JP6832276B2

JP6832276B2 - 薬剤の眼内送達

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Publication number: JP6832276B2
Application number: JP2017523822A
Authority: JP
Inventors: ウチェグブ、イジェオマ; スチャツレイン、アンドレアス; カプレット、ロレンツォ
Original assignee: ナノメリクスリミテッド
Priority date: 2014-11-03
Filing date: 2015-11-02
Publication date: 2021-02-24
Anticipated expiration: 2035-11-02
Also published as: US10987304B2; US20210212938A1; WO2016071677A1; EP3215119A1; JP2017533228A; CA2966592A1; CN116392600A; EP3215119B1; CN107106487A; GB201419540D0; US20170326064A1; CA2966592C

Description

本発明は、薬剤の眼内送達のための新規のシステムに関する。

局所眼科製剤は、一般的に、眼の前方部に影響を及ぼす疾患（緑内障、虹彩炎、結膜炎眼感染症及び眼球乾燥症候群（ＤＥＳ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない）の治療に用いられる。ＤＥＳとは、様々な病因を有する眼表面障害のスペクトルをいい、涙液生成及び排液の不適切なバランス又は涙液組成の異常に起因する角膜及び結膜の慢性眼球乾燥により特徴づけられる。さらに、多くの場合、眼表面の炎症が発生する。

Ｔ細胞リンパ球媒介性炎症反応が、ＤＥＳの可能性のある原因として認識されている。その結果として、近年では、ＤＥＳ治療のために局所免疫抑制剤としてシクロスポリン（ＣＳＡ）及びタクロリムス（ＴＡＣ）の使用が浮上している。このような治療は、炎症反応の低下を示し、また、涙液生成の増加も示唆されている。ＣＳＡ及びＴＡＣの疎水性及び低い水溶性により、それらは、一般的に、生物学的利用能の制限、安定性及び眼耐性の問題に結びついている油性ビヒクルを用いて製剤化される。

市販のＲＥＳＴＡＳＩＳ（登録商標）のようなエマルジョン系製剤は、涙液生成を有意に改善させることが示されている。しかしながら、ＲＥＳＴＡＳＩＳ（登録商標）は最適ではなく、その製剤は、低い眼の生物学的利用能に悩まされることが知られている。ＲＥＳＴＡＳＩＳ（登録商標）のようなひまし油ベースのエマルジョンが、二峰性の液滴サイズ分布により特徴付けられるということが報告されている。その結果として、これらの組成物は、液滴合体を生じさせ、保存期間を制限するという傾向がある。

ひまし油エマルジョン液滴の前角膜滞留時間が限られること、油滴に対するＣＳＡの親和性がより大きいことから、眼組織中に上記の薬剤をその治療レベル（５０〜３００ｎｇ／ｇ）に保つために毎日２回の投与を必要とする。角膜表面上の滞留時間を長くするために正電荷エマルジョンの使用が提案されている。液滴上の正電荷が、角膜細胞の負電荷表面との相互作用を増加させるという仮説が立てられている。これに関して、正電荷エマルジョンは、ＲＥＳＴＡＳＩＳ（登録商標）と比較して、単回投与後に、ウサギの角膜中において、より高い最大濃度を示した（Ｐ．Ｄａｕｌｌ，ｅｔａｌ；ＤｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅＡｉｎｏｃｕｌａｒｔｉｓｓｕｅｓａｆｔｅｒｔｏｐｉｃａｌａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎｏｆｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅＡｃａｔｉｏｎｉｃｅｍｕｌｓｉｏｎｓｔｏｐｉｇｍｅｎｔｅｄｒａｂｂｉｔｓ，Ｃｏｒｎｅａ，３２（２０１３）３４５−３５４）。

Ｋｕｗａｎｏらは、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｒｅｓｅａｒｃｈ，１９（２００２）１０８−１１１」で、ステアリン酸ポリオキシル４０を含有するＣＳＡの水性分散液を製造した。ステアリン酸ポリオキシル４０を含有するＣＳＡの水性分散液は、ＣＳＡのひまし油液及びＣＳＡのひまし油ｏ／ｗエマルジョンの両方と比べて、より高い生物学的利用能を有した。著者らは、ＣＳＡの生物学的利用能が、その担体から分散媒へのその放出速度に影響されるということを示唆した。これに関して、油性ビヒクル（ひまし油のエマルジョン又は溶液）からのＣＳＡの放出が、油性相におけるＣＳＡの高い分配係数により制限された。ステアリン酸ポリオキシル４０を含有する組成物は、水性ベース（無油性）であるので、この障害を受けていなかった。さらに、ステアリン酸ポリオキシル４０は、エマルジョンの液滴よりもはるかに小さい２００ｎｍのミセルを形成した。それにより、より多くのＣＳＡを放出する可能性がある。

Ｃａｌｖｏらは、「ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，１０３（１９９４）２８３−２９１」において、ε−カプロラクトンナノ粒子の使用が、ＣＳＡの眼内浸透を向上させることを報告した。著者らは、これらのナノ粒子が、ＣＳＡ油性溶液よりも５倍多くのＣＳＡを角膜レベルに到達させることを証明した。このような向上は、投与部位でのナノ粒子の滞留時間の延長によるものであると提案されている。

ＷＯ２００４／０２６９１２には、疎水性薬剤を可溶化するために用いられる多糖類が記載されている。多糖類は、両親媒性であり、一般的に以下の任意の誘導体から選ばれる：キトサン、デキストラン、アルギン酸、デンプン、デキストラン及びグアーガム。第４級アンモニウムパルミトイルグリコールキトサン（ＧＣＰＱ）及び第４級アンモニウムヘキサデシルグリコールキトサン（ＧＣＨＱ）が、可溶化多糖類として、本特許出願の実施例において用いられる。

