳基-G1-7烷基)、C3-20杂环基和C5-20芳基(包括例如C5-20碳芳基、C5-20杂芳基、C1-7烷基-C5-20芳基和C5-20卤代芳基)基团。
本文使用的术语“环结构”指由3至10个共价连接的原子、还更优选3至8个共价连接的原子、还更优选5至6个共价连接的原子构成的闭合环。环可以是脂环或芳环。本文使用的术语“脂环”指不是芳环的环。
本文使用的术语“碳环”指所有环原子都是碳原子的环。
本文使用的术语“碳芳环”指所有环原子都是碳原子的芳环。
本文使用的术语“杂环”指其中至少一个环原子是多价环杂原子的环，所述杂原子例如氮、磷、硅、氧或硫，更通常为氮、氧或硫。优选地，所述杂环具有1至4个杂原子。
以上环可以是“多环基团”的一部分。
优选地，所述两亲性碳水化合物是棕榈酰乙二醇壳聚糖季铵盐(GCPQ)。在这种情况下，棕榈酰化水平优选为5-50％/单体。季铵化水平优选为1-40％/单体。
在本发明的组合物中，药物优选以0.001-1％w/v的浓度存在。
当浓度表示为％w/v时，这意指在100mL组合物中所包含的以g为单位的固体的量。
所述两亲性碳水化合物的分子量范围是1-50kDa。优选使用凝胶渗透色谱法-多角度光散射(GPC-MALLS)来测量分子量。
所述两亲性碳水化合物在水性介质中能够自组装成颗粒，而不需要存在其他试剂例如三聚磷酸盐。通常形成胶束。
本发明的组合物可形成颗粒聚集物。这些聚集物可通过单个两亲性分子和亲水药物的聚集而形成，并且平均颗粒大小为10nm至20μm。
优选地，所述两亲性碳水化合物形成可负载药物的纳米粒。可形成碳水化合物和药物的分散体，其为澄清的或透明的。通常将所述两亲性化合物与药物混合，并且通过对混合物进行涡旋和探针超声处理或通过对混合物进行高压均质化来制备分散体。
通过使用显微镜或使用光子关联光谱法可容易地测定平均颗粒大小，并且可在过滤之前于水分散体中便利地测定。更优选地，所述聚合的胶束聚集物的最小平均颗粒大小为至少10nm，更优选至少30nm，且最大平均颗粒大小优选为10μm或更小。
通常，所述两亲性碳水化合物与药物的比例在1∶1至50∶1的范围内，更优选在1∶1至20∶1的范围内。
通常，所述两亲性碳水化合物/药物/药学上可接受的载体的比例可为约1-40mg∶1mg∶1g，例如1-5mg∶1mg∶1g。
本发明的药物组合物可为适于眼部给药的液体形式或固体形式。通常制剂为澄清的或乳白色的液体制剂。
根据年龄、体重、给药时间等可确定适合的每日剂量。通常的眼用剂量为0.01-10mg/人/天，但每日剂量可随患者的状况和体重以及药物性质而变化。
实施例
材料和方法
聚合物
如之前在US20100159014 A1，I.F.Uchegbu，A.G.Schatzlein，X.Hou，Polymericmicellar clusters and their uses in formulating drugs中所描述的，合成并表征N-棕榈酰基-N-单甲基-N，N-二甲基-N，N，N-三甲基-6-O-乙二醇壳聚糖(GCPQ)。用于实验的GCPQ含有20.51Mol％棕榈酰基/单体单元，11.93Mol％季铵基/单体单元，分子量为9.13kDa。
CSA组合物
如下制备包含CSA的组合物。向经称重的聚合物样品和经称重的药物样品中加入磷酸盐缓冲盐水(pH＝7.4，20mL)。初始聚合物/药物的重量比为7.5∶1，并且将药物含量调整至0.05％、0.08％和0.1％w/v的浓度。将液体混合物涡旋2分钟以确保完全混合，随后在20,000psi下进行高压均质化(Avestin Emulsiflex，GCT Technology，英国)，进行30个循环。
CsA制剂稳定性
对于稳定性分析，将制剂的等分部分一式三份地贮存于冷藏温度(2-3℃)、室温(16-22℃)或较高温度(40℃)下，并且在进行冻-融循环(-20℃下2天，5℃下2天，40℃下2天，重复3个循环)时进行监测。在多个时间间隔下，使用高效液相色谱法(HPLC)测定来分析制剂的药物含量。
CsA测定
如之前在W.P.Cheng，A.I.Gray，L.Tetley，T.L.B.Hang，A.G.I.F.Uchegbu，Polyelectrolyte nanoparticles with high drug loading enhance theoral uptake of hydrophobic compounds.Biomacromolecules，7(2006)1509-1520中所描述的，进行HPLC测定。简言之，将制剂的等分部分(100μL)采用等体积的甲醇稀释，过滤(0.22μm)溶液并将滤液注入C18反相Onyx整体柱(100×4.6mm)。流动相为乙腈、水(60∶40)，流速为1.2mL min-1，注射体积为20μL，柱温为70℃。HPLC系统为Agilent 1200系列(AgilentTechnologies Ltd，英国)，并且通过Agilent ChemStation软件来分析数据。