ＷＯ２００８／０１７８３９には、両親媒性炭水化物ポリマーから形成されるミセルクラスター及び疎水性薬剤の製剤化におけるそれらの使用が記載されている。具体的に、ＧＣＰＱが両親媒性炭水化物ポリマーとして例示されている。具体的に、免疫抑制剤としてのプレドニゾロンの使用が言及されている。

ＲＥＳＴＡＳＩＳ（登録商標）が、現在、ＤＥＳの治療に用いられているが、この課題を解決するために、依然として別の製剤が必要とされている。理想的な製剤は、薬剤の生物学的利用能を向上させる一方で、少なくともＲＥＳＴＡＳＩＳ（登録商標）のものに匹敵する安定性及び眼の忍容性を有する必要がある。

本発明の第一の形態によれば、眼への局所適用による眼障害の治療に使用するための、２％ｗ／ｖ未満の濃度のマクロライド免疫抑制剤及び１〜５０ｋＤａの範囲の分子量を有する両親媒性炭水化物化合物を含む水性組成物であって、
両親媒性炭水化物化合物が、組成物に対して１０％ｗ／ｖ未満の濃度で存在し、一般式：

［式中、
ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＝１．０００であり、
ａは、０．００〜０．８４であり、
ｂは、０．０１〜０．４０であり、
ｃは、０．１０〜０．９４であり、
ｄは、０．０５〜０．５０であり；
Ｘは、疎水基であり；
Ｒ_１、Ｒ_２及びＲ_３は、独立して、置換又は無置換のアルキル基から選ばれ；
Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６及びＲ_１０は、独立して、水素、置換又は無置換のアルキル基、置換又は無置換のエーテル基、又は置換又は無置換のアルケン基から選ばれ；
Ｒ_７は、存在していても、或いは存在していなくてもよく、存在する場合、無置換又は置換されたアルキル基、無置換又は置換されたアミン基又は置換又は無置換のアミド基であり；
Ｒ_８及びＲ_９は、独立して、水素及び置換又は無置換のアルキル基、置換又は無置換のエーテル基、又は置換又は無置換のアルケン基のいずれかから選ばれる。］
で表されるもの又はその塩である、水性組成物が提供される。

本発明の第二の形態によれば、１種以上の医薬上許容される賦形剤、並びに２％ｗ／ｖ未満の濃度のマクロライド免疫抑制剤及び１〜５０ｋＤａの範囲の分子量を有する両親媒性炭水化物化合物を含む眼投与に適した医薬組成物であって、
両親媒性炭水化物化合物が、組成物に対して１０％ｗ／ｖ未満の濃度で存在し、一般式：

［式中、
ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＝１．０００であり、
ａは、０．００〜０．８４であり、
ｂは、０．０１〜０．４０であり、
ｃは、０．１０〜０．９４であり、
ｄは、０．０５〜０．５０であり；
Ｘは、疎水基であり；
Ｒ_１、Ｒ_２及びＲ_３は、独立して、置換又は無置換のアルキル基から選ばれ；
Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６及びＲ_１０は、独立して、水素、置換又は無置換のアルキル基、置換又は無置換のエーテル基、又は置換又は無置換のアルケン基から選ばれ；
Ｒ_７は、存在していても、或いは存在していなくてもよく、存在する場合、無置換又は置換されたアルキル基、無置換又は置換されたアミン基又は置換又は無置換のアミド基であり；
Ｒ_８及びＲ_９は、独立して、水素及び置換又は無置換のアルキル基、置換又は無置換のエーテル基、又は置換又は無置換のアルケン基のいずれかから選ばれる。］
で表されるもの又はその塩である、医薬組成物が提供される。

本発明の第三の形態によれば、本発明の第一又は第二の形態の組成物を眼に局所投与する眼障害の治療方法が提供される。

両親媒性炭水化物化合物は、水性媒体中においてナノ粒子に自己集合することが可能である。

本発明の目的は、良好な安定性、忍容性及び生物学的利用性を有する眼科組成物を提供することである。これは、水性媒体中において自己集合することが可能な正電荷の両親媒性自己集合ポリマーを用いることにより達成される。これらのポリマーは、眼科組成物に適した多機能性を有する。それらは、粘膜付着性を有する正電荷のナノ粒子薬剤担体の形態で粘性又は非粘性の水性分散液を形成する。１種のみの賦形剤が使用できるので、製剤の簡素さが維持される。とりわけ、脂質又はエマルジョンの使用を必要としない。

ポリマー分子の分子量は重要であり、１ｋＤａ未満であると、一般的に、十分な量の薬剤をカプセル化するには小さすぎ、５０ｋＤａを超えると、ポリマーにより粘性が高すぎる組成物がもたらされ得る。また、適切なポリマー濃度も重要であり、ゲル形成防止のため、組成物に対して１０％ｗ／ｖ未満であるべきである。さらに、２％ｗ／ｖ未満の薬剤濃度とすることにより、ポリマー分子内に完全に組み込むことが可能となる。

（発明の詳細な説明）
マクロライド薬剤は、免疫抑制剤として有用であり、通常、シロリムス、シクロスポリンＡ、タクロリムス及びエベロリムスから選ばれ、好ましくは、シクロスポリンＡ（ＣＳＡ）である。ＣＳＡは、角膜移植片拒絶及び様々な眼障害（乾性角結膜炎及びブドウ膜炎を含む）の治療のための、眼科における応用可能性を示す強力な免疫抑制剤である。水溶性の低さにより、ＣＳＡは、現在、上記でさらに議論したような眼科エマルジョン（Ｒｅｓｔａｓｉｓ（登録商標））として製剤化される。

本発明の組成物は、眼球乾燥症候群（ＤＥＳ）（乾性角結膜炎（ＫＣＳ）としても知られる）、春季角結膜炎（ＶＫＣ）、湿疹、アトピー性角結膜炎（ＡＫＣ）、シェーグレン症候群、屈折矯正手術術後、角膜移植又はコンタクトレンズ不耐症の治療に用いることができる。

薬剤は、通常、自己集合正電荷両親媒性ポリマーによりカプセル化される。

薬剤は、好ましくは、角膜及び結膜のような表在性眼組織に送達される。

両親媒性化合物は、キトサン誘導体である。

両親媒性炭水化物化合物は、式：

［式中、
ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＝１．０００であり、
ａは、０．００〜０．８４であり、
ｂは、０．０１〜０．４０であり、
ｃは、０．１０〜０．９４であり、
ｄは、０．０５〜０．５０であり；
Ｘは、疎水基であり；
Ｒ_１、Ｒ_２及びＲ_３は、独立して、置換又は無置換のアルキル基から選ばれ；
Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６及びＲ_１０は、独立して、水素、置換又は無置換のアルキル基、置換又は無置換のエーテル基、又は置換又は無置換のアルケン基から選ばれ；
Ｒ_７は、存在していても、或いは存在していなくてもよく、存在する場合、無置換又は置換されたアルキル基、無置換又は置換されたアミン基又は置換又は無置換のアミド基であり；
Ｒ_８及びＲ_９は、独立して、水素、及び置換又は無置換のアルキル基、置換又は無置換のエーテル基、又は置換又は無置換のアルケン基のいずれかから選ばれる。］
で表されるもの又はその塩である。

上記一般式では、ａ、ｂ、ｃ及びｄ単位は、任意の順序で配置され得、順序付けされたもの、部分的に順序付けられたもの、或いはランダムなものであり得る。式中の^＊は、連続したポリマー鎖を示すために用いられる。

好ましい実施形態では、ｄ単位のモル比は、０．０８〜０．２５の範囲内である。

好ましくは、ｂ単位のモル比は、０．０２〜０．４である。

上記式から分かるように、ａ及びｃ単位は、任意で存在しなくてもよい。ｄ単位は、疎水基で誘導体化されたモノマー単位の第一部分を提供し、ｂ単位は、四級窒素基で誘導体化されたモノマー単位の第二部分を提供する。存在する場合、ａ単位は、アミン基が第一基又は第二基とは異なる手法により誘導化されたモノマー単位の第三基を提供する。

存在する場合、ｃ単位は、アミン基が誘導体化されていないモノマー単位の第四基を提供する。

本発明において、疎水基Ｘは、好ましくは、アルキル基（例えば、Ｃ_４−３０アルキル基）、アルケニル基（例えば、Ｃ_４−３０アルケニル基）、アルキニル基（例えば、Ｃ_４−３０アルキニル基）、アリール基（例えば、Ｃ_５−２０アリール基）、１個を上回るＣ_４−Ｃ_８環構造を有する多環式疎水基（例えば、ステロール（例、コレステロール））、１個を上回るＣ_４−Ｃ_８ヘテロ原子環構造を有する多環式疎水基、ポリオキサＣ_１−Ｃ_４アルキレン基（例えば、ポリオキサブチレンポリマー）、又は疎水性ポリマー置換基（例えば、ポリ（乳酸）基、ポリ（ラクチド−コ−グリコライド）基又はポリ（グリコール酸）基）である置換又は無置換基から選ばれる。Ｘ基は、直鎖、分枝鎖又はシクロ基であり得る。Ｘ基の何れかは、ｄ単位に直接結合してもよく（即ち、モノマー単位のＣ２で）、或いはアミン基、アシル基、又はアミド基のような官能基を介して結合し、その結果、Ｘ’−環、Ｘ’−ＮＨ−、Ｘ’−ＣＯ−環、Ｘ’ＣＯＮＨ−環（式中、Ｘ’は、上記定義の疎水基である。）として表され得る結合を形成してもよい。

Ｘ基の好ましい例としては、式ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｎ−ＣＯ−ＮＨ−又はＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｎ−ＮＨ−又はアルケン酸ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｐ−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ_２）_ｑ−ＣＯ−ＮＨ−（式中、ｎは、４〜３０であり、より好ましくは、６〜２０であり、ｐ及びｑは、同一又は異なって、４〜１６、より好ましくは、４及び１４である。）により表されるものが挙げられる。Ｘ置換基の特に好ましいクラスは、例えば、式ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｎＣＯ−ＮＨ−（式中、ｎは２〜２８である。）により表されるようなアミド基を介してキトサンモノマー単位に結合している。アミド基は、例えば、キトサンのアミン基へのカルボン酸のカップリングにより生成する。好ましい例は、脂肪酸誘導体ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｎＣＯＯＨ（例えば、カプリン酸（ｎ＝８）、ラウリン酸（ｎ＝１０）、ミリスチン酸（ｎ＝１２）、パルミチン酸（ｎ＝１４）、ステアリン酸（ｎ＝１６）又はアラキジン酸（ｎ＝１８）に基づくもの）である。

上記式では、Ｒ_１、Ｒ_２及びＲ_３は、好ましくは、独立して、置換又は無置換のアルキル基（例えば、Ｃ_１−１０アルキル基）から選ばれる。Ｒ_１、Ｒ_２及び／又はＲ_３は、直鎖又は分枝鎖であり得る。好ましくは、Ｒ_１、Ｒ_２及びＲ_３は、独立して、メチル、エチル又はプロピル基から選ばれる。

上記式では、Ｒ_８及びＲ_９は、好ましくは、独立して、水素、及び置換又は無置換のアルキル基（例えば、Ｃ_１−１０アルキル基）から選ばれる。Ｒ_８及び／又はＲ_９は、直鎖又は分枝鎖であり得る。好ましくは、Ｒ_８及びＲ_９は、独立して、メチル、エチル又はプロピル基から選ばれる。