体内实验
对于CSA的局部眼部给药，将包含GCPQ的0.05％w/v CSA组合物施用于雄性新西兰家兔(n＝3，Harlan，英国)，所述CSA组合物按照上文的描述而制备，制备方法稍有改变。
体内制剂
将GCPQ(GCPQLC2Sep13-去质子化，Mw＝13210Da，Mn＝12180Da，摩尔％棕榈酰化＝17％，摩尔％季铵基团＝12％)以0.75％w/v的浓度分散于含有3.1％w/v丙三醇的水溶液中。通过在定轨振荡器上轻轻振荡至少2小时而使聚合物分散。一旦聚合物完全分散，使用3.1μm注射器式滤器来过滤分散体。
将上述聚合物分散体添加到经称重的CSA粉末中(加入目标量2倍的CSA)。通过首先对混合物进行涡旋，随后使用高压均质器(Avestin C5)在18000psi下处理30个循环，从而使CSA粉末分散。高压均质化之后，使用NaOH(1M)将pH调节至7.4。将制剂贮存在5℃下至少24h，通过HPLC进行分析，并最终采用含有0.75％w/vGCPQ和3.1％w/v丙三醇的聚合物分散体(之前调节至pH 7.4并使用3.1μm注射器式滤器来过滤)稀释以使所述制剂达到所需的浓度。
动物实验
实验前使2.5至3kg的新西兰白化病雄性家兔(Harlan laboratories，英国)适应不少于5天。这些家兔在整个研究过程中可自由获得水。将所述制剂施用于双眼中。为了给予所述制剂，将下眼睑从眼球处轻轻拉开，使用标有刻度的微量移液管将25μL制剂施用到下结膜穹窿中。给药后，用手将上下眼睑合在一起约5秒钟以允许制剂与角膜接触。随后，记录之后60秒内眨眼的次数。在预先安排的时间点(0.5、2、4、8、24小时)，从边缘耳动脉取动脉血样品。随后，通过静脉内(IV)过量注射戊巴比妥处死家兔。使用2μL毛细管收集眼泪样品。解剖各组织，采用0.9％NaCl溶液冲洗，在滤纸上干燥并贮存，用于随后的分析。按照以下顺序收集眼组织以使污染最小：(1)房水、(2)结膜、(3)玻璃状液、(4)晶状体、(5)角膜和(6)巩膜。将来自双眼的组织贮存在相同的容器中。首先(解剖后2-5小时)将样品贮存在冰中(解剖后2-5小时)，随后将样品贮存在-80℃直到进行分析。
组织分析
使用液相色谱-质谱(LC-MS/MS)来测定组织中CSA的浓度。
标准品的制备
在玻璃小瓶中制备浓度为1mg mL-1的CSA于甲醇中的储备溶液(用于LC-MS，Sigma-Aldrich)。通过在甲醇中连续稀释CSA储备溶液来制备工作标准品(WS)，以获得浓度范围为约50至1000000ng mL-1的工作标准品(表1)。
表1：CSA工作标准溶液的制备
稀释剂：甲醇
将CsA-d12(Recipe，德国)用作内标。制备内标(IS)于乙腈中的浓度为6.25μg mL-1的储备溶液。通过采用甲醇稀释IS储备溶液来新鲜制备IS标准溶液(IS-PPT)以产生浓度为5ng mL-1的IS。
将组织解冻(用剪刀将固体组织剪成小片)、称重(99.0±1.0mg，或者对液态组织而言为99μL)并放置在1.5mL聚丙烯微量离心管中。向各管中加入一定体积的工作标准品WS0-WS14(表2)。然后将加入了标准品的(spiked)样品涡旋10分钟。
表2：CSA校准标准品的制备
然后通过添加400μL的IS-PPT并在室温下涡旋4小时来提取加入了标准品的样品。随后从涡旋中取出样品并放置在5℃下30分钟，然后离心(5000g×10分钟)。将上清液转移到HPLC小瓶中并使用LC-MS进行分析。
样品制备
将组织解冻(用剪刀将固体组织剪成小片)、称重(100.0±1.0mg，或者对于液态组织而言为100μL)并放置在1.5mL聚丙烯微量离心管中。然后通过添加400μL的IS-PPT并在室温下涡旋4小时来提取样品。随后从涡旋中取出样品并放置在5℃下30分钟，然后离心(5000g×10分钟)。将上清液转移到HPLC小瓶中并使用LC-MS进行分析。
LC-MS/MS仪器
在Agilent 6400系列三重四极杆LC/MS系统(Agilent technologies，Berkshire，英国)上分析样品，该系统包括脱气装置(HiP脱气装置1260/G4225A)、二元泵(HiP 1260二元泵/G1312B)、自动进样器(HiP进样器1260/G1367E)、柱温箱(G1316A)和三重四极质谱仪(G6460A)。Agilent MassHunter Workstation软件用于系统控制、数据采集和数据处理。
色谱条件