上記式では、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６及びＲ_１０は、Ｃ６又は糖単位上に存在し、独立して、水素、置換又は無置換のアルキル基、置換又は無置換のエーテル基、又は置換又は無置換のアルケン基から選ばれる。好ましくは、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６及びＲ_１０基は、１個以上のヒドロキシル基又はその他の非イオン性親水性置換基で置換されている。Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、及びＲ_１０基は、例えば、式−（ＣＨ_２）_ｐ−ＯＨ（式中、ｐは、１〜１０であり、好ましくは、２〜４である。）、又は−（ＣＨ_２）_ｐ−ＣＨ（ＣＨ_２−ＯＨ）_２（式中、ｐは、１〜１０である。）、又は−（ＣＨ２）_ｐ−Ｃ（ＣＨ_２−ＯＨ）_ｒ（式中、ｐは、１〜１０であり、ｒは、３である。）、又は−（ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＨ）_ｐ（式中、ｐは、１〜３００である。）で表される。

Ｒ_７基は、一般式において、存在しても、存在しなくてもよい。存在しない場合、キトサン骨格のモノマー単位に直接結合した第４級アンモニウム官能基を提供する。Ｒ_７基が存在する場合、例えば、式−（ＣＨ_２）_ｎ−で表されるような無置換又は置換されたアルキル基（例えば、Ｃ_１−１０アルキル基）、式−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｎ−で表されるようなアミン基、又は式−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ_２）_ｎ−で表されるようなアミド基であり得る（ｎは、１〜１０であり、好ましくは、１〜４である。）。Ｒ_７Ｎ^＋Ｒ_１Ｒ_２Ｒ_３置換基の好ましい例は、ベタイン（−ＯＯＣ−ＣＨ_２−Ｎ^＋−（ＣＨ_３）_３）とｂ単位のアミン置換基のカップリングにより提供され、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ_２−Ｎ^＋Ｒ_１Ｒ_２Ｒ_３のようなアミド基を提供する。

示されているように、本明細書に記載の置換基のいくつかは、無置換であってもよく、或いは当業者によく知られているような１以上の追加の置換基で置換されていてもよい。一般的な置換基としては、例えば、ハロ；ヒドロキシル；エーテル（例えば、Ｃ_１−７アルコキシ）；ホルミル；アシル（例えば、Ｃ_１−７アルキルアシル、Ｃ_５−２０アリールアシル）；ハロゲン化アシル；カルボキシ；エステル；アシルオキシ；アミド；アシルアミド；チオアミド；テトラゾリル；アミノ；ニトロ；ニトロソ；アジド；シアノ；イソシアノ；シアナト；イソシアナト；チオシアノ；イソチオシアノ；スルフヒドリル；チオエーテル（例えば、Ｃ_１−７アルキルチオ）；スルホン酸；スルホナート；スルホン；スルホニルオキシ；スルフィニルオキシ；スルファミノ；スルホンアミノ；スルフィンアミノ；スルファミル；スルホンアミド；Ｃ_１−７アルキル（例えば、無置換Ｃ_１−７アルキル、Ｃ_１−７ハロアルキル、Ｃ_１−７ヒドロキシアルキル、Ｃ_１−７カルボキシアルキル、Ｃ_１−７アミノアルキル、Ｃ_５−２０アリール−Ｃ_１−７アルキルを含む）；Ｃ_３−２０ヘテロシクリル；及びＣ_５−２０アリール（例えば、Ｃ_５−２０カルボアリール、Ｃ_５−２０ヘテロアリール、Ｃ_１−７アルキル−Ｃ_５−２０アリール及びＣ_５−２０ハロアリールを含む）基が挙げられる。

本明細書で用いられる用語「環構造」は、３〜１０個の共有結合原子、なおより好ましくは、３〜８個の共有結合原子、なおより好ましくは、５〜６個の共有結合原子の閉じた環に関する。環は、脂環式環又は芳香環であり得る。本明細書で用いられる用語「脂環式環」は、芳香環ではない環に関する。

本明細書で用いられる用語「炭素環」は、全ての環原子が炭素原子である環に関する。

本明細書で用いられる用語「炭素芳香環」は、全ての環原子が炭素原子である芳香環に関する。

本明細書で用いられる用語「複素環」は、環原子の少なくとも１個が多価の環ヘテロ原子（例えば、窒素、リン、ケイ素、酸素又は硫黄、より一般的には、窒素、酸素、又は硫黄）である環に関する。好ましくは、複素環は、１〜４個のヘテロ原子を有する。

上記の環は、「多環式基」の一部であり得る。

好ましくは、両親媒性炭水化物化合物は、第４級アンモニウムパルミトイルグリコールキトサン（ＧＣＰＱ）である。この場合は、パルミトイル化レベルは、好ましくは、１モノマーあたり５〜５０％である。四級化レベルは、好ましくは、１モノマーあたり１〜４０％である。

本発明の組成物において、薬剤は、好ましくは、０．００１〜１％ｗ／ｖの範囲内の濃度で存在する。

濃度が％ｗ／ｖで表される場合、これは、組成物１００ｍＬ中に含まれる固体の量（ｇ）を意味する。

両親媒性炭水化物化合物は、１〜５０ｋＤａの範囲内の分子量を有する。分子量は、好ましくは、ゲル透過クロマトグラフィー−多角度光散乱（ＧＰＣ−ＭＡＬＬＳ）を用いて測定する。

両親媒性炭水化物化合物は、トリポリホスフェートのようなその他の薬剤の存在なしに、水性媒体中において、粒子に自己集合することが可能である。一般的に、ミセルを形成する。

本発明の組成物は、微粒子凝集体を形成してもよい。これらは、個々の両親媒性物質分子及び親水性薬剤の凝集により形成させることができ、１０ｎｍ〜２０μｍの平均粒径を有する。

好ましくは、両親媒性炭水化物化合物は、薬剤を充填できるナノ粒子を形成する。透明又は半透明の炭水化物及び薬剤の分散体が形成し得る。一般的に、両親媒性化合物を薬剤と混合し、混合物のボルテックス及びプローブ超音波処理、或いは混合物の高圧均質化により分散体を調製する。

平均粒径は、顕微鏡により又は光子相関分光法を用いることにより容易に測定することができ、好都合なことに、ろ過前に水性分散液中において測定される。より好ましくは、ポリマーミセル凝集体は、少なくとも１０ｎｍ、より好ましくは少なくとも３０ｎｍの最小平均粒径、及び好ましくは１０μｍ以下の最大平均粒径を有する。

通常、両親媒性炭水化物化合物、対、薬剤の比は、１：１〜５０：１の範囲内、より好ましくは１：１〜２０：１の範囲内である。

通常、両親媒性炭水化物化合物、対、薬剤、対、医薬上許容される担体の比は、約１〜４０ｍｇ：１ｍｇ：１ｇであり得、例えば、１〜５ｍｇ：１ｍｇ：１ｇである。

本発明の医薬組成物は、眼投与に適した液体又は固体形態であり得る。一般的に、製剤は、透明又は乳白色の液体製剤である。

適切な１日用量は、年齢、体重、投与時間等に基づいて決定することができる。１日用量が、患者の状態及び体重、並びに薬剤の性質に応じて変化し得る一方で、代表的な眼用量は、０．０１〜１０ｍｇ／人／日である。

物質及び方法
ポリマー
Ｎ−パルミトイル−Ｎ−モノメチル−Ｎ，Ｎジメチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−６−Ｏ−グリコールキトサン（ＧＣＰＱ）を合成し、以前にＵＳ２０１００１５９０１４「Ｉ．Ｆ．Ｕｃｈｅｇｂｕ，Ａ．Ｇ．Ｓｃｈａｔｚｌｅｉｎ，Ｘ．Ｈｏｕ，Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃｍｉｃｅｌｌａｒｃｌｕｓｔｅｒｓａｎｄｔｈｅｉｒｕｓｅｓｉｎｆｏｒｍｕｌａｔｉｎｇｄｒｕｇｓ」に記載された通りに特徴づけた。実験に用いられるＧＣＰＱは、モノマー単位に対して２０．５１Ｍｏｌ％のパルミトイル基、モノマー単位に対して１１．９３Ｍｏｌ％の第４級アンモニウム基を有し、９．１３ＫＤａの分子量を有した。

ＣｓＡ組成物
ＣＳＡを含む組成物は、以下の通り調製した。ポリマーの秤量した試料及び薬剤の秤量した試料に、リン酸緩衝食塩水（ｐＨ＝７．４、２０ｍＬ）を加えた。初期のポリマー、薬剤の重量比は７．５：１であり、薬剤含有量を調整し、０．０５％、０．０８％及び０．１％ｗ／ｖの濃度とした。液体混合物を２分間ボルテックスし、完全な混合を確保にし、次いで、３０サイクル間２０，０００ｐｓｉで高圧均質化に付した（英国ＡｖｅｓｔｉｎＥｍｕｌｓｉｆｌｅｘ，ＧＣＴＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。

ＣｓＡ製剤安定性
安定性分析のために、製剤のアリコートを、冷蔵温度（２〜３℃）、室温（１６〜２２℃）又は加速温度（４０℃）の何れか３通りで保存し、また、凍結融解サイクル（−２０℃で２日間、５℃で２日間及び４０℃で２日間、３サイクルの繰り返し）の実行時にもモニターした。様々な時間間隔で、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）アッセイにより薬剤含有量について製剤を分析した。

ＣｓＡアッセイ
ＨＰＬＣアッセイを、これまでに「Ｗ．Ｐ．Ｃｈｅｎｇ，Ａ．Ｉ．Ｇｒａｙ，Ｌ．Ｔｅｔｌｅｙ，Ｔ．Ｌ．Ｂ．Ｈａｎｇ，Ａ．Ｇ．Ｓｃｈａｔｚｌｅｉｎ，Ｉ．Ｆ．Ｕｃｈｅｇｂｕ，Ｐｏｌｙｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓｗｉｔｈｈｉｇｈｄｒｕｇｌｏａｄｉｎｇｅｎｈａｎｃｅｔｈｅｏｒａｌｕｐｔａｋｅｏｆｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，７（２００６）１５０９−１５２０．」で説明されているようにして行った。簡単に、アリコート（１００μＬ）を等量のメタノールで希釈し、溶液をろ過し（０．２２μｍ）、ろ液を、Ｃ１８逆相オニキスモノリシックカラム（１００Ｘ４．６ｍｍ）に注入した。移動相をアセトニトリル、水（６０：４０）、流速を１．２ｍＬｍｉｎ−１、注入体積を２０μＬ、カラム温度を７０℃とした。ＨＰＬＣシステムは、アジレント１２００シリーズ（英国アジレント・テクノロジーズ社）とし、データを、アジレントＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウエアで分析した。

ｉｎｖｉｖｏ実験
ＣＳＡの局所眼投与のために、雄のニュージーランドウサギ（ｎ＝３、英国ハーラン）に、手順に軽微な変更を加えて上記のように調製したＧＣＰＱを含む０．０５％ｗ／ＶのＣＳＡ組成物を投与した。