在Agilent Zorbax Extend-C18(50×2.1mm柱，孔径＝3.5μm)上对样品(注入体积＝5μL)进行色谱分析，所述Agilent Zorbax Extend-C18配备了Cartridge Gemini(C18 4×2.0mm)保护柱并且柱温为60℃，流动相的流速为600μL min-1。流动相梯度如表3所示，其中溶液A＝0.02％w/v乙酸水溶液，溶液B＝含有0.02％w/v乙酸的甲醇。在上述色谱条件下获得的两种分析物的典型保留时间报告于表4中。
表3：LC-MS/MS分析的梯度法
表4：LC-MS/MS保留时间
分析物 时间(分钟)
CSA 2.14
CSA-d12 2.14
质谱仪条件
离子源为Agilent Jet Stream(AJS)，其以氮作为源，扫描模式为多重反应监测(MRM)，极性为阳离子模式，喷雾器压力为30psi，气体流速设置为5L min-1，气体温度为340℃，毛细管电压设置为5000V，套管气加热器设置为400℃，套管气体流速设置为11L min-1，锥孔电压(VCharging)设置为1500V。表5报告了用于对两种分析物中的每一种进行定量的质谱仪条件。
表5：设置用干LC-MS/MS分析的离子通道检测器
定量
使用如表2中所描述的方法而制备的标准品来构建CSA和CSA-d12的校正曲线。
药代动力学分析
使用Microsoft Excel professional plus 2010来计算药代动力学参数。使用IBM SPSS Statistics用于统计分析。低于定量限度(BLQ)的值视为计算值为0。
绕计分析
使用IBM SPSS Statistics用于统计分析。低于定量限度(BLQ)的值视为计算值为0。首先进行双因素方差分析，然后进行事后检验(Tukey′s HSD)以检测在整套时间点中3种制剂之间的差异。当在三种制剂中出现统计上显著的差异时，采用单因素方差分析，随后进行事后检验(分别为Tukey′s HSD，或等方差或不等方差Games-Howell)来评估各时间点内的统计学显著差异。
结果
表6报告了澄清液体制剂的物理化学特征。渗透压和pH在眼用制剂的范围内。
表6：组合物的物理化学性质
ND：未测定
当在上述条件下进行热稳定性研究时，所述制剂在药物含量方面是稳定的(表7-10)。
表7：进行热稳定性研究时，包含CSA 0.050％w/v和GCPQ 0.375％w/v的组合物的药物含量
表8：进行热稳定性研究时，包含CSA 0.080％w/v和GCPQ 0.600％w/v的组合物的药物含量
表9：进行热稳定性研究时，包含CSA 0.100％w/v和GCPQ 0.750％w/v的组合物的药物含量
表10：进行冻-融循环时，包含CSA 0.100％w/v和GCPQ 0.750％w/v的组合物的药物含量
贮存天数 [CSA]±SD(μg/mL) 贮存温度
0 782.26±88.21 不适用
1-2 724.85±26.31 -20℃
3-4 906.99±107.78 4℃
5-6 724.31±70.27 40℃
7-8 863.16±113.29 -20℃
9-10 820.26±68.06 4℃
11-12 773.26±57.71 40℃
13-14 786.46±107.28 -20℃
15-16 696.72±163.89 4℃
17-18 834.18±67.33 40℃
当制剂处于加速的贮存温度(40℃)时，其呈现为乳白色液体并且可逆地变为更加不透明的，当暴露于较低的温度(室温)时，其恢复乳白色的外观，当贮存在较低温度(室温和冷藏)时，其保持乳白色的外观；贮存在40℃时这种外观的改变是由于环孢菌素A固有的溶解度的改变，因为随着温度从冷藏温度升至人体生理温度，药物溶解度变低(5℃下溶解度＝101.5μg mL-1，25℃下溶解度＝19.9μg mL-1，37℃下溶解度＝3.7μg mL-1)。
在贮存期间，如通过目视观察所确定的，未观察到药物沉淀。在所有三个制剂的贮存条件下，药物含量在30天中保持不变(表7-9)(对数据进行方差分析检验，原始制剂和贮存的制剂之间没有显著差异)。
当进行热循环时，目视宏观分析表明，在3个循环结束时制剂看起来略微浑浊，但是没有任何药物沉淀，如通过目视观察所确定的。此外，药物含量在热循环期间是稳定的(表10)(如通过对结果进行方差分析检验所确定的)。
表11中报告了在包含CSA 0.050％w/v和GCPQ 0.75％w/v的组合物的局部眼部给药之后，各组织中的CSA浓度。作为对照制剂给药。
BLQ_p：低于血浆中的定量限(1.6ng/mL)；BLQ_a：低于房水中的定量限(0.5ng/mL)