ｉｎｖｉｖｏ製剤
ＧＣＰＱ（ＧＣＰＱＬＣ２Ｓｅｐ１３−脱プロトン化、Ｍｗ＝１３，２１０Ｄａ、Ｍｎ＝１２，１８０Ｄａ、モル％パルミトイル化＝１７％、モル％第４級アンモニウム基＝１２％）を、３．１％ｗ／Ｖのグリセリンを含む水溶液に０．７５％ｗ／Ｖの濃度で分散した。少なくとも２時間オービタルシェーカーでポリマーを穏やかに振盪することにより分散させた。ポリマーを完全に分散させてから、３．１μｍシリンジフィルターにより分散液をろ過した。

上記のポリマー分散液を、量り取った量のＣＳＡ粉末を加えた（目標量の２倍のＣＳＡを加えた。）。ＣＳＡ粉末を、はじめに混合物をボルテックスし、次いで、高圧ホモジナイザー（ＡｖｅｓｔｉｎＣ５）を用いて１８０００ｐｓｉで３０サイクル処理することにより分散させた。高圧均質化の後、ＮａＯＨ（１Ｍ）を用いてｐＨを７．４に調整した。製剤を５℃で少なくとも２４時間保存し、ＨＰＬＣで分析し、最後に０．７５％ｗ／ＶのＧＣＰＱ及び３．１％ｗ／Ｖのグリセロールを含むポリマー分散液（予めｐＨ７．４に調整し、３．１μｍシリンジフィルターを用いてろ過したもの）で希釈し、製剤を必要な強度とした。

動物実験
ニュージーランドアルビノ雄ウサギ２．５〜３ｋｇ（英国ハーランラボラトリーズ）を、実験の５日以上前に順化させた。試験中、ウサギを水に自由に出入りさせた。製剤を両目に投与した。製剤投与のために、下眼瞼を穏やかに眼球から引き離し、目盛り付きマイクロピペットを用いて、２５μＬの製剤を下部結膜盲嚢に塗布した。投与後、上眼瞼及び下眼瞼をおよそ５秒間一緒に手で保持し、製剤が角膜と接触するようにした。次いで、その後６０秒後に瞬きの回数を記録した。事前に決められた時点（０．５、２、４、８、２４時間）で、動脈血の試料を周辺耳動脈から採取した。次いで、ペントバルビタールのＩＶ過剰投与注射によりウサギを処分した。涙液試料を２μＬのキャピラリーで採取した。様々な組織を解剖し、０．９％ＮａＣｌ溶液で洗浄し、ろ紙上で乾燥し、その後の分析のために保存した。汚染を最小限に抑えるために、眼組織を以下の順番で回収した：（１）房水、（２）結膜、（３）硝子体液、（４）水晶体、（５）角膜及び（６）強膜。両目由来の組織を、同じ容器に保存した。はじめに（解剖２〜５時間後）、試料を氷中に保存し（解剖後２〜５時間）、その後、分析を行うまでそれらを−８０℃で保存した。

組織分析
組織中のＣＳＡの濃度を、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を用いて測定した。

標準の調製
ＣＳＡ原液を、メタノール（ＬＣ−ＭＳ用，シグマ−アルドリッチ）中、ガラス製バイアルにおいて１ｍｇｍＬ^−１の濃度で調製した。作業標準（ＷＳ）を、メタノール中でのＣＳＡ原液の連続希釈により調製し、〜５０〜１００００００ｎｇｍＬ^−１の濃度範囲の作業標準（表１）を得た。

表１：ＣＳＡ作業標準溶液の調製

ＣｓＡ−ｄ１２（独国レシピー）を内部標準として用いた。内部標準（ＩＳ）の原液を、アセトニトリル中で６．２５μｇｍＬ^−１の濃度に調製した。ＩＳ標準液（ＩＳ−ＰＰＴ）を、メタノールでのＩＳ原液の希釈により新たに調製し、５ｎｇｍＬ^−１の濃度でＩＳを得た。

組織を解凍し（はさみで小片に切断した固体組織で）、重さを量り（９９．０±１．０ｍｇ又は液体組織は９９μＬ）、１．５ｍＬポリプロピレンマイクロ遠心分離管に入れた。それぞれの管に、ある体積の作業標準ＷＳ０〜ＷＳ１４（表２）を加えた。次いで、スパイクした試料を、１０分間ボルテックスした。

表２：ＣＳＡ較正標準の調製

次いで、スパイクした試料を、４００μＬのＩＳ−ＰＰＴを加えることにより抽出し、室温で４時間ボルテックスした。次いで、試料をボルテックスから取り出し、そのまま５℃で３０分間放置した後、遠心分離（５０００ｇＸ１０分）した。上清をＨＰＬＣバイアルに移し、ＬＣ−ＭＳを用いて分析した。

試料の調製
組織を解凍し（はさみで小片に切断した固体組織で）、重さを量り（１００．０±１．０ｍｇ又は液体組織１００μＬ）、１．５ｍＬポリプロピレンマイクロ−遠心分離管に入れた。次いで、試料を、４００μＬのＩＳ−ＰＰＴを加えることにより抽出し、室温で４時間ボルテックスした。次いで、試料をボルテックスから取り出し、そのまま５℃で３０分間放置した後、遠心分離した（５０００ｇＸ１０分）。上清をＨＰＬＣバイアルに移し、ＬＣ−ＭＳを用いて分析した。

ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ計測
試料を、脱ガス装置（ＨｉＰ脱ガス装置１２６０／Ｇ４２２５Ａ）、バイナリポンプ（ＨｉＰ１２６０バイナリポンプ／Ｇ１３１２Ｂ）、オートサンプラ（ＨｉＰサンプラ１２６０／Ｇ１３６７Ｅ）、カラムオーブン（Ｇ１３１６Ａ）及びトリプル四重極質量分析計（Ｇ６４６０Ａ）を含むアジレント６４００シリーズトリプル四重極ＬＣ／ＭＳシステム（英国バークシャー、アジレントテクノロジーズ）で分析した。アジレントＭａｓｓＨｕｎｔｅｒＷｏｒｋｓｔａｔｉｏｎソフトウエアを、システム制御、データ取得及びデータ処理のために使用した。

クロマトグラフィー条件
試料（注入体積＝５μＬ）を、６０℃のカラム温度、６００μＬｍｉｎ^−１の流速の移動相を伴う、ＣａｒｔｒｉｄｇｅＧｅｍｉｎｉ（Ｃ１８４ｘ２．０ｍｍ）ガードカラムを備えたアジレントＺｏｒｂａｘＥｘｔｅｎｄ−Ｃ１８（５０ｘ２．１ｍｍカラム、細孔径＝３．５μｍ）でクロマトグラフに付した。移動相のグラジエントは、表３に示した通りである（溶液Ａ＝０．０２％ｗ／ｖ酢酸水、溶液Ｂ＝０．０２％ｗ／ｖ酢酸を含むメタノール）。上記のクロマトグラフ条件下で得られた２つの被分析物の代表的な保持時間を、表４に報告する。

表３：ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析のためのグラジエント法

表４：ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ保持時間

質量分析計の条件
イオンソースを、窒素をソースとするアジレントＪｅｔＳｔｒｅａｍ（ＡＪＳ）とし、スキャンモードを多重反応モニタリング（ＭＲＭ）とし、極性を陽性イオンモードとし、ネブライザー圧を３０ｐｓｉとし、ガスフローを５Ｌｍｉｎ^−１とし、ガス温度を３４０℃とし、キャピラリー電圧を５０００Ｖとし、シースガスヒーターを４００℃とし、シースガスフローを１１Ｌｍｉｎ^−１とし、Ｖチャージングを１５００Ｖとした。表５は、２つの被分析物各々の定量化のための質量分析計の条件を報告する。

表５：ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析のためのイオンチャネル検出器の設定

定量化
ＣＳＡ及びＣＳＡ−ｄ１２の較正曲線を、表２において説明されるようにして調製した標準を用いて作成した。

薬物動態分析
ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌプラス２０１０を用いて、薬物動態パラメーターを算出した。ＩＢＭＳＰＳＳＳｔａｔｉｓｔｉｃｓを統計分析のために使用した。定量限界未満の値（ＢＬＱ）を、計算のために０とみなした。

統計分析
ＩＢＭＳＰＳＳＳｔａｔｉｓｔｉｃｓを、統計分析のために用いた。定量限界未満の値（ＢＬＱ）を、計算のために０とみなした。まずは、２元配置ＡＮＯＶＡ分析、続いて、事後検定（テューキーのＨＳＤ）を行い、時間点全体にわたる３つの製剤の間の差を試験した。３つの製剤の間に統計学的に有意な差異が見出された場合、各時点における統計学的に有意な差異を、一元配置ＡＮＯＶＡ、続いて、事後検定（それぞれ等分散または不等分散を有するテューキーのＨＳＤ又はＧａｍｅｓ−Ｈｏｗｅｌｌの何れか）を用いて評価した。

結果
表６は、透明液体製剤の物理化学的特性を報告する。浸透圧及びｐＨは、眼科調製物の範囲内であった。

表６：組成物の物理化学的性質

上記条件下で熱安定性試験に付した製剤は、薬剤含有量に対して安定であった（表７〜１０）。

表７：熱安定性試験に付したＣＳＡ０．０５０％ｗ／Ｖ及びＧＣＰＱ０．３７５％ｗ／Ｖを含む組成物の薬剤含有量

表８：熱安定性試験に付したＣＳＡ０．０８０％ｗ／Ｖ及びＧＣＰＱ０．６００％ｗ／Ｖを含む組成物の薬剤含有量

表９：熱安定性試験に付したＣＳＡ０．１００％ｗ／Ｖ及びＧＣＰＱ０．７５０％ｗ／Ｖを含む組成物の薬剤含有量

表１０：凍結融解サイクルに付したＣＳＡ０．１００％ｗ／Ｖ及びＧＣＰＱ０．７５０％ｗ／Ｖを含む組成物の薬剤含有量

乳白色液体の製剤を、加速保存温度（４０℃）に付すと可逆的により不透明となり、より低い温度（室温）にさらすと乳白色の外観に戻り、より低い温度（室温及び冷蔵）で保存した場合には乳白色の外観が保持された。４０℃で保存した場合のこの外観変化は、冷蔵温度からヒトの生理学的温度に温度が上昇するにつれて薬剤の溶解度が低下するというシクロスポリンＡの固有溶解度の変化に起因する（溶解度＝５℃で１０１．５μｇｍＬ−１、２５℃で１９．９μｇｍＬ−１、及び３７℃で３．７μｇｍＬ−１）。

目視観察により測定した限りでは、保存期間の間に薬剤沈殿物が観察されなかった。３つの製剤の保存条件全てにおいて、薬剤含有量が３０日間にわたって変化しなかった（表７〜９）（データに対してＡＮＯＶＡ検定を行った。初期の製剤及び保存した製剤の間に有意な差はなかった。）。

熱サイクルに付した場合、視覚的巨視的分析により、３サイクルの終わりに製剤にわずかな濁りが見られることが明らかとなったが、目視観察による測定ではいかなる薬剤沈殿物も存在しなかった。さらに、薬剤含有量は、熱サイクルの間安定していた（表１０）（結果に対するＡＮＯＶＡ検定で決定した）。

ＣＳＡ０．０５０％ｗ／Ｖ及びＧＣＰＱ０．７５％ｗ／ｖを含む組成物の局所眼投与後の様々な組織におけるＣＳＡ濃度を、表１１に報告する。Ｒｅｓｔａｓｉｓ（登録商標）を対照の製剤として投与した。