体内局部眼部给药实验表明，包含GCPQ的组合物的生物利用度比市售组合物更高(表11)。特别地，当在所有时间点(除最终的24小时时间点以外)与Restasis进行比较时，GCPQ组合物在角膜和结膜中的药物水平在统计上显著地更高(p＜0.05)。此外，当在4和8小时的时间点与进行比较时，GCPQ组合物在巩膜中的药物水平在统计上显著地更高(p＜0.05)。结果表明，在房水、玻璃状液和血浆中，两种组合物之间在药物水平上没有差异。
这些结果总体上表明，GCPQ组合物更有效地将CSA递送到眼组织(角膜和结膜)中，其为DES的主要靶点。值得注意的是，血浆中的CSA浓度低于血浆中的定量限(1.6ng/mL)，因此表明所述制剂不诱导全身性副作用。

Claims (14)

1.一种水性组合物，其包含浓度低于2％w/v的大环内酯免疫抑制剂药物和分子量范围为1-50kDa的两亲性碳水化合物，所述组合物通过局部施用于眼睛来治疗眼部疾病，其中：
所述两亲性碳水化合物以组合物的10％w/v以下的浓度存在并且为由以下通式表示的化合物或其盐：
其中，a+b+c+d＝1.000，并且
a为0.00至0.84，
b为0.01至0.40，
c为0.00至0.84，且
d为0.05至0.50；
并且其中：
X是疏水基团；
R1、R2和R3独立地选自取代的或未取代的烷基；
R4、R5、R6和R10独立地选自氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的醚基、或取代的或未取代的烯基；
R7可存在或不存在，并且当存在时，其为取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的氨基、或取代的或未取代的酰氨基；
R8和R9独立地选自氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的醚基、或取代的或未取代的烯基。
2.权利要求1的组合物，其中所述药物选自西罗莫司、环孢菌素A、他克莫司和依维莫司，优选环孢菌素A。
3.权利要求1或2的组合物，其不包含脂质。
4.前述权利要求中任一项的组合物，其用于治疗干眼综合征(DES)、春季角结膜炎(VKC)、湿疹、特应性角结膜炎(AKC)、综合征、术后屈光手术、角膜移植或隐形眼镜不耐受。
5.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述药物被构成所述碳水化合物的自组装的带正电荷的两亲性聚合物包封。
6.前述权利要求中任一项的组合物，其为聚合的聚集物形式，所述聚合的聚集物的平均颗粒大小为10nm至20μm。
7.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述碳水化合物为棕榈酰乙二醇壳聚糖季铵盐(GCPQ)。
8.权利要求7的组合物，其中棕榈酰化水平d的范围是0.08-0.25。
9.权利要求7或8的组合物，其中季铵化水平b的范围是0.02至0.20。
10.前述权利要求中任一项的组合物，其中药物以0.001-1％w/v的浓度存在。
11.一种适合于眼部给药的药物组合物，其包含一种或更多种药学上可接受的赋形剂、浓度低于2％w/v的大环内酯免疫抑制剂药物和分子量范围为1-50kDa的两亲性碳水化合物，其中所述两亲性碳水化合物以组合物的10％w/v以下的浓度存在并且为由以下通式表示的化合物或其盐：
其中，a+b+c+d＝1.000，并且
a为0.00至0.84，
b为0.01至0.40，
c为0.10至0.94，且
d为0.05至0.50；
并且其中：
X是疏水基团；
R1、R2和R3独立地选自取代的或未取代的烷基；
R4、R5、R6和R10独立地选自氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的醚基、或取代的或未取代的烯基；
R7可存在或不存在，并且当存在时，其为取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的氨基、或取代的或未取代的酰氨基；
R8和R9独立地选自氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的醚基、或取代的或未取代的烯基。
12.权利要求11的药物组合物，其具有权利要求2至10中的任何一种特征。
13.一种治疗眼部疾病的方法，其中将权利要求1-12中任一项的组合物局部施用于眼睛。
14.权利要求13的方法，其中所述眼部疾病选自干眼综合征(DES)、春季角结膜炎(VKC)、湿疹、特应性角结膜炎(AKC)、综合征、术后屈光手术、角膜移植和隐形眼镜不耐受。
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