表１１：ＣＳＡ０．０５０％ｗ／Ｖ及びＧＣＰＱ０．７５％ｗ／Ｖ、並びにＲｅｓｔａｓｉｓ（登録商標）を含む組成物の局所眼投与後の様々なウサギ眼組織におけるＣＳＡ濃度

ＢＬＱ＿ｐ：血漿における定量限界（１．６ｎｇ／ｍＬ）未満；ＢＬＱ＿ａ：房水における定量限界（０．５ｎｇ／ｍＬ）未満。

ｉｎ−ｖｉｖｏ局所眼投与の実験により、ＧＣＰＱを含む組成物は、市販の組成物のＲｅｓｔａｓｉｓ（登録商標）に比べてより生物学的に利用可能であることが明らかとなった（表１１）。具体的に、角膜及び結膜における薬剤の量は、ＧＣＰＱ組成物を用いると、終わりの２４時間の時点を除いて全ての時点で、Ｒｅｓｔａｓｉｓと比較した場合に統計的に有意（ｐ＜０．０５）に高かった。さらに強膜における薬剤の量は、ＧＣＰＱ組成物を用いると、４及び８時間の時点で、Ｒｅｓｔａｓｉｓ（登録商標）と比較した場合に統計的に有意（ｐ＜０．０５）に高かった。房水、硝子体液及び血漿では、２つの組成物の間に薬剤の量の差が見られなかった。

これらの結果をまとめると、ＧＣＰＱ組成物が、ＤＥＳの主な標的である眼組織（角膜及び結膜）にＣＳＡを送達する上でより効果的であることが明らかとなる。とりわけ、血漿におけるＣＳＡ濃度は、血漿における定量限界（１．６ｎｇ／ｍＬ）未満であった。したがって、製剤が全身性副作用を引き起こさないことを示唆している。

Claims

眼への局所適用による眼障害の治療に使用するための、２％ｗ／ｖ未満の濃度のシクロスポリンＡ及び１〜５０ｋＤａの範囲の分子量を有する両親媒性炭水化物化合物を含む水性組成物であって、
両親媒性炭水化物化合物が、組成物に対して１０％ｗ／ｖ未満の濃度で存在し、且つ一般式：

［式中、
ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＝１．０００であり、
ａは、０．００〜０．８４であり、
ｂは、０．０１〜０．４０であり、
ｃは、０．００〜０．８４であり、
ｄは、０．０５〜０．５０であり；
Ｘは、疎水基であり；
Ｒ_１、Ｒ_２及びＲ_３は、独立して、置換又は無置換のアルキル基から選ばれ；
Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６及びＲ_１０は、独立して、水素、置換又は無置換のアルキル基、置換又は無置換のエーテル基、又は置換又は無置換のアルケン基から選ばれ；
Ｒ_７は、存在していても、或いは存在していなくてもよく、存在する場合、無置換又は置換されたアルキル基、無置換又は置換されたアミン基又は置換又は無置換のアミド基であり；
Ｒ_８及びＲ_９は、独立して、水素、及び置換又は無置換のアルキル基、置換又は無置換のエーテル基、又は置換又は無置換のアルケン基のいずれかから選ばれる。］
で表されるもの又はその塩である、水性組成物。
脂質を含まない請求項１に記載の組成物。
眼球乾燥症候群（ＤＥＳ）、春季角結膜炎（ＶＫＣ）、湿疹、アトピー性角結膜炎（ＡＫＣ）、シェーグレン症候群、屈折矯正手術術後、角膜移植又はコンタクトレンズ不耐症の治療に用いるための請求項１又は２に記載の組成物。
シクロスポリンＡが、炭水化物化合物を形成する自己集合することが可能な正電荷の両親媒性ポリマーによりカプセル化される請求項１〜３の何れか一項に記載の組成物。
１０ｎｍ〜２０μｍの平均粒径を有するポリマー凝集体の形態である請求項１〜４の何れか一項に記載の組成物。
炭水化物化合物が、第４級アンモニウムパルミトイルグリコールキトサン（ＧＣＰＱ）である請求項１〜５の何れか一項に記載の組成物。
パルミトイル化レベルｄが、０．０８〜０．２５の範囲内である請求項６に記載の組成物。
四級化レベルｂが、０．０２〜０．２０の範囲内である請求項６又は７に記載の組成物。
シクロスポリンＡが、０．００１〜１％ｗ／ｖの範囲内の濃度で存在する請求項１〜８の何れか一項に記載の組成物。
１種以上の医薬上許容される賦形剤、２％ｗ／ｖ未満の濃度のシクロスポリンＡ及び１〜５０ｋＤａの範囲の分子量を有する両親媒性炭水化物化合物を含む眼投与用の医薬組成物であって、
両親媒性炭水化物化合物が、組成物に対して１０％ｗ／ｖ未満の濃度で存在し、且つ一般式：

ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＝１．０００であり、
ａは、０．００〜０．８４であり、
ｂは、０．０１〜０．４０であり、
ｃは、０．１０〜０．９４であり、
ｄは、０．０５〜０．５０であり；
Ｘは、疎水基であり；
Ｒ_１、Ｒ_２及びＲ_３は、独立して、置換又は無置換のアルキル基から選ばれ；
Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６及びＲ_１０は、独立して、水素、置換又は無置換のアルキル基、置換又は無置換のエーテル基、又は置換又は無置換のアルケン基から選ばれ；
Ｒ_７は、存在していても、或いは存在していなくてもよく、存在する場合、無置換又は置換されたアルキル基、無置換又は置換されたアミン基又は置換又は無置換のアミド基であり；
Ｒ_８及びＲ_９は、独立して、水素及び置換又は無置換のアルキル基、置換又は無置換のエーテル基、又は置換又は無置換のアルケン基のいずれかから選ばれる。］
で表されるもの又はその塩である、医薬組成物。
請求項２〜９の特徴の何れかを有する請求項１０に記載の医薬組成物。